JoVE Journal > Genetics
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Genetics

Manipulation af genfunktioner i mexicansk Cavefish

Published: April 22, 2019
doi:
10.3791/59093
, , , , ,
1Department of Biological Sciences,Florida Atlantic University, 2Jupiter Life Science Initiative,Florida Atlantic University, 3Harriet L. Wilkes Honors College,Florida Atlantic University

Summary

Vi beskriver tilgange til manipulering af gener i den evolutionære modelsystem Astyanax mexicanus. Tre forskellige teknikker er beskrevet: Tol2-medieret transgenese, målrettede manipulation af genomet ved hjælp af CRISPR/Cas9 og knockdown ytringsfriheden ved hjælp af morpholinos. Disse værktøjer bør lette den direkte undersøgelse af gener, der ligger til grund for variationen mellem overflade – og hulen-boligen former.

Abstract

Cave dyr giver en overbevisende system for at undersøge den evolutionære mekanismer og genetiske grundlag bag ændringer i mange komplekse træk, herunder øjet degeneration, albinisme, søvn tab, Hyperfagi og sensoriske forarbejdning. Arter af cavefish fra hele verden vist en konvergent evolution morfologiske og adfærdsmæssige træk på grund af delte miljøbelastning mellem forskellige grotte systemer. Forskellige cave arter er blevet undersøgt i laboratoriet indstilling. Den mexicanske tetra, Astyanax mexicanus, med seende og blinde former, har givet unik indsigt i biologiske og molekylære processer bag udviklingen af komplekse træk og er godt klar som en spirende modelsystem. Mens kandidat gener regulering udviklingen af forskellige biologiske processer er blevet identificeret i A. mexicanus, har evnen til at validere en rolle for enkelte gener været begrænset. Anvendelsen af transgenese og gen-redigering teknologi har potentialet til at overvinde denne store forhindring og til at efterforske de mekanismer, der ligger til grund for udviklingen af komplekse træk. Her, beskriver vi en anden metode til at manipulere genekspression i A. mexicanus. Metoder omfatter brug af morpholinos, Tol2 transgenese, og gen-redigering systemer, er almindeligt anvendt i zebrafisk og andre fisk modeller, for at manipulere genfunktion i A. mexicanus. Disse protokoller indeholder detaljerede beskrivelser af timet avl procedurer, indsamling af befrugtede æg, injektioner og udvælgelse af genetisk modificerede dyr. Disse metodiske tilgange giver mulighed for undersøgelse af de genetiske og neurale mekanismer bag udviklingen af forskellige træk i A. mexicanus.

Introduction

Siden Darwins Arternes oprindelse1, har forskere fået dybtgående indsigt i hvordan træk er formet evolutionært som svar på definerede miljømæssigt og økologisk pres, takket være hule organismer2. Den mexicanske tetra, A. mexicanus, består af eyed forfædres ‘overflade’ befolkning, der bebor floder i hele Mexico og det sydlige Texas og mindst 29 geografisk isolerede befolkninger af afledte cave morphs bebo Sierra del Abra og andre områder af nordøstlige Mexico3. En række af grotte-associerede træk er blevet identificeret i A. mexicanus, herunder ændret iltforbrug, depigmentering, tab af øjne, og ændret fodring og fouragering adfærd4,5,6, 7,8,9. A. mexicanus præsenterer en kraftfuld model for at undersøge mekanismerne på konvergent evolution på grund af en veldefineret evolutionære historie, en detaljeret beskrivelse af økologiske miljø og tilstedeværelsen af selvstændigt udviklet cave populationer10,11. Mange af de hule-afledte træk, der er til stede i cavefish, herunder øjet tab, sove tab, øget fodring, tab af skolegang, reduceret aggression, og reduceret stress svar, har udviklet sig flere gange gennem uafhængige oprindelse, ofte udnytter forskellige genetiske veje mellem caves8,12,13,14,15. Dette gentages evolution er en kraftfuld aspekt af A. mexicanus system og kan give indsigt i den mere generelle spørgsmål om hvordan genetiske systemer kan være rystet til at generere tilsvarende fænotyper.

Mens anvendelsen af genteknologi for mekanistisk undersøgelse af genfunktioner har været begrænset i mange fiskearter (herunder A. mexicanus), danne de seneste fremskridt i zebrafisk grundlag for genetisk teknologiudvikling i fisk 16,17,18,19,20. Adskillige værktøjer er meget udbredt i zebrafisk for at manipulere genekspression, og gennemførelsen af disse procedurer har længe blevet standardiseret. For eksempel, injektion af morpholino oligos (MOs) på stadiet encellede selektivt blokerer RNA og forhindrer oversættelse til et korte tidsmæssige vindue under udvikling21,22. Desuden gen-redigering metoder, såsom grupperet regelmæssigt interspaced korte palindromiske gentagelser (CRISPR) / CRISPR-forbundet protein 9 (Cas9) og transkription aktivere-lignende effektor nukleasen (TALEN), giver mulighed for generation af definerede sletninger eller i nogle tilfælde, indsættelser gennem en rekombination i genomer19,20,23,24. Transgenese bruges til at manipulere stabil genekspression eller funktion i en celletype specifikke måde. Tol2 systemet er brugt effektivt til at generere transgene dyr af coinjecting transposase mRNA med en Tol2 DNA plasmid indeholder et transgen25,26. Tol2 system udnytter Tol2 transposase af medaka til at generere stabile kønscelleoverførsel indsætninger af transgene construct17. Generere Tol2 transgenics indebærer coinjecting et plasmid som indeholder en transgen flankeret af Tol2 integrering websteder og mRNA for Tol2 transposase17. Dette system er blevet brugt til at generere et array af transgene linjer i zebrafisk og dets anvendelse har for nylig udvidet til yderligere emergent modelsystemer, herunder cichlider, killifish, Hundestejle, og mere for nylig, den mexicanske cavefish27, 28,29,30.

Mens cavefish er et fascinerende biologisk system for informative mekanismer af trait evolution, har sin fulde kapacitet som en evolutionær model ikke blevet fuldt udnyttet. Dette er delvis på grund af manglende evne til at manipulere genetiske og cellulære funktion direkte31. Kandidat gener regulering komplekse træk er blevet identificeret ved hjælp af kvantitative træk loci (QTL) undersøgelser, men valideringen af disse kandidat gener har været vanskelige32,33,34. For nylig, forbigående knockdown ved hjælp af morpholinos, gen redigering bruger CRISPR og TALEN, og brugen af Tol2-medieret transgenese har været brugt til at undersøge det genetiske grundlag bag en række træk35,36,37 ,38. Implementering og standardisering af disse teknikker vil give mulighed for manipulationer, at afhøre de molekylære og neurale fundament for biologiske egenskaber, herunder manipulation af genfunktioner, mærkning af definerede cellepopulationer, og udtryk for funktionelle journalister. Der henviser til, at en vellykket gennemførelse af disse genetiske værktøjer til at manipulere gen eller cellulære funktion er blevet påvist i emergent modelsystemer, er detaljerede protokoller stadig mangler i A. mexicanus.

A. mexicanus har kritisk indsigt i mekanismerne i evolution som reaktion på et skiftende miljø og præsentere mulighed for at identificere nye gener, der regulerer forskellige træk. En række faktorer tyder på, at A. mexicanus er en ekstremt tractable model for anvendelse af etablerede genomisk værktøjer i øjeblikket tilgængelig i etablerede genetiske modeller, herunder evnen til at let fastholde fisk i laboratorier, store kuld størrelse, gennemsigtighed, sekventeret genom og definerede adfærdsmæssige assays39. Her, beskriver vi en metode til anvendelse af morpholinos, transgenese og gen redigering i overfladen og cave populationer af A. mexicanus. Den bredere anvendelse af disse værktøjer i A. mexicanus muliggør en mekanistisk undersøgelse af de molekylære processer bag udviklingen af udviklingsmæssige, fysiologiske og adfærdsmæssige forskelle mellem cavefish og overflade fisk.

Protocol

1. Morpholino oligo design Bemærk: Sekvenser for A. mexicanus er tilgængelige via nationale Center for bioteknologi Information (NCBI) genet og NCBI SRA (https://www.ncbi.nlm.nih.gov), samt fra Ensembl genom browser (https://www.ensembl.org). Når du udformer en morpholino til brug i både overflade – og hulen-boligen former, er det afgørende at identificere eventuelle genetiske variation mellem morphs i denne fase, så disse genetiske regioner kan undgås som mål for morpholinos. E…

Representative Results

Flere bestande af hulen-boligen A. mexicanus Vis reduceret søvn og øget vågenhed/aktivitet i forhold til deres overflade-bolig artsfæller14. Hypocretin/orexin (HCRT) er en yderst velbevarede neuropeptid, som virker til at øge vågenhed, og afvigelser i HCRT pathway forårsager narkolepsi hos mennesker og andre pattedyr47,48. Vi har tidligere vist, at hulen A. mexicanus har øget udtryk for HCRT peptid, tyder på, at …

Discussion

Her, leverer vi en metode for at manipulere genfunktion ved hjælp af morpholinos, CRISPR/Cas9 gen redigering og transgenese metode. Rigdommen af genteknologi og optimering af disse systemer i zebrafisk vil sandsynligvis give mulighed for overførsel af disse værktøjer til A. mexicanus med lethed52. De seneste resultater har brugt disse metoder i A. mexicanus, men de forbliver underudnyttede i undersøgelsen af forskellige morfologiske, udviklingsmæssige og adfærdsmæssige tr…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Forfatterne takke Sunishka Thakur for hendes hjælp i genotypebestemmelse og imaging oca2 mutant fisk afbildet i figur 2. Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health (NIH) award R21NS105071 til A.C.K. og E.R.D., National Science Foundation (NSF) award 1656574 til A.C.K. og NSF award 1754321 J.K. og A.C.K.

Materials

Fish breeding & egg supplies
Fine mesh fish net Penn Plax BN4
Fish tank heater Aqueon 100106108
Egg traps Custom made NA Design and create plastic grate to place at bottom of tank to protect eggs
Glass pipettes Fisher Scientific 13-678-20C
Pipette bulbs Fisher Scientific 03-448-21
Agarose Fisher Scientific BP160-500
Egg molds Adaptive Science Tools TU-1
Morpholino supplies
Control Morpholino Gene Tools, LLC Standard control olio
Custom Morpholino Gene Tools, LLC NA
Phenol Red Sigma Aldrich P0290-100ML
CRISPR supplies
Cas9 Plasmid AddGene 46757
GoTaq DNA Polymerase Promega M3001
KOD Hot Start Taq EMD Millipore 71-842-3
Primers Integrated DNA Technologies Custom
T7 Megascript Kit Ambion/Thermofisher AM1333
miRNeasy Kit Qiagen 217004
mMessage mMachine T3 kit Ambion/Thermofisher AM1348
MinElute Kit Qiagen 28204
Tol2 transgenesis supplies
pCS-zT2TP plasmid Kawakami et al., 2004 Request from senior author
CutSmart Buffer New England Biolabs B7204
NotI-HF Restriction Enzyme New England Biolabs R3189
PCR purification Kit Qiagen 28104
SP6 mMessenger Kit Ambion/Thermofisher AM1340
Microinjection supplies
Glass Capillary Tubes Sutter Instruments BF100-58-10
Pipette puller Sutter Instruments P-97
Picoinjector Warner Instruments PLI-100A
Micromanipulator World Precision Instruments M3301R
Micromanipulator Stand World Precision Instruments M10
Micmanipulator Base World Precision Instruments Steel Plate Base, 10 lbs
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Darwin, C. . On the Origin of Species by Means of Natural Selection. , (1859).
  2. Culver, D. C., Pipan, T. . The Biology of Caves and Other Subterranean Habitats. , (2009).
  3. Mitchell, R. W., Russell, W. H., Elliott, W. R. . Mexican Eyeless Characin Fishes, Genus Astyanax: Environment, Distribution, and Evolution. , (1977).
  4. Huppop, K. Oxygen consumption of Astyanax fasciatus (Characidae, Pisces): A comparison of epigean and hypogean populations. Environmental Biology of Fishes. 17, 299-308 (1986).
  5. Moran, D., Softley, R., Warrant, E. J. Eyeless Mexican Cavefish Save Energy by Eliminating the Circadian Rhythm in Metabolism. PLoS ONE. 9 (9), e107877 (2014).
  6. Protas, M. E., et al. Genetic analysis of cavefish reveals molecular convergence in the evolution of albinism. Nature genetics. 38, 107-111 (2006).
  7. Wall, A., Volkoff, H. Effects of fasting and feeding on the brain mRNA expressions of orexin tyrosine hydroxylase (TH), PYY and CCK in the Mexican blind cavefish (Astyanax fasciatus mexicanus). General and Comparative Endocrinology. 183, 44-52 (2013).
  8. Aspiras, A., Rohner, N., Marineau, B., Borowsky, R., Tabin, J. Melanocortin 4 receptor mutations contribute to the adaptation of cavefish to nutrient-poor conditions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (31), 9668-9673 (2015).
  9. Yoshizawa, M., Gorički, &. #. 3. 5. 2. ;., Soares, D., Jeffery, W. R. Evolution of a behavioral shift mediated by superficial neuromasts helps cavefish find food in darkness. Current Biology. 20 (18), 1631-1636 (2010).
  10. Jeffery, W. R. Regressive Evolution in Astyanax Cavefish. Annual Review of Genetics. 43, 25-47 (2009).
  11. Gross, J. B. The complex origin of Astyanax cavefish. BMC Evolutionary Biology. 12, 105 (2012).
  12. Elipot, Y., Hinaux, H., Callebert, J., Rétaux, S. Evolutionary shift from fighting to foraging in blind cavefish through changes in the serotonin network. Current Biology. 23 (1), 1-10 (2013).
  13. Kowalko, J. E. J., et al. Loss of schooling behavior in cavefish through sight-dependent and sight-independent mechanisms. Current Biology. 23 (19), 1874-1883 (2013).
  14. Duboué, E. R. E. R., Keene, A. C. A. C., Borowsky, R. L. R. L. Evolutionary convergence on sleep loss in cavefish populations. Current Biology. 21 (8), 671-676 (2011).
  15. Chin, J. S., et al. Convergence on reduced stress behavior in the Mexican blind cavefish. Developmental Biology. , (2018).
  16. Scheer, N., Campos-Ortega, J. A. Use of the Gal4-UAS technique for targeted gene expression in the zebrafish. Mechanisms of Development. 80 (2), 153-158 (1999).
  17. Kawakami, K., Shima, A., Kawakami, N. Identification of a functional transposase of the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish, and its transposition in the zebrafish germ lineage. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (21), 11403-11408 (2000).
  18. Balciunas, D., et al. Enhancer trapping in zebrafish using the Sleeping Beauty transposon. BMC Genomics. , (2004).
  19. Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair. Genome Research. 24 (1), 142-153 (2014).
  20. Kimura, Y., Hisano, Y., Kawahara, A., Higashijima, S. I. Efficient generation of knock-in transgenic zebrafish carrying reporter/driver genes by CRISPR/Cas9-mediated genome engineering. Scientific Reports. 4, (2014).
  21. Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. A Primer for Morpholino Use in Zebrafish. Zebrafish. 6 (1), 69-77 (2009).
  22. Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene “knockdown” in zebrafish. Nature Genetics. , (2000).
  23. Sander, J. D., et al. Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs. Nature Biotechnology. , (2011).
  24. Huang, P., et al. Heritable gene targeting in zebrafish using customized TALENs. Nature Biotechnology. , (2011).
  25. Kawakami, K. Transposon tools and methods in zebrafish. Developmental Dynamics. 234 (2), 244-254 (2005).
  26. Urasaki, A., Morvan, G., Kawakami, K. Functional dissection of the Tol2 transposable element identified the minimal cis-sequence and a highly repetitive sequence in the subterminal region essential for transposition. Genetics. 174 (2), 639-649 (2006).
  27. Juntti, S. A., Hu, C. K., Fernald, R. D. Tol2-Mediated Generation of a Transgenic Haplochromine Cichlid, Astatotilapia burtoni. PLoS ONE. 8 (10), (2013).
  28. Harel, I., Valenzano, D. R., Brunet, A. Efficient genome engineering approaches for the short-lived African turquoise killifish. Nature Protocols. 11 (10), 2010-2028 (2016).
  29. Erickson, P. A., Ellis, N. A., Miller, C. T. Microinjection for Transgenesis and Genome Editing in Threespine Sticklebacks. Journal of Visualized Experiments. (111), e54055 (2016).
  30. Elipot, Y., Legendre, L., Père, S., Sohm, F., Rétaux, S. Astyanax transgenesis and husbandry: how cavefish enters the laboratory. Zebrafish. 11 (4), 291-299 (2014).
  31. Keene, A., Yoshizawa, M., McGaugh, S. . Biology and Evolution of the Mexican Cavefish. , (2015).
  32. Casane, D., Rétaux, S. Evolutionary Genetics of the Cavefish Astyanax mexicanus. Advances in Genetics. 95, 117-159 (2016).
  33. Mcgaugh, S., et al. The cavefish genome reveals candidate genes for eye loss. Nature Communications. 5, 5307 (2014).
  34. Yoshizawa, M., et al. Distinct genetic architecture underlies the emergence of sleep loss and prey-seeking behavior in the Mexican cavefish. BMC Biology. 13 (1), (2015).
  35. Ma, L., Jeffery, W. R., Essner, J. J., Kowalko, J. E. Genome editing using TALENs in blind Mexican cavefish, Astyanax mexicanus. PLoS ONE. 10 (3), (2015).
  36. Bilandzija, H., Ma, L., Parkhurst, A., Jeffery, W. A potential benefit of albinism in Astyanax cavefish: downregulation of the oca2 gene increases tyrosine and catecholamine levels as an alternative to melanin synthesis. PLoS ONE. 8 (11), e80823 (2013).
  37. Alie, A., et al. Developmental evolution of the forebrain in cavefish: from natural variations in neuropeptides to behavior. eLife. 7, e32808 (2018).
  38. Jaggard, J. B., et al. Hypocretin underlies the evolution of sleep loss in the Mexican cavefish. eLife. 7, e32637 (2018).
  39. Borowsky, R. Handling Astyanax mexicanus eggs and fry. Cold Spring Harbor Protocols. 3 (11), (2008).
  40. Varshney, G. K., Sood, R., Burgess, S. M. Understanding and Editing the Zebrafish Genome. Advances in Genetics. 92, 1-52 (2015).
  41. Wierson, W. A., et al. GeneWeld: a method for efficient targeted integration directed by short homology. BioRxiv. , (2018).
  42. Klaassen, H., Wang, Y., Adamski, K., Rohner, N., Kowalko, J. E. CRISPR mutagenesis confirms the role of oca2 in melanin pigmentation in Astyanax mexicanus. Developmental Biology. , (2018).
  43. Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (34), 13904-13909 (2013).
  44. Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: A multisite gateway-based construction Kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).
  45. Kawakami, K., et al. A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish. Developmental Cell. 7 (1), 133-144 (2004).
  46. Kowalko, J., Ma, L., Jeffery, W. Genome Editing in Astyanax mexicanus Using Transcription Activator-like Effector Nucleases (TALENs). Journal of Visualized Experiments. (112), e54113 (2016).
  47. Nishino, S., Ripley, B., Overeem, S., Lammers, G. J., Mignot, E. Hypocretin (orexin) deficiency in human narcolepsy. Lancet. , (2000).
  48. Lin, L., et al. The sleep disorder canine narcolepsy is caused by a mutation in the hypocretin (orexin) receptor 2. Cell. , (1999).
  49. Park, H. C., et al. Analysis of upstream elements in the HuC promoter leads to the establishment of transgenic Zebrafish with fluorescent neurons. Developmental Biology. 227 (2), 279-293 (2000).
  50. Higashijima, S., Masino, M. A., Mandel, G., Fetcho, J. R. Imaging Neuronal Activity During Zebrafish Behavior With a Genetically Encoded Calcium Indicator. Journal of Neurophysiology. , (2003).
  51. Vladimirov, N., et al. Light-sheet functional imaging in fictively behaving zebrafish. Nature Methods. 11 (9), 883-884 (2014).
  52. Halpern, M. E., et al. Gal4/UAS transgenic tools and their application to zebrafish. Zebrafish. 5 (2), 97-110 (2008).
  53. Jaggard, J. B., Stahl, B. A., Lloyd, E., Prober, D. A., Duboue, E. R., Keene, A. C. Hypocretin underlies the evolution of sleep loss in the Mexican cavefish. bioRxiv. 7, e32637 (2018).
  54. Bedell, V. M., Westcot, S. E., Ekker, S. C. Lessons from morpholino-based screening in zebrafish. Briefings in Functional Genomics. , (2011).
  55. Robu, M. E., et al. p53 activation by knockdown technologies. PLoS Genetics. , (2007).
  56. Hisano, Y., et al. Precise in-frame integration of exogenous DNA mediated by CRISPR/Cas9 system in zebrafish. Scientific reports. 5, 8841 (2015).
  57. Prykhozhij, S., et al. Optimized knock-in of point mutations in zebrafish using CRISPR/Cas9. Nucleic Acids Res. 46 (17), (2018).
  58. Tessadori, F., et al. Effective CRISPR/Cas9-based nucleotide editing in zebrafish to model human genetic cardiovascular disorders. Disease Model Mechanisms. 11 (10), (2018).
  59. Armstrong, G., Liao, M., You, Z., Lissouba, A., Chen, B., Drapeau, P. Homology Directed Knockin of Point Mutations in the Zebrafish tardbp and fus Genes in ALS Using the CRISPR/Cas9 System. PLoS ONE. 11 (3), (2016).
  60. Friedrich, R. W., Jacobson, G. A., Zhu, P. Circuit Neuroscience in Zebrafish. Current Biology. 20 (8), (2010).
  61. Friedrich, R. W., Genoud, C., Wanner, A. A. Analyzing the structure and function of neuronal circuits in zebrafish. Frontiers in Neural Circuits. 7, (2013).
  62. Scott, E. K., et al. Targeting neural circuitry in zebrafish using GAL4 enhancer trapping. Nature Methods. 4 (4), 323-326 (2007).
  63. Asakawa, K., Kawakami, K. Targeted gene expression by the Gal4-UAS system in zebrafish. Development Growth and Differentiation. , (2008).
  64. Lloyd, E., et al. Evolutionary shift towards lateral line dependent prey capture behavior in the blind Mexican cavefish. Developmental Biology. , (2018).

Tags

Cave FishAstyanax MexicanusGene Function ManipulationMorpholinoCRISPRTol2 TransposaseGenetic ToolsDevelopmental BiologyModel Organism

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Stahl, B. A., Jaggard, J. B., Chin, J. S., Kowalko, J. E., Keene, A. C., Duboué, E. R. Manipulation of Gene Function in Mexican Cavefish. J. Vis. Exp. (146), e59093, doi:10.3791/59093 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image