Vi beskriver metoder for manipulering av gener i den evolusjonære modellsystem Astyanax mexicanus. Tre ulike teknikker er beskrevet: Tol2-mediert transgenesis, målrettet manipulering av genomet bruker CRISPR/Cas9 og knockdown uttrykk ved hjelp av morpholinos. Disse verktøyene skal lette direkte etterforskning av gener underliggende variasjon mellom overflaten og hulen boligen skjemaer.
Hulen dyr gir et spennende system for gransker evolusjonære mekanismer og genetisk baser underliggende endringer i mange komplekse egenskaper, inkludert øye degenerasjon, albinisme, sove tap, hyperphagia og sensorisk prosessering. Arter av cavefish fra hele verden vise en konvergent evolusjon av morfologiske og atferdsmessige egenskaper på grunn av delt miljøbelastningene mellom forskjellige hule systemene. Mangfoldig hule arter har blitt studert i laboratoriet innstillingen. Den meksikanske tetra, Astyanax mexicanus, med seende og blind skjemaer har unik innsikt i biologiske og molekylære prosesser underliggende utviklingen av komplekse trekk og er godt klar som en ny modell. Mens kandidat gener regulere utviklingen av ulike biologiske prosesser er blitt identifisert i A. mexicanus, er muligheten til å validere en rolle for enkelte gener begrenset. Programmet transgenesis og gen-redigering teknologi har potensialet å overvinne denne betydelig hinder og undersøke mekanismene bak utviklingen av komplekse trekk. Her beskriver vi en annen metode for å manipulere genuttrykk i A. mexicanus. Metoder omfatter bruk av morpholinos, Tol2 transgenesis, og gen-redigering systemer, vanligvis brukes i sebrafisk og andre fisk modeller, manipulere gen funksjon i A. mexicanus. Disse protokollene inneholder detaljerte beskrivelser av tidsbestemte avl prosedyrer, innsamling av befruktet egg, injeksjoner og valg av genmodifiserte dyr. Disse metodologiske tilnærmingsmåter vil tillate etterforskningen av genetiske og nevrale mekanismene bak utviklingen av forskjellige trekk i A. mexicanus.
Siden Darwins Origin of Species1fått forskere betydelig innsikt i hvordan trekk er formet evolusjonært svar på definerte miljøeffekter og økologiske press, takket være hule organismer2. Den meksikanske tetra, A. mexicanus, består av eyed forfedrenes ‘overflate’ populasjoner som bor elver i Mexico og sørlige Texas og minst 29 geografisk isolert bestander av avledede hule morphs bor Sierra del Abra og andre deler av nordøst Mexico3. En rekke hule-tilknyttede egenskaper har blitt identifisert i A. mexicanus, inkludert endrede oksygenforbruk, depigmentering, tap av øyne, og endret fôring og beite atferd4,5,6, 7,8,9. A. mexicanus presenterer en kraftig modell for å undersøke mekanismer for konvergent evolusjon en veldefinert evolusjonær historie, en detaljert karakterisering av økologiske miljøet og tilstedeværelsen av uavhengig utviklet seg hulen bestander10,11. Mange av de avledede hule egenskapene som finnes i cavefish, inkludert øye tap, sove tap, økt fôring, tap av skolegang, redusert aggresjon, og redusert stressresponser, har utviklet seg flere ganger gjennom uavhengige opprinnelse, ofte utnytte ulike genetisk veier mellom grotter8,12,13,14,15. Dette gjentas evolusjon er en kraftig del av A. mexicanus og kan gi innsikt i spørsmålet om hvordan genetiske systemer mer generelle kan være opprørt generere lignende fenotyper.
Mens anvendelsen av genetisk teknologi for mekanistisk etterforskningen av gen funksjon har blitt begrenset mange fiskearter (inkludert A. mexicanus), gir nylige fremskritt innen sebrafisk grunnlag for genetisk teknologiutvikling i fisk 16,17,18,19,20. Mange verktøy er mye brukt i sebrafisk for å manipulere genekspresjon, og gjennomføringen av disse prosedyrene har lenge blitt standardisert. For eksempel injeksjon av morpholino oligos (MOs) på encellede scenen selektivt blokkerer RNA og hindrer oversettelse for et kort timelige vindu under utvikling21,22. I tillegg gen-redigering tilnærminger, slik som clustered regelmessig interspaced kort palindromic gjentar (CRISPR) / CRISPR-assosiert protein 9 (Cas9) og transkripsjon aktivator som effektor nuclease (TALEN), tillater generering av definerte slettinger eller, i noen tilfeller, innsettinger gjennom en rekombinasjon i genomer19,20,23,24. Transgenesis brukes til å manipulere stabil genuttrykk eller funksjonen på en celle-type bestemt måte. Tol2 systemet brukes effektivt til å generere transgene dyr ved coinjecting transposase mRNA med en Tol2 DNA plasmider inneholder en transgene25,26. Tol2 systemet benytter Tol2 transposase av medaka å generere stabil germline innsettinger av transgene construct17. Genererer Tol2 transgenics innebærer coinjecting en plasmider inneholder en transgene flankert av Tol2 integrasjon områder og mRNA for Tol2 transposase17. Dette systemet har blitt brukt til å generere en rekke transgene linjer i sebrafisk og bruken har nylig utvidet til flere emergent modellsystemer, inkludert ciklider, killifish, Stingsild, og, mer nylig, den meksikanske cavefish27, 28,29,30.
Cavefish er et fascinerende biologiske system for Klargjørende mekanismer av egenskap evolusjon, har sin fulle kapasitet som en evolusjonær modell ikke blitt fullt utnyttet. Dette er delvis på grunn av en manglende evne til å manipulere genetiske og cellular fungere direkte31. Kandidat gener regulere komplekse egenskaper har blitt identifisert ved hjelp av kvantitative egenskap loci (QTL) studier, men validering av disse kandidat gener er vanskelig32,33,34. Nylig forbigående knockdown bruker morpholinos, gene redigering med CRISPR og TALEN, og bruk av Tol2-mediert transgenesis har blitt brukt til å undersøke genetisk grunnlag underliggende flere trekk35,36,37 ,38. Implementering og standardisering av disse teknikkene gjør manipulasjoner som forhøre molekylære og nevrale grunnlaget for biologiske egenskaper, inkludert manipulering av gen funksjon, merkingen av definerte celle populasjoner, og uttrykket av funksjonelle journalister. Mens den vellykkede implementeringen av disse genetiske verktøy for å manipulere genet eller cellulære funksjoner har blitt vist i emergent modellsystemer, er detaljert protokoller fortsatt mangler i A. mexicanus.
A. mexicanus gi viktig innsikt i mekanismer for utviklingen som svar på en endring miljøet og presentere mulighet til å identifisere romanen gener som regulerer ulike egenskaper. En rekke faktorer tyder på at A. mexicanus er en ekstremt tett modell for søker etablerte genomisk verktøy tilgjengelig i etablerte genetisk modeller, inkluderer evnen å lett vedlikeholde fisk i laboratorier, stor Foreldreomsorg og yngelens størrelse, åpenhet, sekvensert genomet og definerte opptreden analyser39. Her beskriver vi en metode for bruk av morpholinos, transgenesis og gene redigere overflaten og hule bestander av A. mexicanus. Bredere anvendelse av disse verktøyene i A. mexicanus vil tillate en mekanistisk undersøkelse molekylære prosesser underliggende utviklingen av utviklingsmessige, fysiologiske og behavioral forskjellene mellom cavefish og overflate fisk.
Her gitt vi en metode for å manipulere gen funksjon morpholinos, CRISPR/Cas9 gene redigering og transgenesis metodikk. Vell av genetisk teknologi og optimalisering av disse systemene i sebrafisk vil trolig tillate overføring av disse verktøyene i A. mexicanus med letthet52. Nyere funn har brukt disse metodene i A. mexicanus, men de forblir underutilized etterforskningen av ulike morfologiske, utviklingsmessige og atferdsmessige egenskaper i dette systemet30</…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker Sunishka Thakur for henne hjelp i genotyperingteknologi og tenkelig oca2 mutant fisken avbildet i figur 2. Dette arbeidet ble støttet av National Science Foundation (NSF) prisen 1656574 til A.C.K., NSF award 1754321 JK og A.C.K., og National Institutes of Health (NIH) award R21NS105071 A.C.K. og E.R.D.
Fish breeding & egg supplies | |||
Fine mesh fish net | Penn Plax | BN4 | |
Fish tank heater | Aqueon | 100106108 | |
Egg traps | Custom made | NA | Design and create plastic grate to place at bottom of tank to protect eggs |
Glass pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20C | |
Pipette bulbs | Fisher Scientific | 03-448-21 | |
Agarose | Fisher Scientific | BP160-500 | |
Egg molds | Adaptive Science Tools | TU-1 | |
Morpholino supplies | |||
Control Morpholino | Gene Tools, LLC | Standard control olio | |
Custom Morpholino | Gene Tools, LLC | NA | |
Phenol Red | Sigma Aldrich | P0290-100ML | |
CRISPR supplies | |||
Cas9 Plasmid | AddGene | 46757 | |
GoTaq DNA Polymerase | Promega | M3001 | |
KOD Hot Start Taq | EMD Millipore | 71-842-3 | |
Primers | Integrated DNA Technologies | Custom | |
T7 Megascript Kit | Ambion/Thermofisher | AM1333 | |
miRNeasy Kit | Qiagen | 217004 | |
mMessage mMachine T3 kit | Ambion/Thermofisher | AM1348 | |
MinElute Kit | Qiagen | 28204 | |
Tol2 transgenesis supplies | |||
pCS-zT2TP plasmid | Kawakami et al., 2004 | Request from senior author | |
CutSmart Buffer | New England Biolabs | B7204 | |
NotI-HF Restriction Enzyme | New England Biolabs | R3189 | |
PCR purification Kit | Qiagen | 28104 | |
SP6 mMessenger Kit | Ambion/Thermofisher | AM1340 | |
Microinjection supplies | |||
Glass Capillary Tubes | Sutter Instruments | BF100-58-10 | |
Pipette puller | Sutter Instruments | P-97 | |
Picoinjector | Warner Instruments | PLI-100A | |
Micromanipulator | World Precision Instruments | M3301R | |
Micromanipulator Stand | World Precision Instruments | M10 | |
Micmanipulator Base | World Precision Instruments | Steel Plate Base, 10 lbs |