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Biochemistry

Análisis de absorción endocíticas y transporte retrógrado a la red Trans-Golgi en células cultivadas de Nanobodies funcionalizados

Published: February 21, 2019 doi: 10.3791/59111
Automatic Translation
1, 1
1Biozentrum, University of Basel

Summary

Transporte retrógrado de proteínas de la superficie de la célula al Golgi es esencial para mantener la homeostasis de la membrana. Aquí, describimos un método para analizar bioquímicamente transporte de superficie de Golgi de la célula de proteínas recombinantes utilizando nanobodies funcionalizados en células HeLa.

Abstract

Transporte de proteínas y membranas de la superficie celular hasta el Golgi y más allá es esencial para la homeostasis, la identidad de organelas y la fisiología. Para estudiar el tráfico de proteína retrógrada, recientemente hemos desarrollado herramientas basadas en nanobody versátil para analizar el transporte de la superficie celular para el aparato de Golgi, ya sea por proyección de imagen fija y vivo de la célula, por microscopia electrónica o bioquímico. Hemos diseñado nanobodies funcionalizados anti-verde proteína fluorescente (GFP), carpetas pequeñas, monoméricas, de alta afinidad de la proteína, que puede ser aplicado a líneas celulares de expresión de proteínas de membrana de interés con una parte extracelular de la GFP. Derivatizados nanobodies a los reporteros GFP específicamente se internalizan y transportado piggyback a lo largo de vías de clasificación de los reporteros. Nanobodies fueron funcionalizados con fluoróforos transporte retrógrado por microscopía de fluorescencia y proyección de imagen, con ascorbato peroxidasa 2 (APEX2) para investigar la localización ultraestructural del reportero nanobody complejos de electrónica en vivo microscopia y con motivos de tirosina sulfatación (TS) para evaluar la cinética de la llegada de trans-Golgi network (TGN). En este artículo metodológico, describiremos el procedimiento general para expresar y purificar nanobodies funcionalizados para bacteriano. Ilustramos el uso poderoso de nuestra herramienta usando los nanobodies mCherry y TS modificado para analizar endocíticas absorción y llegada del TGN de proteínas de carga.

Introduction

Tráfico retrógrado de proteínas y lípidos de la superficie celular en varios compartimientos intracelulares es crucial para el mantenimiento de la homeostasis de la membrana para contrarrestar la secreción y reciclaje de componentes de maquinarias de transporte anterograde1 , 2. después de internalización vía endocytosis clathrin-dependiente - independiente o, carga de proteína y lípidos en primer lugar rellenar temprano endosomas desde donde son más bien a lo largo del sistema endo-lisosomales, reciclado a la membrana plasmática, Redirigido o dirigidas a la red trans-Golgi (TGN). Reciclaje de endosomas y la superficie de la célula al TGN es parte del ciclo funcional de una serie de receptores de transmembrana carga anterógrada, tales como los receptores de manosa-6-fosfato catión-dependiente y la independiente del catión (CDMPR y CIMPR) entrega recién sintetizado lisosomales hidrolasas desde el TGN para fines endosomas y lisosomas3,4,5, sortilina, SorLA6,7y Wntless (WLS) transporte de ligandos Wnt a la superficie de la célula 8 , 9 , 10 , 11. otras proteínas obtenidos al TGN son TGN46 y sus isoformas relacionadas12,13,14, trampas ( N- etilmaleimida sensible fusión factor accesorio receptores solubles) 15 , 16 , precursora del amiloide (APP) de la proteína18,19, anquilosis progresiva (ANK) proteína20, 17, transportadores metálicos como ATP7A/B o DMT121,22y transmembrana procesamiento de las enzimas como la carboxipeptidasa D, furin o BACE123,24,25. Aparte de estas proteínas endógenas, toxinas bacterianas y vegetales (por ejemplo, la toxina Shiga y el cólera, ricina y abrina) secuestran maquinarias transporte retrógrado para llegar a la sala de emergencia para retrotranslocation en el citosol26,27, 28,29.

Para analizar directamente tráfico retrógrado, previamente hemos desarrollado un conjunto de herramientas basadas en nanobody etiqueta y seguir las proteínas de carga de la superficie de la célula a compartimientos intracelulares30. Nanobodies representan una nueva familia de proteínas ligantes derivados homodiméricas pesada cadena-sólo anticuerpos (hcAbs) que ocurren naturalmente en camélidos y peces cartilaginosos31,32. Constituyen el dominio variable de cadena pesada (VHH) de hcAbs y tienen muchas ventajas sobre anticuerpos convencionales (por ejemplo, IgGs): son monoméricas, pequeño (~ 15 kDa), altamente soluble, desprovisto de disulfuro, puede ser bacteriano expresada y seleccionado para alta afinidad de Unión33,34,35,36. Para que nuestra herramienta nanobody versátil y ampliamente aplicables, empleamos funcionalizados anti-GFP nanobodies para etiqueta de superficie y pista proteínas etiquetadas con GFP en su dominio extracelular/lumenal. Funcionalización de nanobodies con mCherry, ascorbato peroxidasa 2 (APEX2) transporte retrógrado37, o secuencias de sulfatación (TS) de tirosina de las proteínas de transmembrana carga bonafide puede ser analizado ya sea fijo y vive la proyección de imagen de la célula, por microscopia electrónica, o bioquímico. Ya que la sulfatación de la tirosina mediado por Sulfotransferasas tyrosylprotein (TPST1 y TPST2) es una modificación postraduccional restringida para el trans-Golgi/TGN, directamente podemos estudiar transporte y cinética de las proteínas de interés de la superficie celular para esto 38,compartimiento de intracelular Golgi del39,40.

En este artículo de métodos, nos describe la facilidad de producción de nanobodies funcionalizados (VHH-2xTS, - APEX2, - mCherry y derivados) para una serie de aplicaciones para analizar el transporte retrógrado en células de mamíferos30. Nos centramos principalmente en el uso de TS nanobody sitio modificado para el análisis del tráfico intracelular de la superficie celular del compartimiento de sulfatación.

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Protocol

1. bacteriana transformación con Nanobodies funcionalizados

Nota: Este protocolo ha sido optimizado para la expresión, purificación y análisis de nanobodies funcionalizados anti-GFP como se describió anteriormente30. Derivatización con otras moléculas de proteína puede requerir modificación de este protocolo estándar.

  1. Descongelar las bacterias chemocompetent (~ 100 μL) adecuadas para la expresión de la proteína (p. ej., Escherichia coli Rosetta BL21 (DE3) células) colocándolos en hielo.
    Nota: Preparar chemocompetent células bacterianas según procedimientos de laboratorio estándar. Como alternativa, las células bacterianas químicamente competentes pueden adquirirse comercialmente.
  2. Añadir 50 ng de un plásmido de codificación nanobodies funcionalizados. Para permitir suficiente biotinylation site-specific de la reportera nanobody durante expresión bacteriana, también añadir un triple exceso (150 ng) de un plásmido de expresión bacteriana codificación ligasa biotina BirA (véase también la tabla 1 para obtener información de plásmido). Suavemente la pipeta hacia arriba y hacia abajo.
    Nota: Si nanobody Biotinilación no es necesario o los reporteros nanobody carezcan de un péptido de aceptador de biotina (BAP), la transformación con un plásmido de codificación BirA no es necesario.
  3. Incube las células bacterianas por 30 min en hielo.
  4. Calor del choque las células bacterianas mediante la colocación de 1 min a 42 ° C en un baño de agua o un bloque de calefacción.
  5. Añadir 1 mL de temperatura ambiente (RT) medio de caldo (LB) Luria e incubar las bacterias transformadas en un termoagitador durante 1 h a 37 ° C para permitir la expresión fenotípica de genes de resistencia. Para preparar 1 L LB medium, extracto de equilibrio 5 g de levadura, 10 g de triptona 10 g de NaCl, llenar con agua y esterilizar en autoclave. Si el nanobody funcionalizado ha sido subcloned en un vector de expresión que contiene resistencia a ampicilina/carbenicilina, paso 1.5 puede omitirse.
  6. De la pelotilla de la bacteria a 11.000 x g durante 1 min y resuspender en 100 μl de medio LB fresco.
  7. Las bacterias suspendidas en placas de LB con los antibióticos respectivos (por ejemplo, con 50 de μg/mL kanamicina y 50 carbenicilina μg/mL cuando las bacterias han sido co transformadas con nanobody reportero y BirA como se indicó anteriormente (paso 1.2)) de la placa.
  8. Coloque las placas LB en una incubadora a 37 ° C y dejar crecer durante la noche (O/N).
    Nota: El protocolo puede hacer una pausa aquí mediante el almacenamiento de la placa LB con colonias crecidas a 4 ° C. Uso de parafilm para sellar placas LB.

2. bacteriana cultivo líquido y la inducción de expresión Nanobody funcionalizados

  1. Elegir una colonia de bacterias que contienen el vector de interés de la placa y dejarla crecer en un frasco que contenga 20 mL de medio LB suplementado con antibióticos O/N en un incubador de agitación a 37 ° C (véase también paso 1.7 con respecto a la selección de antibióticos).
  2. Al día siguiente, diluir el cultivo bacteriano crecido 20 mL en un frasco que contenga 1 L de medio LB con los antibióticos de selección.
  3. Seguir a incubar el cultivo bacteriano a 37 ° C hasta que alcance un OD600 de 0.6-0.7. Permita que la cultura se enfríe a RT antes de inducir la expresión de la proteína.
  4. Inducen la expresión de la proteína de nanobodies funcionalizados y BirA mediante la adición de 1 mL de 1 M Isopropil-β-d-thiogalactopyranosid (IPTG) a una concentración final de 1 mM del inductor (1:1, 000 dilución). Añadir 10 mL de 20 mM d-biotina solución madre dando por resultado 200 μm d-biotina en el medio de crecimiento para permitir el biotinylation del BAP epitopo presente en nanobodies funcionalizados (véase también la tabla 1 para obtener información de plásmido)
    Nota: La solución madre de d-biotina es preparada en el ddH2O y puesta en solución por adición drop-wise de 500 mM NaH2PO4. Por otra parte, d-biotina también puede ser disuelto en DMSO. Para producir nanobodies fusionados con APEX2 (VHH-APEX2), el medio LB debe ser complementado además con 1 mM 5-aminolevulínico ácido (dALA) clorhidrato para promover la incorporación de hemo. dALA se preparó una solución stock de 100 mM en ddH2O.
  5. Incubar el cultivo bacteriano inducido por IPTG 1 L a 30 ° C durante 4 h para VHH-2xTS, a 20 ° C o RT O/N para VHH-APEX2 o a los 16 ° C O/N para VHH-mCherry (véase también la tabla 1 para obtener información de plásmido).
    Nota: Condiciones de expresión de una nueva construcción nanobody deben ser optimizadas por el experimentador.
  6. Transferir el cultivo bacteriano del frasco en una botella de 1 L centrifugación y sedimenten las células a 5.000 x g a 4 ° C por 45 min, decantar el sobrenadante y siguen con la purificación.
    Nota: El protocolo puede hacer una pausa aquí por almacenar el pellet bacteriano a-80 ° C indefinidamente. El pellet para VHH-APEX2 o VHH mCherry suele ser marrón (debido a la hemo incorporado) o rosa, respectivamente.

3. purificación de Nanobodies funcionalizados

  1. Si es necesario descongelar el pellet bacteriano congelado en el hielo (véase también paso 2.6).
  2. Añadir 30 mL de tampón de unión fría (imidazol de 20 mM en PBS 1 x) para el precipitado de células bacterianas y resuspender mediante pipeteo arriba y abajo. Transferir bacterias resuspendidas a un tubo etiquetado 50 mL.
  3. Suplemento el enlace 30 mL tampón con lisozima 200 μg/mL, 20 μg/mL de DNasa I, 1 mM MgCl2 y 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoruro (PMSF) e Incube primero por 10 min a temperatura ambiente y luego por 1 h a 4 ° C en un agitador de extremo a extremo.
  4. Mecánicamente lyse las células bacterianas en un tubo de 50 mL colocando un sonicador de punta en la suspensión. Se aplican pulsos de constante 3 x 1 min 1 min enfriamiento períodos intermedios.
  5. Centrifugue el lisado a 15.000 x g a 4 ° C por 45 minutos para que sedimenten las células intactas y desechos bacteriano. Transfiera la sonicación lisado de célula bacteriana o en una botella de centrifugación adecuada para la centrifugación o el lisado se dividen en varios tubos de 5 mL para centrifugación mesa.
  6. Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de 50 mL y desechar los restos sedimentados.
  7. Almacenar el despejado lisado en hielo mientras se prepara la purificación por cromatografía de afinidad metálica inmovilizados (IMAC). Para aislar nanobodies funcionalizados con etiqueta histidina, empleo de un solo uso sus columnas (véase Tabla de materiales) que permite la purificación rápida y simple flujo de gravedad.
    Nota: Alternativamente, puede utilizarse también la purificación por lotes en lugar de columnas comerciales.
  8. Sus columnas en un soporte metálico de montaje.
    1. La forma cónica de la solución de almacenamiento de información de las columnas y equilibrar su columna con 10 mL de tampón de unión (imidazol de 20 mM en PBS 1 x).
    2. Vacío por flujo de gravedad (el flujo a través se pueden desechar).
  9. Gradualmente la carga el despejado bacteriana lisado (~ 30 mL) en la columna. Vacío por flujo de gravedad (el flujo a través se pueden desechar).
  10. Lavarla columna 2 x con 10 mL de tampón de unión (imidazol de 20 mM en PBS 1 x).
  11. Eluir los nanobodies con 2 mL de tampón de elución (imidazol de 500 mM de 1 x PBS) en un tubo de 2 mL y aplicar un cambio de buffer.
  12. Cambio de buffer.
    1. Equilibrar una desalación columna (véase Tabla de materiales) colocado en un adaptador de columna de tubo de 50 mL 5 veces con 5 mL de PBS 1 x.
    2. Permitir que el tampón entrar en la cama embalada. Deseche el flujo a través.
    3. Después de la quinta equilibrar PBS, girar la columna a 1.000 x g durante 2 minutos.
    4. Deseche el flujo a través.
    5. Coloque la columna con el adaptador en un nuevo tubo de 50 mL. Cargar los 2 mL de eluídas nanobody funcionalizado (del paso 3.11) en la columna de desalación equilibrado de PBS y centrifugado a 1.000 x g durante 2 min y recoger el eluido.
      Nota: En lugar de columnas comerciales de desalación, la diálisis puede aplicarse para cambiar la composición del tampón.
  13. Determinar la concentración de proteína (nanobody) del efluente usando el bicinchoninic (BCA) o el ensayo de Bradford según las instrucciones del fabricante.
    Nota: Para los ensayos de absorción nanobody por líneas de celulares de reportero GFP, una concentración stock de 2-10 mg/mL es óptima.

4. validación de expresión Nanobody funcionalizados (tinción de Coomassie)

  1. Preparar geles de 10-12.5% sodio dodecil sulfato-poliacrilamida gel electroforesis (SDS-PAGE) según protocolos estándar.
    Nota: Como alternativa, utilizar geles de gradiente prefabricados disponibles en el mercado.
  2. Pipetee 20 μg de purificada nanobody funcionalizado en un tubo de 1,5 mL y hervir en el tampón de muestra a 95 ° C durante 5 minutos.
    Nota: Por ejemplo, añadir 10 μl de una solución madre a nanobody 2 mg/mL en un tubo de 1,5 mL con 10 μl de tampón x 2. Si el volumen es demasiado pequeño, diluir más nanobody en PBS antes de añadir el tampón de muestra.
  3. Cargar el nanobody purificada hervida en el tampón de muestra en un gel de SDS-poliacrilamida y ejecutar según el protocolo estándar de la página hasta que el tinte de referencia (por ejemplo, azul de bromofenol) ha llegado al final del gel de separación, seguido de la tinción de Coomassie y extracción.
  4. Gel de Coomassie tinción y extracción.
    1. Uncast el gel y tinción con solución de tinción de Coomassie (5% de una solución Coomassie en 10% de ácido acético y el 45% de metanol en ddH2O 10 g/L) de 20-30 min a temperatura ambiente en una plataforma móvil de agitación. El gel debe estar cubierto completamente en la solución de tinción.
    2. Desteñir el gel 2 - 3 veces con desteñir solución (7,5% de ácido acético y 15% metanol en ddH2O) por 1 h a temperatura ambiente, antes de dejar el gel O/N para la extracción de más.
      Nota: Exceso Coomassie puede ser eficientemente absorbido colocando toallas de papel de cocina todo el gel.
  5. El gel con un sensor o una cámara de elección de la imagen.
    Nota: Nanobody expresión puede validarse aún más por el análisis de immunoblot usando los anticuerpos contra sus epitopos (véase también figura 1A).

5. absorción de Nanobodies funcionalizados por células cultivadas para la tinción de fluorescencia

  1. En una campana de cultivo celular, células HeLa de semilla ~ 400.000 a 500.000 estable expresando una proteína reportera GFP-etiquetado en cubreobjetos vidrio 18 mm (no. 1.5 H) en platos de 35 mm o bien 6 racimos con medio completo que contenga antibióticos (medio de Dulbecco modificado Eagle, DMEM suplementado con 10% de suero fetal de ternero (FCS), 100 estreptomicina unidades/mL, 2 mM l-glutamina y puromicina de 1.5 μg/mL).
    Nota: Aquí, utilizamos células HeLa estable expresan EGFP-Calnexin, EGFP-CDMPR y TfR-EGFP para fines de ilustración. Aparte de líneas celulares estables, pueden usarse también transitorio transfected las células HeLa. Líneas celulares estables pueden cultivarse conjuntamente en este paso con los padres no-transduced las células HeLa, por comparación directa.
  2. Incube las células O/N a 37 ° C en un incubador 7,5% CO2 para proliferar.
    Nota: Las células deben tener una confluencia de ~ 80% al día siguiente.
  3. Pipeta 2 μl de una solución 2 mg/mL nanobody a 15 o 50 mL de tubo con 2 mL de medio completo (este volumen es suficiente para cubrir un plato de 35 mm o bien de un grupo de 6-bien, ajustar el volumen del medio y nanobody proporcionalmente con más d cultura de célula ishes o racimos).
    Nota: Con el fin de Ilustración, aquí utilizamos VHH-mCherry, ya que no hay tinción de anticuerpo más se requiere para ver nanobody internalizado por los reporteros EGFP (ver figura 2).
  4. Retire el medio de crecimiento de las células y añadir 2 mL de medio completo precalentado que contiene 2 μg/mL funcionalizado nanobody por plato de 35 mm o bien de 6 unidad.
  5. Incube las células por 1 h a 37 ° C en un incubador 7,5% CO2 para permitir la absorción nanobody mediada por el reportero.
    Nota: Según el experimento planeado, el tiempo de absorción nanobody necesita ser ajustado. Para el experimento que se muestra a continuación, 1 hora es suficiente para alcanzar el estado estable de absorción nanobody EGFP-CDMPR y TfR-EGFP.
  6. Quite el medio y lavar las celdas 2 - 3 veces con 1 mL de 1 x PBS a TA.
  7. Fijar las células con 1 mL de 3% paraformaldehido (PFA) durante 10 min a TA.
  8. Eliminar la solución de la PFA y saciar fijador restante con 1 mL de 50 mM NH4Cl en 1 x PBS durante 5 min a TA.
    Nota: 3% PDA debe eliminarse de los residuos por separado como fijador.
  9. Lavar las células 3 veces con 1 mL de 1 x PBS a TA.
  10. Permeabilizar las células con 1 mL de 0,1% Tritón X-100 en PBS 1 x durante 10 min a TA.
    Nota: Aunque no permeabilización es necesaria, EGFP y mCherry fluorescencia es mejor, cuando luego las células están incrustadas en medio de montaje.
  11. Lavar las células 3 veces con 1 mL de 1 x PBS a TA.
  12. Colocar el cubreobjetos con el fórceps en una gota (~ 100 μL) de 1% de BSA en PBS de x 1 que contiene 5 μg/mL DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole) por 5 min a TA.
  13. Coloque el cubreobjetos en el plato/pozo y lavar 3 veces con 1 mL de PBS 1 x a TA.
  14. Etiquete los portaobjetos de vidrio y montar las células con Fluoromount-G. Deje que el medio de montaje endurecerse en la oscuridad para 3-4 h y guardar las diapositivas de cristal a 4 º C bajo protección de la luz.
  15. Patrones de tinción utilizando un microscopio de elección (p. ej., punto exploración Confocal microscopio vertical) de la imagen.

6. absorción de Nanobodies funcionalizados por células cultivadas (para análisis de sulfatación)

  1. En una campana de cultivo celular, semilla ~ 400.000 a 500.000 células de HeLa estable expresando una proteína reportera GFP-etiquetado en platos de 35 mm o en racimos de 6 pozos con antibióticos que contengan medio completadas (medio de Dulbecco modificado Eagle, DMEM, suplementado con 10% becerro fetal suero (FCS), 100 estreptomicina unidades/mL, 2 mM l-glutamina y puromicina de 1.5 μg/mL).
    Nota: Como se mencionó anteriormente, aquí utilizamos células HeLa estable expresan EGFP-Calnexin, EGFP-CDMPR y TfR-EGFP para fines de ilustración. Aparte de líneas celulares estables, se puede utilizar también transitorio transfected HeLa.
  2. Incube las células O/N a 37 ° C en un incubador 7,5% CO2 para proliferar.
    Nota: Las células deben tener una confluencia de ~ 80% al día siguiente.
  3. Retire el medio completo, lavar 2 veces con 1 x PBS a temperatura ambiente y matar de hambre las células con medio libre de sulfato (SFM) por 1 h a 37 ° C en un incubador 7,5% CO2 .
    Nota: SFM es preparado agregando 10 mL de MEM aminoácidos (50 x) solución, 5 mL de L-glutamina (200 mM), 5 mL de solución de vitamina (100 x) y 900 μl de CaCl2·2H2O a 500 mL de sales balanceadas del águila. Pasar por un 0,22 μm filtro y alícuota.
  4. En una campana ventilada o en el banco designado para el trabajo de la radiactividad, preparar sulfato de etiquetado medio que contiene 0.5 sulfato de mCi/mL [35S] como sal de sodio en SFM.
    PRECAUCIÓN: Manejar con cuidado todas las soluciones que contienen radioactividad. Sólo funcionan en las campanas designadas o bancos. Todos los material (puntas, tubos, placas, etc.) y tampones de lavado en contacto con la radioactividad tienen que recoger y desechar por separado. Hacerlo así para todos los pasos a continuación (paso 6.5-6.20).
  5. Añadir VHH-2xTS de 1 x PBS en sulfato etiquetado medio a una concentración final de 2 μg/mL.
    Nota: Como control, también incluyen VHH-std u otro nanobody carente de sitios de TS para demostrar el etiquetado específico.
  6. Sustituir SFM por 0,7 mL de sulfato de etiquetado medio que contiene sulfato de 0,5 mCi/mL [35S] y 2 μg/mL VHH-2xTS e Incube las células por 1 h a 37 ° C en un incubador de2 CO 7.5% señalado para el trabajo con la radiactividad.
    Nota: Según el experimento planeado, el tiempo de sulfatación nanobody necesita ser ajustado. Además, para determinar la cinética de la llegada de TGN, etiquetado se realiza para diferentes momentos (por ejemplo, para 10 min, 20 min, 30 min, etcetera).
  7. El etiquetado medio Lave y las células de 2 - 3 veces con PBS 1 x helada sobre una placa de refrigeración o hielo.
  8. Añadir 1 mL de tampón de lisis (PBS conteniendo 1% Tritón X-100 y 0.5% desoxicolato) suplementado con 2 mM PMSF y 1 x inhibidor de la proteasa cóctel e incubar las células durante 10-15 minutos en una plataforma oscilante a 4 ° C.
  9. Raspar y transferir el lisado en un tubo de 1,5 mL, vórtice lisado y lugar para 10-15 min en un rotador de extremo a extremo a 4 ° C.
  10. Preparar un postnuclear lisado por centrifugación a 10.000 x g por 10 min a 4 ° C.
  11. Usando un nuevo tubo de 1.5 mL, preparar 20-30 μl de una mezcla de granos de níquel en un tubo de 1,5 mL y lavar una vez con PBS 1 x por suavemente de peletizado a 1.000 x g durante 1 minuto.
    Nota: En lugar de níquel puede utilizarse granos, granos de estreptavidina (si nanobody está biotinilado) o proteína A granos con un IgG contra un epitopo de la nanobody (T7 - o HA-tag).
  12. Transferir la postnuclear lisado en un tubo de 1,5 mL que contiene granos de níquel e incubar durante 1 h a 4 ° C en un rotador de extremo a extremo para aislar los nanobodies. Quite una parte alícuota (50-100 μL) de la postnuclear lisada y hervir en solución tampón de muestras de la SDS para el análisis de immunoblot subsecuente de nanobody total asociada a células, reportero GFP y control de carga.
  13. Lavar los granos 3 veces con 1 x buffer PBS o lisis por granulación suavemente a 1.000 x g durante 1 minuto.
    Nota: Para el lavado más estricta de los granos, puede incluirse imidazol 20 mM en buffer PBS o lisis.
  14. Cuidadosamente retire todos los buffer de lavado de los granos, añadir 50 μl de 2 x de buffer de la muestra y hervir durante 5 min a 95 ° C.
  15. Carga ambos cocidos granos en un midi 12,5% SDS-PAGE gel y ejecute según el protocolo estándar de la página hasta que el tinte de referencia (por ejemplo, azul de bromofenol) ha llegado al final del gel de separación.
    Nota: También se puede realizar el análisis de Immunoblot nanobody total asociada a células, reportero GFP y control de carga mediante una mini 12,5% SDS-PAGE o prefabricado gel del gradiente.
  16. Fijar el gel separador en 30 mL de tampón de fijación (10% ácido acético y el 45% de metanol en ddH2O) por 1 h a temperatura ambiente, lavar el gel tres veces con 50 mL de agua desionizada y preparar para el secado de gel.
  17. Secado de geles de SDS-PAGE.
    1. Con cuidado coloque el gel fijado en film transparente estirada y cubrirla con papel de filtro de corte.
    2. Coloque el gel con el papel de filtro hacia abajo encima de la plataforma de secado, coloque la tapa de vacío y conectar la bomba de vacío para el secado de gel. Secar el gel para 3-5 h.
    3. Retire el film transparente y colocar el gel seco en un casete de autorradiografía equipado con una pantalla de fósforo.
  18. Autoradiograph imagen mediante un sensor de pantalla de fósforo. Siga las instrucciones del fabricante.
    Nota: Dependiendo de la intensidad de la señal de secado geles deban estar expuesto ya con pantallas de fósforo.

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Representative Results

Para investigar el transporte retrógrado de la proteína a diferentes destinos intracelulares, recientemente hemos establecido una anti-GFP nanobody-herramienta para la etiqueta y siga las proteínas recombinantes de fusión de la superficie de la célula30. Aquí, demostramos la producción bacteriana de tal derivatizada nanobodies y demostrar su aplicación al estudio de absorción endocíticas por microscopía de fluorescencia y immunoblotting, así como su uso para investigar la llegada de TGN por análisis de sulfatación. La aplicación de este último es el enfoque metodológico del presente Protocolo.

Hemos generado una caja de herramientas de nanobodies diferentes anti-GFP funcionalizados con características comunes por clonación molecular estándar30. Nuestro simple nanobody (estándar), VHH-std, contiene el dominio VHH, un T7 y un epitopo de la HA para la posterior detección por anticuerpos específicos, un hexahistidine carboxitrminal (His6)-etiqueta para la purificación y una secuencia de péptidos (BAP) de aceptador de biotina para Biotinilación y alta afinidad estreptavidina desplegable experimentos (figura 1A). Derivatización de VHH-std rinde nanobody diferentes variantes para examinar endocíticas absorción y transporte retrógrado bioquímicamente, por proyección de imagen fija y vivo de la célula y por microscopia electrónica.

Para evaluar el tráfico de proteína de la membrana plasmática para el trans-Golgi y TGN, aprovecharon la localización exclusiva de tyrosylprotein molecular en estos compartimientos así modificado VHH-std con un sitio de sulfatación de la tirosina de tándem (2xTS) derivado de rata procholecystokinin41. Mientras que la modificación de VHH-std con mCherry permite la visualización directa del transporte retrógrado por celular fijo y vivo la proyección de imagen, funcionalización con una peroxidasa, como APEX237, permite estudios de microscopia electrónica, compartimiento citoquímicos ablación, o reacciones de Biotinilación de proximidad-dependiente. Además, la inserción de un sitio de la hendidura para el tabaco etch proteasa del virus (TEV) permite distinguir bioquímicamente los nanobodies intracelular y de superficie-limita (figura 1A). Previamente hemos usado VHH-tev para monitorizar la cinética reciclaje endocíticas enlazado a nanobody EGFP-CDMPR y TfR-EGFP30. Nanobody reaparición en la superficie de la célula después de la absorción podría evaluarse simplemente persiguiendo con aplicada extracelularmente proteasa recombinante de TEV causando una pérdida inversa del cassette de nanobody carboxitrminal del epítopo. Incluir un sitio de la hendidura en la mCherry o APEX2 nanobody fusión es útil para estudiar la cinética de reciclaje de reporteros EGFP por proyección de imagen de células vivas de una manera similar al VHH-tev, o para limitar las reacciones citoquímicas a compartimientos intracelulares, respectivamente. Funcionalización con otros dominios de la proteína (por ejemplo, otros fluoróforos o enzimas) o secuencias diana para otras modificaciones del posttranslational pueden fácilmente lograrse subcloning un inserto respectivo en el plásmido vector codificación VHH-std (ver también Tabla 1 para obtener información de plásmido) utilizando sitios de restricción disponibles SpeI y EcoRI.

Utilizando el protocolo como se describe anteriormente, los nanobodies ilustrados aquí puede ser aislados a la alta pureza y rendimiento (figura 1B). Sólo mCherry fusiones demostradas menor recorte de dominios de la proteína post purificación (figura 1B, ver carriles 7-8). En la ausencia de expresión de la BirA, típicamente obtuvimos 25-35 mg para VHH-std, VHH-2xTS y sus homólogos modificados de tev, o ~ 20 mg para VHH-APEX2 y VHH-mCherry y sus derivados que contengan el tev. Nuestra experiencia demuestra que el coexpression BirA baja nanobody rendimiento en un tercio a la mitad.

Para ilustrar la absorción mediada por el reportero nanobody, hemos utilizado líneas celulares HeLa estable expresan EGFP-Calnexin (CNX), EGFP-CDMPR y TfR-EGFP (figura 2A y B). EGFP fue fusionado al extremo extracelular/lumenal de cada proteína (es decir, entre la secuencia señal y reportero de CNX o CDMPR) y a la carboxyterminus de la TGF, dejando las señales de ordenación citosólicas libre. Todas estas moléculas carga etiquetado EGFP tienen itinerarios de tráfico intracelulares después de ER objetivo. EGFP-Calnexin es residente en la sala de emergencia y normalmente no llega a compartimentos post-Golgi, sirve como un control negativo para la absorción de nanobody potencial e inespecíficos. En cambio, EGFP-CDMPR y TfR-EGFP tienen funciones de transporte más allá del Golgi y así aparecen constantemente en la membrana plasmática. Como era de esperar, cuando mCherry VHH se agregó a una población mixta de células estable expresaban EGFP-CNX y HeLa sin modificar no internalización nanobody se podría observar en cualquiera de los casos. Sin embargo, EGFP-CDMPR y TfR-EGFP capturaron VHH mCherry en la superficie celular y transportaban superpuesto a compartimentos autoguiados hacia el blanco del reportero (figura 2).

VHH-mCherry colocalización con un marcador TGN residente podría utilizarse en principio para evaluar la llegada de TGN. Sin embargo, hemos establecido un enfoque bioquímico basado en la sulfatación de la tirosina. Con el fin de tomar ventaja de esta modificación que ocurre en el Golgi trans/TGN, nanobodies fueron funcionalizados con sitios de TS (figura 1A). Para demostrar la especificidad y la funcionalidad de estas carpetas de proteína, incubamos células estable expresan EGFP-CNX, EGFP-CDMPR y TfR-EGFP con VHH-std o VHH-2xTS de 1 h en presencia de sulfato radioactivo y sin modificar las células HeLa. Radiolabeling de VHH-2xTS sólo se produce cuando un reportero transporta nanobody retrogradely al TGN donde es expuesta a la maquinaria de sulfatación de la tirosina. HeLa que expresan EGFP-CNX y sus células los padres mostrar ninguna absorción nanobody y así no hay sulfatación. EGFP-CDMPR y TfR-EGFP internalizan nanobodies, estas últimas considerablemente más que la anterior. Sin embargo, sólo EGFP-CDMPR causado VHH-2xTS ser sulfatada (Figura 3A). Esto confirma el eficiente transporte retrógrado de CDMPR de la superficie celular para el TGN y proporciona evidencia contra TfR regresando al TGN (como se ha sugerido en algunos estudios42,43).

Cinética de la internalización y la llegada de TGN de proteínas reportero también pueden determinarse mediante el análisis de lysates de la célula después de diferentes tiempos de absorción nanobody y sulfatación. Usando CDMPR de EGFP como reportero, encontramos sulfatación para comenzar solamente después de un período de retraso de ~ 15 minutos y para alcanzar la saturación sólo después > 75 min (figura 3B, carriles 1-6 y C, los símbolos cuadrados). Cinética de absorción y sulfatación apareció cambiada de puesto por casi 30 minutos, lo que refleja el transporte para el TGN. Además, el método permite investigar la clasificación máquinas implicadas en el transporte MPR por interferencia farmacológica o proteína silenciamiento enfoques como caída, golpe de gracia o knocksideways. Aquí, utilizamos brefeldin A (BFA), un inhibidor de factores de intercambio de nucleótido de guanina (GEFs) de varios Arf GTPases, generalmente interferir en el transporte retrógrado al TGN. Cuando se tratan con BFA, totalmente fue suprimido sulfatación mientras que la absorción seguía siendo inafectada en la cinética y en parte (figura 3B, carriles 7-12 y C, Ronda de símbolos).

Figure 1
Figura 1: diseño y producción de nanobodies funcionalizados a proteínas de la superficie celular modificado de EGFP. (A) representación esquemática de los nanobodies derivatizados. Nanobody estándar consiste en el dominio específicos de la GFP VHH, T7 y etiquetas del epítopo HA, un BAP y una etiqueta de purificación hexahistidine (His6). Otros nanobodies además comprenden dos TSs, APEX2 o mCherry, cada uno con o sin un sitio de la hendidura para la proteasa TEV (tev). Barra de escala está en los aminoácidos (aa). (B) bacteriano expresado y purificados nanobodies (50 μg) fueron analizados por electroforesis en geles de SDS gradiente y teñidos con Coomassie. Proteínas marcadoras con masa molecular en kDa se muestran a la izquierda. Sólo mCherry VHH y VHH-tev-mCherry demostraron mínimo recorte entre los dominios mCherry y el VHH. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: absorción y localización intracelular del VHH-mCherry por diversas proteínas de reportero EGFP. (A) representación esquemática de las proteínas de fusión de EGFP. Secuencias derivadas de proteínas de la membrana secretora se muestran en negro con péptidos de señal N-terminal y segmentos transmembranales internos en amarillo, y EGFP se ilustra en verde. EGFP fue fundido a CDMPR, TfR y Calnexin (CNX). Barra de escala en los aminoácidos (aa). EGFP-CDMPR y TfR-EGFP han sido descritos30. (B) HeLa células estable expresión de EGFP reportero proteínas fueron cosechadas, lisis y analizadas por electroforesis en geles de SDS y el immunoblotting usando los anticuerpos anti-GFP y anti-actina. Masa molecular en kDa se indica a la derecha. (C) HeLa células expresando estable el reportero tagged EGFP proteínas se mezclaron con los padres células HeLa, se incubaron con 5 μg/mL mCherry VHH (~ 100 nM) durante 1 h a 37 ° C y procesadas para microscopía de fluorescencia. Barra de escala = 10 μm. La absorción sólo se produce por las células que expresan un reportero con EGFP expuesto en la superficie celular. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Análisis de la sulfatación y la cinética de transporte retrógrado al TGN mediante etiquetado TS nanobodies. (A) Parental y HeLa células expresando estable reportero modificado de EGFP proteínas fueron etiquetadas usando 0.5 sulfato de mCi/mL [35S] de 60 minutos con 2 μg/mL VHH-std o VHH-2xTS. Nanobodies fueron aislados usando granos de níquel, separados en un 12,5% de SDS-PAGE seguido por autorradiografía. Se colectaron alícuotas de lysates de la célula antes del tire de níquel y immunoblotted para la actinia, EGFP y nanobody asociada a células (His6). (B y C) las células HeLa estable expresaban EGFP-CDMPR fueron etiquetadas con 0.5 sulfato de mCi/mL [35S] para hasta 75 min en presencia de 2 μg/mL VHH-2xTS con y sin 2 μg/mL BFA antes del análisis como en (A). Cuantificación de captación de VHH-2xTS y sulfatación de tres experimentos independientes se muestra en % del valor sin BFA después de 75 minutos (media y SD). Cuadrados negros, sin BFA; círculos grises, con BFA; abrir símbolos, absorción; lleno de símbolos, sulfatación. Esta figura ha sido modificada y ampliado de Buser et al., 2018, PNAS30. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: secuencias de la proteína de los nanobodies funcionalizados se muestra en este estudio. T7 epitopo en gris de, VHH en negro, HA epitopo en secuencia de BAP azul, naranja, hexahistidine (His6) en rojo, sitio de la hendidura de proteasa TEV en púrpura, myc epitopo en magenta, la secuencia de la sulfatación de la tirosina en amarillo, APEX2 en verde y mCherry en color rosa. Se han depositado los vectores de expresión codificación estos nanobodies funcionalizados anti-GFP (véase también la tabla 1 para obtener información de plásmido). Haga clic aquí para descargar este archivo.

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Discussion

Nanobodies representan una clase emergente de andamios de proteína ligante con muchas ventajas sobre anticuerpos convencionales: son pequeños, estables, monoméricas, puede seleccionarse para bonos de alta afinidad y falta disulfuro33,35, 44 , 45. se utilizan en un número de aplicaciones, tales como en sistemas de cultivo de células y organismos en el desarrollo de la biología46,47,48,49, como cristalización chaperones a estabilizar los Estados conformacionales en biología estructural50,51,52,53, como inhibidores o moduladores de la actividad de las enzimas54,55, 56, como reactivos de inmunohistoquímica para análisis bioquímicos57, o como "nanobodies secundario" para detectar inmunoglobulinas anti-ratón y el conejos en immunoblots e inmunofluorescencia58. En nuestro estudio anterior, hemos desarrollado y aplicado nanobodies funcionalizados producida por expresión bacteriana a las proteínas de superficie de la etiqueta y seguir su ruta intracelular de varios compartimientos, en particular a la TGN30. Utilizamos un nanobody anti-GFP para poner la herramienta versátil, capaz de proteínas de fusión objetivo con GFP extracelular, YFP o mCerulean que ya podría estar disponible y que se caracteriza. Modificación de nanobodies anti-GFP con mCherry, APEX2 o TS sitios permitidos monitorear la absorción reportero por proyección de imagen fija y vivo de la célula, a ultraestructural visualizar compartimientos del transporte retrógrado a ablar de estos compartimientos, o para el estudio de transporte cinética del TGN. Uno de los inconvenientes de nuestra herramienta es que recombinante modificación de líneas de células blanco (expresión estable o etiquetado endógena) se requiere antes de nanobodies funcionalizados anti-GFP se puede aplicar. Funcionalización de puede aplicarse también al creciente número de nanobodies dirigidos contra proteínas sin etiquetar objetivo endógeno establecidas por inmunización de animales o por selección pantalla de ribosoma y phage-display de VHH sintético bibliotecas59. Uso de nanobodies modificado con sitios de TS (por ejemplo, VHH-2xTS), podemos medir directamente transporte y cinética de la llegada de TGN de proteínas de diverso objetivo modificado de EGFP. Hemos aplicado VHH-2xTS para estudiar la contribución del complejo 1 de proteína adaptadora (AP-1) en el transporte retrógrado de MPRs por análisis cinético directo en las células de knocksideways que permite la rápida inactivación de la maquinaria de transporte dado30. Nanobody sulfatación y transporte por lo tanto retrógrado de MPRs EGFP marcado fue parcialmente, pero no completamente bloqueado. Nuestro enfoque basado en el nanobody mediante sulfatación como sensor de llegada TGN confirmó los resultados anteriores de otros laboratorios que indica una contribución funcional de AP-1 en el transporte retrógrado del endosome a TGN17,60, 61. Nanobodies sulfatable puede proporcionar así una útil herramienta bioquímica para diseccionar la contribución de otros mecanismos de transporte retrógrado, como epsinR, Rab9/TIP47 o SNX-BAR/retrómero complejos, proteínas de cargo por manipulación genómica, genética o química. El protocolo presentado aquí ofrece una base de cómo uno puede hacer uso de nanobodies funcionalizados en general para determinar los compartimentos de destino, los caminos y cinética en células cultivadas de transporte.

Otros grupos ya han hecho uso de TS sitios a seguir el transporte de la célula de la superficie para el TGN. Subunidades de la toxina ricina, Shiga o tos ferina han sido modificados previamente con sitios de sulfatación para demostrar una ruta de transporte a través de la TGN62,63,64,65,66. Por otra parte, péptidos de TS también se habían acoplados químicamente a IgGs analizar transporte retrógrado de GFP-CIMPR y TGN46 endógena a la TGN67,68. Los nanobodies sulfatable tienen la ventaja de la producción bacteriana simple y reproducible y de una estequiometría 1:1 con la proteína diana. Por el contrario, es por ejemplo bien sabido que proteína divalente aglomerantes, tales como depósitos, reticulación puede proteínas de superficie celular y alteran su tráfico intracelular en lisosomas después de endocitosis69,70, destacando el significado de carpetas proteína monomérica con respecto a los métodos existentes. Un paso crítico de nuestra técnica es que manejo con radiactividad se requiere para realizar etiquetado sulfato de nanobodies. Sin embargo, nuestra herramienta de nanobodies functionalized con los sitios de TS para estudiar la llegada de TGN puede ser potencialmente aplicado sin radiactividad utilizando anticuerpos anti-sulfotyrosine.

Nuestro estudio anterior sugiere esa sulfatación nanobody no son muy eficientes, ya que la sulfatación de MPRs no había alcanzado un máximo después del minuto 75, aunque la absorción nanobody se saturó después de 45 min30. Detección de otros sitios naturales de TS puede mejorar la eficiencia de la sulfatación. Alternativamente, para potencialmente mejorar eficiencia de sulfatación, componentes de la maquinaria de sulfatación, como TPST1 y TPST2, podrían ser overexpressed. De hecho, se ha demostrado previamente que la sobreexpresión de uno de los transportadores de la entrega de 3'-phoshoadenosine-5'-fosfosulfato (PAPS), el sustrato para TPSTs, desde el citosol al lumen del Golgi puede alterar el estado de sulfatación de proteoglicanos 71.

Aparte de nanobodies sulfatable, otros derivatizaciones también permiten un transporte seguimiento a través de compartimentos endocíticos y el TGN. APEX2 puede aplicarse como una enzima etiquetadora promiscua de Biotinilación de proximidad-dependiente para el análisis proteómico de transporte retrógrado. Nanobody APEX2 que es interiorizado por un reportero de la carga de intereses etiqueta proteínas en proximidad cercana dentro de los compartimentos de destino. Proteómica comparativa debe permitir identificar otras proteínas endógenas en los diferentes tipos de endosomas y el TGN que accede la nanobody. Muchas variaciones de nanobodies en combinación con su proteína blanco son concebibles. Un informe reciente, por ejemplo, aplica un enfoque invertido al descrito aquí: GFP derivatizado se utilizó para estudiar y la trampa anti-GFP cellularly expresa tagged nanobody vacuolar clasificación receptores en anterograde y retrógrados compartimientos de la planta sistema de endomembrane72. Del mismo modo, pueden diseñarse funcionalizadas nanobody-trampas en sistemas de cultivo de células de mamífero para capturar y acumular reporteros modificado de EGFP en diferentes compartimentos durante el transporte retrógrado.

Nuestro aquí presentado método y Protocolo con el foco en TS sitio tagged nanobodies permite seguimiento cuantitativo y cualitativo de las proteínas de carga de la superficie celular compartimentos endocíticos y el TGN en células de mamífero cultivadas.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue financiado por Grant 31003A-162643 por la Swiss National Science Foundation. Agradecemos a Nicole Beuret y el Biozentrum instalación del núcleo de la proyección de imagen (IMCF) para apoyo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-GFP antibody Sigma-Aldrich 118144600001 Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche
Anti-His6 antibody Bethyl Laboratories A190-114A
Anti-actin antibody EMD Millipore MAB1501
Goat anti-rabbit HRP Sigma-Aldrich A-0545
Goat anti-mouse HRP Sigma-Aldrich A-0168
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Sigma-Aldrich D9542 dissolved in 1x PBS/1%BSA
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Applichem A3672
D-biotin Sigma-Aldrich B4501 dissolved in sterile 500 mM NaH2PO4 or DMSO
5-aminolevuilnic acid (dALA) hydrochloride Sigma-Aldrich A3785 dissolved in sterile water
DNase I Applichem A3778 dissolved in sterile water
Lysozyme Sigma-Aldrich 18037059001 Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche
Brefeldin A (BFA) Sigma-Aldrich B5936
Puromycin Invivogen ant-pr-1
Penicillin/Streptomycin Bioconcept 4-01F00-H
L-glutamine Applichem A3704
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) Sigma-Aldrich D5796
Fetal calf serum (FCS) Biowest S181B-500
Sulfur-35 as sodium sulfate Hartmann Analytics ARS0105 Product contains 5 mCi
Earle's balanced salts Sigma-Aldrich E6267
MEM amino acids (50x) solution Sigma-Aldrich M5550
MEM vitamin solution (100x) Sigma-Aldrich M6895
cOmplete, Mini Protease inhibitor cocktail Sigma-Aldrich 11836153001 Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) Applichem A1008 dissolved in sterile water, stock is 1 M
Carbenicillin disodium salt Applichem A1491 dissolved in sterile water, stock is 100 mg/mL
Kanamycin sulfate Applichem A1493 dissolved in sterile water, stock is 100 mg/mL
Coomassie-R (Brilliant Blue) Sigma-Aldrich B-0149
Paraformaldehyde (PFA) Applichem A3813
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich A2153
Fluoromount-G Southern Biotech 0100-01
Ni Sepharose High Performance GE Healthcare 17-5268-01
His GraviTrap columns GE Healthcare GE11-0033-99
His buffer kit GE Healthcare GE11-0034-00
Disposable PD10 desalting columns GE Healthcare GE17-0851-01
Mini-Protean TGX gels, 4-20%, 15-well Bio-Rad 456-1096
Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) w/o Ca2+/Mg2+ Sigma-Aldrich D8537
35 mm dishes Falcon 353001
6-well plates TPP 92406
Glass coverslips (No. 1.5H) VWR 631-0153
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Applichem A0999.0025 dissolved in 40% DMSO 60% isopropanol, stock in 500 mM
Tryptone Applichem A1553
Yeast extract Applichem A1552
Magnesium chloride hexahydrate Merck Millipore 105833 dissolved in sterile water, stock is 1 M
Calcium chloride dihydrate Merck Millipore 102382 dissolved in sterile water, stock is 1 M
Sodium chloride Merck Millipore 106404 dissolved in sterile water, stock is 5 M

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Inmunología e infección número 144 nanobodies transporte retrógrado complejo de Golgi sulfatación de la tirosina expresión bacteriana radiolabeling EGFP células HeLa
Análisis de absorción endocíticas y transporte retrógrado a la red Trans-Golgi en células cultivadas de Nanobodies funcionalizados
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Buser, D. P., Spiess, M. Analysis of Endocytic Uptake and Retrograde Transport to the Trans-Golgi Network Using Functionalized Nanobodies in Cultured Cells. J. Vis. Exp. (144), e59111, doi:10.3791/59111 (2019).

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