Summary
Dit protocol is gericht op het gebruik van bacteriële sporen als een "live" nanobiotechnological instrument te adsorberen heterologe moleculen met verschillende biologische activiteit. De methoden voor het meten van de doelmatigheid van de adsorptie worden ook weergegeven.
Abstract
De bacteriële spore is een metabolisch rustige cel, gevormd door een aantal beschermende lagen rond een gedehydrateerde cytoplasma. Deze bijzondere structuur maakt de spore uiterst stabiel en resistente en heeft voorgesteld het gebruik van de spore als een platform voor het weergeven van heterologe moleculen. Tot nu toe een scala aan antigenen en enzymen zijn tentoongesteld op sporen van Bacillus subtilis en een paar andere soorten, in eerste instantie door een recombinant aanpak en, vervolgens, door een eenvoudige en efficiënte nonrecombinant methode. De nonrecombinant display systeem is gebaseerd op de directe adsorptie van heterologe moleculen op het oppervlak van de spore, de bouw van recombinante stammen en de introductie van genetisch gemodificeerde bacteriën in het milieu te voorkomen. Geadsorbeerde moleculen zijn gestabiliseerd en beschermd door de interactie met sporen, waardoor de snelle afbraak van antigenen en het verlies van de enzymactiviteit bij ongunstige omstandigheden wordt beperkt. Zodra gebruikt, kunnen spore-geadsorbeerde enzymen worden verzameld gemakkelijk met een minimale vermindering van activiteit en hergebruikt voor aanvullende reactie rondes. In deze paper wordt weergegeven hoe te adsorberen model moleculen om gezuiverde sporen van B. subtilis, hoe te te evalueren van de doeltreffendheid van adsorptie en hoe verzamelt gebruikte sporen om ze te recyclen voor nieuwe reacties.
Introduction
Displaysystemen zijn gericht op de presentatie van biologisch actieve moleculen op het oppervlak van micro-organismen en toepassingen vinden in allerlei velden, uit industriële aan medische en milieu biotechnologie. Naast bacteriofagen1,2 en cellen van verschillende gram-negatieve en -positieve soorten3,4,5,6,7, bacteriële sporen ook geweest voorgesteld als displaysystemen door twee benaderingen8,9.
Door zijn bijzondere structuur, namelijk een gedehydrateerde cytoplasma omringd door een aantal beschermende lagen10, biedt de spore verschillende voordelen ten opzichte van phage en cel-gebaseerde display systemen8,9. Een eerste voordeel komt uit de extreme robuustheid en stabiliteit van sporen op voorwaarden dat zou schade wordt berokkend aan alle andere cellen10,11. Spore-weergegeven antigenen en enzymen zijn stabiel na langdurige opslag bij kamertemperatuur12 en beschermd tegen aantasting bij lage pH en hoge temperaturen13. Een tweede voordeel van sporen is de veiligheid van vele spore-vormende soorten. B. subtilis, B. clausii, B. coagulansen verschillende andere soorten wereldwijd als probiotica worden gebruikt en heb op de markt voor menselijk of dierlijk gebruik voor decennia14,15. Deze uitzonderlijke veiligheidsreputatie is een voor de hand liggende algemene vereiste voor een oppervlakte display systeem en is van bijzonder belang wanneer het systeem is bedoeld voor gebruik voor menselijke of dierlijke16. Een derde is belangrijk voordeel van een display spore-gebaseerd systeem dat het geen beperkingen voor de grootte van het molecuul dat moet worden blootgesteld. In faag gebaseerde systemen, een grote heterologe eiwit kan invloed hebben op de structuur van de Eiwitmantel, terwijl in de cel-gebaseerde systemen, het kan invloed hebben op de structuur van het membraan of kan de membraan translocatie stap17limiet/schaden. De beschermende lagen rond de spore zijn samengesteld uit meer dan 70 verschillende eiwitten10 en zijn flexibel genoeg om goed te keuren van grote buitenlandse eiwitten zonder duidelijk structurele defect of functionele bijzondere waardevermindering8. Bovendien, met beide spore gebaseerde displaysystemen is het membraan translocatie van het heterologe eiwit niet nodig8,9. Inderdaad, heterologe eiwitten zijn ofwel in het cytoplasma van de cel van de moeder geproduceerd en gemonteerd op de spore die vormt in de dezelfde cytoplasma of geadsorbeerd op de volwassen spore8,9.
Spore display was in eerste instantie verkregen door het ontwikkelen van een genetische systeem ingenieur van de spore oppervlakte18. Deze genetische systeem was gebaseerd op ik) de bouw van een gen fusie tussen het gen dat codeert voor een spore vacht eiwit (gebruikt als drager) en de gene codering voor de proteïne worden weergegeven - de aanwezigheid van de transcriptionele en translationele signalen van de endogene gen zal de controle van de expressie van de fusie, en ii) integratie van het chimeer gen op het chromosoom van B. subtilis te verlenen van de genetische stabiliteit. Een scala aan antigenen en enzymen zijn tentoongesteld door deze recombinante aanpak, met behulp van diverse spore oppervlakte eiwitten als dragers en die gericht zijn op verschillende mogelijke toepassingen, variërend van mucosal vaccin aan biokatalysator biosensor, bioremediatie, of bioanalytical gereedschap8,13.
Meer heeft, een andere benadering van spore display onlangs ontwikkelde19. Dit tweede systeem is nonrecombinant en vertrouwt op de spontane en uiterst krap adsorptie van moleculen op de oppervlakte van spore9. Antigenen19,20 en enzymen13,21 efficiënt zijn tentoongesteld en is gebleken dat deze methode is aanzienlijk efficiënter dan de recombinant. Deze nonrecombinant benadering kunt u de weergave van eiwitten in de oorspronkelijke vorm20 en kan ook worden gebruikt met gesteriliseerde met autoclaaf, dood sporen19. Het moleculaire mechanisme van adsorptie is niet volledig opgehelderd nog. De negatieve lading en de hydrophobicity van de spore voorgesteld als relevante eigenschappen voor de adsorptie13,19,22. Onlangs is gebleken dat een model eiwit, de rode autofluorescent proteïne (mRFP) van het koraal Discosoma, wanneer geadsorbeerd aan het spore, kon infiltreren door de oppervlakte lagen lokaliseren in de innerlijke vacht23. Als bewaarheid voor andere proteïnen, uitleggen de interne lokalisatie van de heterologe eiwitten hun verhoogde stabiliteit wanneer geadsorbeerde tot en met23van de sporen.
In een recente studie, twee enzymen katalyseren van twee opeenvolgende stappen van het traject van de afbraak Xylaan hingen onafhankelijk op sporen van B. subtilis en, wanneer geïncubeerd samen konden uitvoeren van beide afbraak stappen21. Sporen verzameld na de reactie waren nog steeds actief en kunnen blijven de Xylaan afbraak op de toevoeging van vers basismateriaal21. Zelfs als een verlies van ongeveer 15% van het eindproduct werd waargenomen in de tweede reactie21, is de herbruikbaarheid van geadsorbeerde enzymen voor één, evenals scriptingregel, reacties een belangrijk bijkomend voordeel van de spore display systeem.
Pan et al.24 gemeld een aanvullende benadering om weer te geven van heterologe eiwitten op het oppervlak van de spore: heterologe eiwitten (een endoglucanase eiwit en een beta-galactosidase een) geproduceerd in de cel van de moeder tijdens de sporevorming werden spontaan ingekapseld in de vormende spore jas, zonder de noodzaak van een vervoerder. Deze bijkomende spore display systeem is een combinatie van deze twee benaderingen die tot nu toe beschreven. Inderdaad, het is recombinant aangezien de heterologe eiwitten zijn ontworpen om te worden uitgedrukt in de cel van de moeder tijdens de sporevorming, terwijl hun vergadering binnen de vacht spontaan was en dus nonrecombinant24. De efficiëntie van de weergave van deze aanvullende benadering blijft echter om te worden getest en vergeleken met de andere twee benaderingen met behulp van de dezelfde heterologe eiwitten.
Dit protocol omvat niet de processen van spore productie en zuivering, die al uitgebreid elders24beschreven. Het omvat de adsorptie-reactie, de evaluatie van de efficiëntie van adsorptie door dot-bevlekken en fluorescentie microscopie, en de recycling van geadsorbeerde enzymen voor aanvullende reactie rondes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. adsorptie reactie
- Incubeer 2, 5 en 10 µg mRFP met 2 x 109 van B. subtilis wild-type gezuiverde sporen in 200 µL van bindende 50 mM Natriumcitraat, buffer, pH 4.0 (16.7 mM Natriumcitraat dihydraat; 33,3 mM citroenzuur) gedurende 1 uur bij 25 ° C op een rockende shaker (Figuur 1) .
- Centrifugeer het bindende mengsels (13.000 x g gedurende 10 minuten) om fractionate pellets (P2, P5 en P10) en supernatant (S2, S5 en S10). Bewaar het supernatant voor de indirecte evaluatie van de doeltreffendheid van de adsorptie in stap 3.2 beschreven.
- Wassen van de pellets 2 x met 200 µL van bindende buffer en resuspendeer hen in 100 µL van bindende buffer en gebruiken voor de volgende analyse.
Opmerking: De bindende reactie bij voorkeur treedt op bij een pH-waarde lager dan het elektrisch punt van het eiwit; meestal 1,5 M fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), pH 4.0 of 50 mM Natriumcitraat, pH 4.0, worden gebruikt.
2. directe beoordeling van de efficiëntie van adsorptie
-
Extractie van oppervlakte-eiwitten en westelijke vlekkenanalyse
- Neem 50 µL van mRFP-geadsorbeerde sporen resuspensie (P2, P5 en P10 van stap 1.3) en voeg 50 µL van 2 x natrium dodecyl sulfaat (SDS)-dithiothreitol (DTT) (0,1 M Tris-HCl, pH 6.8; 2% SDS; 0.1 M DTT) te solubilize oppervlakte spore eiwitten.
- Gebruik de gratis, gezuiverde mRFP en extracten van dezelfde hoeveelheden sporen die zijn niet geadsorbeerd aan het eiwit als de positieve en negatieve controles, respectievelijk.
- Na 45 min van incubatie bij 65 ° C, centrifugeren (13.000 x g gedurende 10 minuten) de mengsels en analyseren van 10 µL van de uitgepakte (bezinken) eiwitten door westelijke vlek met het monoklonaal anti-zijn antilichaam herkennen de zijn label aanwezig op de N-terminal van mRFP ( Figuur 2A).
-
Fluorescent microscopie opmerkingen
Opmerking: Met behulp van fluorescerende heterologe eiwitten of uitvoeren van een analyse van de immunofluorescentie, is het mogelijk om lokaliseren en kwantificeren van de geadsorbeerde moleculen door fluorescentie microscopie.- Neem 5 µL van de geadsorbeerde sporen resuspensie van stap 1.3 en voeg 95 µL van 1 x PBS, pH 4.0, ~ 1 x 106 sporen/µL verkrijgen.
- Plaats 5 µL van schorsing op een microscoopglaasje, bedek het met een dekglaasje aan eerder behandeld met poly-l-lysine voor 30 s, en het onder een fluorescentie Microscoop observeren.
- Opslaan voor elk veld, de fase contrast microscopie beeld en fluorescentie microscopie beeld (afbeelding 2B).
Opmerking: U kunt ook fluorescerende sporen kunnen worden geanalyseerd door cytofluorimetry. Resuspendeer een totaal van 106 sporen geadsorbeerde of niet-geadsorbeerde met het heterologe eiwit in 1 mL 1 x PBS, pH 4.0, en analyseren van de opschorting met behulp van een stroom cytometer (Figuur 2C).
-
Data-analyse met behulp van ImageJ
- Open de fluorescentie microscopie afbeeldingen met ImageJ software (http://rsbweb.nih.gov/ij/) en controleer of alle afbeeldingen zijn in de 8-bits indeling (afbeelding | Type | 8-bit).
- Het contrast worden aangepast indien nodig (afbeelding | Aanpassen | Helderheid Contrast) en controleer of de schaal van de afbeelding pixels (afbeelding | Stel schaal).
- Selecteer in het menu analyseren instellen van metingen. Zorg ervoor dat gebied, Geïntegreerde dichtheiden Betekenen Gray waarde die is geselecteerd.
- Trek een lijn rond de spore van belang met behulp van een van de tekening/selectiegereedschappen (dat wil zeggen, cirkel-, veelhoek, of vrije vorm) (Figuur 3).
- Maatregel selecteren in het menu analyseren (of druk op cmd + M). Een pop-upvenster met een stapel van waarden voor deze eerste spore verschijnt (Figuur 3).
- Herhaal deze twee stappen voor ten minste 50 andere sporen in het gezichtsveld gekozen te meten.
- Selecteer verschillende regio's zonder enige sporen (die hebben geen fluorescentie) en herhaal de meting; Dit is de achtergrond.
Opmerking: De grootte is niet belangrijk. Fluorescentie van deze tegenwaarde-achtergrond worden gebruikt voor het handmatig verwijderen van de achtergrond. - Selecteer alle gegevens in het resultatenvenster en kopieer de resultaten in een spreadsheet.
- Berekent het gemiddelde van de Geïntegreerde dichtheid en het gebied van de geselecteerde sporen en de fluorescentie van de achtergrondwaarden en ze gebruiken om het verkrijgen van de gecorrigeerde totaal-per-cel-fluorescentie (CTCF) met behulp van de formule: CTCF = gemiddelde geïntegreerde Dichtheid - (gemiddelde gebied x gemiddelde achtergrond fluorescentie).
Opmerking: Als alternatief, als alle de sporen goed afzonderlijk weergegeven, is het mogelijk om te analyseren van alle de sporen van het afbeeldingsveld met behulp van de functie Analyseren deeltjes, volgens ImageJ van instructie. Om te voorkomen dat de software een specifieke fluorescentie- of aggregaten van spore leest, de dimensie van de deeltjes moet worden ingesteld op pixelˆ2 = 50-200 (Figuur 4).
3. indirecte evaluatie van de efficiëntie van adsorptie
- Maak seriële verdunningen voor de gezuiverde proteïne.
- Een eerste 1,5 mL-buis met 250 µL van gezuiverde mRFP op een eindconcentratie van 0,5 ng/µL, met behulp van de bindende buffer voor te bereiden. Dit volume is voldoende om het laden van twee rijstroken.
- Zes tweevoudige seriële verdunningen van 250 µL (eindvolume) elk, met behulp van de bindende buffer uitvoeren
- Maak tweeledig seriële verdunningen voor het supernatant monsters met de Fractie van de niet-afhankelijke mRFP van de reactie van de adsorptie (S2, S5 en S10 uit stap 1.2).
- Zet van 100 µL van elke bovendrijvende substantie in een tube van 1,5 mL en voeg 100 µL van bindende buffer. Zes tweevoudige seriële verdunningen van 200 µL (eindvolume) elk, met behulp van de bindende buffer uitvoeren
- Snijd een nitrocellulose membraan (0,45 µm cutoff), 9 x 10 cm in omvang, het gebied van 5 (aantal monsters) x 6 (aantal verdunningen) stippen bedekt. Het membraan moet niet verder reiken dan de rand van de pakking van het toestel van de vlek dot.
- Plaats het prewet membraan in het toestel van de vlek dot. Verwijder eventuele luchtbellen gevangen tussen het membraan en de pakking. Dekking van het ongebruikte deel van het apparaat met tape of paraffine film om te voorkomen dat lucht doorlopen van deze putten.
- Het stip vlek apparaat zoals beschreven door de fabrikant te monteren.
- Als een vacuüm wordt gebruikt tijdens de montage, hydrateren het membraan met 100 µL van 1 x PBS per putje te zorgen voor de uniforme binding van het antigeen en halo's of een signaal zwak detectie te voorkomen.
- Verwijder voorzichtig de buffer uit de putten door vacuüm. Zodra de bufferoplossing uit alle putten wegloopt, stop de vacuümpomp en koppelt u deze los.
- Het laden van de standaard in de meeste externe twee rijstroken en de monsters in het midden (Figuur 5). Vul de juiste putjes met 100 µL van elke verdunning. Hetzelfde volume gebruikt voor elk putje moet ervoor zorgen dat een homogene filtratie van alle putjes van de steekproef.
- Zet de vacuümpomp voor 2 min, stoppen, en dan, toestaan dat de steekproef wilt filteren via het membraan zwaartekracht stroom.
- Was alle de putjes met 100 µL van 1 x PBS en laat de vacuümpomp uitvoeren voor een andere 5 min na het wassen buffer heeft zijn volledig gedraineerd uit het apparaat.
- Met het vacuüm op, draai de schroeven en zorgvuldig open het toestel van de vlek dot.
- Uitschakelen van het vacuüm, neem het membraan, en verwerkt volgens een protocol voor westelijke vlek.
- Een densitometric analyse van de filter, door middel van passende software, zoals ImageJ uitvoeren.
- Het meten van de geïntegreerde dichtheid van elke stip door waarin ze met een cirkel van hetzelfde gebied en het gebruik van de opdracht Analyseren/maatregel .
- Een achtergrondcorrectie van het beeld, tekenen van een cirkel in een leeg gebied en het meten van de geïntegreerde dichtheid of met behulp van de opdracht Proces/Subtract achtergrond maken
- De geïntegreerde dichtheid van de standaard puntjes te correleren met de hoeveelheid geladen eiwitten en het verkrijgen van een kalibratie-lijn (R-2 waarden voor kalibratie bochten over 0.95 moet).
- Gebruik de kalibratiekromme te extrapoleren van de concentratie van mRFP van elk monster dot.
- Bereken de concentratie van de mRFP nog in de niet-afhankelijke breuken.
Opmerking: Om de correcte afsluiting van het toestel van de vlek dot en dus tot onderwerp het membraan tot een uniforme druk, draai de schroeven door het volgen van een diagonaal gekruiste regeling en open vervolgens de vacuümpomp aan te scherpen de schroeven sterker.
4. spore collectie en opnieuw gebruiken
- Uitvoeren voor de recycling van de geadsorbeerde spore, twee reacties van de adsorptie van 2.0 x 109 gezuiverd sporen met 10 µg gezuiverde GH10-XA xylanase of 10 µg gezuiverde GH3-XT β-xylosidase, zoals beschreven in stappen 1.1-1.3 (Figuur 6A).
- Verzamelen van de pellets met de enzym-geadsorbeerde sporen, resuspendeer hen in 50 µL van de optimale buffer voor de enzymatische reactie assay (50 mM natriumfosfaat buffer met een pH van 6.5; 2.48689 g/L Na2HPO4, 4.88991 g/L NaH2PO4), en meng ze samen met het oog op een mengsel van 100 µL van sporen adsorberend GH10-XA of GH3-XT.
- Toevoegen van het substraat (5 mg/mL 4-O-methyl-d-glucuronod-xylan [MGX]) en laat het enzym reacties plaatsvinden voor 16 h bij 65 ° C.
- Centrifugeer het reactiemengsel (voor 15 min bij 13.000 x g) en bewaar het supernatant met het enzym reactieproduct.
- Resuspendeer de pellet in 100 µL van verse 50 mM natriumfosfaat buffer met een pH van 6.5 in aanwezigheid van een nieuw substraat (MGX) (Figuur 6B).
Opmerking: Om te adsorberen van meer dan één enzym, het is mogelijk te adsorberen beide samen of één voor één onafhankelijk. De laatste mogelijkheid vergemakkelijkt de kwantitatieve analyse van de adsorptie-efficiëntie en de activiteit van elk enzym, waardoor een stoichiometrische evenwicht van elk enzym nodig voor de reacties.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Succesvolle adsorptie kan worden geëvalueerd door het westelijke bevlekken. Op de reactie, het mengsel is gefractioneerde door centrifugeren en gewassen, en de Fractie van de pellet (Figuur 1) wordt gebruikt om uit te pakken van de oppervlakte-eiwitten. Het extract is gefractioneerde door SDS polyacrylamide-gelelektroforese (pagina), electrotransferred naar een Polyvinylideenfluoride (PVDF) fluoride membraan, en gereageerd tegen de primaire en secundaire antilichamen. De aanwezigheid van eiwitten van de verwachte grootte, alleen in de baan geladen met een extract van de geadsorbeerde sporen, is kenmerkend voor een succesvolle adsorptie reactie(Figuur 2).
De efficiency van de reactie van de adsorptie kan worden geëvalueerd door de directe en indirecte methoden. De directe beoordeling van de efficiëntie van de adsorptie hangt af van het heterologe eiwit dat is gebruikt en kan worden uitgevoerd door fluorescentie microscopie (Figuur 2B) en cytofluorimetry (Figuur 2C) op de pellet-breuk na de versplintering van de adsorptie-reactie. Een kwantificering van de fluorescerende signalen aanwezig op de sporen kan worden uitgevoerd met behulp van de software van de ImageJ (Figuur 3 en Figuur 4). Een indirecte analyse van de adsorptie-efficiëntie kan worden uitgevoerd door een stip bevlekken analyse (Figuur 5A) van het supernatant breuk met de niet-afhankelijke eiwitten (Figuur 1). Een densitometric analyse van de niet-afhankelijke eiwitten (Figuur 5B) kunnen dan wetenschappers om te berekenen niet indirect de hoeveelheid eiwit geadsorbeerde op sporen.
Twee opeenvolgende reacties kunnen worden gekatalyseerd door een mengsel van sporen weergeven van één van beide één van de twee specifieke enzymen (Figuur 6A). De geadsorbeerde enzyme(s) kunnen worden verzameld met een eenvoudige centrifugeren stap, gewassen en geïncubeerd met vers basismateriaal voor een nieuwe cyclus van de reactie (Figuur 6B).
Figuur 1:opzet van het adsorptiekinetiek-experiment. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Directe analyse van de efficiëntie van het display mRFP. (A) Western blot met mRFP-specifieke antilichaam. C + = gratis gezuiverde mRFP; C - = een uittreksel van de eiwitten uit sporen niet geadsorbeerd aan het eiwit; P2/P5/P10 = eiwitten gewonnen uit B. subtilis sporen geadsorbeerde met 2, 5 en 10 mg mRFP, respectievelijk. (B) immunofluorescentie microscopie van geadsorbeerde sporen. Immunoreactions werden uitgevoerd met een primair antilichaam herkennen de geadsorbeerde proteïne en met een fluorescerende secundair antilichaam geconjugeerd met fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC). Het linker paneel toont de fluorescentie van rode intrinsieke mRFP, dat het rechter paneel toont de groene fluorescentie van FITC-geconjugeerd secundair antilichaam. (C) cytometrische analyse van de geadsorbeerde sporen stromen. De sporen reageerde met mRFP-specifieke antilichamen en met FITC-geconjugeerd secundaire antilichamen en vervolgens werden geanalyseerd door cytofluorimetry. De analyse werd uitgevoerd op de gehele spore bevolking (10.000 gebeurtenissen, ungated). In het linker paneel, worden niet-geadsorbeerde sporen in zwart, mRFP-geadsorbeerde sporen in het rood weergegeven. Het rechter paneel toont de voorwaartse en zijdelingse (FSC-WS) stip scatterplot. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: handmatige kwantificering van het fluorescerende signaal door ImageJ. Een fluorescentie Microscoop afbeelding van sporen, geadsorbeerde met de rode fluorescerende eiwit mRFP, geanalyseerd met ImageJ software. Een gele cirkel heeft opgesteld rond een spore om densitometric gegevens (vergrote beeld) te verkrijgen. De popup doos toont de resultaten van de densitometric analyse van de geselecteerde spore. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: gelijktijdige kwantificering van het fluorescerende signaal door ImageJ. (A) Popup doos verkregen bij het selecteren van de Particle analyseren. Een intervalwaarde van 50-200 pixel ^ 2 moet worden ingesteld voor sporen23. (B) segmentatie van het beeld van Figuur 3A nadat u Analyseren deeltjes (links), en de resultaten van de relatieve densitometric analyse (rechts). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: Dot Bevlekkende en densitometric analyse. (A) Dot bevlekken met seriële verdunningen van het gezuiverde mRFP in tweevoud (Std1 en Std2) en het supernatant (S10, S5 en S2) van de reactie van de adsorptie uitgevoerd met 10, 5 en 2 µg voor mRFP, respectievelijk23. (B) de stip bevlekken van paneel A wordt gebruikt voor de densitometric analyse. De cirkels geven het gebied gebruikt voor het kwantificeren van de dichtheid van de signalen. Het paneel aan de rechterkant meldt een voorbeeld van de resultaten van de densitometric analyse. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6: omzetting van Xylaan door herbruikbare sporen. (A) algemene schema van Xylaan afbraak. (B) sporen de xylanase of de β-xylosidase-enzymen, weer te geven wanneer vermengd, katalyseren de afbraak van de twee stappen van Xylaan. Na de reactie, het monster is gefractioneerde door centrifugeren. De bovendrijvende vloeistof bevat het reactieproduct, terwijl de pellet spore-gebonden enzymen die kunnen worden hergebruikt bevat door toevoeging van vers basismateriaal. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol spore adsorptie is zeer eenvoudig en ongecompliceerd. De reactie is strikt afhankelijk van de pH van de buffer van de reactie en de efficiëntie van adsorptie is optimaal bij zure pH-waarden (pH 5.0 of lager). Bij neutrale pH-omstandigheden, de efficiëntie van adsorptie is laag, en bij alkalische pH waardes, adsorptie niet kan optreden. Optimale adsorptie wordt verkregen met behulp van een volume van 200 µL in 1,5 mL buizen (of een vergelijkbare verhouding te houden) op een rockende shaker.
Adsorptie is zeer strak en wast met een buffer op de dezelfde pH van de buffer reactie niet leiden tot een willekeurige release van de geadsorbeerde eiwitten. Wast met basische buffers kunnen resulteren in een minimale (over het algemeen minder dan 15%26) versie van het geadsorbeerde eiwit.
De indirecte evaluatie van de efficiëntie van adsorptie door dot bevlekken is betrouwbaar als verschillende verdunningen van het gezuiverde en niet-afhankelijke eiwitten worden geanalyseerd en de densitometric analyse is correct uitgevoerd. Geen bewijs van een aantasting van de heterologe eiwitten geweest gerapporteerde25. De directe beoordeling van de efficiëntie van adsorptie is sterk afhankelijk van het eiwit dat is geadsorbeerd. Als het eiwit autofluorescent of fluorescently aangeduid, een ImageJ-bijgewoonde analyse een kwantitatieve bepaling van de fluorescentie, alsmede van het bedrag van fluorescerende moleculen biedt aanwezig op de spore. Als het eiwit een enzymatische activiteit heeft, kan een specifieke enzymatische assay een indicatie van de hoeveelheid proteïne opleveren op de sporen. Het is echter bekend dat de enzymatische activiteit geassocieerd met de sporen kan worden verhoogd door een stabilisatie-effect als gevolg van de interactie met het spore-13. Als de geadsorbeerde eiwit niet tl is en niet een enzymatische activiteit hoeft, kan de efficiëntie van adsorptie door dot bevlekken op sporen geëxtraheerd drastische voorwaarden worden geëvalueerd.
Een verzameling van gebruikte sporen kan gebeuren door een zeer eenvoudige procedure. Een wassen stap met de reactie buffer kan worden belangrijk voor het verwijderen van reactie bijproducten, terwijl de toevoeging van vers basismateriaal essentieel is voor het starten van een nieuwe reactie21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door de "Finanziamento di Ricerca di Ateneo" naar L. Baccigalupi, titel van het project "SP-LAY: bacteriële sporen als live platform voor eiwitten weergave".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1% Poly-L-lysine solution | Sigma | P8920 | |
| 0.45 µm Nitrocellulose Blotting Membrane | Sartorius | M_Blotting_Membranes | |
| 100× objective UPlanF1 | Olympus | microscope equipment | |
| Bacillus subtilis strain NCIB3610 | Bacillus Genetic Stock Center | 3A1 | |
| BD ACCURI C6 PLUS | BD | flow cytometer | |
| BX51 | Olympus | Fluorescent microscope | |
| Clarity | Biorad | 1705060 | |
| DP70 digital camera a | Olympus | microscope equipment | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, FITC | Thermo fisher | F-2754 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) | Abcam | ab6721 | |
| Monoclonal Anti-polyHistidine−Peroxidase antibody | Sigma | A7058-1VL | used to detect adsorbed proteins presenting a 6xhistidine-tag at C- or N- terminal |
| SecureSlip glass coverslip | Sigma | S1815-1PAK | |
| Superwhite Uncharged Microscope Slides | VWR | 75836-190 | |
| U-CA Magnification Changer | Olympus | microscope equipment |
References
- Felici, F., et al. Peptide and protein display on the surface of filamentous bacteriophage. Biotechnology Annual Review. 1, 149-183 (1995).
- Cortese, R., et al. Identification of biologically active peptides using random libraries displayed on phage. Current Opinion in Biotechnology. 6, 73-80 (1995).
- Sousa, C., Cebolla, A., de Lorenzo, V. Enhanced metalloadsorption of bacterial cells displaying poly-His peptides. Nature Biotechnology. 14, 1017-1020 (1996).
- Richins, R., Kaneva, I., Mulchandani, A., Chen, W. Biodegradation of organophosphorus pesticides by surface-expressed organophosphorus hydrolase. Nature Biotechnology. 15, 984-987 (1997).
- Wu, J. Y., et al. Expression of immunogenic epitopes of hepatitis B surface antigen with hybrid flagellin proteins by a vaccine strain of Salmonella. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86, 4726-4730 (1989).
- Newton, S. M., Jacob, C. O., Stocker, B. A. Immune response to cholera toxin epitope inserted in Salmonella flagellin. Science. 244, 70-72 (1989).
- Fischetti, V. A., Medaglini, D., Pozzi, G. Gram-positive commensal bacteria for mucosal vaccine delivery. Current Opinion in Biotechnology. 7, 659-666 (1996).
- Isticato, R., Ricca, E. Spore surface display. Microbiology Spectrum. 2 (5), (2014).
- Ricca, E., et al. Mucosal vaccine delivery by non-recombinant spores of Bacillus subtilis. Microbial Cell Factories. 13, 115 (2014).
- McKenney, P. T., Driks, A., Eichenberger, P. The Bacillus subtilis assembly and functions of the multilayered coat. Nature Reviews Microbiology. 11, 33-44 (2013).
- Knecht, L. D., Pasini, P., Daunert, S. Bacterial spores as platforms for bioanalytical and biomedical applications. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 400, 977-989 (2011).
- Isticato, R., Cangiano, G., De Felice, M., Ricca, E. Display of molecules on the spore surface. Bacterial Spore Formers: Probiotics and Emerging Applications. Ricca, E., Henriques, A. O., Cutting, S. M. , Horizon Bionsciences. Norfolk, UK. 193-200 (2004).
- Sirec, T., et al. Adsorption of β-galactosidase of Alicyclobacillus acidocaldaricus wild type and mutant spores of Bacillus subtilis. Microbial Cell Factories. 11, 100 (2012).
- Cutting, S. M. Bacillus probiotics. Food Microbiology. 28, 214-220 (2011).
- Baccigalupi, L., Ricca, E., Ghelardi, E. Non-LAB Probiotics: Spore Formers. Probiotics and Prebiotics: Current Research and Future Trends. Venema, K., Do Carmo, A. P. , Caister Academic Press. 93-103 (2014).
- Cutting, S. M., Hong, H. A., Baccigalupi, L., Ricca, E. Oral Vaccine Delivery by Recombinant Spore Probiotics. International Reviews of Immunology. 28, 487-505 (2009).
- Lee, S. Y., Choi, J. H., Xu, Z. Microbial cell-surface display. Trends in Biotechnology. 21, 45-52 (2003).
- Isticato, R., et al. Surface display of recombinant proteins on Bacillus subtilis spores. Journal of Bacteriology. 183, 6294-6301 (2001).
- Huang, J. M., et al. Mucosal delivery of antigens using adsorption to bacterial spores. Vaccine. 28, 1021-1030 (2010).
- Isticato, R., et al. Non-recombinant display of the B subunit of the heat labile toxin of Escherichia coli wild type and mutant spores of Bacillus subtilis. Microbial Cell Factories. 12, 98 (2013).
- Mattossovich, R., et al. Conversion of xylan by recyclable spores of Bacillus subtilis thermophilic enzymes. Microbial Cell Factories. 16, 218 (2017).
- Pesce, G., et al. Surface charge and hydrodynamic coefficient measurements of Bacillus subtilis by optical tweezers. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 116, 568-575 (2014).
- Donadio, G., et al. Localization of a red fluorescence protein adsorbed on wild type and mutant spores of Bacillus subtilis. Microbial Cell Factories. 15, 153 (2016).
- Pan, J. G., Choi, S. K., Jung, H. C., Kim, E. J. Display of native proteins on Bacillus subtilis spores. FEMS Microbiology Letters. 358, 209-217 (2014).
- Cutting, S., Vander Horn, P. B. Genetic analysis. Molecular Biological Methods for Bacillus. Harwood, C., Cutting, S. , John Wiley & Sons. Chichester, UK. (1990).
- Lanzilli, M., et al. Display of the peroxiredoxin Bcp1 of Sulfolobus solfataricus probiotic spores of Bacillus megaterium. New Biotechnology. 46, 38 (2018).
