Summary
Этот протокол ориентирована на использование бактериальных спор как «живой» nanobiotechnological инструмент адсорбировать гетерологичных молекулы с различными биологической деятельности. Также приведены методы для измерения эффективности адсорбции.
Abstract
Бактериальная спора является ячейкой метаболически покоя, сформирован целый ряд защитных слоев, окружающих обезвоженной цитоплазмы. Это своеобразная структура делает споро чрезвычайно стабильные и устойчивые и предложил использование спор в качестве платформы для отображения гетерологичных молекул. До настоящего времени различные антигены и ферментов выставлялись на спор Bacillus subtilis и несколько других видов, первоначально рекомбинантных подход и, затем, простой и эффективный метод nonrecombinant. Nonrecombinant отображения система основана на прямой адсорбции гетерологичных молекул на поверхности споро, избегая строительство рекомбинантных штаммов и выпуска генетически модифицированных бактерий в окружающей среде. Адсорбированных молекул стабилизировалась и охраняются взаимодействия с спор, который ограничивает быстрой деградации антигены и потеря активности ферментов в неблагоприятных условиях. После использования, споро адсорбированные ферменты можно легко собраны с минимальным снижением активности и повторно использовать для дополнительных реакции раундов. В этом документе показано, как адсорбировать молекулы модель для очищенного спор B. subtilis, как оценивать эффективность адсорбции и как собрать используемые споры утилизировать их для новых реакций.
Introduction
Системы отображения направлены на представление биологически активных молекул на поверхности микроорганизмов и поиск приложений в различных областях, от промышленных до медицинских и экологических биотехнологий. В дополнение к бактериофаги1,2 и клетки различных грамотрицательных и - положительных видов3,4,5,6,7, также были бактериальных спор предложенный как систем отображения двух подходов8,9.
Из-за его своеобразная структура, а именно обезвоженной цитоплазмы, в окружении ряда защитных слоев10, споро обеспечивает несколько преимуществ перед8,на основе ФАГ - и клетки систем отображения9. Первое преимущество приходит от экстремальных надежности и стабильности спор на условиях, которые бы пагубным для всех других клеток10,11. Spore отображается антигены и ферментов являются стабильными, после длительного хранения при комнатной температуре12 и защищены от деградации при низких значениях рН и температура13. Второе преимущество спор является безопасность многих видов спорообразующих. B. subtilis, б. clausii, б. coagulansи несколько других видов используются во всем мире как пробиотики и были на рынке для человека или животных использования для десятилетий14,15. Эта запись исключительных безопасности является очевидное общее требование для поверхности дисплея системы и имеет особое значение, когда система предназначена для использования человеческого или животного16. Третий важным преимуществом системы на основе spore отображения является, что она не имеет ограничений на размер молекулы, которая подвергается. В системах на базе фага, большой гетерологичных белка может повлиять на структуру капсида, в то время как в системах на базе ячейки, это может повлиять на структуру мембраны или может лимит/повредить мембраны транслокации шаг17. Защитные слои, окружающих споро состоят из более чем 70 различных белков10 и являются достаточно гибкими для того, чтобы принять большие инородные белки без каких-либо очевидной структурных дефектов или функциональными нарушениями8. Кроме того с обеих систем отображения на основе spore, мембраны транслокации белка гетерологичных не требуется8,9. Действительно гетерологичных белки либо производятся в цитоплазме клеток матери и собрал на спор, который формируется в том же цитоплазме или адсорбируется на зрелых споро8,9.
Споро отображения изначально был получен путем генетической системы инженера споро поверхности18. Эта генетическая система была основана на я) строительство гена слияние между кодирование гена для ползучих пальто белок (используется в качестве носителя) и кодирование гена белка будет отображаться - наличие сигналов транскрипционный анализ и трансляционная эндогенных Джин будет контролировать выражение fusion и ii) интеграция химерных гена в хромосоме B. subtilis предоставлять генетической стабильности. Этот рекомбинантных подход, с помощью различных белков споро поверхности как перевозчиков и направленный на различных потенциальных приложений, начиная от слизистой вакцины глюкозоизомеразы, биосенсор, биовосстановления, были отображены различные антигены и ферментов или Биоаналитические инструмент8,13.
Совсем недавно другой подход споро дисплей был развитых19. Эта вторая система nonrecombinant и опирается на спонтанное и крайне жесткой адсорбции молекул на поверхности споро9. Антигены19,20 и ферменты13,21 эффективной отображаться и показали, что этот метод является значительно более эффективным, чем рекомбинантных. Такой nonrecombinant подход позволяет отображать белков в родной форме20 и может также использоваться с газобетона, смерть споры19. Молекулярный механизм адсорбции полностью еще не выяснены. Отрицательный заряд и гидрофобность спора были предложены как соответствующие свойства для адсорбции13,19,22. Недавно было показано, что модель белка, белка красный autofluorescent (mRFP) коралловых Discosoma, когда адсорбированные споро, смог проникнуть через поверхностные слои локализации в внутренний слой23. Если доказана верно для других белков, внутренней локализации гетерологичных белков может объяснить их повышение стабильности при адсорбированные споры23.
В недавнем исследовании двух ферментов, катализирующих два последовательных шагов по пути деградации xylan независимо были выставлены на спор B. subtilis и, когда инкубировали вместе, были в состоянии выполнять шаги как деградация21. Споры, собранные после реакции были все еще активен и способен продолжать xylan деградации при добавлении свежий субстрат21. Даже если потеря около 15% конечного продукта наблюдался в второй реакции21, многократного использования адсорбированных ферментов для одного, а нескольких шаг, реакций является дополнительное важное преимущество системы отображения споро.
24 Пан et al. сообщили дополнительные подход для отображения гетерологичных белков на поверхности споро: гетерологичных белков (эндоглюканаза белок и бета галактозидазы, один) производится в ячейке мать во время заспорение были спонтанно заключенная в формирование пальто споро, без необходимости перевозчика. Эта система отображения дополнительных spore является сочетание двух подходов, изложенных до настоящего времени. Действительно, это рекомбинантных, поскольку гетерологичных белки были инженерии выражаться в ячейке мать во время заспорение, в то время как их сборку в пальто было спонтанным и, следовательно, nonrecombinant24. Однако эффективность отображения этого дополнительного подхода остается быть проверены и по сравнению с другими двумя подходами, используя же гетерологичных белков.
Настоящий Протокол исключает споро производственные процессы и очистки, которые были описаны подробно в другом месте24. Она включает в себя адсорбции реакции, оценки эффективности адсорбции точка промокательной и Люминесцентная микроскопия, и рециркуляции адсорбированных ферментов для дополнительных реакции раундов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. адсорбция реакция
- Проинкубируйте 2, 5 и 10 мкг mRFP с 2 х 109 B. subtilis одичал тип очищенный спор в 200 мкл привязки буфера, цитрат натрия 50 мм, pH 4.0 (16,7 мм натрия цитрат дигидрат; лимонная кислота 33,3 мм) за 1 ч при 25 ° C на качалки шейкер (рис. 1) .
- Центрифуга привязки смеси (13 000 x g 10 мин) чтобы фракционировать окатышей (P2, P5 и P10) и supernatants (S2, S5 и S10). Храните supernatants для косвенной оценки эффективности адсорбции, описанный в шаге 3.2.
- Вымойте гранул 2 x с 200 мкл привязки буфер и Ресуспензируйте их в 100 мкл привязки буфер и использовать его для следующего анализа.
Примечание: Преференциально происходит реакция привязки в значение рН ниже, чем изоэлектрической точке белка; как правило, 1,5 М фосфат амортизированное saline (PBS), рН 4,0 или цитрат натрия 50 мм, pH 4.0, используются.
2. прямой оценки эффективности адсорбции
-
Удаление поверхностных белков и Западный анализ помаркой
- Возьмите 50 мкл ресуспендирования адсорбированные mRFP споры (P2, P5 и P10 шага 1.3) и добавьте 50 мкл 2 x додецилового сульфата натрия (SDS)-Дитиотреитол (DTT) (0,1 М трис-HCl, pH 6.8; 2% SDS; 0,1 М DTT) чтобы солюбилизировать протеины поверхности споро последнего.
- Используйте бесплатные, очищенный mRFP и экстракты же количество спор, которые являются не адсорбированного белка как позитивные и негативные элементы управления, соответственно.
- После 45 минут инкубации при температуре 65 ° C, центрифуги (13 000 x g 10 мин) смеси и анализировать 10 мкл извлечения белков (супернатант), Западная помарка с моноклональные антитела против его, признавая его Бирка присутствующая на N-терминала mRFP ( Рисунок 2A).
-
Люминесцентная микроскопия наблюдения
Примечание: С помощью флуоресцентных белков гетерологичных или выполнения анализа иммунофлюоресценции, можно локализовать и количественно адсорбированных молекул по микроскопии флуоресцирования.- Возьмите 5 мкл адсорбированных споры ресуспендирования из шага 1.3 и 95 мкл ПБС, рН 4,0, чтобы получить ~ 1 x 10-6 споры/мкл.
- Место 5 мкл суспензии на микроскопа, накройте его с coverslip, ранее получавших поли l Лизин для 30 сек и наблюдать под флуоресцентным микроскопом.
- Для каждого поля сохраните изображение фазово контрастной микроскопии и Люминесцентная микроскопия image (рис. 2B).
Примечание: в качестве альтернативы, флуоресцентный споры могут быть проанализированы по cytofluorimetry. Ресуспензируйте в общей сложности 106 споры адсорбированные или не адсорбируется с гетерологичных белка в 1 мл ПБС, рН 4.0 и анализировать подвеска с помощью проточный цитометр (рис. 2C).
-
Анализ данных с помощью ImageJ
- Откройте изображения микроскопии флуоресцирования с ImageJ программного обеспечения (http://rsbweb.nih.gov/ij/) и убедитесь, что все изображения находятся в 8-битном формате (изображения | Тип | 8-битный).
- При необходимости отрегулируйте контраст (изображения | Отрегулируйте | Яркость контрастность) и убедитесь, что масштаб изображения ПИКСЕЛЬ (изображения | Задайте шкала).
- В меню Анализ выберите набор измерений. Убедитесь, что область, Комплексной плотностии Означает значение серого выбран.
- Нарисуйте линию вокруг споро интерес с помощью любого из инструментов рисования/выделения (например, круг, многоугольник, или полилинии) (рис. 3).
- Выберите меру из меню (или нажмите cmd + M). Всплывающее окно со стеком значения для этого первый спор (рис. 3).
- Повторите эти два шага для по крайней мере 50 другие споры в поле зрения решили измерить.
- Выберите несколько регионов без любой спор, (которые имеют не флуоресценции) и повторите измерение; Это будет фон.
Примечание: Размер не важен. Эти соответствующие значения флуоресценции фон будет использоваться для вручную вычитание фона. - Выберите все данные в окне результаты и копирование результатов в электронную таблицу.
- Вычислить среднее Комплексной плотности и области выбранной споры и фоновых значений флуоресценции и использовать их для получения исправленные флуоресценции всего в клеток (CTCF) по формуле: CTCF = означает комплексное Плотность - (средняя площадь x означает фон флуоресценции).
Примечание: в качестве альтернативы, если все споры хорошо разделенных, это возможность анализировать все споры поля изображения с помощью функции Анализа частиц, после ImageJ инструкция. Чтобы избежать, что программное обеспечение считывает конкретных флуоресценции или споро агрегаты, измерения частиц должен быть установлен на pixelˆ2 = 50-200 (рис. 4).
3. косвенные оценки эффективности адсорбции
- Подготовьте серийных разведений для очищенный протеин.
- Подготовьте первые 1,5 мл трубка, содержащая 250 мкл очищенный mRFP в конечной концентрации 0,5 нг/мкл, с использованием привязки буфера. Этот объем является достаточно, чтобы загрузить две полосы.
- Выполняют шесть двойную серийных разведений 250 мкл (конечный объем) каждый, с использованием привязки буфера.
- Подготовьте двойную серийных разведений для супернатанта образцы, содержащие несвязанных mRFP фракция адсорбции реакции (S2, S5 и S10 с шагом 1,2).
- Положите 100 мкл каждого супернатант в 1,5 мл и 100 мкл буфера привязки. Выполняют шесть двойную серийных разведений 200 мкл (конечный объем) каждый, с использованием привязки буфера.
- Вырежьте нитроцеллюлозные мембранные (0,45 мкм отсечки), 9 см х 10 см в размер, чтобы покрыть площадь 5 (количество образцов) x 6 (количество разведений) точек. Мембрана не должно выходить за пределы края прокладки точка блот аппарата.
- Место prewet мембрану в аппарате блот точка. Удалите все пузырьки воздуха, в ловушке между мембраны и прокладки. Обложка неиспользованную часть аппарата с ленты или парафин пленкой для предотвращения перемещения через эти скважины воздуха.
- Соберите точка блот аппарат как описано заводом-изготовителем.
- Если пылесос используется при монтаже, увлажняет мембраны с 100 мкл ПБС за хорошо для обеспечения единообразного связывание антигена и предотвращения ореолов или слабые обнаружения сигнала.
- Аккуратно извлеките буфер из скважин в вакууме. Как только буферный раствор стекает из всех скважин, остановки вакуумного насоса и отключить его.
- Загрузите стандарта в двух самых внешних дорожек и образцы в середине (рис. 5). Заполните соответствующие лунки с 100 мкл каждого разведения. Тот же объем, используемый для каждой скважины следует обеспечить однородный фильтрации всех образцов скважин.
- Включите вакуумный насос для 2 мин, остановить его и затем, позволяют образца для фильтрации через мембрану самотечный поток.
- Вымойте все скважины с 100 мкл 1 x PBS и пусть вакуумный насос баллотироваться еще 5 мин после Отмывающий буфер был полностью осушенных из аппарата.
- С вакуумом на Отвинтите винты и тщательно открыть аппарат блот точка.
- Выключите пылесос, взять мембраны и процесс его после западной помарке протокол.
- Денситометрических анализ фильтра, с помощью соответствующего программного обеспечения, таких как ImageJ.
- Измерьте комплексной плотность каждой точки их структурирование с круг того же района и используя команду Analyze/мера .
- Сделайте коррекцию фона изображения, рисование круга в пустой области и измерения ее комплексной плотности или с помощью команды Фон процесса/вычесть .
- Корреляции комплексных плотность стандартных точек с количество загруженных белка и получить калибровка линии (2 значения R для калибровочных кривых должны быть более 0,95).
- Используйте калибровочной кривой экстраполировать концентрацию mRFP каждой точки образца.
- Рассчитайте концентрацию mRFP, оставаясь в несвязанных фракций.
Примечание: Для обеспечения правильного закрытия аппарата блот точка и, следовательно, к теме мембраны для равномерного давления, затяните винты, следуя схеме раскосно пересеченных и, затем откройте вакуумный насос сильно затяните винты.
4. споры сбор и повторное использование
- Для рециркуляции адсорбированных споро, выполняют две реакции адсорбции 2.0 x 109 очищенного споры с 10 мкг очищенный GH10-XA ксиланаза или 10 мкг очищенный GH3-XT β-xylosidase, как описано в шагах 1.1-1.3(рис. 6).
- Собирать гранулы, содержащие адсорбированные фермента споры, Ресуспензируйте их в 50 мкл оптимального буфера для assay ферментативной реакции (50 мм buffer фосфат натрия, рН 6,5; 2.48689 г/Л Na2HPO4, 4.88991 г/Л NaH2PO4), и смешать их вместе, чтобы получить смесь 100 мкл спор поглощения GH10-XA или GH3-XT.
- Добавление подложки (5 мг/мл 4-O-methyl-d-glucuronod-xylan [MGX]) и пусть ферментативных реакций занять место для 16 h на 65 ° C.
- Центрифуга реакционной смеси (за 15 мин на 13 000 x g) и хранить супернатанта, содержащие продукт реакции энзима.
- Ресуспензируйте гранулы в 100 мкл буфера натрия фосфат свежие 50 мм на рН 6,5 присутствии новый субстрат (MGX) (Рисунок 6B).
Примечание: Для более чем одного фермента, это позволяет адсорбировать оба вместе или по одному самостоятельно. Последняя возможность облегчает количественный анализ эффективности адсорбции и деятельности каждого фермента, позволяя стехиометрическим баланс каждого ферментов, необходимых для реакций.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Успешное адсорбции может оцениваться Западный blotting. После реакции смесь фракционированный центрифугированием и промывают, и фракция гранул (рис. 1) используется для извлечения белков поверхности. Экстракт фракционированный электрофореза геля полиакриламида SDS (страница), electrotransferred к мембране винилидена фторида (PVDF) и выступили против первичных и вторичных антител. Наличие белков ожидаемого размера, только в переулке, загружен с экстрактом адсорбированных споры, является показателем успешной адсорбции реакции(рис. 2).
Эффективность реакции адсорбция может оцениваться путем прямых и косвенных методов. Прямой оценки эффективности адсорбция зависит гетерологичных белок, который был использован и могут выполняться по микроскопии флуоресцирования (рис. 2B) и cytofluorimetry (рис. 2C) на фракция гранул После фракционирование адсорбции реакции. Количественная оценка флуоресцентные сигналов на споры могут выполняться с помощью программного обеспечения ImageJ (рис. 3 и рис. 4). Косвенный анализ эффективности адсорбция может осуществляться точка промокательной анализ (рис. 5A) супернатанта фракции, содержащие несвязанных белок (рис. 1). Денситометрических анализ несвязанных белка (рис. 5B) затем позволит ученым косвенно вычислить количество белка, адсорбированные на спор.
Два последовательных реакций может быть катализируемой смесь споры, отображение либо один из двух специфических ферментов (рисA). Адсорбированные enzyme(s) могут быть собраны с шагом простой центрифугирования, промывают и инкубировали с свежий субстрат для нового цикла реакции (рис. 6B).
Рисунок 1:Общая схема эксперимента адсорбции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Прямой анализ эффективности дисплея mRFP. (A) западной помарке с mRFP специфические антитела. C + = Бесплатная очищенная mRFP; C - = белков экстракта из спор не адсорбированного белка; P2/P5/P10 = белки, извлеченные из спор B. subtilis адсорбированные с 2, 5 и 10 мг mRFP, соответственно. (B) иммунофлуоресценции адсорбированных спор. Immunoreactions были исполнены с основного антитела, признавая адсорбированных белка и флуоресцентные вторичное антитело проспряганное с флуоресцеин Изотиоцианаты (FITC). Левая панель показывает флуоресценции Красного внутренней mRFP, правой панели показывает Зеленая Флуоресценция вторичное антитело проспряганное FITC. (C) анализ гранулярных адсорбированных спор потока. Споры отреагировал с mRFP специфических антител и вторичных антител, FITC-конъюгированных и, затем, были проанализированы cytofluorimetry. Анализ проводился на весь спор населения (10000 событий, ungated). В левой панели не адсорбируется споры показаны в черный, адсорбированные mRFP споры в красный цвет. Правая панель показывает вперед и боковых (FSC-SSC) точка точечной. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: ручной количественная оценка флуоресцентного сигнала ImageJ. Флуоресценции Микроскоп изображение спор, адсорбированного с красного флуоресцирующего белка mRFP, проанализированы с ImageJ программного обеспечения. Желтый круг был составлен вокруг один спор для получения денситометрических данных (увеличенное изображение). Всплывающее окно показывает результаты денситометрических анализа выбранного споро. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: одновременного количественного определения флуоресцентного сигнала ImageJ. (A) получил всплывающее окно при выборе Анализа частиц. Значение интервала по 50-200 пикселей ^ 2 должен быть установлен для споры23. (B) сегментации изображения Рисунок 3A после использования Анализа частиц (слева) и результаты анализа относительной денситометрических (справа). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: точка анализа blotting и денситометрических. (A) точка промокательной с серийных разведений очищенный mRFP в двух экземплярах (Std1 и2Std) и супернатант (S10, S5 и S2) реакции адсорбции, выступал с 10, 5 и 2 мкг mRFP, соответственно23. (B) точка промокательной группа A используется для денситометрических анализа. Круги показывают область используется для quantitate плотность сигналов. Пример результатов, полученных с денситометрических анализа докладов группы справа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6: Преобразование xylan путем многократного использования споры. (A) общая схема xylan деградации. (B) споры, показывая ксиланаза или β-xylosidase ферменты, когда смешиваются, катализировать двухэтапный деградации xylan. После реакции образец фракционированный центрифугированием. Супернатант содержит продукт реакции, а гранулы споро прыгните ферменты, которые могут быть повторно использованы, добавляя свежий субстрат. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот спор адсорбции протокол является очень простым и понятным. Реакция является строго зависит от pH буфера реакции и эффективность адсорбции является оптимальным в кислой рН (рН 5,0 или ниже). На нейтральном pH эффективность адсорбции низка, и в щелочной рН, адсорбция может не произойти. Оптимальное адсорбции извлекается с помощью объемом 200 мкл в 1,5 мл трубки (или сохраняя аналогичный коэффициент) на качалки шейкер.
Адсорбция очень туго, и моет с буфером в же pH буфера реакции не вызывают любой релиз адсорбированных белков. Мойки с щелочных буферов может привести к минимальной (обычно меньше, чем 15%26) релиз адсорбированных белка.
Косвенные оценки эффективности адсорбции промокательной точка является надежным, если анализируются несколько разведений очищенный и несвязанных белка и денситометрических анализ выполняется должным образом. Никаких признаков деградации гетерологичных белков был сообщил25. Прямой оценки эффективности адсорбции во многом зависит от белок, который является адсорбированные. Если белок является autofluorescent или дневно помечены, при содействии ImageJ анализ дает количественное определение флюоресценции и количества флуоресцентных молекул присутствует на спор. Если белок имеет ферментативную активность, конкретные ферментативные пробирного может предоставить указание количеств белка настоящее на споры. Однако известно, что ферментативной активности, связанные с споры могут быть увеличены эффект стабилизации за счет взаимодействия с spore13. Если адсорбированных белок не флуоресцентные и не имеют ферментативной активности, эффективности адсорбции может оцениваться точка промокательной на споры, извлечены резкое условиях.
Набор используемых споры могут быть сделаны очень простая процедура. Стиральная шаг с буфером реакции может быть важным для удаления побочных продуктов реакции, в то время как добавление свежий субстрат необходимо инициировать новую реакцию21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана «Finanziamento di Ricerca ди Ateneo» к L. Baccigalupi, название проекта «SP-LAY: бактериальные споры как живой платформы для отображения белков».
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1% Poly-L-lysine solution | Sigma | P8920 | |
| 0.45 µm Nitrocellulose Blotting Membrane | Sartorius | M_Blotting_Membranes | |
| 100× objective UPlanF1 | Olympus | microscope equipment | |
| Bacillus subtilis strain NCIB3610 | Bacillus Genetic Stock Center | 3A1 | |
| BD ACCURI C6 PLUS | BD | flow cytometer | |
| BX51 | Olympus | Fluorescent microscope | |
| Clarity | Biorad | 1705060 | |
| DP70 digital camera a | Olympus | microscope equipment | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, FITC | Thermo fisher | F-2754 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) | Abcam | ab6721 | |
| Monoclonal Anti-polyHistidine−Peroxidase antibody | Sigma | A7058-1VL | used to detect adsorbed proteins presenting a 6xhistidine-tag at C- or N- terminal |
| SecureSlip glass coverslip | Sigma | S1815-1PAK | |
| Superwhite Uncharged Microscope Slides | VWR | 75836-190 | |
| U-CA Magnification Changer | Olympus | microscope equipment |
References
- Felici, F., et al. Peptide and protein display on the surface of filamentous bacteriophage. Biotechnology Annual Review. 1, 149-183 (1995).
- Cortese, R., et al. Identification of biologically active peptides using random libraries displayed on phage. Current Opinion in Biotechnology. 6, 73-80 (1995).
- Sousa, C., Cebolla, A., de Lorenzo, V. Enhanced metalloadsorption of bacterial cells displaying poly-His peptides. Nature Biotechnology. 14, 1017-1020 (1996).
- Richins, R., Kaneva, I., Mulchandani, A., Chen, W. Biodegradation of organophosphorus pesticides by surface-expressed organophosphorus hydrolase. Nature Biotechnology. 15, 984-987 (1997).
- Wu, J. Y., et al. Expression of immunogenic epitopes of hepatitis B surface antigen with hybrid flagellin proteins by a vaccine strain of Salmonella. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86, 4726-4730 (1989).
- Newton, S. M., Jacob, C. O., Stocker, B. A. Immune response to cholera toxin epitope inserted in Salmonella flagellin. Science. 244, 70-72 (1989).
- Fischetti, V. A., Medaglini, D., Pozzi, G. Gram-positive commensal bacteria for mucosal vaccine delivery. Current Opinion in Biotechnology. 7, 659-666 (1996).
- Isticato, R., Ricca, E. Spore surface display. Microbiology Spectrum. 2 (5), (2014).
- Ricca, E., et al. Mucosal vaccine delivery by non-recombinant spores of Bacillus subtilis. Microbial Cell Factories. 13, 115 (2014).
- McKenney, P. T., Driks, A., Eichenberger, P. The Bacillus subtilis assembly and functions of the multilayered coat. Nature Reviews Microbiology. 11, 33-44 (2013).
- Knecht, L. D., Pasini, P., Daunert, S. Bacterial spores as platforms for bioanalytical and biomedical applications. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 400, 977-989 (2011).
- Isticato, R., Cangiano, G., De Felice, M., Ricca, E. Display of molecules on the spore surface. Bacterial Spore Formers: Probiotics and Emerging Applications. Ricca, E., Henriques, A. O., Cutting, S. M. , Horizon Bionsciences. Norfolk, UK. 193-200 (2004).
- Sirec, T., et al. Adsorption of β-galactosidase of Alicyclobacillus acidocaldaricus wild type and mutant spores of Bacillus subtilis. Microbial Cell Factories. 11, 100 (2012).
- Cutting, S. M. Bacillus probiotics. Food Microbiology. 28, 214-220 (2011).
- Baccigalupi, L., Ricca, E., Ghelardi, E. Non-LAB Probiotics: Spore Formers. Probiotics and Prebiotics: Current Research and Future Trends. Venema, K., Do Carmo, A. P. , Caister Academic Press. 93-103 (2014).
- Cutting, S. M., Hong, H. A., Baccigalupi, L., Ricca, E. Oral Vaccine Delivery by Recombinant Spore Probiotics. International Reviews of Immunology. 28, 487-505 (2009).
- Lee, S. Y., Choi, J. H., Xu, Z. Microbial cell-surface display. Trends in Biotechnology. 21, 45-52 (2003).
- Isticato, R., et al. Surface display of recombinant proteins on Bacillus subtilis spores. Journal of Bacteriology. 183, 6294-6301 (2001).
- Huang, J. M., et al. Mucosal delivery of antigens using adsorption to bacterial spores. Vaccine. 28, 1021-1030 (2010).
- Isticato, R., et al. Non-recombinant display of the B subunit of the heat labile toxin of Escherichia coli wild type and mutant spores of Bacillus subtilis. Microbial Cell Factories. 12, 98 (2013).
- Mattossovich, R., et al. Conversion of xylan by recyclable spores of Bacillus subtilis thermophilic enzymes. Microbial Cell Factories. 16, 218 (2017).
- Pesce, G., et al. Surface charge and hydrodynamic coefficient measurements of Bacillus subtilis by optical tweezers. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 116, 568-575 (2014).
- Donadio, G., et al. Localization of a red fluorescence protein adsorbed on wild type and mutant spores of Bacillus subtilis. Microbial Cell Factories. 15, 153 (2016).
- Pan, J. G., Choi, S. K., Jung, H. C., Kim, E. J. Display of native proteins on Bacillus subtilis spores. FEMS Microbiology Letters. 358, 209-217 (2014).
- Cutting, S., Vander Horn, P. B. Genetic analysis. Molecular Biological Methods for Bacillus. Harwood, C., Cutting, S. , John Wiley & Sons. Chichester, UK. (1990).
- Lanzilli, M., et al. Display of the peroxiredoxin Bcp1 of Sulfolobus solfataricus probiotic spores of Bacillus megaterium. New Biotechnology. 46, 38 (2018).
