Adsorção de esporos, como um sistema de exibição Nonrecombinant por enzimas e antígenos

Summary

Este protocolo incide sobre o uso de esporos bacterianos como uma ferramenta de “ao vivo” nanobiotechnological para adsorver moléculas heterólogos com várias atividades biológicas. Também são mostrados os métodos para medir a eficiência da adsorção.

Abstract

O esporo bacteriano é uma célula metabolicamente quiescente, formada por uma série de camadas protetoras cercando uma citoplasma desidratada. Essa estrutura peculiar faz com que o esporo extremamente estável e resistente e tem sugeriu o uso do esporo como uma plataforma para exibir moléculas heterólogos. Até agora, uma variedade de enzimas e antígenos tenham sido exibidos em esporos de Bacillus subtilis e de algumas outras espécies, inicialmente por uma abordagem recombinante e, em seguida, por um simples e eficiente método de nonrecombinant. O sistema de exibição nonrecombinant baseia-se a adsorção direta de heterólogos moléculas sobre a superfície do esporo, evitando a construção de cepas recombinantes e a liberação de bactérias geneticamente modificadas no ambiente. Adsorvida moléculas são estabilizadas e protegidas pela interação com esporos, que limita a degradação rápida dos antígenos e a perda da atividade da enzima em condições desfavoráveis. Uma vez utilizado, esporo-adsorvido enzimas podem ser facilmente coletadas com uma redução mínima de atividade e reutilizadas para rodadas adicionais de reação. Neste trabalho é mostrado como adsorver moléculas modelo para purificado esporos de b. subtilis, como avaliar a eficiência de adsorção e como coletar esporos usados para reciclá-los para novas reações.

Introduction

Sistemas de visualização visam apresentar moléculas biologicamente ativas na superfície de microorganismos e encontrando aplicações em uma variedade de campos, de industrial de biotecnologia médica e ambiental. Além do fago^1,2 e células de vários Gram – positivo e espécie^3,4,5,6,7, esporos bacterianos foram também proposto como sistemas de exposição por duas abordagens^8,9.

Devido à sua estrutura peculiar, ou seja uma citoplasma desidratada rodeada por uma série de camadas protetoras¹⁰, o esporo oferece várias vantagens em fago – e baseada em célula exibir sistemas^8,9. Uma primeira vantagem vem da extrema robustez e estabilidade de esporos em condições que seriam deletérios para todas as outras células^10,11. Enzimas e antígenos de esporo é exibido são estáveis, após prolongado armazenamento em temperatura ambiente¹² e protegida da degradação em pH baixo e altas temperaturas¹³. Uma segunda vantagem dos esporos é a segurança de muitas espécies formadoras de esporos. B. subtilis, b. clausii, b. coagulanse várias outras espécies são utilizados mundialmente como probióticos e tem sido no mercado para uso humano ou animal por décadas^14,15. Este registro de segurança excepcional é um requisito geral óbvio para um sistema de exibição de superfície e é de particular relevância quando o sistema se destina para uso humano ou animal¹⁶. Um terceiro, vantagem importante de um sistema de vídeo baseados em esporo é que não tem limitações para o tamanho da molécula que tem que ser exposto. Em sistemas baseados no fago, uma grande proteína heteróloga pode afetar a estrutura do capsídeo, enquanto em sistemas baseados em células, podem afetar a estrutura da membrana ou podem limite/afectar a membrana translocação passo¹⁷. As camadas protetoras em torno do germe são compostas de mais de 70 diferentes proteínas¹⁰ e são flexíveis o suficiente para aceitar grandes proteínas estrangeiras sem qualquer defeito estrutural evidente ou comprometimento funcional⁸. Além disso, com ambos os sistemas de vídeo baseados em esporos, a translocação da membrana da proteína heteróloga não é necessário^8,9. Na verdade, proteínas heterólogos são produzidas no citoplasma da célula-mãe e montadas o Spore que está se formando no mesmo citoplasma ou adsorvido no esporo maduro^8,9.

Exposição de esporos obteve-se, inicialmente, através do desenvolvimento de um sistema genético para a superfície do esporo¹⁸de engenheiro. Este sistema genético baseou-se na eu) a construção de uma fusão do gene entre o gene que codifica para uma proteína de casaco de esporos (usada como um porta-aviões) e o gene que codifica para a proteína a ser exibido – a presença dos sinais do endógeno transcriptional e translacionais Gene controlará a expressão da fusão e ii) integração do gene quimérico no cromossomo b. subtilis conceder estabilidade genética. Uma variedade de enzimas e antígenos tem sido exibido por esta abordagem recombinante, usando várias proteínas de superfície de esporos como portadores e visando diversas aplicações potenciais, que variam de vacina da mucosa a biocatalisador, biosensor, biorremediação, ou bioanalíticos ferramenta^8,13.

Mais recentemente, uma abordagem diferente da exposição de esporos tem sido desenvolvidos¹⁹. Este segundo sistema é nonrecombinant e baseia-se na adsorção de moléculas sobre a superfície do esporo⁹espontânea e extremamente apertada. Antígenos^19,20 e enzimas^13,21 tenham sido exibidos de forma eficiente e revelaram que este método é significativamente mais eficiente do que a recombinação. Essa abordagem nonrecombinant permite a exibição das proteínas em forma nativa²⁰ e também pode ser usada com autoclavados, esporos de morte¹⁹. O mecanismo molecular de adsorção tem não foi totalmente esclarecido ainda. A carga negativa e a hidrofobicidade dos esporos foram propostas como propriedades relevantes para a adsorção de^13,19,22. Recentemente, demonstrou-se que uma proteína de modelo, a proteína de autofluorescent vermelho (mRFP) do coral Discosoma, quando adsorvido para o spore, foi capaz de se infiltrar através das camadas superficiais, localizando-se no revestimento interno²³. Se provou verdadeiro para outras proteínas, a localização interna das proteínas heterólogos pode explicar sua estabilidade aumentada quando adsorvido a esporos²³.

Em um estudo recente, duas enzimas catalisando duas etapas sucessivas da via de degradação de xilana independentemente foram exibidas em esporos de b. subtilis em, quando incubados juntos, foram capazes de realizar as duas etapas de degradação²¹. Esporos recolhidos após a reação foram ainda ativo e capaz de continuar a degradação de xilana mediante a adição de substrato fresco²¹. Mesmo que a segunda reação²¹, observou-se uma perda de cerca de 15% do produto final, a reusabilidade das enzimas adsorvidas para reações simples, bem como várias etapas, é uma vantagem adicional importante do sistema de exposição de esporos.

Pan et al²⁴ relatou uma abordagem adicional para exibir heterólogos proteínas sobre a superfície do esporo: proteínas heterólogos (uma proteína de palha e uma beta-galactosidase um) produzidas na célula mãe durante esporulação eram espontaneamente envolto no casaco formando esporos, sem a necessidade de uma operadora. Este sistema de exibição adicionais esporo é uma combinação das duas abordagens descritas até agora. De fato, é recombinante desde as proteínas heterólogos foram projetadas para ser expressa em células-mãe durante esporulação, enquanto seu assembly dentro do casaco foi espontânea e, portanto, nonrecombinant²⁴. No entanto, a eficiência da exposição desta abordagem adicional permanece para ser testadas e comparadas com as outras duas abordagens usando as mesmas proteínas heterólogos.

O presente protocolo exclui os processos de produção de esporos e purificação, que tem sido extensivamente em outros lugares descritos²⁴. Inclui a reação de adsorção, a avaliação da eficiência de adsorção por microscopia-mancha do ponto e fluorescência, e a reciclagem de enzimas adsorvidas por reação adicional rodadas.

Protocol

1. reação de adsorção Incubar a 2, 5 e 10 µ g de mRFP com 2 x 109 de b. subtilis spores purificados do selvagem-tipo em 200 µ l de binding buffer, citrato de sódio 50 mM, pH 4.0 (16,7 mM citrato de sódio di-hidratado, ácido cítrico de 33,3 mM) por 1h a 25 ° C, num balanço agitador (Figura 1) . Centrifugar as misturas de vinculação (13.000 x g durante 10 minutos) para fractionate Pelotas (P2, P5 e P10) e sobrenadantes (S2, S5 e S1…

Representative Results

Adsorção de sucesso pode ser avaliada pela mancha ocidental. Após a reação, a mistura é fracionada por centrifugação e lavada, e a fração de pelota (Figura 1) é usada para extrair as proteínas de superfície. O extrato é fracionado por eletroforese em gel de poliacrilamida SDS (página), electrotransferred a uma membrana de polivinilideno (PVDF) de flúor e reagiu contra anticorpos primários e secundários. A presença de proteínas do tamanho e…

Discussion

Este protocolo de adsorção de esporos é muito simples e direto. A reação é estritamente dependente do pH do buffer de reação e a eficiência da adsorção é ideal em valores de pH ácido (pH 5.0 ou inferior). Em condições de pH neutro, a eficiência da adsorção é baixa, e em valores de pH alcalino, a adsorção pode não ocorrer. Adsorção ideal é obtida usando um volume de 200 µ l em tubos de 1,5 mL (ou mantendo uma relação semelhante) num agitador de balanço.

Adsorção ?…

Materials

0.1% Poly-L-lysine solution	Sigma	P8920
0.45 µm Nitrocellulose Blotting Membrane	Sartorius	M_Blotting_Membranes
100× objective UPlanF1	Olympus	microscope equipment
Bacillus subtilis strain NCIB3610	Bacillus Genetic Stock Center	3A1
BD ACCURI C6 PLUS	BD	flow cytometer
BX51	Olympus	Fluorescent microscope
Clarity	Biorad	1705060
DP70 digital camera a	Olympus	microscope equipment
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, FITC	Thermo fisher	F-2754
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP)	Abcam	ab6721
Monoclonal Anti-polyHistidine−Peroxidase antibody	Sigma	A7058-1VL	used to detect adsorbed proteins presenting a 6xhistidine-tag at C- or N- terminal
SecureSlip glass coverslip	Sigma	S1815-1PAK
Superwhite Uncharged Microscope Slides	VWR	75836-190
U-CA Magnification Changer	Olympus	microscope equipment