Summary
Bu iletişim kuralı Contegra molekülleri çeşitli biyolojik etkinlikler ile absorbe için bir "canlı" nanobiotechnological araç olarak bakteriyel sporlar kullanımı üzerinde duruluyor. Adsorpsiyon verimini ölçmek için yöntemleri de gösterilir.
Abstract
Bakteri spor koruyucu Katmanlar susuz bir sitoplazma çevreleyen bir dizi tarafından kurulan metabolik olarak sakin bir hücredir. Bu kendine özgü yapısı son derece sağlam ve dayanıklı spor yapar ve spor kullanım Contegra molekülleri görüntülemek için bir platform olarak önerdi. Şimdiye kadar çeşitli antijenleri ve enzimler görüntülenen sporlar Bacillus subtilis ve birkaç diğer türler üzerinde başlangıçta rekombinant bir yaklaşım tarafından ve daha sonra basit ve etkili bir nonrecombinant yöntemi tarafından. Nonrecombinant görüntüleme sistemi doğrudan adsorpsiyon rekombinant suşları inşaat ve çevre genetiği değiştirilmiş bakteri sürümü kaçınarak spore yüzeyi Contegra moleküllerin temel alır. Adsorbe molekülleri stabilize ve sınırlarını antijenleri hızlı yıkımı ve olumsuz koşullar, enzim aktivitesinin kaybı sporlar, etkileşim tarafından korunmaktadır. Bir kez kullanılan, spor adsorbe enzimler kolayca etkinliği en az bir azalma ile toplanan ve ek tepki tur için yeniden kullanılabilir. Bu yazıda modeli molekülleri saf sporlar B. subtilisiçin absorbe, adsorpsiyon verimliliğini değerlendirmek ve onları yeni reaksiyonlar için geri dönüşüm için kullanılan sporlar toplamak gösterilir.
Introduction
Görüntü sistemleri biyolojik olarak aktif molekülleri mikroorganizmaların yüzeyinde sunulması ve alanları, sanayi sağlık ve Çevre Biyoteknoloji için çeşitli uygulamalar bulma hedefleniyor. Phages1,2 ve çeşitli Ayagin Gram-negatif - pozitif türler ve3,4,5,6,7, hücrelerin yanı sıra bakteriyel sporlar de olmuştur görüntü sistemleri iki yaklaşım8,9tarafından önerilen.
Kendine özgü yapısını, yani koruyucu Katmanlar10, bir dizi tarafından çevrili bir susuz sitoplazma nedeniyle spor fajının ve hücre tabanlı görüntü sistemleri8,9çeşitli avantajlar sağlar. İlk bir avantaj aşırı sağlamlık ve tüm diğer hücreleri10,11için zararlı olacağını koşulları, sporlar kararlılığını gelir. Spore görüntülenen antijenleri ve enzimler sonra depolama oda sıcaklığında12 uzun süreli ve düşük pH ve yüksek sıcaklıklara13düşüş korunuyorsunuz stabildir. İkinci avantajı sporlar spor oluşturan birçok türün güvenliğidir. B. subtilis, d. clausii, d. coagulansve birkaç diğer türler probiyotikler olarak dünya çapında kullanılan ve onlarca yıl14,15insan ya da hayvan kullanılmak için piyasada olmuştur. Bu olağanüstü güvenlik sicili bir yüzey görüntüleme sistemi için açık bir genel gereksinimi ve sistem insan ya da hayvan kullanım16için amaçlanan belirli alaka. Bir üçüncü önemli bir spor tabanlı görüntü sistemi maruz vardır molekülün boyutu sınırlamaları yok avantajdır. Feyc tabanlı sistemlerde, bir büyük Contegra protein yapısı etkileyebilir kapsid, hücre tabanlı sistemlerde ise, bu membran yapısı etkileyebilir veya limit/membran translocation adım17bozabilen. Spore çevreleyen koruyucu Katmanlar 70'den fazla farklı proteinler10 / oluşmaktadır ve herhangi bir belirgin yapısal kusur veya fonksiyonel bozukluğu8olmadan büyük yabancı proteinler kabul verecek kadar esnektir. Buna ek olarak, her iki spor tabanlı görüntü sistemleri, membran translocation kapaklı protein değil gerekli8,9' dur. Nitekim, kapaklı proteinler ya anne hücre sitoplazma içinde üretilen ve aynı sitoplazma oluşuyor veya olgun spor8,9tarihinde adsorbe spore monte.
Spore görüntü başlangıçta spore yüzey18mühendisi genetik bir sistem geliştirerek elde edildi. Bu genetik sistem üzerinde dayalı) bir gen füzyon gen (bir taşıyıcı olarak kullanılan) bir spor ceket protein desteği ve gen olmak için protein arasındaki inşaat görüntülenen - transkripsiyon ve çevirim sinyalleri endojen varlığı Gen füzyon ve II ifadesi kontrol) genetik istikrar vermek için B. subtilis kromozom üzerinde chimeric gen entegrasyonu. Çeşitli spor yüzey proteinleri kullanarak taşıyıcıları ve çeşitli olası uygulamaları hedefleyen, Mukozal aşı değişen biocatalyst, Biyoalgılayıcı, Biyoremidasyon, rekombinant bu yaklaşım tarafından görüntülenen çeşitli antijenleri ve enzimler veya bioanalytical aracı8,13.
Daha yakın zamanlarda, farklı bir yaklaşım spor ekranının gelişmiş19olmuştur. Bu ikinci sistem nonrecombinant ve spontan ve son derece sıkı adsorpsiyon spore yüzey9moleküllerin dayanmaktadır. Antijenleri19,20 ve enzimler13,21 verimli bir şekilde görüntülenen ve bu yöntem rekombinant bir daha önemli ölçüde daha etkili olduğunu ortaya koymuştur. Nonrecombinant bu yaklaşım içinde yerel form20 protein görüntülenmesine izin verir ve ayrıca autoclaved ile kullanılabilir, ölüm19sporlar. Adsorpsiyon moleküler mekanizması tam olarak henüz açıklık olmuştur değil. Negatif yük ve spor hydrophobicity ilgili özellikler olarak adsorpsiyon13,19,22için önerilmiştir. Son zamanlarda, bir modeli protein, spore için adsorbe zaman mercan Discosoma, kırmızı autofluorescent protein (mRFP) iç kat23' yerelleştirme yüzey katmanı üzerinden sızmayı başardı gösterilmiştir. Diğer proteinler için gerçek olduğunu kanıtladı, kapaklı proteinlerin iç yerelleştirme sporlar23adsorbe zaman onların artan istikrar açıklar.
Son bir çalışmada, iki enzim xylan bozulması yolun iki ardışık adımlar katalizlerler B. subtilis sporlar üzerinde bağımsız olarak sergilendi ve birlikte, inkübe zaman her iki bozulması adımları21gerçekleştirmek başardık. Reaksiyon sonra hala aktif ve güçlü-e doğru taze substrat21eklenmesi üzerine xylan bozulma devam sporlar toplanan. Nihai ürünün yaklaşık % 15 kaybı ikinci reaksiyon21' gözlendi, adsorbe enzimler tek yanı sıra çok adımlı, tepkiler kullanılırlığı spore görüntüleme sistemi önemli bir avantajı olsa bile.
Pan ve ark.24 bildirdi Contegra proteinler spore yüzeyinde görüntülemek için ek bir yaklaşım: Anne hücrede sporulation sırasında üretilen Contegra proteinler (bir endoglucanase protein ve bir beta-galaktozidaz biri) idi kendiliğinden şekillendirme spor ceket, bir taşıyıcı, gerek kalmadan kaplı. Bu ek spore görüntüleme sistemi defa açıklanan iki yaklaşım bir kombinasyonudur. Nitekim, rekombinant Contegra proteinler onların derleme ceket içinde spontan iken anne hücrede sporulation sırasında ifade için tasarlanmış bu yana ve bu nedenle, nonrecombinant24. Ancak, bu ek yaklaşım görüntüsünü verimliliğini test ve aynı Contegra proteinler kullanarak diğer iki yaklaşımlar ile karşılaştırıldığında kalır.
Spore üretim süreçlerinin mevcut Protokolü dışlar ve olmuştur arıtma kapsamlı bir şekilde başka bir24bölümünde. Adsorpsiyon tepki, adsorpsiyon dot Blot ve floresan mikroskopisi tarafından verimliliğini değerlendirme içerir ve adsorbe enzimler ek tepki için geri dönüşüm yuvarlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. adsorpsiyon tepki
- 2, 5 ve mRFP 10 µg 2 x 109 / B. subtilis vahşi tipi arıtılmış sporlar tampon, 50 mM sodyum sitrat, pH 4.0 (16,7 mM sodyum sitrat dihydrate; 33,3 mM sitrik asit) 1 h için 25 ° c üzerinde sallanan bir shaker (şekil 1) bağlama 200 µL ile kuluçkaya .
- Bağlama karışımları (13.000 x g 10 dk) santrifüj kapasitesi granül (P2, P5 ve P10) ve supernatants (S2, S5 ve S10) fractionate. 3.2. adımda anlatılan adsorpsiyon verimini dolaylı değerlendirilmesi için supernatants saklayın.
- Granül 2 yıkama x 200 µL tampon ve onlara bağlama 100 µL tampon ve sonraki analiz için kullanın resuspend bağlama ile.
Not: Bağlama tepki tercihen bir pH değeri düşük protein isoelectric noktaya oluşur; genellikle, 1.5 M fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS), pH 4.0 veya 50 mM sodyum sitrat, pH 4.0, kullanılır.
2. doğrudan adsorpsiyon etkinliğinin değerlendirilmesi
-
Ayıklama yüzey proteinleri ve western blot analizi
- MRFP adsorbe sporlar resuspension (P2, P5 ve P10 adım 1.3) 50 µL alıp 2 Sodyum Lauryl Sülfat (SDS) x 50 µL ekleyin-dithiothreitol (DTT) (0,1 M Tris-HCl, pH 6.8; % 2 SDS; 0,1 M DTT) yüzey spore proteinler solubilize için.
- Ücretsiz, saf mRFP ve özleri protein için pozitif ve negatif denetimleri sırasıyla adsorbe değil sporlar aynı miktarda kullanın.
- Karışımlar (13.000 x g 10 dk), kuluçka 65 ° C'de 45 dk sonra santrifüj kapasitesi ve proteinlerin ayıklanan (süpernatant) western blot tarafından monoklonal ile 10 µL Anti-O'nun antikor onun tanıma çözümlemek etiket mRFP ( N-terminal mevcut Şekil 2A).
-
Floresan mikroskopi gözlemler
Not: floresan Contegra proteinler kullanarak veya bir ayirt çözümlemesini yerelleştirilmesine ve adsorbed moleküller tarafından Floresans mikroskobu ölçmek mümkün.- Adsorbed sporlar resuspension adım 1.3 5 µL alıp ~ 1 x 106 sporlar/µL elde etmek için 1 x PBS, pH 4.0, 95 µL ekleyin.
- Süspansiyon bir mikroskop slaytta yer 5 µL kapak ile daha önce Poli-l-lizin 30 ile tedavi coverslip s ve floresan mikroskop altında gözlemlemek.
- Her alan için faz kontrast mikroskobu görüntü ve floresan mikroskobu Image (Resim 2B) kaydedin.
Not: Alternatif olarak, floresan sporlar cytofluorimetry tarafından analiz edilebilir. Toplam 106 sporlar adsorbe ya da değil-1 mL 1 x PBS, pH 4.0, kapaklı protein ile adsorbe ve Akış Sitometresi (Şekil 2C) kullanarak süspansiyon analiz resuspend.
-
ImageJ kullanarak veri analizi
- ImageJ yazılım (http://rsbweb.nih.gov/ij/) ve tüm görüntüleri 8-bit biçiminde olduğundan emin olmak için onay Floresans mikroskobu görüntüleri açın (görüntü | Türü | 8-bit).
- Karşıtlığı ayarlayın (görüntü | Ayarlamak | Parlaklık Kontrast) ve görüntü ölçeğini PİKSEL olduğundan emin olun (görüntü | Ayarla ölçek).
- Analiz menüsünden ölçümleri kümesiniseçin. Alanı, Entegre yoğunlukve Demek gri değeri seçili olduğundan emin olun.
- Çizim/seçim araçlarından birini kullanarak ilgi spor etrafında bir çizgi çizin (yani, daire, çokgen, ya da serbest form) (şekil 3).
- Ölçü birimi Çözümle menüsünden seçin (veya cmd + Mvurmak). Bir pop-up kutusu ilk bu spor için değerler bir deste ile (şekil 3) görüntülenir.
- Ölçülecek seçilen görüş alanı içinde en az 50 diğer sporlar için bu iki adımı yineleyin.
- (Yani hiçbir Floresans var) herhangi bir sporlar olmadan birden fazla bölge seçin ve ölçüm tekrarlayın; Bu arka plan olacak.
Not: Boyutu önemli değildir. Bu ilgili arka plan Floresans değerleri el ile arka plan çıkarmak için kullanılır. - Tüm verileri sonuçları penceresinde seçin ve sonuçları bir elektronik tabloya kopyalayın.
- Entegre yoğunluk ve alan seçili sporlar ve arka plan Floresans değerlerinin ortalamasını hesaplamak ve bunları formülü kullanarak düzeltilmiş hücre başına toplam floresan (CTCF) elde etmek için kullanın: CTCF = ortalama tümleşik Yoğunluğu - (ortalama alan ortalama arka plan floresan x).
Not: Tüm sporlar de ayrılmış görünüyorsa, alternatif olarak, bu Parçacıklar analizImageJ'ın öğretim takip, işlevini kullanarak görüntü alanının tüm sporlar analiz etmek mümkündür. Yazılım belirli bir floresan veya spor toplamları okur önlemek için parçacıklar boyut pixelˆ2 ayarlanması gerekiyor = 50-200 (şekil 4).
3. dolaylı adsorpsiyon etkinliğinin değerlendirilmesi
- Seri dilutions saf protein için hazırlayın.
- 0,5 ng/µL bağlama arabellek kullanarak, son bir konsantrasyon, saf mRFP 250 µL içeren ilk 1.5 mL tüp hazırlayın. Bu birimin iki şeritli yüklemek yeterlidir.
- Bağlama arabellek kullanarak altı iki kat seri dilutions 250 µL (son hacim) her, ile gerçekleştirin.
- İki kat seri dilutions adsorpsiyon tepki (S2, S5 ve S10 adım 1.2) ilişkisiz mRFP kısmını içeren süpernatant örnekleri için hazırlayın.
- Bir 1,5 mL tüp içinde her süpernatant 100 µL koyun ve bağlama arabellek 100 µL ekleyin. Bağlama arabellek kullanarak altı iki kat seri dilutions 200 µL (son hacim) her, ile gerçekleştirin.
- Bir nitroselüloz membran (0,45 µm kesim), 9 cm x 10 cm boyutunda, 5 (örnekleri sayısı) x 6 (dilutions sayısı) nokta alanı kapsayacak şekilde kesin. Membran nokta leke aparatı conta kenar genişletmeniz değil.
- Prewet membran nokta leke cihaz yerleştirin. Membran ve conta arasında sıkışıp herhangi bir hava kabarcıkları kaldırın. Cihazları hava bu kuyu taşınmasını engelleme için teyp veya parafin film ile kullanılmayan kısmı kapsar.
- Üretici tarafından açıklandığı gibi nokta leke aparatı monte.
- Bir vakum montaj sırasında kullanılıyorsa, membran ile antijen Tekdüzen bağlantısını sağlamak ve haleler ya da zayıf algılama sinyali engellemek için 1 x PBS iyi başına 100 µL suyla temasa.
- Yavaşça arabellek vakum tarafından kuyulardan çıkarın. En kısa zamanda bütün kuyulardan arabellek çözüm akmak, vakum pompası durdurmak ve bu kesin.
- İki en dış şeritli standart ve orta (şekil 5) örnekleri yükleyin. Uygun kuyu her seyreltme 100 µL ile doldurun. Her şey için kullanılan aynı birimin tüm örnek Wells homojen bir filtreleme sağlamalıdır.
- Vakum pompası 2 min için açmak, kes şunu ve daha sonra membran yerçekimi akış tarafından filtre uygulamak örnek.
- Bütün wells 1 x PBS ve vakum pompası için başka bir 5 dk sonra çamaşır arabellek çalıştırmak tamamen cihaz süzülmüş izin 100 µL ile yıkayın.
- Vakum üzerinde sabitleyen vidayı gevşetin ve dikkatle nokta leke cihazı açın.
- Vakum açmak, membran almak ve western blot protokol sonrası işleme.
- ImageJ gibi uygun yazılımı kullanarak filtre densitometric bir çözümlemesi gerçekleştirin.
- Her noktanın entegre yoğunluk onları aynı bölgede bir daire ile özetleyen ve Analiz/ölçü komutunu kullanarak ölçer.
- Bir daire içinde boş bir alanı çizim ve entegre yoğunluğu ölçme veya İşlem/çıkarma arka plan komutunu kullanarak görüntünün arka plan düzeltme yapmak.
- Standart nokta entegre yoğunluk dolu protein miktarı ile ilişkilendirmek ve Kalibrasyon hattı (R2 değerleri eğrileri 0,95 üzerinde olmalıdır kalibrasyon için) elde edilir.
- Kalibrasyon eğrisi her örnek noktanın mRFP konsantrasyonu ulaşmak için kullanın.
- İlişkisiz kesirler kalan mRFP konsantrasyonu hesaplayın.
Not: doğru kapanış nokta leke cihazları ve bu nedenle, konu için emin olmak için membran için Tekdüzen bir basınç çapraz çapraz bir düzeni izleyerek vidaları sıkın ve, daha güçlü vidaları sıkın vakum pompası açın.
4. spore koleksiyonu ve yeniden kullanma
- Adsorbed spor geri dönüşüm için saflaştırılmış GH10-XA xylanase 10 µg veya adımları 1.1-1.3 (şekil 6A) açıklandığı gibi saf GH3-XT β-xylosidase, 10 µg 2.0 x 10 saf9 sporlar iki adsorpsiyon reaksiyon gerçekleştirin.
- Enzim adsorbe sporları içeren parçaları toplamak, onları 50 µL (50 mM sodyum fosfat tampon pH 6,5; 2.48689 g/L Na2HPO4, 4.88991 g/L NaH2PO4), enzimatik reaksiyon tahlil için en uygun önbellek resuspend ve bunları birlikte GH10-XA veya GH3-XT adsorbing sporlar 100 µL karışımı elde etmek için karıştırın.
- Belgili tanımlık substrate (5 mg/mL 4-O-methyl-d-glucuronod-xylan [MGX]) ekleyin ve izin için 16 h 65 ° C'de gerçekleşecek enzim reaksiyonları
- Reaksiyon karışımı (için 13.000 x gde 15 dk) santrifüj kapasitesi ve enzim reaksiyon ürünü içeren süpernatant saklayın.
- Pelet 100 µL taze 50 mM sodyum fosfat tampon pH 6,5 yeni substrat (MGX) (şekil 6B) huzurunda resuspend.
Not: birden fazla enzim absorbe için o olanaklı-e doğru her ikisi birlikte absorbe veya tek tek bağımsız olarak. İkinci olasılık adsorpsiyon verimlilik ve stokiometrik bir reaksiyon için gerekli her enzim dengesini sağlayan her enzim aktivitesinin kantitatif analiz kolaylaştırır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Başarılı adsorpsiyon western Blot tarafından tespit edilebilir. Tepki üzerine karışımı Santrifüjü tarafından şeker ve yıkanmış ve Pelet kesir (şekil 1) yüzey proteinleri ayıklamak için kullanılır. Özü şeker SDS polyacrylamide Jel Elektroforez (sayfa), polivinilidin florid (PVDF) membran için electrotransferred tarafından ve birincil ve ikincil antikorlar karşı tepki gösterdi. Sadece adsorbed sporlar, özü ile yüklenen şeritte beklenen boyutu proteinlerin varlığı bir başarılı adsorpsiyon reaksiyon (Şekil 2A) göstergesidir.
Adsorpsiyon tepki verimliliğini doğrudan ve dolaylı yöntemler tarafından değerlendirilebilir. Adsorpsiyon verimini doğrudan değerlendirilmesi kullanılmıştır ve floresan mikroskobu (Şekil 2B) ve cytofluorimetry (Şekil 2C) Pelet kesir Tarih tarafından gerçekleştirilen Contegra protein bağlıdır adsorpsiyon tepki ayırma sonra. Bir miktar sporlar üzerinde mevcut floresan sinyallerin ImageJ yazılımı (şekil 3 ve şekil 4) kullanılarak gerçekleştirilebilir. Adsorpsiyon verimliliği dolaylı bir analizini ilişkisiz protein (şekil 1) içeren süpernatant kesir (şekil 5A) analizini kurutma bir nokta tarafından gerçekleştirilebilir. İlişkisiz protein (şekil 5B) densitometric bir analiz sonra bilim adamları dolaylı olarak sporlar üzerinde adsorbe protein miktarı hesaplamak izin verir.
İki ardışık reaksiyonlar ya da biri iki belirli enzimler (şekil 6A) görüntüleme sporlar karışımı ile katalize. Adsorbed enzyme(s) yıkanmış ve yeni tepki çevriminde (şekil 6B) ile taze substrat inkübe bir basit Santrifüjü adım ile toplanabilir.
Resim 1:adsorpsiyon denemenin genel düzeni. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : Doğrudan mRFP ekran verimliliği analizi. (A)Western blot mRFP özgü antikor ile. C + ücretsiz arıtılmış mRFP; = C - sporlar için protein adsorbe değil protein ayıklamak =; P2/P5/P10 = 2, 5 ve 10 mg mRFP, sırasıyla adsorbe B. subtilis sporlar çıkarılan proteinler. (B) adsorbe sporlar ayirt mikroskobu. İmmunoreactions ile adsorbed protein tanıma bir birincil antikor ve floresein isothiocyanate (FITC) ile Birleşik bir floresan ikincil antikor ile yapıldı. Sol panelde kırmızı iç mRFP floresan doğru kapı aynası ikincil antikor FITC Birleşik yeşil Floresans gösterir. (C) akış sitometrik analizinde adsorbe sporlar. Sporlar FITC Birleşik ikincil antikorlar ve mRFP özel antikorlar ile tepki gösterdi ve o zaman, cytofluorimetry tarafından analiz edildi. Analiz tüm spor nüfus (10,000 olayları, ungated) gerçekleştirildi. Sol panelde değil adsorbe sporlar kırmızı siyah, mRFP adsorbe sporlar gösterilmektedir. Doğru kapı aynası ön ve yan dağılım (FSC-SSC) nokta çizim gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: Floresan sinyal ImageJ tarafından el ile miktar. Sporlar, ImageJ yazılımı ile analiz kırmızı floresan protein mRFP ile adsorbe bir Floresans mikroskobu görüntüsü. Sarı bir daire bir spor densitometric verileri (büyütülmüş görüntü) elde etmek için çizilmiştir. Açılan kutusu seçili spor densitometric incelemenin sonuçlarını gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: ImageJ floresan sinyaliyle eşzamanlı quantification. (A)açılan kutusu elde edilen Analiz parçacıkseçerken. 50-200 piksel aralığı değerini ^ 2 olan sporlar23için ayarlanacak. (B) bölümleme Parçacıklar analiz (solda) ve göreceli densitometric analiz sonuçları (sağda) kullandıktan sonra görüntünün şekil 3A . Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5: kurutma ve densitometric analiz nokta. (A)nokta ile yinelenen (Std1 ve Std2) ve süpernatant (S10, S5 ve S2) 10, 5 ve 2 µg mRFP, sırasıyla23ile gerçekleştirilen adsorpsiyon tepki saf mRFP seri dilutions kurutma. (B) nokta paneli A kurutma densitometric analizi için kullanılır. Daireler sinyallerin yoğunluğu quantitate için kullanılan alanını gösterir. Sağdaki panelde densitometric analizi ile elde edilen sonuçlar bir örnek raporlar. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 6: xylan tarafından yeniden kullanılabilir sporlar çevrimi. (A)genel düzeni xylan bozulması. Xylanase veya β-xylosidase enzimler, birlikte, karışık görüntüleniyor (B) sporlar xylan iki aşamalı bozulması katalizler. Reaksiyon sonra örnek Santrifüjü tarafından şeker. Pelet taze substrat ekleyerek yeniden kullanılabilir spore bağlı enzimler taşıdığı sürece süpernatant reaksiyon ürünü içerir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu spor adsorpsiyon çok basit ve kolay iletişim kuralıdır. Reaksiyon kesinlikle tepki tamponunun pH bağımlıdır ve adsorpsiyon verimini asidik pH değerlerinde (pH 5.0 veya daha düşük) en iyi yöntemdir. Nötr pH koşulları, adsorpsiyon verimliliği düşüktür ve alkali pH değerlerinde adsorpsiyon değil oluşabilir. En iyi adsorpsiyon 1,5 mL tüpler (veya benzer bir oranı tutmak) 200 µL hacmi üzerinde sallanan bir shaker kullanarak elde edilir.
Adsorpsiyon çok sıkı ve yıkar bir arabellek tepki arabellek aynı pH ile adsorbed proteinler, herhangi bir sürümünü neden olmaz. Yıkama ile alkali tampon a en az neden olabilir (genellikle az %1526) yayın adsorbed protein.
Dot Blot tarafından adsorpsiyon verimini dolaylı değerlendirilmesi güvenilir ise saflaştırılmış ve ilişkisiz protein birkaç dilutions analiz edilir ve densitometric analiz düzgün yapılır. Kapaklı proteinler bozulma kanıtı yok bildirilen25olmuştur. Adsorpsiyon verimini doğrudan değerlendirilmesi adsorbe protein üzerinde büyük ölçüde bağlıdır. Protein autofluorescent veya fluorescently etiketli, ImageJ destekli analiz kantitatif tayin Floresans ve floresan molekülleri miktarda sağlar spore üzerinde mevcut. Protein enzimatik aktivite varsa, belirli bir enzimatik tahlil sporlar üzerinde protein mevcut miktarda belirtisi sağlayabilir. Ancak, bu sporlar ile ilişkili enzimatik aktivite spor13ile etkileşim nedeniyle stabilizasyon etkisi artarak bilinmektedir. Adsorbed protein flüoresan değil ve enzimatik aktivite yok, adsorpsiyon verimini üzerindeki sert koşullar altında çıkarılan dot Blot tarafından değerlendirilebilir.
Kullanılan sporları topluluğu tarafından çok basit bir işlem yapılabilir. Bir çamaşır adım tepki arabelleği ile reaksiyon yan ürünleri, taze substrat yanı sıra yeni bir reaksiyon21başlatmak için gerekli olmakla birlikte kaldırmak önemli olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu eser "Finanziamento di Ricerca di Ateneo" L. Baccigalupi, proje başlığı için tarafından desteklenen "SP-LAY: bakteriyel sporlar proteinler görüntü için canlı platform olarak".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1% Poly-L-lysine solution | Sigma | P8920 | |
| 0.45 µm Nitrocellulose Blotting Membrane | Sartorius | M_Blotting_Membranes | |
| 100× objective UPlanF1 | Olympus | microscope equipment | |
| Bacillus subtilis strain NCIB3610 | Bacillus Genetic Stock Center | 3A1 | |
| BD ACCURI C6 PLUS | BD | flow cytometer | |
| BX51 | Olympus | Fluorescent microscope | |
| Clarity | Biorad | 1705060 | |
| DP70 digital camera a | Olympus | microscope equipment | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, FITC | Thermo fisher | F-2754 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) | Abcam | ab6721 | |
| Monoclonal Anti-polyHistidine−Peroxidase antibody | Sigma | A7058-1VL | used to detect adsorbed proteins presenting a 6xhistidine-tag at C- or N- terminal |
| SecureSlip glass coverslip | Sigma | S1815-1PAK | |
| Superwhite Uncharged Microscope Slides | VWR | 75836-190 | |
| U-CA Magnification Changer | Olympus | microscope equipment |
References
- Felici, F., et al. Peptide and protein display on the surface of filamentous bacteriophage. Biotechnology Annual Review. 1, 149-183 (1995).
- Cortese, R., et al. Identification of biologically active peptides using random libraries displayed on phage. Current Opinion in Biotechnology. 6, 73-80 (1995).
- Sousa, C., Cebolla, A., de Lorenzo, V. Enhanced metalloadsorption of bacterial cells displaying poly-His peptides. Nature Biotechnology. 14, 1017-1020 (1996).
- Richins, R., Kaneva, I., Mulchandani, A., Chen, W. Biodegradation of organophosphorus pesticides by surface-expressed organophosphorus hydrolase. Nature Biotechnology. 15, 984-987 (1997).
- Wu, J. Y., et al. Expression of immunogenic epitopes of hepatitis B surface antigen with hybrid flagellin proteins by a vaccine strain of Salmonella. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86, 4726-4730 (1989).
- Newton, S. M., Jacob, C. O., Stocker, B. A. Immune response to cholera toxin epitope inserted in Salmonella flagellin. Science. 244, 70-72 (1989).
- Fischetti, V. A., Medaglini, D., Pozzi, G. Gram-positive commensal bacteria for mucosal vaccine delivery. Current Opinion in Biotechnology. 7, 659-666 (1996).
- Isticato, R., Ricca, E.
- Ricca, E., et al. Mucosal vaccine delivery by non-recombinant spores of Bacillus subtilis. Microbial Cell Factories. 13, 115 (2014).
- McKenney, P. T., Driks, A., Eichenberger, P. The Bacillus subtilis assembly and functions of the multilayered coat. Nature Reviews Microbiology. 11, 33-44 (2013).
- Knecht, L. D., Pasini, P., Daunert, S. Bacterial spores as platforms for bioanalytical and biomedical applications. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 400, 977-989 (2011).
- Isticato, R., Cangiano, G., De Felice, M., Ricca, E. Display of molecules on the spore surface. Bacterial Spore Formers: Probiotics and Emerging Applications. Ricca, E., Henriques, A. O., Cutting, S. M. , Horizon Bionsciences. Norfolk, UK. 193-200 (2004).
- Sirec, T., et al. Adsorption of β-galactosidase of Alicyclobacillus acidocaldaricus wild type and mutant spores of Bacillus subtilis. Microbial Cell Factories. 11, 100 (2012).
- Cutting, S. M.
- Baccigalupi, L., Ricca, E., Ghelardi, E. Non-LAB Probiotics: Spore Formers. Probiotics and Prebiotics: Current Research and Future Trends. Venema, K., Do Carmo, A. P. , Caister Academic Press. 93-103 (2014).
- Cutting, S. M., Hong, H. A., Baccigalupi, L., Ricca, E. Oral Vaccine Delivery by Recombinant Spore Probiotics. International Reviews of Immunology. 28, 487-505 (2009).
- Lee, S. Y., Choi, J. H., Xu, Z.
- Isticato, R., et al. Surface display of recombinant proteins on Bacillus subtilis spores. Journal of Bacteriology. 183, 6294-6301 (2001).
- Huang, J. M., et al. Mucosal delivery of antigens using adsorption to bacterial spores. Vaccine. 28, 1021-1030 (2010).
- Isticato, R., et al. Non-recombinant display of the B subunit of the heat labile toxin of Escherichia coli wild type and mutant spores of Bacillus subtilis. Microbial Cell Factories. 12, 98 (2013).
- Mattossovich, R., et al. Conversion of xylan by recyclable spores of Bacillus subtilis thermophilic enzymes. Microbial Cell Factories. 16, 218 (2017).
- Pesce, G., et al. Surface charge and hydrodynamic coefficient measurements of Bacillus subtilis by optical tweezers. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 116, 568-575 (2014).
- Donadio, G., et al. Localization of a red fluorescence protein adsorbed on wild type and mutant spores of Bacillus subtilis. Microbial Cell Factories. 15, 153 (2016).
- Pan, J. G., Choi, S. K., Jung, H. C., Kim, E. J. Display of native proteins on Bacillus subtilis spores. FEMS Microbiology Letters. 358, 209-217 (2014).
- Cutting, S., Vander Horn, P. B. Genetic analysis. Molecular Biological Methods for Bacillus. Harwood, C., Cutting, S. , John Wiley & Sons. Chichester, UK. (1990).
- Lanzilli, M., et al. Display of the peroxiredoxin Bcp1 of Sulfolobus solfataricus probiotic spores of Bacillus megaterium. New Biotechnology. 46, 38 (2018).
