संपोषित कोशिकाओं में प्रकार्यीकृत नैनोबॉडीज का उपयोग करते हुए ट्रांस-गोल्गी नेटवर्क में एन्डोसिटिक के उत्थान और प्रतिगामी परिवहन का विश्लेषण
Summary
कोशिका की सतह से गोलगी के लिए प्रोटीन का प्रतिगामी परिवहन झिल्ली होमियोस्टेसिस को बनाए रखने के लिए आवश्यक है । यहां, हम एक विधि का वर्णन करने के लिए biochemically सेल सतह का विश्लेषण करने के लिए-पुनः संयोजक प्रोटीन के golgi परिवहन HeLa कोशिकाओं में क्रियाशील नैनोबॉडीज का उपयोग ।
Abstract
कोशिका की सतह से गोलगी के लिए प्रोटीन और झिल्ली का परिवहन और परे होमियोस्टेसिस, अंगक पहचान और शरीर क्रिया विज्ञान के लिए आवश्यक है । प्रतिगामी प्रोटीन ट्रैफ़िक का अध्ययन करने के लिए, हमने हाल ही में एक बहुमुखी nanobody-आधारित टूलकिट विकसित किया है ताकि सेल की सतह से गोलगी कॉम्प्लेक्स तक परिवहन का विश्लेषण हो, या तो फिक्स्ड और लाइव सेल इमेजिंग द्वारा, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा, या बायोकैमिकली । हम क्रियाशील विरोधी हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (gfp) nanobodies इंजीनियर-छोटे, monomeric, उच्च संबध प्रोटीन बाँधने-कि सेल के लिए लागू किया जा सकता है एक extracellular gfp मोइटी के साथ ब्याज की झिल्ली प्रोटीन व्यक्त लाइनों । derivatized gfp पत्रकारों को बाध्य nanobodies विशेष रूप से भली भांति और ‘ पत्रकारों छंटाई मार्गों के साथ piggyback परिवहन कर रहे हैं । नैनोबॉडीज को फ्लोरोप्रेसेंस माइक्रोस्कोपी और लाइव इमेजिंग द्वारा प्रतिगामी परिवहन के साथ क्रियाशील किया गया था, एस्कॉर्बेट peroxidase 2 (APEX2) के साथ, इलेक्ट्रॉन द्वारा रिपोर्टर-नैनोबॉडी परिसरों के अल्ट्रास्ट्रक्चरल स्थानीयकरण की जांच करने के लिए माइक्रोस्कोपी, और tyrosine सल्फेशन (टीएस) के साथ ट्रांस-गोल्गी नेटवर्क (tgn) आगमन की गतिकी का आकलन करने के लिए रूपांकनों । इस methodological लेख में, हम बैक्टीरियोली व्यक्त करने के लिए सामान्य प्रक्रिया रूपरेखा और क्रियाशील नैनोबॉडीज को शुद्ध । हम हमारे उपकरण के शक्तिशाली उपयोग का वर्णन mcherry-और टीएस संशोधित nanobodies का उपयोग करने के लिए endocytic उत्थान और कार्गो प्रोटीन के tgn आगमन का विश्लेषण ।
Introduction
कोशिका की सतह से प्रोटीन और लिपिड का प्रतिगामी यातायात विभिन्न इंट्रासेलुलर डिब्बों के लिए झिल्ली होमियोस्टेसिस के रखरखाव के लिए counterbalance स्राव के लिए महत्वपूर्ण है और एंट्रोग्रेड परिवहन मशीनरी के घटकों को रीसायकल करने के लिए1 , 2. clathrin-निर्भर या-स्वतंत्र endocytosis के माध्यम से इंटर्नशिप के बाद, प्रोटीन और लिपिड कार्गो पहले जहां वे आगे भी endo-lysosomal प्रणाली, प्लाज्मा झिल्ली को पुनर्नवीनीकरण के साथ या तो पुनर्निर्देशित कर रहे हैं से जल्दी endosomes आबाद, या ट्रांस गोल्गी नेटवर्क (tgn) को लक्षित । endosomes और/या tgn के लिए सेल सतह से पुनर्चक्रण एंट्रोग्रेड ट्रांसमेम्ब्रेन कार्गो रिसेप्टर्स के एक नंबर के कार्यात्मक चक्र का हिस्सा है, जैसे धनायन निर्भर और धनायन स्वतंत्र मनोस-6-फॉस्फेट रिसेप्टर्स (cdmpr और cimpr) पहुंचाने नए संश्लेषित लाइसोसोमल हाइड्रोलीज़ को टीजीएन से देर से एंडोसोमस और लाइसोसोम3,4,5, सोर्टिलिं और सोरला6,7, और नाहीन (wls) को सेल की सतह पर wntless लिगंडस के परिवहन के लिए 8 , 9 , 10 , 11. अंय प्रोटीन tgn को वापस प्राप्त TGN46 और उसके संबंधित isoforms12,13,14, snares (घुलनशील N-ethylmaleimide संवेदनशील फ्यूजन फैक्टर लगाव रिसेप्टर्स) 15 , 16 , 17, एमीलॉइड प्रणेता प्रोटीन (एपीपी)18,19, प्रगतिशील एंसिलोसिस (ANK) प्रोटीन20, धातु ट्रांसपोर्टरों जैसे ATP7A/बी या DMT121,22, और ट्रांसमेम्ब्रेन कार्बोक्सिपेप्टिडेस डी, फ्रिन या BACE123,24,25सहित प्रोसेसिंग एंजाइम । इन अंतर्जात प्रोटीन के अलावा, जीवाणु और संयंत्र विषाक्त पदार्थों (जैसे, shiga और हैजा विष, ricin और abrin) अपहरण प्रतिगामी परिवहन मशीनरी cytosol26,27में retrotranslocation के लिए ईआर तक पहुँचने के लिए, 28,29.
आदेश में सीधे प्रतिगामी यातायात का विश्लेषण करने के लिए, हम पहले से एक nanobody-आधारित toolkit विकसित किया है लेबल और सेल की सतह से इंट्रासेल्युलर डिब्बों30के लिए कार्गो प्रोटीन का पालन करें । नैनोबॉडीज प्रोटीन के एक नए परिवार का प्रतिनिधित्व करते हैं, जो कि स्वाभाविक रूप से camelids और उपास्थि मछलियों31,३२में पाए जाने वाले समलैंगिकता भारी-श्रृंखला-केवल एंटीबॉडी (एचकेबीएस) से व्युत्पंन हैं वे चर भारी श्रृंखला hcabs के डोमेन (vhh) का गठन और पारंपरिक एंटीबॉडी (उदाहरण के लिए, iggs) पर कई फायदे हैं: वे monomeric हैं, छोटे (~ 15 केडीए), अत्यधिक घुलनशील, डिसल्फाइड बांड से रहित, जीवाणुरोधी व्यक्त किया जा सकता है, और के लिए चयनित उच्च-संबध बाइंडिंग३३,३४,३५,३६। हमारे nanobody उपकरण बहुमुखी और मोटे तौर पर लागू करने के लिए, हम सतह लेबल करने के लिए क्रियाशील विरोधी gfp nanobody कार्यरत है और उनके extracellular/lumenal डोमेन पर gfp के साथ टैग की गईं प्रोटीन ट्रैक । mcherry, एस्कॉर्बेट peroxidase 2 (APEX2)३७, या tyrosine सल्फेशन (टीएस) दृश्यों, वास्तविक ट्रांसमेम्ब्रेन कार्गो प्रोटीन के प्रतिगामी परिवहन के साथ nanobodies के functionalization द्वारा या तो फिक्स्ड और लाइव सेल इमेजिंग द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है, द्वारा इलेक्ट्रॉन सूक्ष्मदर्शी, या biochemically । tyrosylprotein सल्फोट्रांसटोरिज़ (TPST1 और TPST2) द्वारा मध्यस्थता के बाद से टायरोसिन सल्फेशन ट्रांस गोल्गी/tgn के लिए प्रतिबंधित एक posttranslational संशोधन है, हम सीधे सेल सतह से इस के लिए ब्याज की प्रोटीन की परिवहन और कैनेटीक्स का अध्ययन कर सकते हैं आंतरकोशिकीय गोलगी डिब्बा३८,३९,४०.
इस तरीके लेख में, हम क्रियाशील नैनोबॉडीज (vhh-2xts,-APEX2,-mcherry और डेरिवेटिव) के उत्पादन में आसानी का वर्णन आवेदनों की एक संख्या के लिए उपयुक्त स्तनधारी कोशिकाओं में प्रतिगामी परिवहन का विश्लेषण करने के लिए30. हम मुख्य रूप से सेल की सतह से सल्फेशन के डिब्बे के लिए इंट्रासेलुलर यातायात के विश्लेषण के लिए टीएस साइट-संशोधित नैनोबॉडी के उपयोग पर ध्यान केंद्रित करते हैं ।
Protocol
Representative Results
Discussion
nanobodies पारंपरिक एंटीबॉडी पर कई फायदे के साथ प्रोटीन बांधने की मशीन मचाने के एक उभरते वर्ग का प्रतिनिधित्व करते हैं: वे छोटे हैं, स्थिर, monomeric, उच्च संबध और कमी के लिए चुना जा सकता है डाइसलफाईड बांड३३<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम ग्रांट 31003a-१६२६४३ द्वारा स्विस नेशनल साइंस फाउंडेशन द्वारा समर्थित था । हम समर्थन के लिए निकोल beuret और biozentrum इमेजिंग कोर सुविधा (imcf) धंयवाद ।
Materials
| Anti-GFP antibody | Sigma-Aldrich | 118144600001 | Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche |
| Anti-His6 antibody | Bethyl Laboratories | A190-114A | |
| Anti-actin antibody | EMD Millipore | MAB1501 | |
| Goat anti-rabbit HRP | Sigma-Aldrich | A-0545 | |
| Goat anti-mouse HRP | Sigma-Aldrich | A-0168 | |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | dissolved in 1 x PBS/1%BSA |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Applichem | A3672 | |
| D-biotin | Sigma-Aldrich | B4501 | dissolved in sterile 500 mM NaH2PO4 or DMSO |
| 5-aminolevuilnic acid (dALA) hydrochloride | Sigma-Aldrich | A3785 | dissolved in sterile water |
| DNase I | Applichem | A3778 | dissolved in sterile water |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | 18037059001 | Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche |
| Brefeldin A (BFA) | Sigma-Aldrich | B5936 | |
| Puromycin | Invivogen | ant-pr-1 | |
| Penicillin/Streptomycin | Bioconcept | 4-01F00-H | |
| L-glutamine | Applichem | A3704 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Biowest | S181B-500 | |
| Sulfur-35 as sodium sulfate | Hartmann Analytics | ARS0105 | Product contains 5 mCi |
| Earle's balanced salts | Sigma-Aldrich | E6267 | |
| MEM amino acids (50 x) solution | Sigma-Aldrich | M5550 | |
| MEM vitamin solution (100 x) | Sigma-Aldrich | M6895 | |
| cOmplete, Mini Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | 11836153001 | Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche |
| Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) | Applichem | A1008 | dissolved in sterile water, stock is 1 M |
| Carbenicillin disodium salt | Applichem | A1491 | dissolved in sterile water, stock is 100 mg/mL |
| Kanamycin sulfate | Applichem | A1493 | dissolved in sterile water, stock is 100 mg/mL |
| Coomassie-R (Brilliant Blue) | Sigma-Aldrich | B-0149 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Applichem | A3813 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Ni Sepharose High Performance | GE Healthcare | 17-5268-01 | |
| His GraviTrap columns | GE Healthcare | GE11-0033-99 | |
| His buffer kit | GE Healthcare | GE11-0034-00 | |
| Disposable PD10 desalting columns | GE Healthcare | GE17-0851-01 | |
| Mini-Protean TGX gels, 4-20%, 15-well | Bio-Rad | 456-1096 | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) w/o Ca2+/Mg2+ | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| 35-mm dishes | Falcon | 353001 | |
| 6-well plates | TPP | 92406 | |
| Glass coverslips (No. 1.5H) | VWR | 631-0153 | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Applichem | A0999.0025 | dissolved in 40% DMSO 60% isopropanol, stock in 500 mM |
| Tryptone | Applichem | A1553 | |
| Yeast extract | Applichem | A1552 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Merck Millipore | 105833 | dissolved in sterile water, stock is 1 M |
| Calcium chloride dihydrate | Merck Millipore | 102382 | dissolved in sterile water, stock is 1 M |
| Sodium chloride | Merck Millipore | 106404 | dissolved in sterile water, stock is 5 M |
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