Summary
Denne protokollen fokuserer på bruk av bakteriell spores som et "live" nanobiotechnological-verktøy for å adsorberes heterologous molekyler med ulike biologiske aktiviteter. Metodene for å måle effektiviteten av adsorpsjon vises også.
Abstract
Bakteriell spore er en metabolically quiescent celle, dannet av en rekke beskyttende lag rundt en dehydrert cytoplasma. Denne særegne strukturen gjør spore ekstremt stabil og motstandsdyktig og har foreslått bruk av spore som en plattform for å vise heterologous molekyler. Så langt, en rekke antigener og enzymer har vært vist på sporer av Bacillus subtilis og noen andre arter, først med en rekombinant tilnærming, og deretter, etter en enkel og effektiv nonrecombinant metode. Nonrecombinant skjermsystemet er basert på direkte opptak av heterologous molekyler på spore overflaten, unngå bygging av rekombinant stammer og utgivelsen av genmodifiserte bakterier i miljøet. Adsorbert molekyler er stabilisert og beskyttet av samspillet med sporer, som begrenser rask nedbrytning av antigener og tap av enzym aktivitet i ugunstige forhold. Når utnyttes, kan spore-adsorbert enzymer samlet lett med minimal reduksjon av aktivitet og gjenbrukes for flere reaksjon runder. I dette papiret vises slik adsorberes modell molekyler å renset sporer av B. subtilis, hvordan man skal vurdere effektiviteten av adsorpsjon og hvordan du samler brukt spores for å resirkulere dem for nye reaksjoner.
Introduction
Displaysystemer er rettet mot presentere biologisk aktive molekyler på overflaten av mikroorganismer og finne programmer i en rekke felt, fra industriell til medisinsk og miljømessige bioteknologi. I tillegg til phages1,2 og cellene i ulike Gram-negative og -positive arter3,4,5,6,7, har bakteriell sporer også vært foreslått som displaysystemer med to tilnærminger8,9.
På grunn av sin særegne struktur, nemlig en dehydrert cytoplasma omgitt av en rekke beskyttende lag10, gir spore flere fordeler sammenlignet med phage - og celle-baserte display systemer8,9. En første fordel kommer fra den ekstreme robusthet og stabilitet av sporer på forhold som ville være skadelig for alle andre celler10,11. Spore vises antigener og enzymer er stabile etter langvarig lagring ved romtemperatur12 og beskyttet mot fornedrelse ved lav pH og høye temperaturer13. En annen fordel med sporene er sikkerheten til mange spore-forming arter. B. subtilis, B. clausii, B. coagulans, og flere andre arter brukes verden over som probiotika og har vært på markedet for mennesker eller dyr bruk for tiår14,15. Dette eksepsjonelle sikkerhet posten er en opplagt generelle forutsetning for et overflaten skjermsystem og er spesielt relevant når systemet er ment for mennesker eller dyr Bruk16. En tredje er viktig fordel av en spore-baserte vise system at den ikke har begrensninger for størrelsen av molekylet som utsettes. I phage-baserte systemer, et stort heterologous protein kan påvirke strukturen av kapsid, mens celle-baserte systemer den kan påvirke strukturen i membranen eller grense/forlengelsesslanger membran translokasjon trinn17. Beskyttende lag rundt spore består av mer enn 70 ulike proteiner10 og er fleksible nok til å akseptere store utenlandske proteiner uten tydelig strukturelle feil eller nedsatt fysisk funksjon8. I tillegg med systemene spore-baserte vise er membran translokasjon av heterologous protein ikke nødvendige8,9. Faktisk er heterologous proteiner enten produsert i mor cellen cytoplasma og montert på spore som danner i samme cytoplasma eller adsorbert på eldre spore8,9.
Spore skjermen ble først innhentet av utvikle en genetisk system til ingeniør spore overflaten18. Denne genetiske systemet var basert på jeg) bygging av en genet fusjon genet koding for en spore pels protein (brukes som en bærer) og gene koding for protein skal vises - tilstedeværelsen av transcriptional og translasjonsforskning signalene fra den endogene Gene vil kontrollere uttrykket av fusion og ii) integrering av chimeric genet på B. subtilis kromosomet gi genetisk stabilitet. En rekke antigener og enzymer har blitt vist av denne rekombinant tilnærming, med ulike spore overflaten proteiner som bærere og sikte på ulike potensielle programmer, alt fra mucosal vaksine biocatalyst, biosensor, bioremediation, eller bioanalytical verktøyet8,13.
En annen tilnærming av spore har nylig vært utviklet19. Dette andre systemet nonrecombinant og avhengig av spontan og stramt opptak av molekyler på spore overflaten9. Antigener19,20 og enzymer13,21 har vist effektivt og har avdekket at denne metoden er betydelig mer effektiv enn den rekombinante. Denne nonrecombinant kan vise proteiner i opprinnelige form20 og kan også brukes med autoklaveres, død sporer19. Molekylær mekanisme adsorpsjon er ikke fullt avklart ennå. Negativ ladning og hydrophobicity av spore har blitt foreslått som egenskaper relevante for adsorpsjon13,19,22. Nylig har det vært vist at en modell protein, røde autofluorescent protein (mRFP) av den coral Discosoma, når adsorbert å spore, klarte å infiltrere gjennom overflaten lag lokalisere i indre lag23. Hvis viste gjelder for andre proteiner, kunne den interne lokaliseringen av heterologous proteiner forklare deres økt stabilitet når adsorbert sporer23.
I en fersk studie, enzymene utløse to påfølgende trinnene i xylan fornedrelse veien var uavhengig vises på sporer av B. subtilis og når ruges sammen, kunne utføre begge fornedrelse trinnene21. Sporer samlet etter reaksjonen var fortsatt aktiv og kan fortsette xylan nedbrytning etter tillegg av fersk substrat21. Selv om et tap på rundt 15% av det endelige produktet ble observert i andre reaksjon21, er gjenbruk av adsorbert enzymer for enkelt, samt flere trinn, reaksjoner en ekstra viktig fordel av spore display system.
Pan et al.24 rapportert flere tilnærming vise heterologous proteiner spore overflaten: heterologous proteiner (en endoglucanase protein og en beta-galactosidase en) produsert i mor cellen under sporulation var spontant innkapslet i forming spore pelsen, uten behovet av en operatør. Denne ekstra spore display system er en kombinasjon av metodene beskrevet så langt. Faktisk er det rekombinant siden heterologous proteiner var konstruert for å bli uttrykt i mor cellen under sporulation, mens deres montering i pelsen var spontan og derfor nonrecombinant24. Effektiviteten av visningen av denne ekstra imidlertid å være testet og sammenliknet med andre metodene ved hjelp av samme heterologous proteiner.
Nåværende protokollen ekskluderer produksjonsprosesser spore og rensing, som har vært beskrevet mye andre steder24. Det inkluderer adsorpsjon reaksjonen, evaluering av effektiviteten av adsorpsjon av dot-blotting og fluorescens mikroskopi, og resirkulering av adsorbert enzymer for ekstra reaksjon runder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. adsorpsjon reaksjon
- Inkuber 2, 5 og 10 µg av mRFP med 2 x 109 av B. subtilis vill-type renset sporer i 200 µL av bindende buffer, 50 mM natriumsitrat, pH 4.0 (16,7 mM natriumsitrat dihydrate, 33.3 mM sitronsyre) 1t ved 25 ° C på en rocking shaker (figur 1) .
- Sentrifuge bindende blandinger (13 000 x g i 10 min) å smuldre vekk pellets (P2 P5 og P10) og supernatants (S2, S5 og S10). Lagre supernatants for indirekte vurdering av effektiviteten av adsorpsjon beskrevet i trinn 3.2.
- Vask pellets 2 x med 200 µL av bindende buffer og resuspend dem i 100 µL av binding bufferen og bruke det i neste analysen.
Merk: Binding reaksjonen fortrinnsvis oppstår på en pH-verdi som er lavere enn isoelectric poenget med protein; vanligvis 1,5 M fosfat-bufret saltvann (PBS), pH 4.0 eller 50 mM natriumsitrat, pH 4.0 brukes.
2. direkte evaluering av effektiviteten av adsorpsjon
-
Utvinning av overflaten proteiner og western blot analyse
- Ta 50 µL av mRFP-adsorbert spores rørets (P2 P5 og P10 trinn 1.3) og legge 50 µL av 2 x natrium dodecyl sulfate (SDS)-dithiothreitol (DTT) (0.1 M Tris-HCl, pH 6.8; 2% SDS, 0.1 M DTT) til solubilize overflaten spore proteiner.
- Bruk gratis, renset mRFP og ekstrakter av den samme mengden spores som ikke er adsorbert til protein som positive og negative kontroller, henholdsvis.
- Etter 45 minutter med inkubering på 65 ° C, sentrifuge (13 000 x g i 10 min) blandinger og analysere 10 µL av utdraget proteiner (supernatant) ved western blot med monoklonalt anti-hans antistoff anerkjenne hans etiketten på N-terminal av mRFP ( Figur 2A).
-
Fluorescerende mikroskopi observasjoner
Merk: Ved å bruke fluorescerende heterologous proteiner eller en immunofluorescence analyse, er det mulig å lokalisere og kvantifisere adsorbert molekyler av fluorescens mikroskopi.- Ta 5 µL av adsorbert spores rørets fra trinn 1.3 og legge 95 µL av 1 x PBS, pH 4.0, hente ~ 1 x 106 sporer/µL.
- Sted 5 µL av suspensjon på et mikroskop lysbilde, dekke det med en dekkglassvæske som tidligere er behandlet med poly-l-lysine for 30 s, og observere det under fluorescens mikroskop.
- For hvert felt, kan du lagre kontrast mikroskopi bildet og fluorescens mikroskopi bildet (figur 2B).
Merk: Alternativt fluorescerende sporer kan analyseres av cytofluorimetry. Resuspend totalt 106 sporer adsorbert eller ikke-adsorbert med heterologous proteinet i 1 mL 1 x PBS, pH 4.0 og analysere ved hjelp av en flyt cytometer (figur 2C) suspensjon.
-
Dataanalyse ved hjelp av ImageJ
- Åpne mikroskopi fluorescens med ImageJ programvare (http://rsbweb.nih.gov/ij/) og kontroller at alle bildene er i 8-biters format (bilde | Type | 8-biters).
- Juster kontrasten (bilde | Justere | Lysstyrke kontrast) og kontroller at omfanget av bildet er PIXEL (bilde | Angi skala).
- Analyser-menyen, velg Angi mål. Pass på at , Integrert tetthetog Mener grå verdien som er valgt.
- Tegne en linje rundt spore rundt med et tegning/utvalg (dvs., sirkel, polygon eller en frihåndstegning) (Figur 3).
- Velg mål i analyser-menyen (eller finne cmd + M). Et popup-boksen med en bunke med verdier for denne første spore vises (Figur 3).
- Gjenta disse to trinnene for minst 50 andre sporer i synsfeltet valgt som skal måles.
- Velg flere områder uten noen sporer (som har ingen fluorescens) og gjenta målingen; Dette vil være bakgrunnen.
Merk: Størrelsen er ikke viktig. Disse tilsvarende bakgrunn fluorescens verdiene brukes manuelt trekke fra bakgrunnen. - Velg alle data i resultatvinduet og kopiere resultatene til et regneark.
- Beregner gjennomsnittet av Integrert tettheten og området valgte spores og bakgrunn fluorescens verdiene og bruke dem til å få den korrigert totalt per celle fluorescensen (CTCF) ved hjelp av formelen: CTCF = mener integrert Tetthet - (mener området x mener bakgrunnen fluorescens).
Merk: Alternativt, hvis alle spores vises godt adskilt, er det mulig å analysere alle spores i bildefeltet funksjonen Analysere partikleretter Imagejs instruksjon. For å unngå at programvaren leser en bestemt fluorescens eller spore aggregater, dimensjonen av partikler må angis på pixelˆ2 = 50-200 (Figur 4).
3. indirekte vurdering av effektiviteten av adsorpsjon
- Klargjør fortsettelsene fortynninger for renset protein.
- Forberede en første 1,5 mL tube med 250 µL av renset mRFP på en siste konsentrasjon på 0,5 ng/µL, bruke bindende bufferen. Dette er tilstrekkelig til å laste inn to baner.
- Utføre seks todelt føljetong fortynninger av 250 µL (siste volum) hver, med binding bufferen.
- Forberede todelt føljetong fortynninger for supernatant prøvene som inneholder ubundet mRFP brøkdel av adsorpsjon reaksjonen (S2, S5 og S10 fra trinn 1.2).
- Sett 100 µL av hver nedbryting i en 1,5 mL tube og tilsett 100 µL bindende bufferen. Utføre seks todelt føljetong fortynninger av 200 µL (siste volum) hver, med binding bufferen.
- Skjær en nitrocellulose membran (0,45 µm cutoff), 9 cm x 10 cm i størrelse, å 5 (antall eksempler) x 6 (antall fortynninger) prikker. Membranen skal ikke gå utenfor kanten av pakningen av dot blot apparater.
- Plass prewet membranen i dot blot apparatet. Fjern eventuelle luftbobler fanget mellom membranen og pakningen. Dekke den ubrukte delen av apparatet med bånd eller parafin film hindre at luft beveger seg gjennom de brønnene.
- Samle dot blot apparatet som beskrevet av produsenten.
- Hvis en vakuum brukes under montering, rehydrate membranen med 100 µL av 1 x PBS per brønn å sikre ensartet binding av antigen og forhindre halos eller et svakt oppdagelsen signal.
- Fjern bufferen fra brønnene av vakuum. Så snart buffer løsning tømmer alle brønnene, slutter vakuumpumpe og koble den.
- Last standarden i de to mest eksterne banene og prøvene i midten (figur 5). Fylle riktig brønnene med 100 µL av hver fortynning. Samme volum brukes for hver brønn skal sikre en homogen filtrering av alle utvalg.
- Aktivere vakuumpumpe i 2 minutter, stoppe det, og deretter la prøve å filtrere gjennom membranen av gravitasjon flow.
- Vask alle brønnene med 100 µL av 1 x PBS og la vakuumpumpe løpe for en annen 5 min etter vask bufferen har drenert fra apparatet.
- Løsne skruene vakuum på, og nøye åpne dot blot apparatet.
- Slå av vakuum, ta membranen og behandle den etter en western blot protokoll.
- Utføre en densitometric analyse av filteret, passende programvare, for eksempel ImageJ.
- Måle integrerte tettheten av hvert punkt beskriver dem med en sirkel av samme område og bruke kommandoen Analyser/mål .
- Korrigere bakgrunnen av bildet, tegne en sirkel i et tomt område og måle dens integrert tetthet eller bruke kommandoen Prosessen/trekk fra bakgrunn .
- Koordinere integrert tettheten av standard prikker med mengden lastet protein og få en kalibrering linje (R2 verdier for kalibrering kurver være over 0,95).
- Bruk kalibreringskurven for å ekstrapolere konsentrasjonen av mRFP av hvert eksempel punkt.
- Beregn konsentrasjonen av mRFP igjen i ubundet fraksjoner.
Merk: for å sikre korrekt avslutning av dot blot apparater, og derfor faget membranen til et ensartet press, stramme skruene ved å følge et diagonalt krysset oppsett og deretter åpner vakuumpumpe å stramme skruene sterkere.
4. spore samling og bruke
- Resirkulering av adsorbert spore, utføre to adsorpsjon reaksjoner på 2,0 x 109 renset sporer med 10 µg av renset GH10-XA-xylanase eller 10 µg av renset GH3-XT β-xylosidase, som beskrevet i trinn 1,1-1,3 (figur 6en).
- Samle pellets som inneholder enzym-adsorbert spores, resuspend dem i 50 µL optimal bufferstørrelsen for den enzymatiske reaksjonen analysen (50 mM natrium fosfatbuffer ved pH 6,5, 2.48689 finans Na2HPO4, 4.88991 finans NaH2PO4), og bland dem sammen for å få en 100 µL blanding av sporer adsorbing GH10-XA eller GH3-XT.
- Legg underlaget (5 mg/mL 4-O-methyl-d-glucuronod-xylan [MGX]) og la enzym reaksjonene skje etter 16 h på 65 ° C.
- Sentrifuge reaksjonsblandingen (i 15 min 13 000 x g) og lagre nedbryting som inneholder enzym reaksjon produktet.
- Resuspend pellet i 100 µL av fersk 50 mM natrium fosfatbuffer ved pH 6,5 i nærvær av en ny substrat (MGX) (figur 6B).
Merk: for å adsorberes flere enzym, er det mulig å adsorberes begge sammen eller enkeltvis uavhengig. Sistnevnte muligheten forenkler kvantitativ analyse av adsorpsjon effektiviteten og aktiviteten til hver enzym, slik at en stoichiometric balanse mellom hver enzym nødvendig for reaksjonene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vellykket adsorpsjon kan vurderes av vestlige blotting. På reaksjonen, blandingen er fraksjonert med sentrifugering og vasket, og pellets brøken (figur 1) brukes til å hente overflaten proteiner. Ekstraktet er fraksjonert av SDS polyakrylamid gel geleelektroforese (side), electrotransferred til en polyvinylidene fluor (PVDF) membran, og reagerte mot primære og sekundære antistoffer. Tilstedeværelsen av proteiner av forventede størrelsen, bare i kjørefelt lastet med et utdrag av adsorbert spores, er et tegn på en vellykket adsorpsjon reaksjon (figur 2A).
Effektiviteten av adsorpsjon reaksjonen kan bli vurdert av direkte og indirekte metoder. Direkte evalueringen av adsorpsjon effektiviteten avhenger av heterologous protein som har blitt brukt og kan utføres av fluorescens mikroskopi (figur 2B) og cytofluorimetry (figur 2C) på pellet brøken etter fraksjoneres av adsorpsjon reaksjonen. En kvantifisering fluorescerende signaler på sporer kan utføres ved hjelp av ImageJ programvaren (Figur 3 og Figur 4). En indirekte analyse av adsorpsjon effektiviteten kan utføres av en prikk blotting analyse (figur 5et) av supernatant delen inneholder ubundet protein (figur 1). En densitometric analyse av ubundet protein (figur 5B) gjør deretter forskere til å beregne indirekte mengden av protein adsorbert på sporene.
To påfølgende reaksjoner kan være katalysert av en blanding av sporer viser ett av de to spesielle enzymene (figur 6en). Den adsorbert enzyme(s) kan samles med en enkel sentrifugering trinn, vasket, og inkubert med fersk substrat for en ny reaksjon syklus (figur 6B).
Figur 1:generelle ordningen av adsorpsjon eksperimentet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Direkte analyse av effektiviteten av displayet mRFP. (A) Western blot med mRFP-spesifikke antistoffer. C ++ = gratis renset mRFP; C - = en protein ekstrakt fra sporer ikke adsorbert protein; P2/P5/P10 = proteiner utvunnet fra B. subtilis sporer adsorbert med 2, 5 og 10 mg mRFP, henholdsvis. (B) Immunofluorescence mikroskopi adsorbert sporer der. Immunoreactions ble utført med en primær antistoff gjenkjenne adsorbert protein og med et fluorescerende sekundære antistoff konjugert med fluorescein isothiocyanate (FITC). Informasjonsvinduet viser den røde iboende mRFP fluorescensen, på høyre side viser grønne fluorescens FITC-konjugerte sekundære antistoff. (C) Flow cytometric analyse av adsorbert sporer. Spores reagerte med mRFP-spesifikke antistoffer og FITC-konjugerte sekundære antistoffer og deretter ble analysert av cytofluorimetry. Analyse var utført på hele spore befolkningen (10.000 hendelser, ungated). Venstre panel vises ikke-adsorbert sporer i svart, mRFP-adsorbert sporer i rødt. Panelet til høyre viser frem og side xy (FSC-SSC) dot tomten. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: manuell kvantifisering av fluorescerende av ImageJ. En fluorescens mikroskop bilde av sporer, adsorbert med røde fluorescerende protein mRFP, analysert med ImageJ programvare. En gul sirkel er trukket rundt en spore å anskaffe densitometric (forstørret bilde). Popup-boksen viser resultatene av densitometric analyse av den valgte spore. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: samtidige kvantifisering av fluorescerende av ImageJ. (A) Popup-boksen oppnådd når du velger Analysere partikkel. En Intervallverdi av 50-200 pixel ^ 2 må være satt til sporer23. (B) segmentering av bildet av Figur 3A etter å Analysere partikler (venstre) og de relative densitometric analyseresultatene (høyre). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Dot blotting og densitometric analyse. (A) Dot blotting med føljetong fortynninger av det renset mRFP kopi (Std1 og Std2) og nedbryting (S10 S5 og S2) av adsorpsjon reaksjon med 10, 5 og 2 µg av mRFP, henholdsvis23. (B) dot blotting panelet A brukes for densitometric analyse. Sirklene viser området som brukes til quantitate tetthet av signaler. Panelet til høyre rapporterer et eksempel på resultatene med densitometric analysen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: konvertering av xylan av gjenbrukbare sporer. (A) generelle ordningen med xylan fornedrelse. (B) sporer viser xylanase eller β-xylosidase enzymer, når blandet sammen, katalysere i two-step nedbrytning av xylan. Etter reaksjon er prøven fraksjonert med sentrifugering. Nedbryting inneholder reaksjon produktet, mens pellet inneholder spore-bundet enzymer som kan gjenbrukes ved å legge friske substrat. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne spore adsorpsjon protokollen er svært enkel og grei. Reaksjonen er strengt avhengig pH i bufferen som reaksjon og effektiviteten av adsorpsjon er optimal på surt pH-verdier (pH 5.0 eller lavere). På nøytral pH forhold, effektiviteten av adsorpsjon er lav, og på alkaliske pH-verdier, adsorpsjon forekomme. Optimal adsorpsjon oppnås med et volum på 200 µL i 1,5 mL rør (eller holde et lignende forhold) på en rocking shaker.
Adsorpsjon er svært stramt, og vasker med en buffer på samme pH i bufferen som reaksjon forårsaker ikke noen utgivelsen av adsorbert proteiner. Vasker med alkaliske buffere kan resultere i en minimal (vanligvis mindre enn 15%26) utgivelsen av adsorbert protein.
Indirekte vurdering av effektiviteten av adsorpsjon av dot blotting er pålitelig hvis flere fortynninger av renset og ubundet protein er analysert og densitometric analysen utføres riktig. Ingen bevis på nedbrytning av heterologous proteiner har vært rapportert25. Direkte evaluering av effektiviteten av adsorpsjon er sterkt avhengig av proteinet som er adsorbert. Hvis protein er autofluorescent eller fluorescently merket, en ImageJ-assistert analyse gir en kvantitativ beslutning av fluorescensen og mengder fluorescerende molekyler presentere på spore. Hvis protein har en enzymatisk aktivitet, kan en bestemt enzymatisk analysen gi en indikasjon på mengder protein tilstede på spores. Men er det kjent at den enzymatiske aktiviteten tilknyttet sporer kan økes ved en stabilisering virkning samspillet med spore13. Hvis adsorbert protein er ikke fluorescerende og har ikke en enzymatisk aktivitet, kan effektiviteten av adsorpsjon evalueres av dot blotting på sporer pakkes under drastisk forhold.
En samling av brukte sporer kan gjøres av en veldig enkel prosedyre. En vask steg med reaksjon bufferen kan være viktig å fjerne reaksjon biprodukter, mens tillegg av fersk underlaget er avgjørende for å starte en ny reaksjon21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av «Finanziamento di Ricerca di Ateneo"til L. Baccigalupi, prosjekttittel" SP-LAY: bakteriell sporer live plattform for proteiner visning ".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1% Poly-L-lysine solution | Sigma | P8920 | |
| 0.45 µm Nitrocellulose Blotting Membrane | Sartorius | M_Blotting_Membranes | |
| 100× objective UPlanF1 | Olympus | microscope equipment | |
| Bacillus subtilis strain NCIB3610 | Bacillus Genetic Stock Center | 3A1 | |
| BD ACCURI C6 PLUS | BD | flow cytometer | |
| BX51 | Olympus | Fluorescent microscope | |
| Clarity | Biorad | 1705060 | |
| DP70 digital camera a | Olympus | microscope equipment | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, FITC | Thermo fisher | F-2754 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) | Abcam | ab6721 | |
| Monoclonal Anti-polyHistidine−Peroxidase antibody | Sigma | A7058-1VL | used to detect adsorbed proteins presenting a 6xhistidine-tag at C- or N- terminal |
| SecureSlip glass coverslip | Sigma | S1815-1PAK | |
| Superwhite Uncharged Microscope Slides | VWR | 75836-190 | |
| U-CA Magnification Changer | Olympus | microscope equipment |
References
- Felici, F., et al. Peptide and protein display on the surface of filamentous bacteriophage. Biotechnology Annual Review. 1, 149-183 (1995).
- Cortese, R., et al. Identification of biologically active peptides using random libraries displayed on phage. Current Opinion in Biotechnology. 6, 73-80 (1995).
- Sousa, C., Cebolla, A., de Lorenzo, V. Enhanced metalloadsorption of bacterial cells displaying poly-His peptides. Nature Biotechnology. 14, 1017-1020 (1996).
- Richins, R., Kaneva, I., Mulchandani, A., Chen, W. Biodegradation of organophosphorus pesticides by surface-expressed organophosphorus hydrolase. Nature Biotechnology. 15, 984-987 (1997).
- Wu, J. Y., et al. Expression of immunogenic epitopes of hepatitis B surface antigen with hybrid flagellin proteins by a vaccine strain of Salmonella. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86, 4726-4730 (1989).
- Newton, S. M., Jacob, C. O., Stocker, B. A. Immune response to cholera toxin epitope inserted in Salmonella flagellin. Science. 244, 70-72 (1989).
- Fischetti, V. A., Medaglini, D., Pozzi, G. Gram-positive commensal bacteria for mucosal vaccine delivery. Current Opinion in Biotechnology. 7, 659-666 (1996).
- Isticato, R., Ricca, E. Spore surface display. Microbiology Spectrum. 2 (5), (2014).
- Ricca, E., et al. Mucosal vaccine delivery by non-recombinant spores of Bacillus subtilis. Microbial Cell Factories. 13, 115 (2014).
- McKenney, P. T., Driks, A., Eichenberger, P. The Bacillus subtilis assembly and functions of the multilayered coat. Nature Reviews Microbiology. 11, 33-44 (2013).
- Knecht, L. D., Pasini, P., Daunert, S. Bacterial spores as platforms for bioanalytical and biomedical applications. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 400, 977-989 (2011).
- Isticato, R., Cangiano, G., De Felice, M., Ricca, E. Display of molecules on the spore surface. Bacterial Spore Formers: Probiotics and Emerging Applications. Ricca, E., Henriques, A. O., Cutting, S. M. , Horizon Bionsciences. Norfolk, UK. 193-200 (2004).
- Sirec, T., et al. Adsorption of β-galactosidase of Alicyclobacillus acidocaldaricus wild type and mutant spores of Bacillus subtilis. Microbial Cell Factories. 11, 100 (2012).
- Cutting, S. M. Bacillus probiotics. Food Microbiology. 28, 214-220 (2011).
- Baccigalupi, L., Ricca, E., Ghelardi, E. Non-LAB Probiotics: Spore Formers. Probiotics and Prebiotics: Current Research and Future Trends. Venema, K., Do Carmo, A. P. , Caister Academic Press. 93-103 (2014).
- Cutting, S. M., Hong, H. A., Baccigalupi, L., Ricca, E. Oral Vaccine Delivery by Recombinant Spore Probiotics. International Reviews of Immunology. 28, 487-505 (2009).
- Lee, S. Y., Choi, J. H., Xu, Z. Microbial cell-surface display. Trends in Biotechnology. 21, 45-52 (2003).
- Isticato, R., et al. Surface display of recombinant proteins on Bacillus subtilis spores. Journal of Bacteriology. 183, 6294-6301 (2001).
- Huang, J. M., et al. Mucosal delivery of antigens using adsorption to bacterial spores. Vaccine. 28, 1021-1030 (2010).
- Isticato, R., et al. Non-recombinant display of the B subunit of the heat labile toxin of Escherichia coli wild type and mutant spores of Bacillus subtilis. Microbial Cell Factories. 12, 98 (2013).
- Mattossovich, R., et al. Conversion of xylan by recyclable spores of Bacillus subtilis thermophilic enzymes. Microbial Cell Factories. 16, 218 (2017).
- Pesce, G., et al. Surface charge and hydrodynamic coefficient measurements of Bacillus subtilis by optical tweezers. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 116, 568-575 (2014).
- Donadio, G., et al. Localization of a red fluorescence protein adsorbed on wild type and mutant spores of Bacillus subtilis. Microbial Cell Factories. 15, 153 (2016).
- Pan, J. G., Choi, S. K., Jung, H. C., Kim, E. J. Display of native proteins on Bacillus subtilis spores. FEMS Microbiology Letters. 358, 209-217 (2014).
- Cutting, S., Vander Horn, P. B. Genetic analysis. Molecular Biological Methods for Bacillus. Harwood, C., Cutting, S. , John Wiley & Sons. Chichester, UK. (1990).
- Lanzilli, M., et al. Display of the peroxiredoxin Bcp1 of Sulfolobus solfataricus probiotic spores of Bacillus megaterium. New Biotechnology. 46, 38 (2018).
