Summary
פרוטוקול זה מתמקד בשימוש של נבגי חיידקים ככלי nanobiotechnological "חי" כדי לספוח את מולקולות heterologous עם פעילויות ביולוגיות שונות. המפה מראה גם השיטות כדי למדוד את היעילות של ספיחה.
Abstract
הנבג החיידק הוא תא סמויה השבתה הדרגתית, שהוקמה על ידי סדרה של שכבות ההגנה המקיפה של הציטופלסמה מיובש. מבנה משונה זה גורם הנבג יציב ועמיד מאוד והציע את השימוש הנבג כפלטפורמה להצגת מולקולות heterologous. עד כה, מגוון רחב של אנטיגנים ואנזימים הוצגו על נבגים של Bacillus subtilis ושל כמה מינים אחרים, בתחילה על ידי בגישה רקומביננטי ואז, בשיטה nonrecombinant פשוטה ויעילה. מערכת התצוגה nonrecombinant מבוסס על ספיחה ישירה של מולקולות heterologous על פני השטח נבג, הימנעות הבנייה של זנים רקומביננטי על שחרורו של חיידקים מהונדסים לסביבה. מולקולות הספוחה התייצב, מוגן על ידי האינטראקציה עם נבגים, אשר מגביל את ההתדרדרות המהירה של אנטיגנים ואובדן של פעילות אנזים-התנאים שלילי. ברגע מנוצל, אנזימים נבג-הספוחה ניתן לאסוף בקלות עם ירידה מזערית של פעילות ולהשתמש בהם שימוש חוזר לביקור נוסף תגובה. נייר זה מוצג כיצד לספוח מולקולות דגם מטוהרים נבגים של B. subtilis, כיצד להעריך את היעילות של ספיחה וכיצד לאסוף את הנבגים בשימוש כדי למחזר אותם לתגובות חדשות.
Introduction
מערכות התצוגה מכוונים הצגת מולקולות פעילים ביולוגית על פני השטח של מיקרואורגניזמים ומציאת יישומים במגוון רחב של שדות, מן התעשייה כדי מנרב רפואיות וסביבתיות. בנוסף phages1,2 תאים שונים גראם שליליים וחיוביים - מינים3,4,5,6,7, נבגי חיידקים היו גם מערכות התצוגה כפי שהוצע על ידי שתי גישות8,9.
בגלל המבנה המיוחד שלה, כלומר הציטופלסמה מיובש מוקף על ידי סדרה של שכבות ההגנה10, הנבג מספקת מספר יתרונות על פני phage תא מבוססות התצוגה מערכות8,9. יתרון ראשון מגיע קיצוני החוסן והיציבות של נבגים על תנאי זה יהיה ברישול על כל שאר התאים10,11. אנטיגנים מוצגים נבג ואנזימים יציבים לאחר שהוארך אחסון בטמפרטורת החדר12 ולהגן עליהם מפני השפלה ב pH נמוך, טמפרטורות גבוהות13. יתרון נוסף של נבגים זה הביטחון של מינים רבים להיוות נבג. B. subtilis, נולד ב- clausii, נולד ב- coagulans, מספר מינים אחרים משמשים ברחבי העולם כמו פרוביוטיקה, היו בשוק לשימוש אדם או בעלי חיים במשך עשרות שנים14,15. רשומה בטיחות יוצאת דופן זו היא ברורה הדרישה כללי מערכת התצוגה משטח והיא הרלוונטיות, כאשר המערכת מיועדת לשימוש אדם או בעלי חיים16. שלישית, יתרון חשוב של מערכת התצוגה המבוסס נבג הוא כי אין לו מגבלות עבור הגודל המולקולה שצריך להיות חשופים. במערכות מבוססות phage, חלבון heterologous גדול עשוי להשפיע על המבנה capsid, בעוד מערכות מבוססות תא, זה עלול להשפיע על המבנה של הקרום או עשוי להגביל/לפגום ממברנה רוברטסונית שלב17. שכבות ההגנה המקיפה הנבג מורכב של חלבונים שונים יותר מ 7010 והם גמיש מספיק כדי לקבל חלבונים זרים גדולים ללא כל פגם מבנית ניכרת או תיפקודי8. בנוסף, עם שתי מערכות תצוגה מבוססי נבג, רוברטסונית ממברנה של החלבון heterologous אינו נדרש8,9. אכן, חלבונים heterologous או המיוצר בציטופלסמה אמא תא, התאספו על הנבג היא יצירת בציטופלסמה אותו או הספוחה8,ספורה בוגר9.
נבג התצוגה הושג בתחילה על ידי פיתוח מערכת גנטית להנדס את השטח נבג18. מערכת גנטית זו התבססה על אני) הבנייה של שילוב גנים בין קידוד גנטי את חלבון המעיל נבג (משמש כנשא) את קידוד גנטי החלבון להיות מוצג - הנוכחות של גנים ברמת השעתוק והתרגום מאותת אנדוגני ג'ין ישלוט הביטוי של פיוז'ן, ו- ii) שילוב של הגן chimeric על כרומוזום ה- B. subtilis להעניק יציבות גנטית. מגוון רחב של אנטיגנים ואנזימים הוצגו על ידי גישה זו רקומביננטי, שימוש שונים נבג פני שטח חלבונים נשאים, מכוון יישומים אפשריים שונים, החל חיסון הרירית biocatalyst, ביוסנסור, למצבה או כלי וביו-אנליטיות וואלידציה8,13.
לאחרונה, גישה שונה של תצוגת נבג כבר מפותחת19. המערכת השנייה היא nonrecombinant וכן על ספיחה ספונטנית, הדוק ביותר של מולקולות על פני השטח ספורה9. אנטיגנים19,20 ואנזימים13,21 הוצגו בצורה יעילה ו חשפו כי שיטה זו היא באופן משמעותי יעיל יותר האחד רקומביננטי. גישה nonrecombinant זו מאפשר את התצוגה של חלבונים ב- טופס מקורי20 , יכול לשמש גם עם בלוק, מוות נבגים19. מנגנון מולקולרי של ספיחה יש לא מלא הובהרו עדיין. את מטען שלילי, את hydrophobicity של הנבג הוצעו כמאפיינים הרלוונטיים עבור ספיחה13,19,22. לאחרונה, הוכח כי חלבון מודל, החלבון autofluorescent אדום (mRFP) של קורל Discosoma, כאשר הספוחה כדי הנבג, הצליחה לחדור דרך שכבות פני ההתאמה לשפות אחרות המעיל הפנימי23. אם הוכחו כנכונות חלבונים אחרים, לוקליזציה פנימי של החלבונים heterologous יכול להסביר את יציבות מוגברת כאשר הספוחה נבגים23.
במחקר שנערך לאחרונה, שני אנזימים ותזרז שני שלבים רצופים של הנתיב השפלה xylan הוצגו באופן עצמאי על נבגים של B. subtilis , כאשר מודגרות יחד, היו מסוגלים לבצע שני צעדים של השפלה21. נבגים שנאספו לאחר התגובה היו עדיין פעיל, יכולים להמשיך השפלה xylan על התוספת של המצע טריים21. גם אם הפסד של 15% של המוצר הסופי נצפתה ב התגובה השנייה21, שימושית של אנזימים הספוחה לתגובות יחיד, וכן רב שלבי, היא יתרון חשוב נוסף של מערכת התצוגה נבג.
פאן ואח24 דיווח גישה נוספים להצגת חלבונים heterologous על פני השטח נבג: חלבונים heterologous (חלבון endoglucanase ובטא-galactosidase אחד) המיוצר בתא אמא במהלך הנבגה היו באופן ספונטני עטוף במעיל נבג ויוצרים, ללא הצורך של הספק. מערכת תצוגה זו נבג נוספים היא שילוב של שתי הגישות שתוארו עד כה. אכן, זה רקומביננטי מאז החלבונים heterologous היו מהונדסים לבוא לידי ביטוי בתא אמא במהלך הנבגה, בזמן ההרכבה שלהם בתוך המעיל היה ספונטני ו, לכן, nonrecombinant24. עם זאת, היעילות של התצוגה של גישה זו נוספים נשאר להיות נבדק, לעומת שתי הגישות אחרים באמצעות אותם חלבונים heterologous.
בפרוטוקול הנוכחי אינו כולל את תהליכי הייצור נבג, טיהור, אשר היו תיאר בהרחבה במקום אחר24. זה כולל התגובה ספיחה, הערכת היעילות של ספיחה על ידי מיקרוסקופ דוט-סופג, זריחה, וכן מיחזור של אנזימים הספוחה עבור התגובה נוספים סיבובים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ספיחה התגובה
- דגירה 2, 5 ו- 10 µg של mRFP עם 2 x 109 של נבגים מטוהרים פראי-סוג B. subtilis ב 200 µL של איגוד מאגר, 50 מ מ סודיום ציטרט, pH 4.0 (מ מ 16.7 סודיום ציטרט וגופרית והרכבו; חומצה ציטרית 33.3 מ מ) עבור 1 h 25 ° c-מטרף נדנדה (איור 1) .
- Centrifuge את תערובות מחייב (13,000 x g 10 דקות) כדי fractionate כדורי (P2, P5 ו P10), supernatants (S2 S5, S10). אחסן את supernatants עבור הערכת היעילות של ספיחה שמתואר בשלב 3.2 עקיף.
- לשטוף את כדורי 2 x עם 200 µL של איגוד מאגר ו resuspend אותם µL 100 איגוד של מאגר ולהשתמש בו עבור הניתוח הבא.
הערה: איגוד התגובה מעדיפים מתרחשת ערך ה-pH נמוך יותר נקודה איזואלקטרית של החלבון; בדרך כלל, 1.5 M באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS), pH pH 4.0 או 50 מ מ סודיום ציטרט, 4.0, משמשים.
2. ישירה הערכת היעילות של ספיחה
-
מיצוי של חלבונים פני שטח וניתוח תספיג חלבון
- . קח 50 µL של resuspension של mRFP-הספוחה נבגים (P2, P5 ו P10 של צעד 1.3) ולהוסיף 50 µL של 2 x dodecyl נתרן גופרתי (מרחביות)-dithiothreitol (DTT) (0.1 M טריס-HCl, pH 6.8; 2% מרחביות; 0.1 M DTT) כדי solubilize נבג משטח חלבונים.
- השתמש mRFP חינם, מטוהרים תמציות של כמויות זהה של נבגים זה הם לא הספוחה כדי החלבון כפקדי חיוביים ושליליים, בהתאמה.
- אחרי 45 דקות של דגירה ב 65 ° C, centrifuge (13,000 x g 10 דקות) את תערובות ולנתח µL 10 של חילוץ החלבונים (supernatant) על ידי תספיג עם monoclonal נוגדן אנטי שלו לזהות את שלו תג נוכח N-מסוף של mRFP ( איור 2A).
-
מיקרוסקופ פלואורסצנטי תצפיות
הערה: באמצעות חלבונים heterologous פלורסנט או ביצוע ניתוח immunofluorescence, אפשרי להתאים לשפה ולכמת את המולקולות הספוחה על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ.- . קח 5 µL של resuspension של נבגים הספוחה מהשלב 1.3 ולהוסיף µL 95 ל- 1 x PBS, pH 4.0, כדי להשיג ~ 1 x נבגים6 10/µL....
- מקום 5 µL של השעיה בשקופית מיקרוסקופ, לכסות אותו. עם coverslip שטופלו בעבר פולי-l-ליזין ל 30 s, ולבחון אותו תחת מיקרוסקופ זריחה.
- עבור כל שדה, שמור את תמונת מיקרוסקופ שלב החדות ואת תמונת מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית (איור 2B).
הערה: לחלופין, נבגים פלורסנט ניתן לנתח אותם על-ידי cytofluorimetry. Resuspend בסך הכל 106 נבגים הספוחה או לא-הספוחה עם החלבון heterologous של 1 מ"ל של 1 x PBS, pH 4.0, ולנתח את המתלים. באמצעות cytometer של זרימה (איור 2C).
-
ניתוח נתונים באמצעות ImageJ
- פתח את הדימויים מיקרוסקופ זריחה עם תוכנת ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/), ודא כל התמונות הן בתבנית של 8 סיביות (תמונה | סוג | 8 סיביות).
- כוונון הניגודיות במידת הצורך (תמונה | התאם | בהירות ניגודיות), ודא כי קנה המידה של התמונה פיקסל (תמונה | לקבוע קנה מידה).
- מתפריט ' נתח ', בחר לקבוע מידות. ודא כי יש אזור צפיפות משולבת, כלומר ערך אפור שנבחר.
- לצייר קו סביב הנבג עניין תוך שימוש בכל הכלים ציור/בחירה (קרי, מעגל, מצולע, או בצורה חופשית) (איור 3).
- בחר מדד בתפריט נתח (או פגע cmd + M). תיבה מוקפצת עם ערימה של ערכים עבור נבג הראשון הזה מופיע (איור 3).
- חזור על שתי הפעולות הבאות לפחות 50 נבגים אחרים בתוך שדה הראייה נבחר כדי למדוד.
- בחר במספר אזורים ללא כל הנבגים (שיש אין קרינה פלואורסצנטית) וחזור על המדידה; זה יהיה ברקע.
הערה: הגודל הוא לא חשוב. אלו ערכי פלורסצנטיות הרקע המתאים ישמש להפחית באופן ידני את הרקע. - בחר כל הנתונים בחלון תוצאות והעתק את התוצאות לתוך גיליון אלקטרוני.
- לחשב את ממוצעם של צפיפות משולב , אזור של נבגים שנבחרו ואת הערכים פלורסצנטיות רקע ולהשתמש בהם כדי להשיג את פלורסצנטיות סה כלכל-תא המתוקן (CTCF) תוך שימוש בנוסחה: CTCF = משולבים מרושע צפיפות - (כלומר אזור x כלומר רקע זריחה).
הערה: לחלופין, אם כל הנבגים מופיעים מופרדים. ובכן, זה אפשרי לנתח כל נבגים של שדה התמונה באמצעות הפונקציה חלקיקים לנתח, בעקבות ההוראה של ImageJ. כדי למנוע תוכנת קורא פלורסצנטיות ספציפי או נבג אגרגטים, הממד של חלקיקים יש להגדיר ב- pixelˆ2 = 50-200 (איור 4).
3. עקיפה הערכת היעילות של ספיחה
- להכין דילולים טורי עבור חלבון מטוהרים.
- הכן צינור 1.5 mL הראשון המכיל 250 µL של mRFP מטוהרים-ריכוז סופי של 0.5 ng/µL, באמצעות המאגר מחייב. אמצעי אחסון זה מספיקה לטעון שני נתיבים.
- לבצע שישה כפולה טורי דילולים של 250 µL (נפח סופי) כל אחד, באמצעות המאגר מחייב.
- להכין כפולה דילולים טורית על הדגימות supernatant המכיל השבר mRFP לא מאוגד של התגובה ספיחה (S2 S5, S10 מהשלב 1.2).
- מכניסים צינור 1.5 מ ל 100 µL של כל תגובת שיקוע והוסף µL 100 איגוד המאגר. לבצע שישה כפולה טורי דילולים של 200 µL (נפח סופי) כל אחד, באמצעות המאגר מחייב.
- חותכים ניטרוצלולוזה ממברנה (0.45 מיקרומטר הקיצוץ), 9 ס"מ x 10 ס"מ גודל, כך שתכסה את האזור של 5 (מספר דוגמאות) x 6 נקודות (מספר דילולים). הקרום לא יתמשך מעבר לקצה של האטם של המנגנון חשופה נקודה.
- מקם את הקרום prewet המנגנון חשופה נקודה. הסר את כל בועות אוויר לכוד בין הקרום את האטם. לכסות על החלק בחיוב המנגנון עם סרט קלטת או פרפין כדי למנוע אוויר עוברים דרך מאותן בארות.
- להרכיב את המנגנון חשופה נקודה כפי שתואר על ידי היצרן.
- אם ואקום משמש במהלך הרכבת, נתרענן הקרום עם µL 100 ל- PBS x 1 לכל טוב כדי להבטיח הכריכה אחיד של אנטיגן ולמנוע הילות או אות זיהוי חלש.
- הסר בעדינות את המאגר מן הבארות על ידי ואקום. ברגע בופר מנקז כל בארות, לעצור את משאבת ואקום, נתק אותו.
- לטעון את התקן בסמטאות החיצוני ביותר שני והדוגמאות באמצע (איור 5). למלא את ולס המתאימות µL 100 של דילול בכל. באותו אמצעי אחסון המשמש עבור כל טוב עליך לוודא סינון הומוגנית של כל מדגם בארות.
- להפעיל את משאבת ואקום למשך 2 דקות, תפסיק ולאחר מכן, אפשר את הדגימה לסנן דרך הקרום על ידי זרימת הכבידה.
- לשטוף כל הבארות עם µL 100 1 x PBS ולתת משאבת ואקום נוסו על עוד 5 דקות לאחר המאגר כביסה יש כבר מרוקנת לגמרי מן המנגנון.
- עם שואב האבק על, שחרר את הברגים ופתח בזהירות את המנגנון חשופה נקודה.
- לבטל את שואב האבק, לקחת את הקרום, לעבד אותו בעקבות פרוטוקול תספיג חלבון.
- לבצע ניתוח densitometric של המסנן, באמצעות תוכנה מתאימה, כגון ImageJ.
- מודדים את צפיפות משולבת של כל נקודה על ידי חלוקה לרמות אותם עם מעגל באותו האזור באמצעות הפקודה ניתוח/מדד .
- יש לבצע תיקון הרקע של התמונה, ציור מעגל על אזור ריק, מדידת צפיפות משולב שלה או באמצעות הפקודה רקע תהליך/חיסור .
- לתאם צפיפות הנקודות סטנדרטי משולב עם כמות חלבון טעון, לקבל קו כיול (R2 ערכים לצורך כיול עקומות אמורה להסתיים 0.95).
- השתמש את עקומת כיול לשחזר את הריכוז של mRFP של כל נקודה הדגימה.
- חשב את ריכוז mRFP הנותרים בחלקים לא מאוגד.
הערה: כדי להבטיח סגירת הנכון של המנגנון חשופה נקודה ו, לכן, נושא הממברנה כדי לחץ אחיד, הדק את הברגים על-ידי ביצוע ערכה חצה באלכסון, לאחר מכן, פתח את משאבת ואקום להדק את הברגים בצורה חזקה יותר.
4. נבג כלים להשתמש אוסף ולעשות שימוש חוזר
- עבור מיחזור של הנבג הספוחה, לבצע שתי תגובות ספיחה של 2.0 x 109 מטוהרים נבגים עם 10 µg של xylanase GH10-XA מטוהרים או 10 µg של β GH3-XT מטוהרים-xylosidase, כמתואר בצעדים 1.1-1.3 (איור 6א).
- לאסוף את כדורי המכיל אנזים-הספוחה הנבגים, resuspend אותם ב- 50 µL המאגר אופטימלית assay אנזימטי התגובה (50 מ מ מאגר סודיום פוספט ב- pH 6.5; 2.48689 g/L נה2HPO4, 4.88991 g/L NaH2PO4), ומערבבים אותם יחד כדי לקבל תערובת 100 µL של נבגים adsorbing GH10-XA או GH3-XT.
- הוסף את המצע (5 מ"ג/מ"ל 4-O-methyl-d-glucuronod-xylan [MGX]) ותנו תגובות אנזים מתקיימים על h 16-65 מעלות צלזיוס.
- Centrifuge את תערובת התגובה (למשך 15 דקות ב 13,000 x g) ולאחסן את תגובת שיקוע המכיל את המוצר תגובת האנזים.
- Resuspend בגדר ב 100 µL מאגר סודיום פוספט טריים 50 מ מ ב- pH 6.5 בנוכחות מצע חדש (MGX) (ראה תמונה 6B).
הערה: כדי לספוח אנזים אחד או יותר, זה אפשרי כדי לספוח את שניהם יחד או אחד אחד באופן עצמאי. האפשרות השנייה מקלה על ניתוח כמותי של יעילות ספיחה, הפעילות של כל אנזים, המאפשר איזון stoichiometric של כל אנזים הדרוש עבור התגובות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ספיחה מוצלח יכול להיות מוערך על ידי סופג המערבי. על התגובה, התערובת fractionated על ידי צנטריפוגה, שטף, ו השבר גלולה (איור 1) משמש כדי לחלץ את החלבונים משטח. התמצית fractionated על ידי מרחביות לזיהוי בג'ל (עמוד), electrotransferred את קרום פלואוריד (PVDF) polyvinylidene, מחתה כנגד נוגדנים ראשיים ומשניים. נוכחותם של חלבונים של גודל הצפוי, רק בנתיב נטען עם תמצית של נבגים הספוחה, היא מעידה על תגובה ספיחה מוצלחת (איור 2א).
ניתן להעריך את היעילות של התגובה ספיחה על ידי שיטות ישירות ועקיפות. הערכת יעילות ספיחה ישירה תלוי החלבון heterologous שימש והוא יכול להתבצע על ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ (איור 2B) ו cytofluorimetry (איור 2C) על השבר גלולה לאחר fractionation התגובה ספיחה. כימות אותות פלואורסצנט המצויים על הנבגים יכול להתבצע באמצעות התוכנה ImageJ (איור 3 ו- 4 באיור). ניתוח עקיף של יעילות ספיחה יכול להתבצע על ידי נקודה סופג ניתוח (איור 5א) של השבר supernatant המכיל חלבון לא מאוגדים (איור 1). ניתוח densitometric של החלבון לא מאוגדים (איור 5B) ואז יאפשר המדענים לחשב באופן עקיף את כמות החלבונים הספוחה על נבגים.
שתי תגובות רצופות ניתן מזורז על ידי תערובת נבגים הצגת אחד של שני אנזימים ספציפיים (איור 6א). ניתן לאסוף את enzyme(s) הספוחה בצעד צנטריפוגה פשוטה, שטף, מודגרות עם סובסטרט טריים עבור מחזור חדש התגובה (איור 6B).
איור 1:הערכה כללית של הניסוי ספיחה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : ישיר ניתוח של היעילות של התצוגה mRFP. (א) המערבי כתם עם נוגדן ספציפי mRFP. C + = חינם mRFP מטוהרים; C - = תמצית חלבון מכל נבגים לא הספוחה כדי החלבון; P2/P5/P10 = חלבונים מופק B. subtilis נבגים הספוחה עם 2, 5 ו- 10 מ ג של mRFP, בהתאמה. (B) Immunofluorescence מיקרוסקופיה של נבגים הספוחה. Immunoreactions בוצעו עם נוגדן ראשוני של זיהוי החלבון הספוחה ועם של נוגדנים משניים פלורסנט מצומדת עם fluorescein isothiocyanate (FITC). החלונית השמאלית מציגה זריחה אדומה mRFP מהותי, שהחלונית ' נכון ' מציגה את קרינה פלואורסצנטית הירוק של FITC מצומדת נוגדנים משניים. (ג) זורמים cytometric ניתוח של נבגים הספוחה. הנבגים הגיב עם נוגדנים ספציפיים mRFP ועם FITC מצומדת נוגדנים משניים ו, אז, נותחו על ידי cytofluorimetry. הניתוח בוצע על האוכלוסייה כולה נבג (10,000 אירועים, ungated). בחלונית השמאלית, נבגים לא-הספוחה מוצגים שחור, mRFP-הספוחה. נבגים בצבע אדום. הלוח נכון מציג את העלילה נקודה פיזור קדימה ואת הצד (FSC-האס). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: ידנית כימות של האות פלורסנט מאת ImageJ. תמונת מיקרוסקופ זריחה של נבגים, הספוחה עם mRFP חלבון פלואורסצנטי אדום, נותחו בתוכנת ImageJ. עיגול צהוב נשלפה סביב נבג אחד כדי לקבל נתונים densitometric (תמונה מוגדלת) התיבה מוקפצת מציגה את התוצאות של ניתוח densitometric של הנבג שנבחרו. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: בו זמנית כימות של האות פלורסנט מאת ImageJ. (א) קופץ שהושג בעת בחירת חלקיקים לנתח. ערך מרווח זמן של 50-200 פיקסל ^ 2 יש להגדיר עבור נבגים23. (B) פילוח של התמונה של איור 3א לאחר השימוש חלקיקים לנתח (משמאל), ואת תוצאות ניתוח densitometric יחסית (מימין). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5: נקודה סופג וניתוח densitometric. (א) נקודה סופג עם דילולים טורי של mRFP מטוהרים כפילויות (סטיית תקן1 ו Std2), את תגובת שיקוע (S10, S5 ו- S2) התגובה ספיחה הופיעה עם 10, 5 ו 2 µg של mRFP, בהתאמה23. (B) הנקודה סופג של פאנל A משמש עבור הניתוח densitometric. החוגים מציינים את האזור נהגה quantitate הצפיפות של האותות. הפאנל בצד הימין דוחות דוגמה של התוצאות המתקבלות עם הניתוח densitometric. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 6: המרה של xylan על-ידי נבגים לשימוש חוזר. (א) הערכה כללית של השפלה xylan. נבגים (B) הצגת את xylanase או אנזימים β-xylosidase, כאשר מעורבות, לעודד את השפלה שני שלבים של xylan. אחרי התגובה, לדוגמה הוא fractionated על ידי צנטריפוגה. תגובת שיקוע מכיל המוצר התגובה, בעוד בגדר מכיל אנזימים נבג מכורך הניתנים לשימוש חוזר על-ידי הוספת מצע טרי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול זה ספיחה נבג הוא פשוט וברור מאוד. התגובה תלויה אך ורק ה-pH של המאגר התגובה ונמצא היעילות של ספיחה אופטימלית על ערכי pH חומצי (pH 5.0 או נמוכים יותר). ב- pH ניטראלי תנאים, היעילות של ספיחה נמוכה, על ערכי pH אלקליין, ספיחה עלולים להופיע. ספיחה אופטימלית מתקבל באמצעות אמצעי אחסון של µL 200 1.5 mL צינורות (או שמירה על יחס דומה) על נדנדה מטרף.
ספיחה מאוד הדוקה, שוטף באמצעות בופר ב- pH זהה של המאגר התגובה אינם גורמים כל שחרור של החלבונים הספוחה. שוטף עם מאגרי אלקליין עלול לגרום מינימלית (בדרך כלל פחות מ 15%26) שחרורו של החלבון הספוחה.
הערכת היעילות של ספיחה על ידי נקודה סופג עקיף הוא אמין אם דילולים מספר של חלבון מטוהרים והלא מאוגדים הם ניתחו הניתוח densitometric מבוצע כהלכה. אין עדות השפלה של החלבונים heterologous כבר דווח על25. הערכת ישיר היעילות של ספיחה תלויה במידה רבה החלבון הוא הספוחה. אם החלבון הוא autofluorescent או fluorescently שכותרתו, ניתוח בסיוע ImageJ מספקת קביעה כמותית של זריחה ואת הכמויות של מולקולות פלורסנט להציג על הנבג. אם החלבון יש פעילות אנזימטיות, assay אנזימטי ספציפי יכול לספק אינדיקציה על כמויות חלבון נוכח הנבגים. עם זאת, ידוע כי הפעילות האנזימטית מתרחשת המשויך נבגים עשויים להיות מוגברת על ידי אפקט מייצב עקב המפגש עם נבג13. אם החלבון הספוחה אינה פלורסנט אין פעילות אנזימטיות, ניתן להעריך את היעילות של ספיחה על ידי נקודה סופג על נבגים שחולצו בתנאים קיצוניים.
אוסף של נבגים משומש יכול להיעשות על ידי הליך פשוט מאוד. צעד כביסה עם המאגר התגובה עשוי להיות חשוב להסיר את התגובה תוצר לוואי, בעוד התוספת של מצע טרי הוא חיוני כדי ליזום תגובה חדשה21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי "Finanziamento di החיפוש אחר di Ateneo" כדי ל' Baccigalupi, כותרת פרוייקט "SP-LAY: בקטריאלי נבגים כפלטפורמה חיה לתצוגה חלבונים".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1% Poly-L-lysine solution | Sigma | P8920 | |
| 0.45 µm Nitrocellulose Blotting Membrane | Sartorius | M_Blotting_Membranes | |
| 100× objective UPlanF1 | Olympus | microscope equipment | |
| Bacillus subtilis strain NCIB3610 | Bacillus Genetic Stock Center | 3A1 | |
| BD ACCURI C6 PLUS | BD | flow cytometer | |
| BX51 | Olympus | Fluorescent microscope | |
| Clarity | Biorad | 1705060 | |
| DP70 digital camera a | Olympus | microscope equipment | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, FITC | Thermo fisher | F-2754 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) | Abcam | ab6721 | |
| Monoclonal Anti-polyHistidine−Peroxidase antibody | Sigma | A7058-1VL | used to detect adsorbed proteins presenting a 6xhistidine-tag at C- or N- terminal |
| SecureSlip glass coverslip | Sigma | S1815-1PAK | |
| Superwhite Uncharged Microscope Slides | VWR | 75836-190 | |
| U-CA Magnification Changer | Olympus | microscope equipment |
References
- Felici, F., et al. Peptide and protein display on the surface of filamentous bacteriophage. Biotechnology Annual Review. 1, 149-183 (1995).
- Cortese, R., et al. Identification of biologically active peptides using random libraries displayed on phage. Current Opinion in Biotechnology. 6, 73-80 (1995).
- Sousa, C., Cebolla, A., de Lorenzo, V. Enhanced metalloadsorption of bacterial cells displaying poly-His peptides. Nature Biotechnology. 14, 1017-1020 (1996).
- Richins, R., Kaneva, I., Mulchandani, A., Chen, W. Biodegradation of organophosphorus pesticides by surface-expressed organophosphorus hydrolase. Nature Biotechnology. 15, 984-987 (1997).
- Wu, J. Y., et al. Expression of immunogenic epitopes of hepatitis B surface antigen with hybrid flagellin proteins by a vaccine strain of Salmonella. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86, 4726-4730 (1989).
- Newton, S. M., Jacob, C. O., Stocker, B. A. Immune response to cholera toxin epitope inserted in Salmonella flagellin. Science. 244, 70-72 (1989).
- Fischetti, V. A., Medaglini, D., Pozzi, G. Gram-positive commensal bacteria for mucosal vaccine delivery. Current Opinion in Biotechnology. 7, 659-666 (1996).
- Isticato, R., Ricca, E.
- Ricca, E., et al. Mucosal vaccine delivery by non-recombinant spores of Bacillus subtilis. Microbial Cell Factories. 13, 115 (2014).
- McKenney, P. T., Driks, A., Eichenberger, P. The Bacillus subtilis assembly and functions of the multilayered coat. Nature Reviews Microbiology. 11, 33-44 (2013).
- Knecht, L. D., Pasini, P., Daunert, S. Bacterial spores as platforms for bioanalytical and biomedical applications. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 400, 977-989 (2011).
- Isticato, R., Cangiano, G., De Felice, M., Ricca, E. Display of molecules on the spore surface. Bacterial Spore Formers: Probiotics and Emerging Applications. Ricca, E., Henriques, A. O., Cutting, S. M. , Horizon Bionsciences. Norfolk, UK. 193-200 (2004).
- Sirec, T., et al. Adsorption of β-galactosidase of Alicyclobacillus acidocaldaricus wild type and mutant spores of Bacillus subtilis. Microbial Cell Factories. 11, 100 (2012).
- Cutting, S. M.
- Baccigalupi, L., Ricca, E., Ghelardi, E. Non-LAB Probiotics: Spore Formers. Probiotics and Prebiotics: Current Research and Future Trends. Venema, K., Do Carmo, A. P. , Caister Academic Press. 93-103 (2014).
- Cutting, S. M., Hong, H. A., Baccigalupi, L., Ricca, E. Oral Vaccine Delivery by Recombinant Spore Probiotics. International Reviews of Immunology. 28, 487-505 (2009).
- Lee, S. Y., Choi, J. H., Xu, Z.
- Isticato, R., et al. Surface display of recombinant proteins on Bacillus subtilis spores. Journal of Bacteriology. 183, 6294-6301 (2001).
- Huang, J. M., et al. Mucosal delivery of antigens using adsorption to bacterial spores. Vaccine. 28, 1021-1030 (2010).
- Isticato, R., et al. Non-recombinant display of the B subunit of the heat labile toxin of Escherichia coli wild type and mutant spores of Bacillus subtilis. Microbial Cell Factories. 12, 98 (2013).
- Mattossovich, R., et al. Conversion of xylan by recyclable spores of Bacillus subtilis thermophilic enzymes. Microbial Cell Factories. 16, 218 (2017).
- Pesce, G., et al. Surface charge and hydrodynamic coefficient measurements of Bacillus subtilis by optical tweezers. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 116, 568-575 (2014).
- Donadio, G., et al. Localization of a red fluorescence protein adsorbed on wild type and mutant spores of Bacillus subtilis. Microbial Cell Factories. 15, 153 (2016).
- Pan, J. G., Choi, S. K., Jung, H. C., Kim, E. J. Display of native proteins on Bacillus subtilis spores. FEMS Microbiology Letters. 358, 209-217 (2014).
- Cutting, S., Vander Horn, P. B. Genetic analysis. Molecular Biological Methods for Bacillus. Harwood, C., Cutting, S. , John Wiley & Sons. Chichester, UK. (1990).
- Lanzilli, M., et al. Display of the peroxiredoxin Bcp1 of Sulfolobus solfataricus probiotic spores of Bacillus megaterium. New Biotechnology. 46, 38 (2018).
