Summary
该议定书的重点是利用细菌孢子作为 "活" 纳米生物技术工具来吸附具有各种生物活性的异源分子。并给出了测定吸附效率的方法。
Abstract
细菌孢子是一种代谢静止的细胞, 由一系列保护层围绕脱水的细胞质形成。这种特殊的结构使孢子极其稳定和耐药, 并建议使用孢子作为显示异源分子的平台。到目前为止, 在枯草芽孢杆菌和其他几种物种的孢子上都显示了各种抗原和酶, 最初是用重组方法, 然后是用一种简单有效的非重组方法。非重组显示系统是基于在孢子表面直接吸附异源分子, 避免了重组菌株的构建和转基因细菌在环境中的释放。吸附分子通过与孢子的相互作用得到稳定和保护, 从而限制了抗原的快速降解和酶活性在不利条件下的丧失。一旦使用, 孢子吸附酶可以很容易地收集与最小的活性减少和再利用额外的反应轮。本文介绍了如何吸附模型分子对枯草芽孢的纯化, 如何评价吸附效率, 以及如何收集使用过的孢子进行回收, 以获得新的反应。
Introduction
显示系统旨在在微生物表面呈现生物活性分子, 并在从工业到医疗和环境生物技术等多个领域寻找应用。除了噬菌体1,2和细胞的各种革兰氏阴性和阳性物种3,4,5, 6, 7, 细菌孢子也已提出作为显示系统的两个方法8,9。
由于其特殊的结构, 即脱水的细胞质包围了一系列保护层10,孢子提供了几个优势, 比基于噬体和细胞为基础的显示系统8,9。第一个优势来自孢子在对所有其他细胞 10、11 有害的条件下的极端鲁棒性和稳定性。在室温12下长时间储存后, 显示酶的抗原和酶是稳定的, 在低 ph 值和高温度13下防止降解。孢子的第二个优点是许多孢子形成物种的安全性。b. 枯草、b. clausii、b. 凝血和其他几个物种在世界各地被用作益生菌, 并已在人类或动物市场上销售了14、15.这种特殊的安全记录是表面显示系统的一个明显的一般要求, 在该系统用于人类或动物时尤其重要.基于孢子的显示系统的第三个重要优点是, 它对必须暴露的分子的大小没有限制。在基于噬体的系统中, 大型异源蛋白可能会影响衣壳的结构, 而在细胞基系统中, 可能会影响膜的结构, 或可能会限制/损害膜的移位步骤17。孢子周围的保护层由70多个不同的蛋白质10 组成, 具有足够的灵活性, 可以接受大的外来蛋白质, 而不会出现任何明显的结构缺陷或功能障碍8。此外, 在两种基于孢子的显示系统中, 不需要异源蛋白的膜移位 8,9。事实上, 异源蛋白要么在母细胞细胞质中产生, 并聚集在在同一细胞质中形成的孢子上, 要么吸附在成熟的孢子8,9上。
孢子显示最初是通过开发一个基因工程系统来设计孢子表面 18。这个基因系统是基于 i) 在基因编码为孢子涂层蛋白质 (用作载体) 和基因编码之间的结构在被显示的蛋白质-的存在转录和翻译信号的内源性基因将控制融合的表达, ii) 在b.枯草染色体上整合嵌合基因, 以获得遗传稳定性。这种重组方法显示了各种抗原和酶, 使用各种孢子表面蛋白作为载体, 并针对各种潜在的应用, 从黏膜疫苗到生物催化剂、生物传感器、生物修复, 或生物分析工具8,13。
最近, 开发了一种不同的孢子显示方法.这第二个系统是非重组的, 依赖于分子在孢子表面9上的自发和极其紧密的吸附。抗原19、20和酶13、21已有效显示, 该方法明显高于重组方法。这种非重组方法允许以原生形式20显示蛋白质, 也可与蒸压、死亡孢子19 一起使用。吸附的分子机制尚未得到充分的澄清。提出了孢子的负电荷和疏水性, 作为与吸附13、19、22 有关的特性。最近, 研究表明, 珊瑚瘤的一种模型蛋白, 即红色自荧光蛋白 (mrfp), 吸附在孢子中, 能够通过内涂层中的表面层渗透 23.如果证明其他蛋白质是正确的, 异源蛋白的内部定位可以解释它们在吸附到孢子 23时更高的稳定性。
在最近的一项研究中, 两种催化木兰降解途径连续两个步骤的酶在枯草芽孢杆菌孢子上独立显示, 当一起孵育时, 能够同时完成这两个降解步骤21。反应后收集的孢子仍然活跃, 能够在添加新鲜底物21后继续木兰降解。即使在第二反应21中观察到最终产物约15% 的损失, 单次吸附酶的可重用性以及多步骤的反应也是孢子显示系统的另一个重要优势。
Pan 等人报告了在孢子表面显示异源蛋白的另一种方法: 在孢子过程中, 母细胞产生的异源蛋白 (一种内聚糖酶蛋白和β-半乳糖苷酶) 是自发产生的包裹在成型的孢子涂层, 不需要载体。这种额外的孢子显示系统是迄今为止所描述的两种方法的组合。事实上, 它是重组的, 因为异源蛋白被设计成在孢子过程中在母细胞中表达, 而它们在涂层中的组装是自发的, 因此, 非重组 24.然而, 这种附加方法的显示效率仍有待测试, 并通过使用相同的异源蛋白与其他两种方法进行比较。
本议定书不包括孢子的生产和净化过程, 其他地方对这些过程作了广泛的描述。它包括吸附反应、点印迹和荧光显微镜对吸附效率的评价, 以及吸附酶对其他反应轮的回收利用。
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Protocol
1. 吸附反应
- 用 2 x 10 9 b 培养2、5和10μg 的 mRFP . 在25°c 的摇摇振动台上, 在200μl 结合缓冲液中, 在50μl 的结合缓冲液中, 在50μm 柠檬酸钠、ph 4.0 (16.7 mm 柠檬酸钠二水; 33.3 mm 柠檬酸) 中, 在1小时内使用..
- 离心将结合混合物 (13, 000 x g , 10分钟) 离心为分馏颗粒 (p2、P5 和 p10) 和上清液 (s2、S5 和 s10)。储存上清液, 用于对步骤3.2 中描述的吸附效率进行间接评价。
- 用200μl 的结合缓冲液清洗颗粒 2x, 并在100μl 的结合缓冲液中重新悬浮, 然后将其用于下一次分析。
注: 结合反应优先发生在 ph 值低于蛋白质的等电点;通常使用 1.5 M 磷酸盐缓冲盐水 (PBS)、pH 值4.0 或 50 mM 柠檬酸钠, pH 4.0。
2. 吸附效率的直接评价
-
表面蛋白的提取与西方印迹分析
- 取50Μl 的 mrp 吸附孢子的再悬浮 (P2, P5 和步骤1.3 的 P10), 并添加50μl 的2x 十二烷基硫酸钠 (SDS)-二硫代索特 (DTT) (0.1 m Tris-HCl, ph 6.8; 2% SDS; 0.1 M DTT), 以溶解表面孢子蛋白。
- 使用不吸附在蛋白质中的相同数量的自由、纯化的 mRFP 和提取物分别作为阳性和阴性对照。
- 在65°c 孵育45分钟后, 离心机 (13, 000 x g)对混合物进行了分析, 并用单克隆抗他抗体对 mRFP n 端子上存在的他的标记进行了10μl 的西方印迹提取的蛋白质 (上清液) (图 2a)。
-
荧光显微镜观察
注: 通过使用荧光异源蛋白或进行免疫荧光分析, 可以通过荧光显微镜对吸附分子进行定位和量化。- 从步骤1.3 中取出5Μl 的吸附孢子的再悬浮, 加入95Μl 的 1x PBS, pH 4.0, 以获得 ~ 1x10 6Sic/μl.
- 将5Μl 悬浮液放置在显微镜幻灯片上, 用以前用多赖氨酸处理30秒的覆盖片覆盖, 并在荧光显微镜下观察。
- 对于每个领域, 保存相位对比显微镜图像和荧光显微镜图像 (图 2b)。
注: 或者, 荧光孢子可以通过细胞-氟法分析。在 1x PBS, ph 4.0 的1毫升中, 共对 10 6个孢子吸附或不吸附异源蛋白进行吸附, 并使用流式细胞仪分析悬浮液 (图 2c)。
-
使用 ImageJ 进行数据分析
- 使用 ImageJ 软件 (http://rsbweb.nih.gov/ij/) 打开荧光显微镜图像, 并检查以确保所有图像都是8位格式 (图像)产品类型8位)。
- 如有必要, 调整对比度 (图像调整亮度对比度), 并验证图像的比例是否为 pixel (图像)设置比例)。
- 从 "分析" 菜单中选择 "设置测量值"。确保选择了"面积"、 "集成密度" 和"均值"。
- 使用任何绘图选择工具 (即圆形、多边形或自由形状) 在感兴趣的孢子周围画一条线 (图 3)。
- 从 "分析" 菜单中选择"度量" (或点击Cmd + m)。此时将出现一个弹出框, 其中包含第一个孢子的值堆栈 (图 3)。
- 在选择测量的视野中, 对至少50个其他孢子重复这两个步骤。
- 选择多个没有孢子的区域 (没有荧光), 然后重复测量;这将是背景。
注: 大小并不重要。这些相应的背景荧光值将用于手动减去背景。 - 选择 "结果" 窗口中的所有数据, 并将结果复制到电子表格中。
- 使用以下公式计算所选孢子的综合密度和面积以及背景荧光值的平均值, 并使用它们使用以下公式获得校正后的每个细胞总荧光 (ctcf): ctcf = 均值密度-(平均面积 x 平均背景荧光)。
注: 或者, 如果所有孢子看起来都很好分离, 则可以按照 ImageJ 的指示, 使用 "分析粒子" 函数分析图像字段的所有孢子。为了避免软件读取特定的荧光或孢子聚集体, 必须将粒子的尺寸设置为像素 2 = 50-200 (图 4)。
3. 吸附效率的间接评价
- 为纯化的蛋白质准备连续稀释。
- 使用结合缓冲液, 在最终浓度为 0.5 ngμl 的情况下, 准备第一个 1.5 mL 管, 其中含有250μl 的纯化 mRFP。此卷足以加载两条车道。
- 使用绑定缓冲液进行6次双系列稀释, 每次 50Μl (最终体积)。
- 为含有吸附反应未结合 mRFP 分数的上清液样品 (步骤1.2 中的 S2、S5 和 S10) 准备了两次系列稀释剂。
- 将每个上清液100Μl 放入 1.5 mL 管中, 加入100Μl 的结合缓冲液。使用绑定缓冲液进行6次双系列稀释, 每次 200Μl (最终体积)。
- 切割硝化纤维素膜 (0.45μm 截止), 9 厘米 x 10 厘米大小, 以覆盖 5 (样品数量) x 6 (稀释次数) 的面积。膜不应超出点印迹装置垫片的边缘。
- 将预湿膜放入点印迹装置中。去除卡膜和垫片之间的气泡。用胶带或石蜡膜覆盖设备未使用的部分, 以防止空气通过这些井。
- 按照制造商的描述组装点印迹装置。
- 如果在装配过程中使用真空, 则用100μl 每口 1 x PBS 对膜进行再补水, 以确保抗原的均匀结合, 并防止光环或微弱的检测信号。
- 用真空轻轻地从井中取出缓冲液。缓冲液从所有井中排出后, 立即停止真空泵并将其断开。
- 在两个最外部通道中加载标准, 并在中间加载样本 (图 5)。在适当的井中填充每稀释100Μl。每口井使用的相同体积应确保对所有样品井进行均匀过滤。
- 打开真空泵 2分钟, 停止它, 然后, 让样品通过重力流过滤膜。
- 用100μl 的 1x PBS 清洗所有井, 让真空泵在清洗缓冲液完全从设备中排出后再运行5分钟。
- 打开真空后, 松开螺丝, 小心地打开点式印迹装置。
- 关闭真空, 取膜, 并按照西方印迹协议进行处理。
- 使用适当的软件 (如 ImageJ) 对筛选器进行密度分析。
- 通过用相同区域的圆圈和使用Analyze/测量命令来测量每个点的综合密度。
- 对图像进行背景校正, 在空白区域中绘制一个圆, 并测量其集成密度, 或使用Procesx/减去背景命令。
- 将标准点的积分密度与加载的蛋白质量相关联, 并获得校准线 (校准曲线的r2值应超过 0.95)。
- 使用校准曲线来推断每个采样点的 mRFP 浓度。
- 计算留在未绑定分数中的 mRFP 浓度。
注: 为了确保正确关闭点印迹装置, 并因此, 使膜承受均匀的压力, 按照对角交叉方案拧紧螺钉, 然后打开真空泵, 以更强烈地拧紧螺钉。
4. 孢子的收集和再利用
- 如步骤 1.1-1.3 所述 (图 6a)所述, 为回收吸附孢子, 可对 20X10 9 纯化的囊进行两次吸附反应, 并含有10μg 的纯化 gh10-xa 木聚糖酶或10μg 的纯化 GH3-XT β-木质化酶.
- 收集含有酶吸附孢子的颗粒, 以酶反应测定的最佳缓冲液50Μl 重新悬浮 (pH 值6.5 为50mm 磷酸钠缓冲液; ph 值6.5 为 2.48689 G/na 2 hpo 4, 4.88991 nah 2 po 4), 并将它们混合在一起, 以获得吸附 GH10-XA 或 GH3-XT 的100μl 混合孢子。
- 加入底物 (5 mgml 4-O-甲基-d-葡萄糖-木兰 [MGX]), 并让酶反应在65°c 下发生16小时。
- 离心反应混合物 (15分钟在 13, 000 x克), 并储存含有酶反应产物的上清液。
- 在新的基材 (MGX) 存在的情况下, 以 ph 6.5 的速度将颗粒重新注入100μl 的新鲜 50 Mm 磷酸钠缓冲液中 (图 6b)。
注: 要吸附一种以上的酶, 可以单独吸附在一起或一个接一个地吸附。后一种可能性有助于对吸附效率和每种酶的活性进行定量分析, 从而使反应所需的每种酶都能得到化学计量平衡。
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Representative Results
成功的吸附可以通过西方印迹来评估。反应后, 通过离心和洗涤对混合物进行分离, 并使用颗粒分数 (图 1) 提取表面蛋白质。该提取物由 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE) 进行分离, 电转移到聚偏氟乙烯 (PVDF) 膜, 并对原发和二级抗体产生反应。预期大小的蛋白质的存在, 只有在充满吸附孢子提取物的车道上, 就表明吸附反应是成功的 (图 2a)。
吸附反应的效率可以用直接和间接的方法来评价。吸附效率的直接评价取决于所使用的异源蛋白, 可通过荧光显微镜 (图 2 b) 和球团组分上的细胞荧光法 (图 2c)进行在吸附反应的分馏之后。通过 ImageJ 软件 (图 3和图 4), 可以对孢子上存在的荧光信号进行量化。通过对含有未结合蛋白质的上清液分数进行点印迹分析 (图 5a), 可以对吸附效率进行间接分析 (图 1)。然后, 对未结合的蛋白质进行密度分析 (图 5b), 使科学家能够间接计算吸附在孢子上的蛋白质量。
两个连续的反应可以通过显示两个特定酶中的任何一种的孢子来催化 (图 6a)。吸附酶可以用简单的离心步骤收集, 清洗, 并与新鲜底物孵育, 以获得新的反应周期 (图 6b)。
图 1:吸附实验的一般方案.请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 直接分析 mrfp 显示的效率.(a) 具有 mRFP-specific 特异性抗体的西方印迹。C++ = 游离纯化 mRFP;c-= 不吸附在蛋白质中的孢子中提取的蛋白质;p2p·pp10 = 从b.枯草芽孢杆菌中提取的蛋白质, 分别吸附2、5和10毫克 mRFP。(b) 吸附孢子的免疫荧光显微镜。免疫反应是用识别吸附蛋白的初级抗体和荧光二级抗体与荧光素异硫氰酸酯 (FITC) 结合进行的。左侧面板显示红色固有 mRFP 荧光, 右侧面板显示 fitc 共轭二级抗体的绿色荧光。(c) 吸附孢子的流动细胞学分析。孢子与 mrp 特异性抗体和 fitc 共轭二级抗体发生反应, 然后用细胞荧光法进行分析。对整个孢子种群进行了分析 (10, 000个事件, 未申报)。在左侧面板中, 未吸附的孢子以黑色显示, mrfp 吸附孢子以红色显示。右侧面板显示向前和侧面散点 (FSC-SSC) 点图。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3:通过 imagej 对荧光信号进行手动定量.用 ImageJ 软件对吸附在红色荧光蛋白 mRFP 下的孢子进行荧光显微镜图像分析。在一个孢子周围画了一个黄色圆圈, 以获得密度测量数据 (放大图像)。弹出框显示了所选孢子的密度分析结果。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4:通过 imagej 同时量化荧光信号.(a) 选择"分析粒子" 时获得的弹出窗口。必须为芽孢23设置 50-200 pixel^2 的间隔值。(b) 在使用分析粒子(左) 和相对密度分析结果 (右) 后分割图3 a的图像。请点击这里查看此图的较大版本.
图 5:点印迹和密度分析.(a) 用一系列稀释剂对纯化的 mRFP 进行印迹, 一式两份 (std1和 std2) 和上清液 (S10、s5 和 s2) 分别用10、5和2微克的 mrfp 进行吸附反应 23.(b) a 面板的点印迹用于密度分析。圆圈表示用于量化信号密度的区域。右侧的面板报告了密度计分析所获得的结果的一个示例。请点击这里查看此图的较大版本.
图 6:通过可重复使用的孢子转换木兰.(a) 木兰降解的一般方案。(b) 显示木聚糖酶或β-木质硅化酶的孢子混合在一起, 催化木聚糖的两步降解。反应后, 样品通过离心进行分离。上清液含有反应产物, 而颗粒中含有孢子结合酶, 可通过添加新鲜底物重复使用。请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
这种孢子吸附协议非常简单和直接。反应严格取决于反应缓冲液的 pH 值, 在酸性 ph 值 (pH 值5.0 或更低) 下, 吸附效率最佳。在中性 pH 条件下, 吸附效率较低, 在碱性 pH 值下, 可能不会发生吸附。在摇摆机上使用 1.5 Ml 管中的200μl 体积 (或保持相似的比例) 获得最佳吸附。
吸附非常紧密, 在相同的反应缓冲液 ph 值下使用缓冲液清洗不会导致吸附蛋白的任何释放。使用碱性缓冲液清洗可能会导致吸附蛋白的最小 (通常小于 15% 26)释放。
分析了几种纯化和未结合蛋白的稀释, 并进行了适当的密度分析, 对点印迹吸附效率的间接评价是可靠的。目前还没有异源蛋白降解的证据 25.吸附效率的直接评价在很大程度上取决于吸附的蛋白质。如果蛋白质是自荧光或荧光标记, imagej 辅助分析提供了荧光和孢子上存在的荧光分子数量的定量测定。如果蛋白质具有酶活性, 特定的酶检测可以提供孢子上存在的蛋白质量的指示。然而, 众所周知, 由于与孢子13的相互作用, 与孢子相关的酶活性可能会通过稳定效应而增加。如果吸附蛋白不是荧光的, 并且不具有酶活性, 则可以通过在剧烈条件下提取的孢子的点印迹来评价吸附效率。
一个使用过的孢子的集合可以通过一个非常简单的程序来完成。与反应缓冲液一起清洗步骤可能对去除反应副产物很重要, 而添加新鲜底物对于引发新的反应21至关重要.
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了 "Finanziamento di Ricerca di Ateneo" 至 L. Baccigalupi 的支持, 项目标题为 "SP-LAY: 细菌孢子作为蛋白质显示的活平台"。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1% Poly-L-lysine solution | Sigma | P8920 | |
| 0.45 µm Nitrocellulose Blotting Membrane | Sartorius | M_Blotting_Membranes | |
| 100× objective UPlanF1 | Olympus | microscope equipment | |
| Bacillus subtilis strain NCIB3610 | Bacillus Genetic Stock Center | 3A1 | |
| BD ACCURI C6 PLUS | BD | flow cytometer | |
| BX51 | Olympus | Fluorescent microscope | |
| Clarity | Biorad | 1705060 | |
| DP70 digital camera a | Olympus | microscope equipment | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, FITC | Thermo fisher | F-2754 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) | Abcam | ab6721 | |
| Monoclonal Anti-polyHistidine−Peroxidase antibody | Sigma | A7058-1VL | used to detect adsorbed proteins presenting a 6xhistidine-tag at C- or N- terminal |
| SecureSlip glass coverslip | Sigma | S1815-1PAK | |
| Superwhite Uncharged Microscope Slides | VWR | 75836-190 | |
| U-CA Magnification Changer | Olympus | microscope equipment |
References
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