Summary
Denne protokol fokuserer på brugen af bakteriesporer som en "levende" nanobiotechnological redskab til adsorberes heterolog molekyler med forskellige biologiske aktiviteter. Metoder til at måle effektiviteten af adsorption er også vist.
Abstract
Den bakterielle spore er en metabolisk inaktiv celle, dannet af en række beskyttende lag omkring en dehydreret cytoplasma. Denne ejendommelige struktur gør at spore yderst stabil og modstandsdygtig og har foreslået brugen af spore som en platform til at vise heterolog molekyler. Hidtil har en bred vifte af antigener og enzymer er blevet vist på sporer af Bacillus subtilis og et par andre arter, i første omgang af en rekombinant tilgang og derefter, efter en enkel og effektiv metode, nonrecombinant. Nonrecombinant display-system er baseret på direkte adsorption af heterolog molekyler på spore overflade, undgå opførelsen af rekombinant stammer og frigivelsen af genetisk modificerede bakterier i miljøet. Adsorberede molekyler er stabiliseret og beskyttet af samspillet med sporer, som begrænser den hurtige forringelse af antigener og tabet af enzymaktivitet på ugunstige betingelser. Når udnyttet, kan spore-adsorberet enzymer indsamlet nemt med en minimal reduktion af aktivitet og genbrugt til yderligere reaktion runder. I dette papir er vist sådan adsorberes model molekyler til renset sporer af B. subtilis, sådan at evaluere effektiviteten af adsorption, og hvordan de skal indsamle brugte sporer for at genbruge dem til nye reaktioner.
Introduction
Display-systemer er rettet mod præsenterer biologisk aktive molekyler på overfladen af mikroorganismer og at finde programmer i en række forskellige områder, fra industrielle medicinske og miljømæssige bioteknologi. Ud over phages1,2 og celler i forskellige Gram-negative og -positive arter,3,4,5,6,7, har bakteriesporer også været foreslået som display systemer af to tilgange8,9.
På grund af sin særlige struktur, nemlig en dehydreret cytoplasma omgivet af en række beskyttende lag10, giver spore adskillige fordele i forhold til fag - og cellebaserede display systemer8,9. En første fordel kommer fra den ekstreme robusthed og stabilitet af sporer på betingelser, der ville være skadelig for alle andre celler10,11. Spore-vises antigener og enzymer er stabil efter længere tids opbevaring ved stuetemperatur12 og beskyttet mod nedbrydningen ved lav pH og høje temperaturer13. En anden fordel af sporer er sikkerheden for mange sporedannelse danner arter. B. subtilis, B. clausii, B. coagulans, og flere andre arter bruges verden over som probiotika og har været på markedet for menneskers eller dyrs brug for årtier14,15. Denne ekstraordinære sikkerhedsstatistik er en indlysende generelle krav for en overflade displaysystem og er af særlig relevans, når systemet er beregnet til konsum eller foderbrug Brug16. En tredje, er vigtig fordel af en spore-baseret displaysystem at det ikke har begrænsninger for størrelsen af molekylet, der skal udsættes. I phage-baserede systemer, en stor heterolog protein kan påvirke strukturen af kapsid, mens i celle-baserede systemer, det kan påvirke struktur af membran eller kan grænse/forringe membran translokation trin17. De beskyttende lag omkring spore er sammensat af mere end 70 forskellige proteiner10 og er fleksibel nok til at acceptere store udenlandske proteiner uden nogen indlysende konstruktionsfejl eller funktionelle svækkelse8. Derudover med både spore-baseret display systemer er membran omplantning af heterolog protein ikke kræves8,9. Faktisk er heterolog proteiner enten fremstillet i mor cellen cytoplasma og samlet på den spore, der er danner i samme cytoplasmaet eller adsorberet på modne spore8,9.
Spore display blev oprindeligt fremstillet ved at udvikle et genetisk system ingeniør spore overflade18. Denne genetiske systemet var baseret på jeg) opbygningen af et gen fusion mellem det gen, der koder for en spore frakke protein (anvendes som bærestof) og genet koder for proteinet skal vises - tilstedeværelsen af det transkriptionel og translationel signaler af den endogene gen vil kontrollere udtrykket af den fusion, og ii) integration af kimære-gen på B. subtilis kromosom at yde genetisk stabilitet. En bred vifte af antigener og enzymer, der vises af denne rekombinant tilgang, ved hjælp af forskellige sporedannelse overflade proteiner som luftfartsselskaber og sigter mod forskellige potentielle applikationer, der spænder fra slimhinden vaccine til biocatalyst, biosensor, bioremediering, eller bioanalytisk værktøj8,13.
For nylig har har en anderledes tilgang af spore display været udviklede19. Dette andet system er nonrecombinant og bygger på den spontane og yderst stramme adsorption af molekyler på spore overflade9. Antigener19,20 og enzymer13,21 har været effektivt vises og har afsløret, at denne metode er betydeligt mere effektiv end den rekombinante. Denne nonrecombinant tilgang giver mulighed for visning af proteiner i oprindelig form20 og kan også bruges med autoklaveres, død sporer19. Den molekylære mekanisme af adsorption er ikke fuldt klarlagt endnu. Den negative ladning og hydrophobicity af spore er blevet foreslået som egenskaber for relevante for adsorption13,19,22. For nylig, har det vist at en model protein, røde autofluorescent protein (mRFP) af de koraller Discosoma, når adsorberet til spore, kunne infiltrere gennem de overflade lag lokalisering i indre frakke23. Hvis viste sig rigtigt for andre proteiner, kan interne lokaliseringen af de heterolog proteiner forklare deres øget stabilitet, når adsorberet til sporer23.
I en nylig undersøgelse, to enzymer katalysere to successive trin af Nedbrydningsvejen xylan var uafhængigt vises på sporer af B. subtilis , og når inkuberes sammen, var i stand til at udføre både nedbrydning trin21. Sporer indsamlet efter reaktionen var stadig aktive og kan fortsætte xylan nedbrydning ved tilsætning af friske substrat21. Selvom et tab på omkring 15% af det endelige produkt blev observeret i den anden reaktion21, er genbrugelighed af adsorberet enzymer til enkelt, såvel som Multi-trins, reaktioner en yderligere vigtig fordel af spore displaysystem.
Pan et al.24 rapporterede en yderligere tilgang til at vise heterolog proteiner på spore overfladen: heterolog proteiner (en endoglucanase protein og en beta-galactosidase en) produceret i cellen mor under sporulering var spontant indkapslet i den dannende spore pels, uden savn i en transportør. Denne yderligere spore displaysystem er en kombination af de to metoder beskrevet så langt. Faktisk er det rekombinante da heterolog proteiner blev manipuleret til at være udtrykt i cellen mor under sporulering, mens deres forsamling inden for pelsen var spontan og derfor nonrecombinant24. Effektiviteten af visning af denne yderligere tilgang er imidlertid fortsat at blive testet og sammenlignet med de andre to tilgange ved hjælp af de samme heterolog proteiner.
Denne protokol udelukker processer af spore produktion og rensning, som er blevet beskrevet udførligt andetsteds24. Det omfatter adsorption reaktion, evaluering af effektiviteten af adsorption af dot-blotting og Fluorescens mikroskopi, og genbrug af adsorberet enzymer til yderligere reaktion runder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. adsorption reaktion
- Inkuber 2, 5 og 10 µg for mRFP med 2 x 109 i B. subtilis vildtype renset sporer i 200 µL af bindende buffer, 50 mM natriumcitrat, pH 4.0 (16,7 mM natriumcitrat dihydrat; 33.3 mM citronsyre) i 1 time ved 25 ° C på en vuggende shaker (figur 1) .
- Der centrifugeres bindende blandinger (13.000 x g i 10 min.) for at fractionate pellets (P2, P5 og P10) og supernatanter (S2, S5 og S10). Gemme analysere for indirekte evaluering af effektiviteten af adsorption beskrevet taktfast 3.2.
- Vaske pellets 2 x med 200 µL af binding buffer og resuspend dem i 100 µL af binding buffer og bruge det til den næste analyse.
Bemærk: Bindende reaktion fortrinsvis sker ved en pH-værdi lavere end det isoelektriske punkt af protein; typisk, 1,5 M fosfatbufferet saltopløsning (PBS), pH 4,0 eller 50 mM natriumcitrat, pH 4,0, der bruges.
2. direkte vurdering af effektiviteten af adsorption
-
Udvinding af overflade proteiner og western blot analyse
- Tage 50 µL af mRFP-adsorberet sporer resuspension (P2, P5 og P10 i trin 1.3) og der tilsættes 50 µL af 2 x sodium dodecyl sulfat (SDS)-dithiothreitol (DTT) (0,1 M Tris-HCl, pH 6,8; 2% SDS; 0,1 M DTT) til solubilize overflade spore proteiner.
- Brug den gratis, renset mRFP og ekstrakter af de samme mængder af sporer, der ikke er adsorberet til protein som positive og negative kontroller, henholdsvis.
- Efter 45 min inkubation ved 65 ° C, centrifugeres (13.000 x g i 10 min.) blandinger og analysere 10 µL af de udvundne proteiner (supernatanten) af vestlige skamplet med det monoklonale anti-hans antistof anerkende hans tag øjeblikket i N-terminalen af mRFP ( Figur 2A).
-
Fluorescerende mikroskopi observationer
Bemærk: Ved hjælp af fluorescerende heterolog proteiner eller udfører en immunofluorescens analyse, er det muligt at lokalisere og kvantificere de adsorberede molekyler med Fluorescens mikroskopi.- Tage 5 µL af den adsorberede sporer resuspension fra trin 1.3 og tilføje 95 µL 1 x PBS, pH 4.0, at opnå ~ 1 x 106 sporer/µL.
- Sted 5 µL af suspension på et objektglas, dække det med en coverslip, tidligere behandlet med poly-l-lysin til 30 s, og observere det under et fluorescens mikroskop.
- For hvert felt, gemme fase-kontrast mikroskopi billede og Fluorescens mikroskopi billede (fig. 2B).
Bemærk: Alternativt fluorescerende sporer kan analyseres ved cytofluorimetry. Resuspend ialt 106 sporer adsorberet eller ikke-adsorberet med heterolog protein i 1 mL af 1 x PBS, pH 4.0, og analysere suspensionen ved hjælp af en flow Flowcytometret (figur 2C).
-
Dataanalyse ved hjælp af ImageJ
- Åbn Fluorescens mikroskopi billeder med ImageJ software (http://rsbweb.nih.gov/ij/) og check for at sikre alle billeder er i 8-bit format (billede | Type | 8-bit).
- Eventuelt justere kontrasten (billede | Justere | Lys kontrast) og kontrollere, at omfanget af billedet PIXEL (billede | Angive skala).
- Analyser-menuen, Vælg sæt målinger. Sørg for at have område, Integreret tæthedog Betyde grå værdi vælges.
- Tegne en streg omkring spore af interesse ved hjælp af nogen af tegning/markeringsværktøjerne (dvs, cirkel, polygon, eller kombinationstegning) (figur 3).
- Vælg målpunkt fra menuen analyser (eller trykke på cmd + M). En popup-boks med en stak af værdier for denne første spore vises (figur 3).
- Gentag disse to trin for mindst 50 andre sporer i synsfeltet valgt skal måles.
- Vælg flere regioner uden nogen sporer, (der har ingen fluorescens) og Gentag målingen; Dette vil være baggrunden.
Bemærk: Størrelsen er ikke vigtigt. Disse tilsvarende baggrund fluorescens værdier skal bruges til at trække manuelt fra baggrunden. - Vælg alle data i resultatvinduet og kopierer resultaterne til et regneark.
- Beregne gennemsnittet af de Integrerede tæthed og område af de valgte sporer og fluorescens baggrundsværdierne og bruge dem til at opnå den korrigerede alt pr. celle fluorescens (CTCF) ved hjælp af formlen: CTCF = gennemsnitlig integrerede Densitet - (gennemsnitlig område x gennemsnitlig baggrund fluorescens).
Bemærk: Alternativt, hvis alle sporerne vises godt adskilt, det er muligt at analysere alle sporerne af billedfeltet ved hjælp af funktionen Analysere partikler, efter Imagejs instruktion. For at undgå, at software læser en specifik fluorescens eller spore aggregater, dimensionen af partikler har fastsat pixelˆ2 = 50-200 (figur 4).
3. indirekte evaluering af effektiviteten af adsorption
- Forberede serielle fortyndinger i oprenset protein.
- Udarbejde en første 1,5 mL tube indeholder 250 µL af renset mRFP i en endelig koncentration på 0,5 ng/µL, ved hjælp af bindende buffer. Denne mængde er nok til at indlæse to baner.
- Udføre seks serielle Tofoldsfortyndinger af 250 µL (endelige rumfang) hver, ved hjælp af bindende buffer.
- Udarbejde dobbelt serielle fortyndinger supernatanten prøverne der indeholder ubundne mRFP brøkdel af adsorption reaktion (S2, S5 og S10 fra trin 1.2).
- Læg 100 µL af hver supernatanten i 1,5 mL rør og tilsæt 100 µL af binding buffer. Udføre seks serielle Tofoldsfortyndinger af 200 µL (endelige rumfang) hver, ved hjælp af bindende buffer.
- Skære en nitrocellulose membran (0,45 µm cutoff), 9 cm x 10 cm i størrelse, til at dække området i 5 (antallet af prøver) x 6 (antallet af fortyndinger) prikker. Membranen skal ikke strække sig ud over kanten af pakning af dot skamplet apparater.
- Placer prewet membranen i dot skamplet apparater. Fjern eventuelle luftbobler fanget mellem membranen og pakning. Dække den ubrugte del af apparater med tape eller paraffin film til at forhindre, at luft bevæger sig gennem disse brønde.
- Samle dot skamplet apparater som beskrevet af fabrikanten.
- Hvis et vakuum bruges under samling, rehydrere membran med 100 µL 1 x PBS pr. brønd at sikre ensartet binding af antigen og forhindre glorier eller en svag påvisning signal.
- Forsigtigt fjerne bufferen fra brøndene ved vakuum. Så snart stødpudeopløsning afløb fra alle brøndene, stoppe vakuumpumpen og afbryde den.
- Indlæse standard i de to mest ydre baner og prøver i midten (figur 5). Udfyld de relevante brønde med 100 µL af hver fortynding. Samme rumfang bruges til hver brønd bør sikre en homogen filtrering af alle prøve brønde.
- Tænd vakuumpumpen til 2 min, stoppe det, og lad derefter, prøven filtreres gennem membranen af tyngdekraften flow.
- Alle brøndene vaskes med 100 µL 1 x PBS og lad vakuum pumpen køre til en anden 5 min efter vask buffer har været helt drænet fra apparatet.
- Med vakuum på løsne skruerne, og forsigtigt åbne dot skamplet apparater.
- Slukke vakuum, tage membranen, og behandle den efter en vestlige skamplet protokol.
- Udfør en densitometric analyse af filteret, ved hjælp af passende software, såsom ImageJ.
- Måle integrerede tætheden af hver prik af skitserer dem med en kreds af samme område og ved hjælp af kommandoen Analyser/foranstaltning .
- Gøre en baggrundskorrektion for billede, tegne en cirkel i et tomt område og måling af massefylden integreret eller kommandoen Proces/Subtraher baggrund .
- Sammenholde den integrerede tæthed af standard prikker med mængden af protein, lastet og opnå en kalibreringskurve (R2 værdier for kalibrering kurver skal være over 0,95).
- Bruge kalibreringskurven for at ekstrapolere koncentrationen af mRFP i hver prøve prik.
- Beregne koncentrationen af mRFP tilbage i de ubundne fraktioner.
Bemærk: for at sikre den korrekte lukning af dot skamplet apparater og derfor, at emnet membran til et ensartet tryk, spænd skruerne ved at følge et diagonalt krydsede ordningen og derefter åbne vakuumpumpe til at stramme skruerne mere kraftigt.
4. spore indsamling og genbrug
- For genbrug af den adsorberede spore, udføre to adsorption reaktioner af 2.0 x 109 renset sporer med 10 µg af renset GH10-XA xylanase eller 10 µg af renset GH3-XT β-xylosidase, som beskrevet i trin 1.1-1.3 (fig. 6A).
- Indsamle de piller, der indeholder enzym-adsorberet sporerne, resuspend dem i 50 µL af den optimale buffer for enzymatisk reaktion assay (50 mM natrium fosfat buffer pH-værdi på 6,5; 2.48689 g/L Na2HPO4, 4.88991 g/L NaH2PO4), og bland dem sammen for at opnå en 100 µL blanding af sporer adsorbing GH10-XA eller GH3-XT.
- Tilføj substrat (5 mg/mL 4-O-methyl-d-glucuronod-xylan [MGX]) og lad enzym reaktioner finder sted i 16 timer ved 65 ° C.
- Centrifugeres reaktionsblandingen (for 15 min på 13.000 x g) og gemme supernatanten indeholdende reaktion enzymprodukt.
- Resuspenderes i 100 µL af frisk 50 mM natrium fosfat buffer til pH 6,5 i overværelse af en ny substrat (MGX) (fig. 6B).
Bemærk: For at adsorberes mere end ét enzym, det er muligt at adsorberes begge sammen eller enkeltvis uafhængigt. Den sidstnævnte mulighed letter den kvantitative analyse af adsorption effektivitet og aktivitet af hvert enzym, giver en støkiometrisk balance af hvert enzym, der er nødvendige for reaktionerne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vellykket adsorption kan vurderes ved western blotting. Ved reaktionen, blandingen er fraktioneret ved centrifugering og vaskes, og pellet brøkdel (figur 1) bruges til at udtrække de overflade proteiner. Ekstraktet er fraktioneret af SDS polyacrylamid gelelektroforese (side), electrotransferred til en polyvinylidene fluorid (PVDF) membran, og reagerede mod primære og sekundære antistoffer. Tilstedeværelsen af proteiner af den forventede størrelse, kun i den vognbane, fyldt med et uddrag af de adsorberede sporer, er udtryk for en vellykket adsorption reaktion (fig. 2A).
Effektiviteten af adsorption reaktion kan vurderes af direkte og indirekte metoder. Den direkte vurdering af adsorptionen effektivitet afhænger af den heterolog protein, som er blevet brugt og kan udføres af Fluorescens mikroskopi (figur 2B) og cytofluorimetry (figur 2C) på pellet brøkdel efter fraktionering af adsorption reaktion. En kvantificering af de fluorescerende signaler til stede på sporer kan udføres ved hjælp af ImageJ software (figur 3 og figur 4). En indirekte analyse af adsorption effektivitet kan udføres af en prik blotting analyse (figur 5A) af supernatanten fraktion indeholdende den ubundet protein (figur 1). En densitometric analyse af ubundet protein (figur 5B) vil derefter give forskerne til at beregne indirekte mængden af protein adsorberet på sporer.
To successive reaktioner kan være katalyseret af en blanding af sporer viser enten en af de to specifikke enzymer (figur 6A). Den adsorberede enzyme(s) indsamles med en simpel centrifugering skridt, vasket, og inkuberes med friske substrat i en ny reaktion cyklus (fig. 6B).
Figur 1:generelle ordning af adsorption eksperiment. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Direkte analyse af effektiviteten af visningen mRFP. (A) Western blot med mRFP-specifikke antistof. C + = gratis renset mRFP; C - = protein uddrag af sporer ikke adsorberet til protein; P5-P2-P10 = proteiner udvundet fra B. subtilis sporer adsorberet med 2, 5 og 10 mg af mRFP, henholdsvis. (B) immunofluorescens mikroskopi af adsorberet sporer. Immunoreactions blev udført med en primær antistof anerkende den adsorberede protein og med en fluorescerende sekundær antistof konjugeret med fluorescein isothiocyanat (FITC). Panelet til venstre viser den røde iboende mRFP fluorescens, højre panel viser den grønne fluorescens af FITC-konjugeret sekundær antistof. (C) Flow cytometric analyse af adsorberet sporer. Sporerne reagerede med mRFP-specifikke antistoffer med FITC-konjugeret sekundære antistoffer, og derefter blev analyseret ved cytofluorimetry. Analysen blev udført på hele spore befolkningen (10.000 begivenheder, ungated). I venstre panel, er ikke-adsorberet sporer vist i sort, mRFP-adsorberet sporer i rød. Højre panel viser frem og side scatter (FSC-SSC) dot plot. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Manuel kvantificering af de fluorescerende signal af ImageJ. Et fluorescens mikroskop billede af sporer, adsorberet med rødt fluorescerende protein mRFP, analyseres med ImageJ software. En gul cirkel har været udarbejdet omkring en spore til at få densitometric data (forstørrede billede). Popup boksen viser resultaterne af den densitometric analyse af den valgte sporedannelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: samtidige kvantificering af de fluorescerende signal af ImageJ. (A) Popup boks opnås ved at vælge Analysere partikel. En intervalværdi af 50-200 pixel ^ 2 har skal indstilles for sporer23. (B) segmentering af billedet af figur 3A efter at have brugt Analysere partikler (venstre), og de relative densitometric analyseresultater (til højre). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Dot blotting og densitometric analyse. (A) Dot duppe med serielle fortyndinger af det rensede mRFP i to eksemplarer (Std1 og Std2) og supernatanten (S10, S5 og S2) af adsorption reaktionen udføres med 10, 5 og 2 µg af mRFP, henholdsvis23. (B) dot blotting panel A bruges til analysen af densitometric. Cirklerne angiver området bruges til at kvantificere tætheden af signalerne. Panelet til højre rapporterer et eksempel på resultaterne med den densitometric analyse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: konvertering af xylan af genanvendelige sporer. (A) generelle ordning xylan nedbrydning. (B) sporer viser xylanase eller β-xylosidase enzymer, når de blandes sammen, katalyserer totrins nedbrydningen af xylan. Efter reaktionen fraktioneret prøven ved centrifugering. Supernatanten indeholder reaktionsprodukt, mens pelleten indeholder spore-bundet enzymer, der kan genbruges ved at tilføje friske substrat. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollens spore adsorption er meget enkel og ligetil. Reaktionen er strengt afhængig reaktion buffer pH-værdi og effektivitet af adsorption er optimal på sure pH-værdi (pH 5.0 eller lavere). På neutral pH betingelser, effektiviteten af adsorption er lavt, og på alkalisk pH værdier, adsorption kan ikke forekomme. Optimal adsorption er opnået med et rumfang på 200 µL i 1,5 mL rør (eller at holde et lignende forhold) på en vuggende shaker.
Adsorptionen er meget stram, og vasker med en buffer på samme pH reaktion buffer forårsager ikke nogen frigivelse af de adsorberede proteiner. Vasker med alkalisk buffere kan resultere i en minimal (generelt mindre end 15%26) frigivelse af den adsorberede protein.
Den indirekte evaluering af effektiviteten af adsorption af dot blotting er pålidelige, hvis flere fortyndinger i oprenset og ubundet protein er analyseret og densitometric analysen udføres korrekt. Ingen tegn på nedbrydning af de heterolog proteiner har været rapporteret25. Direkte vurdering af effektiviteten af adsorption afhænger meget af det protein, der er adsorberet. Hvis proteinet er autofluorescent eller fluorescently mærket, en ImageJ-assisteret analyse giver en kvantitativ bestemmelse af fluorescens og mængder af fluorescerende molekyler til stede på spore. Hvis proteinet har en enzymatisk aktivitet, kunne en specifik enzymatisk assay giver en indikation af mængder af protein til stede på sporer. Det vides dog at de enzymatiske aktivitet forbundet med sporer kan forhøjes med en stabilisering effekt på grund af interaktion med spore13. Hvis den adsorberede protein er ikke fluorescerende og ikke har en enzymatisk aktivitet, kan effektiviteten af adsorption vurderes af dot blotting på sporer udvundet drastiske betingelser.
En samling af brugte sporer kan gøres ved en meget enkel procedure. En vask skridt med reaktion buffer kan være vigtigt at fjerne reaktion biprodukter, selv om tilsætning af friske substrat er vigtigt at indlede en ny reaktion21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af "Finanziamento di Ricerca di Ateneo" til L. Baccigalupi, projekttitel "SP-LAY: bakteriel sporer som live platform for proteiner display".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1% Poly-L-lysine solution | Sigma | P8920 | |
| 0.45 µm Nitrocellulose Blotting Membrane | Sartorius | M_Blotting_Membranes | |
| 100× objective UPlanF1 | Olympus | microscope equipment | |
| Bacillus subtilis strain NCIB3610 | Bacillus Genetic Stock Center | 3A1 | |
| BD ACCURI C6 PLUS | BD | flow cytometer | |
| BX51 | Olympus | Fluorescent microscope | |
| Clarity | Biorad | 1705060 | |
| DP70 digital camera a | Olympus | microscope equipment | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, FITC | Thermo fisher | F-2754 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) | Abcam | ab6721 | |
| Monoclonal Anti-polyHistidine−Peroxidase antibody | Sigma | A7058-1VL | used to detect adsorbed proteins presenting a 6xhistidine-tag at C- or N- terminal |
| SecureSlip glass coverslip | Sigma | S1815-1PAK | |
| Superwhite Uncharged Microscope Slides | VWR | 75836-190 | |
| U-CA Magnification Changer | Olympus | microscope equipment |
References
- Felici, F., et al. Peptide and protein display on the surface of filamentous bacteriophage. Biotechnology Annual Review. 1, 149-183 (1995).
- Cortese, R., et al. Identification of biologically active peptides using random libraries displayed on phage. Current Opinion in Biotechnology. 6, 73-80 (1995).
- Sousa, C., Cebolla, A., de Lorenzo, V. Enhanced metalloadsorption of bacterial cells displaying poly-His peptides. Nature Biotechnology. 14, 1017-1020 (1996).
- Richins, R., Kaneva, I., Mulchandani, A., Chen, W. Biodegradation of organophosphorus pesticides by surface-expressed organophosphorus hydrolase. Nature Biotechnology. 15, 984-987 (1997).
- Wu, J. Y., et al. Expression of immunogenic epitopes of hepatitis B surface antigen with hybrid flagellin proteins by a vaccine strain of Salmonella. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86, 4726-4730 (1989).
- Newton, S. M., Jacob, C. O., Stocker, B. A. Immune response to cholera toxin epitope inserted in Salmonella flagellin. Science. 244, 70-72 (1989).
- Fischetti, V. A., Medaglini, D., Pozzi, G. Gram-positive commensal bacteria for mucosal vaccine delivery. Current Opinion in Biotechnology. 7, 659-666 (1996).
- Isticato, R., Ricca, E.
- Ricca, E., et al. Mucosal vaccine delivery by non-recombinant spores of Bacillus subtilis. Microbial Cell Factories. 13, 115 (2014).
- McKenney, P. T., Driks, A., Eichenberger, P. The Bacillus subtilis assembly and functions of the multilayered coat. Nature Reviews Microbiology. 11, 33-44 (2013).
- Knecht, L. D., Pasini, P., Daunert, S. Bacterial spores as platforms for bioanalytical and biomedical applications. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 400, 977-989 (2011).
- Isticato, R., Cangiano, G., De Felice, M., Ricca, E. Display of molecules on the spore surface. Bacterial Spore Formers: Probiotics and Emerging Applications. Ricca, E., Henriques, A. O., Cutting, S. M. , Horizon Bionsciences. Norfolk, UK. 193-200 (2004).
- Sirec, T., et al. Adsorption of β-galactosidase of Alicyclobacillus acidocaldaricus wild type and mutant spores of Bacillus subtilis. Microbial Cell Factories. 11, 100 (2012).
- Cutting, S. M.
- Baccigalupi, L., Ricca, E., Ghelardi, E. Non-LAB Probiotics: Spore Formers. Probiotics and Prebiotics: Current Research and Future Trends. Venema, K., Do Carmo, A. P. , Caister Academic Press. 93-103 (2014).
- Cutting, S. M., Hong, H. A., Baccigalupi, L., Ricca, E. Oral Vaccine Delivery by Recombinant Spore Probiotics. International Reviews of Immunology. 28, 487-505 (2009).
- Lee, S. Y., Choi, J. H., Xu, Z.
- Isticato, R., et al. Surface display of recombinant proteins on Bacillus subtilis spores. Journal of Bacteriology. 183, 6294-6301 (2001).
- Huang, J. M., et al. Mucosal delivery of antigens using adsorption to bacterial spores. Vaccine. 28, 1021-1030 (2010).
- Isticato, R., et al. Non-recombinant display of the B subunit of the heat labile toxin of Escherichia coli wild type and mutant spores of Bacillus subtilis. Microbial Cell Factories. 12, 98 (2013).
- Mattossovich, R., et al. Conversion of xylan by recyclable spores of Bacillus subtilis thermophilic enzymes. Microbial Cell Factories. 16, 218 (2017).
- Pesce, G., et al. Surface charge and hydrodynamic coefficient measurements of Bacillus subtilis by optical tweezers. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 116, 568-575 (2014).
- Donadio, G., et al. Localization of a red fluorescence protein adsorbed on wild type and mutant spores of Bacillus subtilis. Microbial Cell Factories. 15, 153 (2016).
- Pan, J. G., Choi, S. K., Jung, H. C., Kim, E. J. Display of native proteins on Bacillus subtilis spores. FEMS Microbiology Letters. 358, 209-217 (2014).
- Cutting, S., Vander Horn, P. B. Genetic analysis. Molecular Biological Methods for Bacillus. Harwood, C., Cutting, S. , John Wiley & Sons. Chichester, UK. (1990).
- Lanzilli, M., et al. Display of the peroxiredoxin Bcp1 of Sulfolobus solfataricus probiotic spores of Bacillus megaterium. New Biotechnology. 46, 38 (2018).
