Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

ניתוח של ספיגת Endocytic ותעבורה רטרוגרדית לרשת הטרנס-גולג'י באמצעות Functionalized Nanobodies בתאים בתרבית

Published: February 21, 2019 doi: 10.3791/59111
Automatic Translation
1, 1
1Biozentrum, University of Basel

Summary

העברת רטרוגרדית חלבונים מהמשטח תא גולג'י הוא חיוני כדי לשמור על הומאוסטזיס ממברנה. כאן, אנו מתארים שיטה לנתח מבחינה ביוכימית תא השטח-כדי-גולג'י הובלה של חומרים באמצעות functionalized nanobodies בתאים הלה.

Abstract

הובלה של חלבונים וממברנות מהמשטח תא גולג'י ומעבר חיוני הומאוסטזיס, זהות אברון, פיזיולוגיה. ללמוד תנועה רטרוגרדית חלבון, לאחרונה פיתחנו ערכת כלים מגוונים מבוססי nanobody לנתח תחבורה מהמשטח תא למתחם גולג'י, או על ידי תא קבוע ולחיות הדמיה, באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים, או מבחינה ביוכימית. אנחנו מהונדסים חלבון פלואורסצנטי ירוק אנטי functionalized (GFP) nanobodies — חלבון קטן, monomeric, גבוהה-זיקה קלסרים — כי ניתן להחיל על שורות תאים לבטא קרום חלבונים עניין עם moiety-GFP חוץ-תאית. Nanobodies derivatized קשור הכתבים GFP במיוחד הם הפנימו והועברו קמח לאורך נתיבי המיון של הכתבים. Nanobodies היו functionalized עם fluorophores בצע תחבורה רטרוגרדית על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ ולחיות הדמיה, עם ascorbate peroxidase 2 (APEX2) לחקור לוקליזציה ultrastructural של מתחמי כתב-nanobody על ידי אלקטרון מיקרוסקופ, ועם טירוזין מוטיבים sulfation (TS) כדי להעריך קינטיקה של טרנס-גולג'י רשת (TGN) הגעה. במאמר מתודולוגי, אנחנו חלוקה לרמות ההליך כללי bacterially אקספרס ולטהר functionalized nanobodies. אנו מדגימים את השימוש כלי שלנו באמצעות את nanobodies mCherry - ו TS-השתנה כדי לנתח ספיגת endocytic ואת ההגעה TGN של חלבונים מטען רב עוצמה.

Introduction

תנועה רטרוגרדית של חלבונים ושומנים מפני השטח תא אל תאי תאיים שונים הוא קריטי עבור תחזוקה של הומאוסטזיס ממברנה לאזן את הפרשה, למחזר מרכיבי anterograde תחבורה machineries1 , 2. בעקבות הפנמה דרך אנדוציטוזה clathrin תלוית או - עצמאית, חלבונים, שומנים בדם מטען קודם לאכלס מוקדם endosomes מהיכן שהם נמצאים רחוק הופנה גם לאורך מערכת אנדו-lysosomal, ממוחזר כדי קרום פלזמה, . או יישוב לרשת הטרנס-גולג'י (TGN). מיחזור endosomes ו/או על פני התא כדי TGN זה חלק מהמחזוריות פונקציונלי של מספר anterograde מטען transmembrane רצפטורים, כגון הקטיון תלוית ועצמאי הקטיון מנוז-6-פוספט הקולטנים (CDMPR ו- CIMPR) אספקת לאחרונה מסונתז hydrolases lysosomal מ TGN endosomes מאחר lysosomes3,4,5, sortilin,6,SorLA7ושל Wntless (WLS) הובלת ונ ט ליגנדים השטח תא 8 , 9 , 10 , 11. לחלבונים אחרים לאחזר לחזור TGN TGN46 הינם שלו קשורים איזופורמים12,13,14, מלכודות (מסיס N- ethylmaleimide רגיש פיוז'ן גורם מצורף קולטנים) 15 , 16 , 17, קודמן עמילואיד חלבון (APP)18,19, ankylosis מתקדמת (תודה) חלבון20, מובילי מתכת כגון ATP7A/B או DMT121,22, ו transmembrane עיבוד אנזימים כולל קרבוקסיפפטידאז D, furin או BACE123,24,25. מלבד אלה חלבונים אנדוגני, רעלים בקטריאלי, צמח (למשל, טוקסין שיגה, כולרה, ריצין ו abrin) לחטוף machineries רטרוגרדית תחבורה כדי להגיע לחדר מיון לשם retrotranslocation לתוך ציטוזול26,27, 28,29.

על מנת לנתח ישירות רטרוגרדית התנועה, קודם לכן פיתחנו ערכת כלים מבוססי nanobody תווית ולעקוב אחר מטענים חלבונים מהמשטח תא תאיים תאים30. Nanobodies לייצג משפחה חדשה של קלסרים חלבון נגזר homodimeric כבד שרשרת-בלבד נוגדנים (hcAbs) המתרחשים באופן טבעי31,של גמליים ודגים סחוס-32. הם מהווים תחום שרשרת כבדה (VHH) משתנה של hcAbs ויש להם יתרונות רבים קונבנציונאלי נוגדנים (למשל, IgGs): הם monomeric, קטן (~ 15 kDa), מסיס מאוד, ללא, אגרות דיסולפידי יכול להיות מבוטא bacterially, ונבחר גבוהה-זיקה מחייבת33,34,35,36. כדי להפוך את כלי nanobody שלנו רב-תכליתי וישימים בקנה מידה נרחב, אנחנו מועסקים nanobodies נגד functionalized-GFP חלבונים פני תווית ולעקוב המתויגת GFP שלהם בתחום חוץ-תאית/lumenal. על ידי functionalization של nanobodies עם mCherry, ascorbate peroxidase 2 (APEX2) תחבורה רטרוגרדית37, או טירוזין sulfation (TS) רצפים, בוטרפליי מטען transmembrane חלבונים ניתן לנתח הכתיב קבוע ולחיות הדמיה תא, על-ידי מיקרוסקופ אלקטרונים, או מבחינה ביוכימית. מאז sulfation טירוזין מתווכת על-ידי sulfotransferases tyrosylprotein (TPST1 ו- TPST2) הוא שינוי posttranslational מוגבלת של הטרנס-גולג'י/TGN, ישירות שלומדים תחבורה, קינטיקה של חלבונים עניין מהמשטח התא הזה תאיים גולג'י תא38,39,40.

במאמר שיטות, נתאר את הקלות של ייצור של nanobodies functionalized (VHH-2xTS-APEX2, - mCherry נגזרים) מתאים עבור מספר יישומים כדי לנתח תחבורה רטרוגרדית תאים בתרבית של30. אנו מתמקדים בעיקר על השימוש של TS באתר-השתנה nanobody עבור ניתוח של התעבורה תאיים מהמשטח תא התא של sulfation.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. חיידקי טרנספורמציה עם Functionalized Nanobodies

הערה: פרוטוקול זה הותאם עבור הביטוי, טיהור, ניתוח של nanobodies נגד functionalized-GFP כפי שתואר לעיל30. Derivatization עם moieties חלבונים אחרים עשויים לדרוש שינוי של הפרוטוקול הסטנדרטי.

  1. להפשיר חיידקים chemocompetent (~ 100 µL) מתאים ביטוי חלבון (כגון Escherichia coli רוזטה BL21 (DE3) תאים) על-ידי הצבתם על קרח.
    הערה: להכין chemocompetent תאים חיידקיים על פי הנהלים מעבדה סטנדרטיים. לחלופין, תאים חיידקיים כשיר מבחינה כימית ניתן לרכוש באופן מסחרי.
  2. להוסיף 50 ng של פלסמיד קידוד functionalized nanobodies. כדי לאפשר מספיק בייעודי לאתר biotinylation של הכתב nanobody במהלך חיידקי הביטוי, גם להוסיף על עודף המשולשת (150 ng) של פלסמיד חיידקי הביטוי קידוד ביוטין ליגאז בירה (ראה גם לוח 1 למידע פלסמיד). בעדינות pipet למעלה ולמטה.
    הערה: אם nanobody biotinylation אינה נחוצה או הכתבים nanobody נטולי פפטיד מקבל ביוטין (BAP), שינוי ושיתוף עם פלסמיד קידוד בירה אינה נדרשת.
  3. דגירה של תאים חיידקיים במשך 30 דקות על קרח.
  4. חום לזעזע את התאים חיידקי על-ידי הצבתם עבור 1 דקות ב- 42 ° C באמבט מים או בלוק חימום.
  5. להוסיף 1 מ"ל בטמפרטורת החדר (RT) לוריא מרק (LB) בינוני דגירה של חיידקים טרנספורמציה thermoshaker עבור h 1 ב 37 ° C כדי לאפשר ביטוי פנוטיפי של גנים עמידות. להכנת 1 ליטר ליברות בינוני, תמצית מאזן 5 גר' שמרים, 10 גרם של טריפטון ו- 10 גרם של NaCl, להתמלא במים, לחטא על-ידי autoclaving. אם יש כבר subcloned את nanobody functionalized של וקטור ביטוי המכיל התנגדות אמפיצילין/carbenicillin, שלב 1.5 יכול להיות מושמט.
  6. גלולה החיידק ב 11,000 x g עבור 1 דקות, resuspend ב µL 100 של מדיום LB טריים.
  7. צלחת את החיידקים על תנאי על צלחות LB המכיל אנטיביוטיקה המתאימים (למשל, עם 50 kanamycin µg/mL ו- 50 carbenicillin µg/mL. כאשר החיידק היה שותף טרנספורמציה עם הכתב nanobody, בירה כאמור לעיל (שלב 1.2)).
  8. למקם את הצלחות LB באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס, תנו לגדול לילה (O/N).
    הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול פה על-ידי אחסון לצלחת ליברות עם מושבות מבוגר ב 4 º C. השתמש מצלמות-מיקרוסקופים לאטום צלחות ליברות.

2. חיידקים תרבות נוזלי, אינדוקציה של הביטוי Functionalized Nanobody

  1. לבחור מושבה בקטריאלי המכיל את הווקטור עניין מהצלחת ולתת לו לגדול בבקבוקון המכיל 20 מ ל LB בינוני בתוספת אנטיביוטיקה ו/ן על חממה חזק ב 37 מעלות צלזיוס (ראה גם שלב 1.7 לגבי הבחירה אנטיביוטיקה).
  2. ביום למחרת, לדלל התרבות חיידקי מבוגר 20 מ"ל לתוך בקבוקון המכיל 1 ליטר של מדיום ליברות עם אנטיביוטיקה הבחירה.
  3. להמשיך דגירה התרבות חיידקי ב 37 ° C עד שהוא מגיע עם יתר600 של 0.6-0.7. לאפשר את התרבות להתקרר כדי RT לפני גרימת ביטוי חלבון.
  4. זירוז ביטוי חלבון של functionalized nanobodies, בירה על ידי התוספת של 1 מ"ל של 1 מ' איזופרופיל-β-d-thiogalactopyranosid (IPTG) כדי ריכוז סופי של 1 מ מ משרן (1:1, 000 דילול). גם להוסיף 10 מ של 20 מ מ d-ביוטין מניות פתרון וכתוצאה מכך 200 מיקרומטר d-ביוטין במצע הגידול כדי לאפשר biotinylation של epitope BAP נוכח nanobodies functionalized (ראה גם לוח 1 למידע פלסמיד)
    הערה: הפתרון מניות d-ביוטין המבושלות ddH2O והביא לתוך פתרון על-ידי חיבור drop-wise 500 מ מ NaH2PO4. לחלופין, d-ביוטין יכולים גם להיות מומס דימתיל סולפוקסיד. כדי לייצר nanobodies דבוקה APEX2 (VHH-APEX2), המדיום LB חייב לקבל השלמה בנוסף עם 1 מ מ 5-aminolevulinic חומצה (dALA) הידרוכלוריד לקדם התאגדות heme. dALA מוכן כפתרון מניות 100 מ מ ב- ddH2O.
  5. דגירה התרבות חיידקי הנגרמת IPTG 1 ליטר ב 30 מעלות צלזיוס במשך 4 שעות עבור VHH-2xTS, 20 ° C או O RT/N עבור VHH-APEX2, או בגיל 16 ° O C/N עבור VHH-mCherry (ראה גם לוח 1 למידע פלסמיד).
    הערה: ביטוי תנאי עבור מבנה nanobody החדש חייב להיות אופטימיזציה על ידי הנסיין.
  6. להעביר את התרבות חיידקי הבקבוק לתוך בקבוק 1 ליטר צנטריפוגה, גלולה התאים ב x 5,000 g ב 4 מעלות צלזיוס במשך 45 דקות Decant תגובת שיקוע ולהמשיך בטהרה.
    הערה: הפרוטוקול ניתן להשהות כאן על-ידי אחסון בגדר חיידקי ב- 80 ° C ללא הגבלת זמן. בגדר VHH-APEX2 או VHH-mCherry הוא בדרך כלל חום (בגלל heme incorporated) או ורוד, בהתאמה.

3. טיהור של Functionalized Nanobodies

  1. במידת הצורך, להפשיר בגדר חיידקי קפוא בקרח (ראה גם שלב 2.6).
  2. להוסיף 30 מ של איגוד כקרח מאגר (20 מ מ imidazole ב 1 x PBS) בגדר תא החיידק, resuspend על ידי pipetting למעלה ולמטה. העברת חיידקים resuspended לתוך צינור שכותרתו 50 מ.
  3. תוספת האיגוד 30 מ ל מאגר עם 200 µg/mL ליזוזים, µg 20/mL DNase אני, MgCl 1 מ2 ו 1 מ"מ phenylmethylsulfonyl פלואוריד (PMSF) לבין דגירה תחילה למשך 10 דקות ב RT, ולאחר מכן עבור h 1-4 מעלות צלזיוס על שאכר מעל קצה-.
  4. מכנית lyse תאים חיידקיים בשפופרת 50 מ על ידי הצבת sonicator עצה אל התליה. החל מינימום 3 x 1 קבוע פולסים עם תקופות הצינון 1דקות שביניהם.
  5. Centrifuge את בקטריאלי lysate ב x 15,000 g ב 4 מעלות צלזיוס במשך 45 דקות לגלולה פסולת של תאים שלמים. להעביר תא החיידק sonicated lysate גם לתוך בקבוק צנטריפוגה המתאים עבור צנטריפוגה או לחלק את lysate לתוך צינורות 5 מ"ל במספר עבור שולחן צנטריפוגה.
  6. להעביר את תגובת שיקוע לתוך צינור 50 מ ל וזורקים את הלכלוך pelleted.
  7. לאחסן את שנוקה lysate על הקרח תוך כדי הכנת טיהור על ידי קיבוע המתכת כרומטוגרפיית זיקה (IMAC). כדי לבודד מתויג היסטידין nanobodies functionalized, להעסיק לשימוש יחיד שלו עמודות (ראה טבלה של חומרים) המאפשר טיהור הכבידה-זרימה מהירה ופשוטה.
    הערה: לחלופין, טיהור אצווה במקום בעמודות מסחרי יכול גם לשמש.
  8. הרכבה שלו עמודות בדוכן מתכת.
    1. להתאחות פתרון אחסון העמודות ולאחר equilibrate את שלו עמודה עם 10 מ"ל של איגוד מאגר (20 מ מ imidazole ב 1 x PBS).
    2. ריק על ידי זרימת הכבידה (הזרימה דרך יכול להימחק).
  9. בהדרגה לטעון את שנוקה חיידקי lysate (~ 30 מ"ל) אל העמודה. ריק על ידי זרימת הכבידה (הזרימה דרך יכול להימחק).
  10. לשטוף את שלו טור 2 x עם 10 מ"ל של איגוד מאגר (20 מ מ imidazole ב 1 x PBS).
  11. Elute את nanobodies עם 2 מ"ל • תנאי מאגר (imidazole 500 מ מ ב- 1 x PBS) לתוך צינור 2 מ"ל ולהחיל החלפת המאגר.
  12. מאגר Exchange.
    1. Equilibrate desalting טור (ראה טבלה של חומרים) להציב מתאם עמודה שפופרת 50 מ ל 5 פעמים עם 5 מ של 1 x PBS.
    2. לאפשר המאגר להזין את המיטה ארוז. למחוק את הזרימה דרך.
    3. לאחר equilibration החמישי PBS, לסובב את העמודה ב x 1000 g למשך 2 דקות.
    4. למחוק את הזרימה דרך.
    5. מקם את העמודה עם המתאם אל צינור 50 מ. לטעון mL 2 של nanobody functionalized eluted (מתוך שלב 3.11) PBS equilibrated עמודה desalting ועל ספין-x 1000 g למשך 2 דקות ולאסוף את eluate.
      הערה: במקום בעמודות desalting מסחרי, ניתן להחיל דיאליזה להחלפת הרכב המאגר.
  13. לקבוע את ריכוז חלבון (nanobody) eluate באמצעות bicinchoninic (BCA) או ברדפורד assay בהתאם להוראות היצרן.
    הערה: עבור מבחני ספיגת nanobody על-ידי שורות תאים כתב ה-GFP, ריכוז מניות של 2-10 מ"ג/מ"ל הוא אופטימלי.

4. אימות של הביטוי Functionalized Nanobody (צביעת Coomassie)

  1. היכונו ג'לים 10-12.5% נתרן dodecyl סולפט-לזיהוי בג'ל (מרחביות-עמוד) על פי פרוטוקולים סטנדרטיים.
    הערה: לחלופין, השתמש זמינים מסחרית precast ג'לים הדרגתיות.
  2. Pipet 20 µg של nanobody functionalized מטוהרים לתוך צינור 1.5 mL לרתיחה במאגר מדגם ב 95 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות.
    הערה: לדוגמה, הוסף 10 µL של 2 מ"ג/מ"ל nanobody מניות פתרון לתוך צינור 1.5 מ עם µL 10 2 x דוגמת המאגר. אם אמצעי האחסון הוא קטן מדי, עוד יותר לדלל nanobody ב- PBS לפני הוספת דוגמת המאגר.
  3. טען את nanobody מטוהרים מבושלים במאגר מדגם על גבי ג'ל מרחביות-לזיהוי, ולהפעיל לפי הפרוטוקול הסטנדרטי דף עד הפניה לצבוע (למשל, bromophenol כחול) הגיע לסוף של הג'ל הפרדת, ואחריו Coomassie מכתים, destaining.
  4. ג'ל Coomassie מכתים, Destaining.
    1. Uncast את הג'ל, את הכתם עם פתרון מוכתמים Coomassie (5% 10 גרם/ליטר Coomassie פתרון מניות ב- 10% חומצה אצטית ו- 45% מתנול ddH2O) למשך 20-30 דקות ב- RT על פלטפורמה חזק נע. הג'ל שאמור להיות מכוסה לגמרי בפתרון מוכתמים.
    2. Destain את הג'ל 2 - 3 פעמים עם destain פתרון (7.5% חומצה אצטית וכ-15% מתנול ddH2O) 1 h כל-RT, לפני שעזב את הג'ל O/N עבור עוד יותר destaining.
      הערה: עודף Coomassie יכול להיות ביעילות ספוגה לגמרי על-ידי הצבת מגבות נייר מטבח סביב הג'ל.
  5. תמונה את הג'ל עם imager או מצלמה של בחירה.
    הערה: הביטוי Nanobody הניתנים לאימות נוסף על-ידי immunoblot ניתוח באמצעות נוגדנים מיקוד epitopes שלה (ראה גם איור 1 א').

5. קליטת Nanobodies Functionalized על ידי תאים בתרבית על ידי קרינה פלואורסצנטית מכתים

  1. בשכונה התרבות תאים, התאים הלה זרע ~ 400,000 ל 500,000 stably ביטוי חלבון מתויג GFP כתב על 18 מ מ coverslips זכוכית דקה (1.5 מס H) מנות 35 מ מ או 6-ובכן באשכולות בינונית מלאה המכילה אנטיביוטיקה (איגל ששינה בינוני של Dulbecco, DMEM בתוספת 10% עגל עוברית סרום (FCS), 100 יחידות/mL סטרפטומיצין, 2 מ מגלוטמין ו puromycin 1.5 µg/mL).
    הערה: כאן, אנו משתמשים הלה תאים stably לבטא EGFP-Calnexin, EGFP-CDMPR ו- TfR-EGFP להמחשה. מלבד שורות תאים יציב, ניתן להשתמש גם transiently transfected הלה תאים. שורות תאים יציב יכול להיות שותף מעובד בשלב זה עם הורים שאינם transduced הלה תאים, לשם השוואה ישירה.
  2. דגירה התאים O/N ב- 37 מעלות צלזיוס חממה2 CO 7.5% כדי להתרבות.
    הערה: תאים צריך את confluency של ~ 80% למחרת.
  3. Pipet 2 µL של 2 מ"ג/מ"ל nanobody פתרון מניות לתוך צינור 15 או 50 מ"ל המכיל 2 מיליליטר בינוני מלא (אמצעי אחסון זה מספיקה לכסות תבשיל 35 מ מ או אחד טוב של אשכול 6-ובכן, לכוונן את עוצמת בינונית, nanobody באופן פרופורציונלי כדי לכלול יותר תא תרבות d ishes או אשכולות).
    הערה: לצורך המחשה, כאן אנו משתמשים VHH-mCherry, מאז לא מכתים נוגדן נוסף נדרש כדי לראות nanobody על ידי העיתונאים EGFP (ראה איור 2C).
  4. הסר את מדיום הגידול של התאים ולהוסיף 2 מ של prewarmed בינוני מלא המכיל 2 nanobody µg/mL functionalized לכל מאכל 35 מ מ או יחידה 6-. טוב.
  5. דגירה את התאים עבור h 1-37 מעלות צלזיוס ב חממה2 CO 7.5% כדי לאפשר ספיגת בתיווך כתב nanobody.
    הערה: בהתאם הניסוי המתוכנן, הזמן של ספיגת nanobody צריך להיות מותאם. עבור הניסוי המוצג כאן, 1 h מספיקה להגיע מצב יציב של ספיגת nanobody על ידי EGFP-CDMPR TfR-EGFP.
  6. להסיר את המדיום. ולשטוף את התאים 2 - 3 פעמים עם 1 מ"ל של PBS x 1-RT.
  7. לתקן את התאים עם 1 מ"ל של 3% paraformaldehyde (PFA) למשך 10 דקות ב- RT.
  8. הסרת פתרון מחברים, להרוות לשבועיים הנותרים עם 1 מ"ל של 50 מ מ NH4Cl ב- PBS x 1 עבור 5 דקות ב- RT.
    הערה: 3% כדורגלן צריך להיות מסולק בנפרד כמו מקבע פסולת.
  9. לשטוף את התאים 3 פעמים עם 1 מ"ל של PBS x 1-RT.
  10. Permeabilize התאים עם 1 מ"ל של 0.1% X-100 Triton ב- PBS 1 x 10 דקות ב- RT.
    הערה: למרות permeabilization לא נדרש, EGFP ו- mCherry הוא טוב יותר כאשר לאחר מכן מוטמעים התאים במדיום הרכבה.
  11. לשטוף את התאים 3 פעמים עם 1 מ"ל של PBS x 1-RT.
  12. למקם את coverslips עם מלקחיים על טיפה (~ 100 µL) של BSA 1% ב- PBS x 1 המכיל 5 µg/mL דאפי (4', 6-diamidino-2-phenylindole) למשך 5 דקות ב- RT.
  13. למקם את coverslips בחזרה לתוך הבאר/הצלחת ולשטוף 3 פעמים עם 1 מ"ל של PBS 1 x-RT.
  14. תווית בשקופיות זכוכית והר התאים עם Fluoromount-G... תן המדיום הרכבה להקשיח בחושך במשך 3-4 h ולאחסן את השקופיות זכוכית ב 4 ° C תחת הגנה אור.
  15. תמונה צביעת דפוסי באמצעות מיקרוסקופ של בחירה (למשל, נקודת סריקה קונאפוקלית זקוף מיקרוסקופ).

6. קליטת Nanobodies Functionalized על ידי תאים בתרבית (לניתוח Sulfation)

  1. בשכונה התרבות תאים, זרע תאים הלה ~ 400,000 ל 500,000 stably ביטוי חלבון כתב מתויג GFP במנות 35 מ מ או 6-ובכן אשכולות עם מלאה בינוני המכיל אנטיביוטיקה (איגל ששינה בינוני של Dulbecco, DMEM, בתוספת 10% עגל עוברית סרום (FCS), 100 יחידות/mL סטרפטומיצין, 2 מ מגלוטמין ו puromycin 1.5 µg/mL).
    הערה: כפי שהוזכר לעיל, אנו משתמשים כאן הלה תאים stably לבטא EGFP-Calnexin, EGFP-CDMPR ו- TfR-EGFP להמחשה. מלבד שורות תאים יציב, ניתן להשתמש גם transiently transfected הלה.
  2. דגירה התאים O/N ב- 37 מעלות צלזיוס חממה2 CO 7.5% כדי להתרבות.
    הערה: תאים צריך confluency של ~ 80% ביום למחרת.
  3. להסיר את המדיום מלאה, לשטוף 2 פעמים עם PBS x 1-RT, להרעיב את התאים בינונית ללא סולפט (SFM) עבור h 1-37 מעלות צלזיוס ב חממה2 CO 7.5%.
    הערה: SFM מוגש על-ידי הוספת 10 מ"ל של הגברת חומצות אמינו (50 x) פתרון, 5 מ לגלוטמין (200 מ מ), 5 מ ל ויטמין פתרון (100 x), ו- 900 µL של ·2H2CaCl2O עד 500 מ"ל של מלחים מאוזנת של נשר. עוברים דרך מסנן מיקרומטר 0.22 aliquot.
  4. המנוע מאוורר או ספסל המיועד לעבודה רדיואקטיביות, להכין סולפט תיוג בינוני המכיל סולפט mCi/mL [35S] 0.5 כ מלח נתרן SFM.
    התראה: בזהירות להתמודד עם כל הפתרונות המכיל רדיואקטיביות. עובד רק ביגוד ייעודי או ספסלים. כל אורח/ים ילד/חומר (טיפים, צינורות, צלחות, וכו ') או שטיפת מאגרי בקשר עם רדיואקטיביות חייב להיות שנאספו והשמדתי בנפרד. . עושה את זה בשביל כל השלבים להלן (שלב 6.5-6.20) גם כן
  5. להוסיף VHH-2xTS ב- 1 x PBS סולפט תיוג בינוניים עד ריכוז סופי של 2 µg/mL.
    הערה: . הפקד, כוללים גם VHH-std או nanobody אחר ללא אתרי TS להפגין תיוג ספציפית.
  6. החלפת SFM על-ידי 0.7 מ של סולפט תיוג סולפט 0.5 mCi/mL [35S] המכיל בינונית ו- 2 µg/mL VHH-2xTS, דגירה את התאים עבור h 1 ב 37 ° C ב- 7.5% CO2 מגשים המיועד לעבודה עם רדיואקטיביות.
    הערה: בהתאם הניסוי המתוכנן, הזמן של nanobody sulfation צריך להיות מותאם. בנוסף, כדי לקבוע TGN ההגעה קינטיקה, תיוג שבוצעו עבור זמנים שונים (למשל, עבור 10 דקות, 20 דקות, 30 דקות, וכו '.).
  7. להסיר את המדיום תיוג ולשטוף את התאים 2 - 3 פעמים עם PBS קר כקרח 1 x על צלחת קירור או קרח.
  8. להוסיף 1 מ"ל של פירוק מאגר (PBS המכיל 1% טריטון X-100 ו- 0.5% deoxycholate) בתוספת 2 מ מ PMSF ו- 1 x מעכב פרוטאז קוקטייל, דגירה התאים למשך 10-15 דקות על פלטפורמה נדנדה ב 4 º C.
  9. לגרד, להעביר את lysate לתוך צינור 1.5 mL, מערבולת lysate, ומניחים למשך 10-15 דקות על מסובב מעל קצה--4 מעלות צלזיוס.
  10. להכין את postnuclear lysate על ידי צנטריפוגה ב x 10,000 ג'י 10 דקות ב 4 º C.
  11. באמצעות צינור 1.5 mL, להכין 20-30 µL של slurry של ניקל חרוזי צינור 1.5 mL, לשטוף פעם עם PBS 1 x על ידי בעדינות pelleting אותם ב x 1000 g עבור 1 דקות.
    הערה: במקום ניקל חרוזים, חרוזים streptavidin (אם nanobody biotinylated) או חלבון A חרוזים עם IgG נגד epitope של nanobody (T7 - או HA-תג) יכול לשמש.
  12. להעביר את postnuclear lysate לתוך צינור 1.5 mL המכילה ניקל חרוזים, תקופת דגירה של h 1 ב 4 ° C-מסובב מעל קצה-כדי לבודד את nanobodies. הסרה של aliquot (µL 50-100) של postnuclear lysate, להרתיח מרחביות למאגר דגימה לניתוח immunoblot הבאים של nanobody תא-הקשורים הכולל, כתב GFP וטעינה שליטה.
  13. לשטוף את החרוזים 3 פעמים עם 1 x מאגר PBS או פירוק על ידי בעדינות pelleting ב x 1000 g עבור 1 דקות.
    הערה: לרחצה מחמירים יותר של חרוזים, 20 מ מ imidazole יכולים להיכלל במאגר PBS או פירוק.
  14. בזהירות להסיר את כל הכביסה מאגר החרוזים, להוסיף 50 µL של 2 x מדגם מאגר אותם מרתיחים 5 דקות ב 95 ° C.
  15. עומס שתי ביצים חרוזים על midi 12.5% מרחביות-דף ג'ל ו לרוץ לפי הפרוטוקול הסטנדרטי דף עד הפניה לצבוע (למשל, bromophenol כחול) הגיע לסוף של הג'ל הפרדת.
    הערה: ניתוח Immunoblot של nanobody תא-הקשורים הכולל, כתב GFP וטעינה הבקרה ניתן גם לבצע שימוש של 12.5% מיני מרחביות-דף או ג'ל הדרגתיות precast.
  16. לתקן את הג'ל הפרדת ~ 30 מ של קיבעון מאגר (10% חומצה אצטית ו- 45% מתנול ddH2O) עבור h 1-RT, לשטוף את הג'ל שלוש פעמים עם ~ 50 מ ל מים יונים ולהתכונן ג'ל ייבוש.
  17. ייבוש מרחביות-דף ג'לים.
    1. בזהירות במקום קבוע בג'ל על נמתח תיאחז הסרט, לכסות את זה עם נייר סינון מנייר.
    2. למקם את הג'ל עם נייר הסינון למטה על גבי פלטפורמת ייבוש, הנח את מכסה ואקום, להחליף את משאבת ואקום לייבוש ג'ל. יבש את הג'ל במשך 3-5 שעות.
    3. הסר את תיאחז הסרט, למקם את הג'ל יבשים קלטת autoradiography מצויד עם מסך זרחן.
  18. Autoradiograph תמונה באמצעות Imager מסך של זרחן. בצע את ההוראות של היצרן.
    הערה: בהתאם הכוח של האות, מיובשים ג'לים הצורך להיחשף יותר עם מסכי זרחן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

לחקור חלבונים רטרוגרדית תחבורה ליעדים תאיים שונים, הקמנו לאחרונה כלי מבוסס-nanobody anti-GFP כדי תווית ובצע פיוז'ן רקומביננטי חלבונים מן השטח תא30. . הנה, נדגים לייצור חיידקים כגון derivatized nanobodies ומדגימים את היישום שלהם ללמוד ספיגת endocytic על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ, immunoblotting, כמו גם השימוש שלהם כדי לחקור את ההגעה TGN על ידי ניתוח sulfation. היישום האחרון הוא המוקד מתודולוגי של פרוטוקול זה.

יש לנו שנוצר ארגז של nanobodies נגד functionalized שונים-GFP בעלות מאפיינים משותפים על ידי שיבוט מולקולרי תקן30. Nanobody (תקן) הפשוטה שלנו, VHH-std, מכיל התחום VHH, T7 של, של epitope HA לגילוי הבאים על ידי נוגדנים ספציפיים, hexahistidine carboxyterminal (His6)-תג טיהור, ביוטין מקבל רצף פפטיד (BAP) עבור biotinylation ואהדה גבוהה streptavidin נפתחים ניסויים (איור 1 א'). Derivatization של VHH-std התשואות גרסאות שונות nanobody לבחון את ספיגת endocytic ותעבורה רטרוגרדית מבחינה ביוכימית, על ידי הדמיה תא קבוע ולחיות, ועל ידי מיקרוסקופ אלקטרונים.

כדי להעריך את התעבורה חלבון של קרום פלזמה הטרנס-גולג'י/TGN, אנו ניצל לוקליזציה בלעדי של tyrosylprotein sulfotransferases בקרונות אלה, ובכך שונה VHH-std טנדם טירוזין sulfation באתר (2xTS) נגזר מן החולדה procholecystokinin41. בעוד שינוי של VHH-std עם mCherry מאפשרת פריט חזותי ישיר רטרוגרדית תעבורה על-ידי תא קבוע ולחיות הדמיה, functionalization עם peroxidase, כגון APEX237, מאפשר לימודי מיקרוסקופ אלקטרונים, cytochemical תא אבלציה, או תגובות biotinylation תלויי-קרבה. בנוסף, הכניסה של אתר המחשוף עבור הטבק לחרוט וירוס (אס) פרוטאז מאפשרת מבחינה ביוכימית להבדיל בין תאיים, משטח מכורך nanobodies (איור 1 א'). בעבר השתמשנו VHH-אס לעקוב אחר endocytic מיחזור קינטיקה של מאוגד-nanobody EGFP-CDMPR ו- TfR-EGFP30. Nanobody המחודשת על פני התא לאחר ספיגת יכול להיות מוערך פשוט על ידי רודף אחרי עם extracellularly יישומית פרוטאז אס רקומביננטי גרימת אובדן ההופכי של קלטת epitope carboxyterminal של nanobody. כולל אתר פצילות mCherry או APEX2 nanobody פיוז'ן שימושי ללמוד קינטיקה מיחזור של עיתונאים EGFP על ידי הדמיה תא חי בצורה דומה VHH-אס, או להגביל תגובות cytochemical מדורים תאיים, בהתאמה. Functionalization עם תחומים חלבון (למשל, אחרים fluorophores או אנזימים) או היעד רצפים אחרים עבור שינויים אחרים posttranslational ניתן להשיג בקלות באמצעות subcloning של הוספה בהתאמה לתוך פלסמיד וקטור VHH קידוד-std (ראה גם טבלה 1 למידע פלסמיד) באמצעות אתרי SpeI ההגבלה EcoRI זמינים.

באמצעות הפרוטוקול כמתואר לעיל, כל nanobodies אילוסטרייטד כאן ניתן לבודד טוהר גבוהה, תשואה (איור 1B). רק mCherry fusions הראה מסיכה קטנה של חלבון תחומים פוסט טיהור (איור 1B, ראה נתיבים 7-8). בהעדר ביטוי בירה, אנחנו בדרך כלל מתקבל 25-35 מ"ג VHH-std, VHH-2xTS, המקבילים אס-השתנה, או ~ 20 מ"ג עבור VHH-APEX2 ו- VHH-mCherry ונגזרותיהם המכילות אס. הניסיון שלנו מראה כי בירה coexpression מוריד את התשואה nanobody בשליש עד חצי.

כדי להמחיש את ספיגת nanobody בתיווך כתב, השתמשנו שורות תאים הלה לבטא stably EGFP-Calnexin (CNX), EGFP-CDMPR ו- TfR-EGFP(איור 2A ו- B). EGFP היה התמזגו עד הסוף חוץ-תאית/lumenal של כל חלבון (קרי, בין הרצף אות וכתבת CNX או CDMPR), וכדי את carboxyterminus של TfR, עוזב את האותות מיון cytosolic בלא הפרעה. כל מולקולות מתויג EGFP מטענים אלה כוללים מסלולים סחר תאיים שונים לאחר ER מיקוד. מאז EGFP-Calnexin הוא תושב בחדר המיון, בדרך כלל לא מגיעים תאי גולג'י-פוסט, הוא משמש פקד שלילי עבור ספיגת nanobody פוטנציאליים ולא ספציפי. לעומת זאת, EGFP-CDMPR והן TfR-EGFP יש תחבורה פונקציות מעבר גולג'י ומופיעות ובכך בהתמדה ב קרום פלזמה. כצפוי צפויה כאשר VHH-mCherry נוספה אוכלוסייה מעורבת של יאומתו הלה ותאים stably לבטא EGFP-CNX, אין הפנמה nanobody יכול להיות שנצפו בכל מקרה. אולם, EGFP-CDMPR והן TfR-EGFP נתפס VHH-mCherry על פני התא, העביר אותם על גב אל תאי ביות של הכתב (איור 2C).

VHH-mCherry colocalization עם סמן TGN תושב יכול לשמש באופן עקרוני כדי להעריך את ההגעה TGN. ובכל זאת, הקמנו בגישה הביוכימי בהתבסס על sulfation טירוזין. על מנת לנצל את השינוי המתרחשים הטרנס-גולג'י/TGN, nanobodies היו functionalized עם TS אתרים (איור 1 א'). כדי להדגים את ירידה לפרטים והפונקציונליות של קלסרים חלבונים אלה, אנחנו מודגרות יאומתו הלה תאים ותאים stably לבטא EGFP-CNX, EGFP-CDMPR ו- TfR-EGFP עם VHH-std או VHH-2xTS עבור 1 h בנוכחות סולפט רדיואקטיבי. Radiolabeling של VHH-2xTS מתרחשת רק כאשר כתב מסיע את nanobody retrogradely אל TGN שבו הוא נחשף המכונות sulfation טירוזין. הלה לבטא EGFP-CNX ותאים הורים שלהם להציג אין ספיגת nanobody, לפיכך אין sulfation. EGFP-CDMPR והן TfR-EGFP הפנימו nanobodies, האחרון במידה ניכרת יותר לשעבר. למרות זאת, רק EGFP-CDMPR גרם VHH-2xTS להיות sulfated (איור 3 א). זה מאשרת רטרוגרדית תעבורה יעילה של CDMPR מפני השטח תא כדי TGN ומספק ראיות נגד TfR חוזרים שוב ושוב אל TGN (כפי הוצע בשנת42,כמה מחקרים43).

ניתן גם לקבוע קינטיקה של הפנמה, TGN ההגעה של הכתב חלבונים על-ידי ניתוח תא lysates לאחר בזמנים שונים של ספיגת nanobody, sulfation. באמצעות EGFP-CDMPR כמו הכתב, מצאנו sulfation להתחיל רק לאחר תקופת השהיה ~ 15 דקות ולהגיע רוויה רק לאחר > 75 דקות (איור 3B, מסלולים 1-6, ו- C, מרובע סמלים). קינטיקה ספיגת ו- sulfation הופיע שהוסטו על ידי כמעט 30 דקות, המשקף, התעבורה TGN. בנוסף, השיטה מאפשרת לחקור את מכונות מיון מעורב MPR התחבורה על ידי התערבות פרמקולוגית או חלבון להשתיק גישות כגון נוקאאוט, הסתרה או knocksideways. כאן השתמשנו brefeldin A (BFA), מעכב של גואנין נוקלאוטיד exchange גורמים (GEFs) של מספר GTPases הב, להתערב בדרך כלל עם התחבורה רטרוגרדית TGN. כאשר מטופלים עם BFA, sulfation לחלוטין בוטלה, בעוד ספיגת נותרה מושפע ב קינטיקה והן במידה (איור 3B, מסלולים 7-12, ו- C, סימנים עגולים).

Figure 1
איור 1: עיצוב וייצור של functionalized nanobodies כדי לעקוב אחר חלבונים פני שטח התא EGFP-השתנה. (א) ייצוג סכמטי של nanobodies derivatized. Nanobody סטנדרטי מורכב התחום הספציפי GFP VHH, T7 ו HA epitope תגיות, BAP, תג טיהור hexahistidine (His6). בנוסף, nanobodies אחרים מהווים TSs שני, APEX2 או mCherry, כל אחד עם או בלי מחשוף אתר אס פרוטאז (אס). סולם בר הוא בחומצות אמינו (aa). (B) Bacterially הביע, מטוהרים nanobodies (50 μg) היו נותחו על ידי מרחביות הדרגתיות-אלקטרופורזה בג'ל, מוכתם Coomassie. סמן חלבונים עם מסה מולקולרית ב- kDa מוצגים בצד השמאל. רק VHH-mCherry, VHH-אס-mCherry הראו חיתוך מינימלי בין VHH את התחומים mCherry. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: ספיגת ולוקליזציה תאיים של VHH-mCherry על ידי חלבונים שונים של הכתב EGFP. (א) ייצוג סכמטי של חלבונים פיוז'ן EGFP. רצפים נגזר מן הפרשה קרום חלבונים מוצגים בשחור עם פפטידים האות N-מסוף ואת מקטעי transmembrane פנימי בצהוב, EGFP מודגם בירוק. EGFP הייתה דבוקה באורך מלא CDMPR, TfR ו Calnexin (CNX). סרגל קנה מידה חומצות אמינו (aa). EGFP-CDMPR ו- TfR-EGFP כבר מתואר30. הלה (B) תאים stably המבטאים חלבונים כתב EGFP נקטפו, lysed, נותחו על ידי מרחביות-אלקטרופורזה בג'ל, immunoblotting באמצעות נוגדנים anti-GFP, אנטי-אקטין. מסה מולקולרית ב- kDa מסומן בצד הימין. (ג) הלה תאים stably לבטא הכתב מתויג EGFP חלבונים, מעורבים עם הורים תאי הלה, מודגרות עם 5 μg/mL VHH-mCherry (~ 100 ננומטר) עבור 1 h ב 37 מעלות צלזיוס ומעובדים על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ. סרגל קנה מידה = 10 μm. ספיגת מתרחשת רק על ידי תאים המבטאים כתב עם EGFP נחשף על פני התא. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: ניתוח Sulfation וקינטיקה של התחבורה רטרוגרדית TGN באמצעות nanobodies מתויג TS- תאים הורי (A) והלה stably לבטא EGFP-לאחרונה כתב חלבונים הודבקו תוויות באמצעות סולפט mCi/mL [35S] 0.5 עבור 60 דקות עם 2 μg/mL VHH-std או VHH-2xTS. Nanobodies היו מבודדים באמצעות חרוזים ניקל, המופרדים על 12.5% מרחביות-דף עקב autoradiography. Aliquots של התא lysates נאספו לפני ניקל לנתץ immunoblotted הקשורים תא nanobody (His6), EGFP של אקטין. (B ו- C) הלה תאים stably לבטא EGFP-CDMPR היו המסומנת סולפט mCi/mL [35S] 0.5 עד 75 דקות בנוכחות 2 μg/mL VHH-2xTS עם או בלי 2 μg/mL BFA לפני ניתוח כמו (א). כימות של ספיגת VHH-2xTS, sulfation מ 3 ניסויים עצמאית מוצג אחוז הערך ללא תואר ראשון לאחר 75 דקות (mean ו SD). ריבועים שחורים, ללא תואר ראשון; עיגולים אפורים, עם תואר ראשון; פתח סמלים, ספיגת; מלא סמלים, sulfation. איור זה יש כבר לשינוי והרחבה של בוסר ואח ', 2018, PNAS30. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

טבלה 1: חלבון רצף nanobodies functionalized המוצגים במחקר זה. T7 epitope אפור, VHH ב שחור, epitope HA ברצף BAP כחול, ב orange, hexahistidine (His6) באדום, אס פרוטאז המחשוף אתר בסגול, epitope myc ילבשו ארגמן, sulfation טירוזין רצף בצהוב, APEX2 בירוק ולאחר mCherry בוורוד. הווקטורים ביטוי קידוד אלה nanobodies נגד functionalized-GFP נצברים (ראה גם לוח 1 למידע פלסמיד). אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Nanobodies מייצג את שיעור המתעוררים של חלבון פיגומים קלסר עם יתרונות רבים על פני נוגדנים קונבנציונלי: הם קטנים, יציבה, monomeric, ניתן לבחור עבור דיסולפידי זיקה וחוסר גבוהה אג ח33,35, 44 , 45. הם משמשים במספר יישומים, כגון מערכות התרבות תאים, אורגניזמים ב ביולוגיה התפתחותית46,47,48,49, כמו התגבשות מתלווה לשמור על לייצב את הברית הסתגלותי ביולוגיה מבנית50,51,52,53, מעכבי או מאפננים פעילות של אנזימים54,55, 56, immunohistochemical ריאגנטים עבור ניתוחים הביוכימי57, או "nanobodies משנית" כדי לזהות immunoglobulins העכבר אנטי וארנבת אנטי-immunoblots ו- immunofluorescence58. במחקר הקודם שלנו, פיתחנו, אפלייד nanobodies functionalized המיוצר על ידי חיידקי הביטוי משטח בעל תווית חלבונים ולעקוב אחר בדרך תאיים מדורים שונים, בפרט TGN30. היינו nanobody anti-GFP להפוך אותו לכלי רב-גוני, מסוגל היעד חלבונים פיוז'ן עם GFP חוץ-תאית, YFP או mCerulean שכבר נמצאות מאופיין וזמינה. השינוי של אנטי-GFP nanobodies mCherry, APEX2 או TS אתרי אפשרה לנו לעקוב אחר כתב ספיגת על ידי הדמיה תא קבוע ולחיות, עד ultrastructurally להמחיש תחבורה רטרוגרדית מדורים, ablate תאים אלה, או ללמוד תחבורה קינטיקה כדי TGN. חסרון אחד של כלי שלנו הוא כי שינוי רקומביננטי של שורות תאים היעד (ביטוי יציב או תיוג אנדוגני) נדרשת לפני יכול להיות מיושם nanobodies נגד functionalized-GFP. Functionalization כמובן ניתן להחיל גם על מספר והולך nanobodies נגד חלבונים היעד אנדוגני לא מתויגות נוסדה על ידי חיסון בעלי חיים או הריבוזום-התצוגה ולהציג phage מבחר VHH סינתטי ספריות59. שימוש nanobodies ששינה עם TS אתרים (למשל, VHH-2xTS), אנו יכולים ישירות למדוד תחבורה, קינטיקה ההגעה TGN של חלבונים היעד EGFP-השתנה מגוונות. לנו יש להחיל VHH-2xTS ללמוד את התרומה של החלבון מתאם 1 מורכבים (AP-1) בהעברה רטרוגרדית של MPRs על ידי ניתוח קינטי ישיר בתאים knocksideways המאפשר איון מהירה של מכונות תחבורה נתון30. Nanobody sulfation ותעבורה ומכאן רטרוגרדית של התווית על-ידי EGFP MPRs חלקית, אבל לא לגמרי נחסמה. גישתנו מבוססת על nanobody באמצעות sulfation כמו חיישן ההגעה TGN אישר תוצאות קודמות ממעבדות אחרים המציין תרומה תפקודית של AP-1 ב רטרוגרדית תחבורה אנדוזום-אל-TGN17,60, 61. Sulfatable nanobodies ובכך מספקים כלי שימושי ביוכימי כדי לנתח את התרומה של machineries רטרוגרדית תחבורה אחרים, כגון epsinR, Rab9/TIP47 או קומפלקסים SNX-בר/retromer, על מטען חלבונים על ידי מניפולציות גנומית, גנטי או כימי. פרוטוקול המובאת כאן המציע בסיס איך אפשר להכין שימוש functionalized nanobodies באופן כללי כדי לקבוע תאי מטרה, מסלולים, ומובילים קינטיקה בתאים בתרבית.

קבוצות אחרות כבר עשו שימוש TS אתרים לעקוב תחבורה מהתא פני השטח כדי TGN. Subunits טוקסין ריצין, שיגה או שעלת שונו בעבר עם אתרי sulfation להפגין נתיב התחבורה דרך TGN62,63,64,65,66. יתר על כן, פפטידים TS היה גם היה כימית מצמידים IgGs כדי assay העברת רטרוגרדית GFP-CIMPR ו- TGN46 אנדוגני ל-67,TGN68. Nanobodies sulfatable שלנו יש היתרון של ייצור חיידקי פשוטה, לשחזור ושל סטויכיומטריה 1:1 עם חלבון המטרה. להפך, למשל ידוע כי חלבון כלט קלסרים, כגון IgGs, crosslink יכול תא חלבונים פני שטח ולשנות שלהם וגדילת כדי lysosomes לאחר אנדוציטוזה69,70, המדגיש המשמעות של חלבון monomeric קלסרים לגבי שיטות קיימות. שלב קריטי של הטכניקה שלנו הוא טיפול עם רדיואקטיביות הוא נדרש לבצע סולפט תיוג של nanobodies. עם זאת, כלי שלנו של nanobodies functionalized עם TS אתרים ללמוד TGN ההגעה ייתכן פוטנציאל יוחלו ללא קרינה רדיואקטיבית באמצעות נוגדנים אנטי-sulfotyrosine.

המחקר הקודם שלנו מציע sulfation nanobody הזה הם לא יעילה מאוד, מאז sulfation של MPRs עדיין לא הגיעה לכל היותר לאחר 75 דקות, אף-על-פי nanobody ספיגת ספוג אחרי 45 דקות30. ואיתור אתרים טבעיים אחרים TS עשוי לשפר את יעילות sulfation. לחלופין, לשיפור פוטנציאל sulfation יעילות, רכיבים של מכונות sulfation עצמו, כגון TPST1 ו- TPST2, עשוי להיות overexpressed. ואכן, בעבר הוכח זה ביטוי של אחד למעליות אספקת 3'-phoshoadenosine-5'-phosphosulfate (דייסות), המצע עבור TPSTs, מן ציטוזול כדי לומן של גולג'י יכול לשנות את מצב sulfation proteoglycans 71.

מלבד sulfatable nanobodies, derivatizations אחרים גם מאפשרים מעקב תחבורה באמצעות תאים endocytic, את TGN. APEX2 יכול להיות מיושם גם אנזים תיוג מופקר בשביל biotinylation תלויי-הסמיכות לניתוח פרוטיאומיה מבנית של תחבורה רטרוגרדית. Nanobody APEX2 זה הוא הפנימו על ידי עיתונאי מטען עניין יהיה תווית חלבונים בסמיכות בתוך התאים היעד. השוואתי פרוטאומיקס צריך לאפשר לזהות לחלבונים אחרים אנדוגני בסוגים שונים של endosomes, את TGN הניגשת nanobody. וריאציות רבות של nanobodies בשילוב עם חלבון המטרה שלו מתקבלות על הדעת. דו ח זה התבצעה, למשל, החלת גישה הפוכה לזו המתוארת כאן: derivatized GFP שימש ללמוד ואף השמנה cellularly ביטוי אנטי-GFP מתויג nanobody vacuolar מיון קולטנים anterograde ו רטרוגרדית תאי הצמח מערכת endomembrane72. באופן דומה, nanobody functionalized-מלכודות עשויות להיות בנויות במערכות תרבות בתרבית של תאים ללכוד ולצבור EGFP-השתנה כתבים בתאים שונים במהלך ההובלה רטרוגרדית.

שלנו כאן הציג שיטה, פרוטוקול תוך התמקדות TS מתויג האתר nanobodies מאפשר ואיכותני מעקב מטענים חלבונים מהמשטח תא תאים endocytic, את TGN בתרבית תאים בתרבית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי גרנט 31003A-162643 על ידי קרן המדע הלאומית השוויצרית. אנו מודים ניקול Beuret, את Biozentrum הדמיה הליבה מתקן (IMCF) לקבלת תמיכה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-GFP antibody Sigma-Aldrich 118144600001 Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche
Anti-His6 antibody Bethyl Laboratories A190-114A
Anti-actin antibody EMD Millipore MAB1501
Goat anti-rabbit HRP Sigma-Aldrich A-0545
Goat anti-mouse HRP Sigma-Aldrich A-0168
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Sigma-Aldrich D9542 dissolved in 1x PBS/1%BSA
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Applichem A3672
D-biotin Sigma-Aldrich B4501 dissolved in sterile 500 mM NaH2PO4 or DMSO
5-aminolevuilnic acid (dALA) hydrochloride Sigma-Aldrich A3785 dissolved in sterile water
DNase I Applichem A3778 dissolved in sterile water
Lysozyme Sigma-Aldrich 18037059001 Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche
Brefeldin A (BFA) Sigma-Aldrich B5936
Puromycin Invivogen ant-pr-1
Penicillin/Streptomycin Bioconcept 4-01F00-H
L-glutamine Applichem A3704
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) Sigma-Aldrich D5796
Fetal calf serum (FCS) Biowest S181B-500
Sulfur-35 as sodium sulfate Hartmann Analytics ARS0105 Product contains 5 mCi
Earle's balanced salts Sigma-Aldrich E6267
MEM amino acids (50x) solution Sigma-Aldrich M5550
MEM vitamin solution (100x) Sigma-Aldrich M6895
cOmplete, Mini Protease inhibitor cocktail Sigma-Aldrich 11836153001 Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) Applichem A1008 dissolved in sterile water, stock is 1 M
Carbenicillin disodium salt Applichem A1491 dissolved in sterile water, stock is 100 mg/mL
Kanamycin sulfate Applichem A1493 dissolved in sterile water, stock is 100 mg/mL
Coomassie-R (Brilliant Blue) Sigma-Aldrich B-0149
Paraformaldehyde (PFA) Applichem A3813
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich A2153
Fluoromount-G Southern Biotech 0100-01
Ni Sepharose High Performance GE Healthcare 17-5268-01
His GraviTrap columns GE Healthcare GE11-0033-99
His buffer kit GE Healthcare GE11-0034-00
Disposable PD10 desalting columns GE Healthcare GE17-0851-01
Mini-Protean TGX gels, 4-20%, 15-well Bio-Rad 456-1096
Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) w/o Ca2+/Mg2+ Sigma-Aldrich D8537
35 mm dishes Falcon 353001
6-well plates TPP 92406
Glass coverslips (No. 1.5H) VWR 631-0153
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Applichem A0999.0025 dissolved in 40% DMSO 60% isopropanol, stock in 500 mM
Tryptone Applichem A1553
Yeast extract Applichem A1552
Magnesium chloride hexahydrate Merck Millipore 105833 dissolved in sterile water, stock is 1 M
Calcium chloride dihydrate Merck Millipore 102382 dissolved in sterile water, stock is 1 M
Sodium chloride Merck Millipore 106404 dissolved in sterile water, stock is 5 M

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Johannes, L., Popoff, V. Tracing the retrograde route in protein trafficking. Cell. 135 (7), 1175-1187 (2008).
  2. Bonifacino, J. S., Rojas, R. Retrograde transport from endosomes to the trans-Golgi network. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 7 (8), 568-579 (2006).
  3. Duncan, J. R., Kornfeld, S. Intracellular movement of two mannose 6-phosphate receptors: return to the Golgi apparatus. Journal of Cell Biology. 106 (3), 617-628 (1988).
  4. Ghosh, P., Dahms, N. M., Kornfeld, S. Mannose 6-phosphate receptors: new twists in the tale. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 4 (3), 202-212 (2003).
  5. Doray, B., Ghosh, P., Griffith, J., Geuze, H. J., Kornfeld, S. Cooperation of GGAs and AP-1 in packaging MPRs at the trans-Golgi network. Science. 297 (5587), 1700-1703 (2002).
  6. Pallesen, L. T., Vaegter, C. B. Sortilin and SorLA regulate neuronal sorting of trophic and dementia-linked proteins. Molecular Neurobiology. 45 (2), 379-387 (2012).
  7. Gustafsen, C., et al. Sortilin and SorLA display distinct roles in processing and trafficking of amyloid precursor protein. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 33 (1), 64-71 (2013).
  8. Yu, J., et al. WLS retrograde transport to the endoplasmic reticulum during Wnt secretion. Developmental Cell. 29 (3), 277-291 (2014).
  9. Harterink, M., et al. A SNX3-dependent retromer pathway mediates retrograde transport of the Wnt sorting receptor Wntless and is required for Wnt secretion. Nature Cell Biology. 13 (8), 914-923 (2011).
  10. Port, F., et al. Wingless secretion promotes and requires retromer-dependent cycling of Wntless. Nature Cell Biology. 10 (2), 178-185 (2008).
  11. McGough, I. J., et al. SNX3-retromer requires an evolutionary conserved MON2:DOPEY2:ATP9A complex to mediate Wntless sorting and Wnt secretion. Nature Communications. 9 (1), 3737 (2018).
  12. Banting, G., Ponnambalam, S. TGN38 and its orthologues: roles in post-TGN vesicle formation and maintenance of TGN morphology. Biochimica et Biophysica Acta. 1355 (3), 209-217 (1997).
  13. Banting, G., Maile, R., Roquemore, E. P. The steady state distribution of humTGN46 is not significantly altered in cells defective in clathrin-mediated endocytosis. Journal of Cell Science. 111 (Pt 23), 3451-3458 (1998).
  14. Ponnambalam, S., Rabouille, C., Luzio, J. P., Nilsson, T., Warren, G. The TGN38 glycoprotein contains two non-overlapping signals that mediate localization to the trans-Golgi network. The Journal of Cell Biology. 125 (2), 253-268 (1994).
  15. Mallard, F., et al. Early/recycling endosomes-to-TGN transport involves two SNARE complexes and a Rab6 isoform. The Journal of Cell Biology. 156 (4), 653-664 (2002).
  16. Lewis, M. J., Nichols, B. J., Prescianotto-Baschong, C., Riezman, H., Pelham, H. R. Specific retrieval of the exocytic SNARE Snc1p from early yeast endosomes. Molecular Biology of the Cell. 11 (1), 23-38 (2000).
  17. Hirst, J., et al. Distinct and overlapping roles for AP-1 and GGAs revealed by the "knocksideways" system. Current biology. 22 (18), 1711-1716 (2012).
  18. Burgos, P. V., et al. Sorting of the Alzheimer's disease amyloid precursor protein mediated by the AP-4 complex. Developmental Cell. 18 (3), 425-436 (2010).
  19. Choy, R. W., Cheng, Z., Schekman, R. Amyloid precursor protein (APP) traffics from the cell surface via endosomes for amyloid beta (Abeta) production in the trans-Golgi network. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States. 109 (30), E2077-E2082 (2012).
  20. Seifert, W., et al. The progressive ankylosis protein ANK facilitates clathrin- and adaptor-mediated membrane traffic at the trans-Golgi network-to-endosome interface. Human Molecular Genetics. 25 (17), 3836-3848 (2016).
  21. Tabuchi, M., Yanatori, I., Kawai, Y., Kishi, F. Retromer-mediated direct sorting is required for proper endosomal recycling of the mammalian iron transporter DMT1. Journal of Cell Science. 123 (Pt 5), 756-766 (2010).
  22. La Fontaine, S., Mercer, J. F. Trafficking of the copper-ATPases, ATP7A and ATP7B: role in copper homeostasis. Archives of Biochemistry and Biophysics. 463 (2), 149-167 (2007).
  23. Burd, C. G. Physiology and pathology of endosome-to-Golgi retrograde sorting. Traffic. 12 (8), 948-955 (2011).
  24. Chia, P. Z., Gasnereau, I., Lieu, Z. Z., Gleeson, P. A. Rab9-dependent retrograde transport and endosomal sorting of the endopeptidase furin. Journal of Cell Science. 124 (Pt 14), 2401-2413 (2011).
  25. Wahle, T., et al. GGA proteins regulate retrograde transport of BACE1 from endosomes to the trans-Golgi network. Molecular and Cellular Neurosciences. 29 (3), 453-461 (2005).
  26. Johannes, L., Goud, B. Surfing on a retrograde wave: how does Shiga toxin reach the endoplasmic reticulum. Trends in Cell Biology. 8 (4), 158-162 (1998).
  27. van Deurs, B., Tonnessen, T. I., Petersen, O. W., Sandvig, K., Olsnes, S. Routing of internalized ricin and ricin conjugates to the Golgi complex. Journal of Cell Biology. 102 (1), 37-47 (1986).
  28. Sandvig, K., van Deurs, B. Membrane traffic exploited by protein toxins. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 18, 1-24 (2002).
  29. Sandvig, K., et al. Retrograde transport of endocytosed Shiga toxin to the endoplasmic reticulum. Nature. 358 (6386), 510-512 (1992).
  30. Buser, D. P., Schleicher, K. D., Prescianotto-Baschong, C., Spiess, M. A versatile nanobody-based toolkit to analyze retrograde transport from the cell surface. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States. 115 (27), E6227-E6236 (2018).
  31. Hamers-Casterman, C., et al. Naturally occurring antibodies devoid of light chains. Nature. 363 (6428), 446-448 (1993).
  32. Greenberg, A. S., et al. A new antigen receptor gene family that undergoes rearrangement and extensive somatic diversification in sharks. Nature. 374 (6518), 168-173 (1995).
  33. Bieli, D., et al. Development and Application of Functionalized Protein Binders in Multicellular Organisms. International Review of Cell and Molecular Biology. 325, 181-213 (2016).
  34. Muyldermans, S. Nanobodies: natural single-domain antibodies. Annual Review of Biochemistry. 82, 775-797 (2013).
  35. Helma, J., Cardoso, M. C., Muyldermans, S., Leonhardt, H. Nanobodies and recombinant binders in cell biology. Journal of Cell Biology. 209 (5), 633-644 (2015).
  36. Harmansa, S., Affolter, M. Protein binders and their applications in developmental biology. Development. 145 (2), (2018).
  37. Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nature Methods. 12 (1), 51-54 (2015).
  38. Huttner, W. B. Tyrosine sulfation and the secretory pathway. Annual Review of Physiology. 50, 363-376 (1988).
  39. Baeuerle, P. A., Huttner, W. B. Tyrosine sulfation is a trans-Golgi-specific protein modification. The Journal of Cell Biology. 105 (6 Pt 1), 2655-2664 (1987).
  40. Stone, M. J., Chuang, S., Hou, X., Shoham, M., Zhu, J. Z. Tyrosine sulfation: an increasingly recognised post-translational modification of secreted proteins. New Biotechnology. 25 (5), 299-317 (2009).
  41. Leitinger, B., Brown, J. L., Spiess, M. Tagging secretory and membrane proteins with a tyrosine sulfation site. Tyrosine sulfation precedes galactosylation and sialylation in COS-7 cells. The Journal of Biological Chemistry. 269 (11), 8115-8121 (1994).
  42. Snider, M. D., Rogers, O. C. Intracellular movement of cell surface receptors after endocytosis: resialylation of asialo-transferrin receptor in human erythroleukemia cells. Journal of Cell Biology. 100 (3), 826-834 (1985).
  43. Shi, G., et al. SNAP-tag based proteomics approach for the study of the retrograde route. Traffic. 13 (7), 914-925 (2012).
  44. Kaiser, P. D., Maier, J., Traenkle, B., Emele, F., Rothbauer, U. Recent progress in generating intracellular functional antibody fragments to target and trace cellular components in living cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1844 (11), 1933-1942 (2014).
  45. Dmitriev, O. Y., Lutsenko, S., Muyldermans, S. Nanobodies as Probes for Protein Dynamics in Vitro and in Cells. The Journal of Biological Chemistry. 291 (8), 3767-3775 (2016).
  46. Harmansa, S., Hamaratoglu, F., Affolter, M., Caussinus, E. Dpp spreading is required for medial but not for lateral wing disc growth. Nature. 527 (7578), 317-322 (2015).
  47. Harmansa, S., Alborelli, I., Bieli, D., Caussinus, E., Affolter, M. A nanobody-based toolset to investigate the role of protein localization and dispersal in Drosophila. eLife. 6, (2017).
  48. Caussinus, E., Kanca, O., Affolter, M. Fluorescent fusion protein knockout mediated by anti-GFP nanobody. Nature Structural & Molecular Biology. 19 (1), 117-121 (2012).
  49. Rothbauer, U., et al. Targeting and tracing antigens in live cells with fluorescent nanobodies. Nature Methods. 3 (11), 887-889 (2006).
  50. Pardon, E., et al. A general protocol for the generation of Nanobodies for structural biology. Nature Protocols. 9 (3), 674-693 (2014).
  51. Steyaert, J., Kobilka, B. K. Nanobody stabilization of G protein-coupled receptor conformational states. Current Opinion in Structural Biology. 21 (4), 567-572 (2011).
  52. Manglik, A., Kobilka, B. K., Steyaert, J. Nanobodies to Study G Protein-Coupled Receptor Structure and Function. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 57, 19-37 (2017).
  53. Zimmermann, I., et al. Synthetic single domain antibodies for the conformational trapping of membrane proteins. eLife. 7, (2018).
  54. De Genst, E., et al. Molecular basis for the preferential cleft recognition by dromedary heavy-chain antibodies. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States. 103 (12), 4586-4591 (2006).
  55. Truttmann, M. C., et al. HypE-specific nanobodies as tools to modulate HypE-mediated target AMPylation. The Journal of Biological Chemistry. 290 (14), 9087-9100 (2015).
  56. Ashour, J., et al. Intracellular expression of camelid single-domain antibodies specific for influenza virus nucleoprotein uncovers distinct features of its nuclear localization. Journal of Virology. 89 (5), 2792-2800 (2015).
  57. Yamagata, M., Sanes, J. R. Reporter-nanobody fusions (RANbodies) as versatile, small, sensitive immunohistochemical reagents. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States. 115 (9), 2126-2131 (2018).
  58. Pleiner, T., Bates, M., Gorlich, D. A toolbox of anti-mouse and anti-rabbit IgG secondary nanobodies. Journal of Cell Biology. 217 (3), 1143-1154 (2018).
  59. Fridy, P. C., et al. A robust pipeline for rapid production of versatile nanobody repertoires. Nature Methods. 11 (12), 1253-1260 (2014).
  60. Robinson, M. S., Sahlender, D. A., Foster, S. D. Rapid inactivation of proteins by rapamycin-induced rerouting to mitochondria. Developmental Cell. 18 (2), 324-331 (2010).
  61. Meyer, C., et al. mu1A-adaptin-deficient mice: lethality, loss of AP-1 binding and rerouting of mannose 6-phosphate receptors. The EMBO Journal. 19 (10), 2193-2203 (2000).
  62. Utskarpen, A., Slagsvold, H. H., Iversen, T. G., Walchli, S., Sandvig, K. Transport of ricin from endosomes to the Golgi apparatus is regulated by Rab6A and Rab6A. Traffic. 7 (6), 663-672 (2006).
  63. Mallard, F., Johannes, L. Shiga toxin B-subunit as a tool to study retrograde transport. Methods in Molecular Medicine. 73, 209-220 (2003).
  64. Mallard, F., et al. Direct pathway from early/recycling endosomes to the Golgi apparatus revealed through the study of shiga toxin B-fragment transport. Journal of Cell Biology. 143 (4), 973-990 (1998).
  65. Plaut, R. D., Carbonetti, N. H. Retrograde transport of pertussis toxin in the mammalian cell. Cellular Microbiology. 10 (5), 1130-1139 (2008).
  66. Johannes, L., Tenza, D., Antony, C., Goud, B. Retrograde transport of KDEL-bearing B-fragment of Shiga toxin. The Journal of Biological Chemistry. 272 (31), 19554-19561 (1997).
  67. Saint-Pol, A., et al. Clathrin adaptor epsinR is required for retrograde sorting on early endosomal membranes. Developmental Cell. 6 (4), 525-538 (2004).
  68. Amessou, M., Popoff, V., Yelamos, B., Saint-Pol, A., Johannes, L. Measuring retrograde transport to the trans-Golgi network. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 15 Unit 15 10 (2006).
  69. Niewoehner, J., et al. Increased brain penetration and potency of a therapeutic antibody using a monovalent molecular shuttle. Neuron. 81 (1), 49-60 (2014).
  70. Villasenor, R., Schilling, M., Sundaresan, J., Lutz, Y., Collin, L. Sorting Tubules Regulate Blood-Brain Barrier Transcytosis. Cell Reports. 21 (11), 3256-3270 (2017).
  71. Dick, G., Grondahl, F., Prydz, K. Overexpression of the 3'-phosphoadenosine 5'-phosphosulfate (PAPS) transporter 1 increases sulfation of chondroitin sulfate in the apical pathway of MDCK II cells. Glycobiology. 18 (1), 53-65 (2008).
  72. Fruholz, S., Fassler, F., Kolukisaoglu, U., Pimpl, P. Nanobody-triggered lockdown of VSRs reveals ligand reloading in the Golgi. Nature Communications. 9 (1), 643 (2018).

Tags

תחבורה רטרוגרדית אימונולוגיה זיהום גיליון 144 nanobodies הגולגי sulfation טירוזין חיידקי הביטוי radiolabeling EGFP תאים הלה
ניתוח של ספיגת Endocytic ותעבורה רטרוגרדית לרשת הטרנס-גולג'י באמצעות Functionalized Nanobodies בתאים בתרבית
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Buser, D. P., Spiess, M. Analysis of … More

Buser, D. P., Spiess, M. Analysis of Endocytic Uptake and Retrograde Transport to the Trans-Golgi Network Using Functionalized Nanobodies in Cultured Cells. J. Vis. Exp. (144), e59111, doi:10.3791/59111 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter