Summary
Transporte retrógrado de proteínas de superfície celular para o Golgi é essencial para manter a homeostase de membrana. Aqui, descrevemos um método para analisar bioquimicamente transporte de superfície-para-Golgi celular de proteínas recombinantes usando funcionalizados nanobodies em células HeLa.
Abstract
Transporte de proteínas e membranas de superfície celular para o Golgi e além é essencial para a homeostase, organela identidade e fisiologia. Para estudar o tráfego de proteína retrógrada, recentemente desenvolvemos um versátil baseado em nanobody toolkit para analisar o transporte de superfície celular para o complexo de Golgi, quer por células fixas e ao vivo de imagens, por microscopia electrónica, ou bioquimicamente. Nós produzimos funcionalizados antiproteína verde fluorescente (GFP) nanobodies — ligantes pequenos, monomérico, alta afinidade da proteína — que pode ser aplicado a linha celular expressam proteínas de membrana de interesse com um moiety extracelular de GFP. Nanobodies pyrazole vinculados para os repórteres de GFP especificamente são internalizados e transportado às costas ao longo das rotas de classificação dos repórteres. Nanobodies foram acrescidas com fluorophores siga transporte retrógrado por microscopia de fluorescência e viver de imagem, com peroxidase de ascorbato 2 (APEX2) para investigar a localização ultra-estrutural do repórter-nanobody complexos por elétrons microscopia e com motivos de tirosina sulfatação (TS) para avaliar a cinética da chegada de rede (TGN) trans-Golgi. Neste artigo metodológico, descrevem o procedimento geral para o modo express e purificar nanobodies funcionalizados. Ilustramos o uso poderoso de nossa ferramenta usando o nanobodies mCherry - e TS-modificado para analisar a captação endocítica e TGN chegada de proteínas de carga.
Introduction
Trânsito retrógrado de proteínas e lipídios de superfície celular para vários compartimentos intracelulares é crucial para a manutenção da homeostase de membrana para contrabalançar a secreção e reciclar componentes de anterógrada transporte machineries1 , 2. após internalização através de endocitose dependente de Clatrina ou - independente, carga de proteínas e lipídios primeiro preencher cedo endossomos de onde eles são mais Redirecionado ou ao longo do sistema endo-lisossomal, reciclado para a membrana plasmática, ou direcionados à rede trans-Golgi (TGN). Reciclagem de endossomos e/ou a superfície da célula para o TGN é parte do ciclo funcional de um número de receptores de carga do transmembrane anterógrada, tais como os receptores de manose-6-fosfato de cação-dependente e independente de cátion (CDMPR e CIMPR) entregando recém sintetizado hidrolases lisossômicas do TGN para tarde endossomos lisossomos3,4,5, sortilin e SorLA6,7e Wntless (WLS) transportando Wnt ligantes à superfície da célula 8 , 9 , 10 , 11. outras proteínas obtidas para o TGN são TGN46 e suas isoformas relacionados12,13,14, SNAREs (solúvel em N- proteà sensíveis à fusão fator acessório receptores) 15 , 16 , 17, precursora amiloide (APP) de proteína18,19, anquilose progressiva (ANK) proteína20transportadores metálicos tais como ATP7A/B ou DMT121,22e do transmembrane processamento de enzimas, incluindo a carboxipeptidase D, furina ou BACE123,24,25. Para além destas proteínas endógenas, toxinas bacterianas e vegetais (por exemplo, toxina Shiga e cólera, ricina e abrin) sequestrar máquinas de transporte retrógrado para alcançar a ER para retrotranslocation para o citosol26,27, 28,29.
A fim de analisar diretamente trânsito retrógrado, anteriormente desenvolvemos um conjunto de ferramentas baseadas em nanobody para rotular e siga proteínas de carga de superfície celular para compartimentos intracelulares30. Nanobodies representam uma nova família de proteínas ligantes derivados de homodimeric cadeia pesada-somente anticorpos (hcAbs) que ocorrem naturalmente em camelídeos e peixes cartilagíneos31,32. Eles constituem o domínio variável de cadeia pesada (VHH) de hcAbs e têm muitas vantagens sobre anticorpos convencionais (por exemplo, IgGs): eles são monoméricos, pequeno (~ 15 kDa), altamente solúvel, desprovida de ligações de bissulfeto, pode ser bacteriana expressos e selecionado para ligação de alta afinidade33,34,35,36. Para tornar a nossa ferramenta de nanobody versátil e amplamente aplicável, utilizamos funcionalizados anti-GFP nanobodies às proteínas de superfície-rótulo e faixa com GFP no seu domínio extracelular/lumenal. Por functionalization de nanobodies com mCherry, peroxidase de ascorbato 2 (APEX2)37, ou sequências de sulfatação (TS) de tirosina, transporte retrógrado de proteínas transmembranares carga de bonafide pode ser analisado por qualquer fixo e vive de imagem latente da pilha, por microscopia eletrônica de varredura, ou bioquimicamente. Desde sulfatação tirosina mediada por sulfotransferases tyrosylprotein (TPST1 e TPST2) é uma modificação pós-traducional restringida para o trans-Golgi/TGN, podemos diretamente estudar transporte e cinética de proteínas de interesse da superfície da pilha para isso intracelulares Golgi compartimento38,39,40.
Neste artigo de métodos, descrevemos a facilidade de produção de nanobodies funcionalizados (VHH-2xTS, - APEX2, - mCherry e derivados) adequado para uma série de aplicativos para analisar o transporte retrógrado em células de mamíferos,30. Focamos principalmente o uso de TS site-modificado nanobody para análise de tráfego intracelular de superfície celular para o compartimento de sulfatação.
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Protocol
1. bacteriana transformação com funcionalizados Nanobodies
Nota: Este protocolo foi otimizado para a expressão, purificação e análise de nanobodies anti-GFP funcionalizados como descrito anteriormente,30. Derivatização com outras partes da proteína pode requerer a modificação do presente protocolo padrão.
- Descongelar as bactérias chemocompetent (~ 100 µ l) adequadas para a expressão da proteína (por exemplo, Escherichia coli Rosetta BL21 (DE3) células), colocando-os em gelo.
Nota: Prepare chemocompetent células bacterianas de acordo com os procedimentos padrão do laboratório. Alternativamente, as células bacterianas quimicamente competentes podem ser adquiridas comercialmente. - Adicionar 50 ng de um plasmídeo codificação nanobodies funcionalizados. Para permitir o suficiente biotinylation site-specific do repórter nanobody durante a expressão bacteriana, também adicionar um excesso de triplo (150 ng) de um plasmídeo bacteriano expressão codificação biotina ligase do BirA (ver também a tabela 1 para obter informações do plasmídeo). Suavemente a pipeta acima e para baixo.
Nota: Se nanobody biotinylation não é necessário ou os repórteres nanobody são desprovidas de um peptídeo de aceitador de biotina (BAP), transformação co com um plasmídeo BirA de codificação não é necessária. - Incube as células bacterianas por 30 min no gelo.
- As células bacterianas de choque de calor, colocando-os por 1 min a 42 ° C em banho-maria ou um bloco de aquecimento.
- Adicionar 1 mL de temperatura (RT) médio de caldo (LB) de Luria e incubar a bactéria transformada em uma thermoshaker para 1 h a 37 ° C, para permitir a expressão fenotípica dos genes de resistência. Para preparar 1 L LB médio, equilíbrio 5 g de fermento extrato, 10g de triptona e 10 g de NaCl, encher com água e esterilizar em autoclave. Se o nanobody funcionalizado tem sido subcloned em um vetor de expressão contendo resistência à ampicilina/carbenicilina, passo 1.5 pode ser omitido.
- As bactérias a 11.000 x g por 1 min de pelotas e Resuspenda em 100 µ l de meio LB fresco.
- As bactérias suspensas em LB placas contendo os respectivos antibióticos (por exemplo, com 50 µ g/mL canamicina e 50 carbenicilina µ g/mL quando as bactérias têm sido co transformadas com nanobody repórter e BirA, tal como acima referido (etapa 1.2)) da placa.
- Coloque as placas LB em uma incubadora a 37 ° C e deixe crescer durante a noite (O/N).
Nota: O protocolo pode ser pausado aqui armazenando a placa LB com colônias crescidas em 4 ° C. Use o parafilm para selar as placas LB.
2. bacteriana cultura líquida e indução da expressão de Nanobody funcionais
- Escolher uma colônia bacteriana contendo o vetor de interesse do prato e deixe crescer em um frasco contendo 20 mL de LB suplementado com antibióticos O/N em uma agitação incubadora a 37 ° C (ver também passo 1.7 sobre seleção de antibióticos).
- No dia seguinte, dilua a cultura bacteriana adulto 20 mL em um frasco contendo 1 L de meio LB com antibióticos de seleção.
- Continue a incubar a cultura bacteriana a 37 ° C, até que ele atinja uma OD600 de 0,6-0,7. Permitir que a cultura arrefecer a RT antes induzindo a expressão de proteínas.
- Induzi a expressão da proteína de nanobodies funcionalizados e BirA pela adição de 1 mL de 1 M isopropil-β-d-thiogalactopyranosid (IPTG) a uma concentração final de 1 mM do indutor (1:1, 000 diluição). Também, adicionar 10 mL de 20 mM d-biotina estoque solução resultando em 200 µM d-biotina, o meio de crescimento para permitir biotinylation do epítopo BAP presente no nanobodies funcionalizados (ver também a tabela 1 para obter informações do plasmídeo)
Nota: A solução d-biotina é preparada em ddH2O e trazida para a solução pela adição de algumas NaH2PO4a 500 mm. Como alternativa, d-Biotina também pode ser dissolvido em DMSO. Para produzir nanobodies fundido ao APEX2 (VHH-APEX2), o meio LB deve ser complementado além com cloridrato de (dALA) o ácido 5-aminolevulínico 1mm para promover a incorporação do heme. dALA é preparado como uma solução estoque de 100 mM em ddH2O. - Incubar a cultura bacteriana induzida por IPTG 1 L a 30 ° C, durante 4 h para VHH-2xTS, a 20 ° C ou O de RT/N para VHH-APEX2 ou no 16 ° C O/N para VHH-mCherry (ver também a tabela 1 para obter informações do plasmídeo).
Nota: Condições de expressão para uma nova construção de nanobody devem ser otimizadas pelo experimentador. - Transferir a cultura bacteriana do recipiente dentro de uma garrafa de centrifugação de 1 L e pelota as células a 5.000 x g a 4 ° C, durante 45 min. decantar o sobrenadante e continuar com a purificação.
Nota: O protocolo pode ser pausado aqui armazenando a pelota bacteriana a-80 ° C indefinidamente. A pelota para VHH-APEX2 ou VHH-mCherry normalmente é acastanhada (por causa do hemo incorporado) ou cor de rosa, respectivamente.
3. purificação de Nanobodies funcionais
- Se necessário, descongelar a pelota bacteriana congelada no gelo (ver também passo 2.6).
- Adicionar 30 mL de tampão de ligação gelada (imidazol 20mm em 1X PBS) para a pelota de célula bacteriana e ressuspender pipetando para cima e para baixo. Transferência de ressuspensão de bactérias em um tubo de 50ml rotulados.
- Suplemento a vinculação de 30 mL buffer com lisozima 200 µ g/mL, 20 µ g/mL DNase I, 1 mM MgCl2 e fluoreto de phenylmethylsulfonyl de 1 mM (PMSF) e incube primeiro para 10 min a RT e depois de 1 h a 4 ° C, um agitador de extremidade-sobre-extremidade.
- Mecanicamente, lyse pilhas bacterianas em um tubo de 50 mL colocando um sonicador de ponta para a suspensão. Aplica pulsos constante 3 x 1 min com períodos de resfriamento 1 min in-between.
- Centrifugue o bacteriano lisado a 15.000 x g a 4 ° C, durante 45 min para os detritos e células intactas de Pelotas. Transferir o lisados bacteriano lisado celular total ou dentro de uma garrafa de centrifugação adequado para centrifugação ou dividir o lisado em vários tubos de 5ml por centrifugação do tabletop.
- Transferir o sobrenadante para um novo tubo de 50 mL e descartar os detritos peletizados.
- Armazenar o apuradas lisado no gelo enquanto prepara a purificação por cromatografia de afinidade de metal imobilizado (IMAC). Para isolar nanobodies funcionalizados com tag histidina, emprega descartáveis suas colunas (ver Tabela de materiais) que permite a purificação de gravidade-fluxo rápido e simples.
Nota: Alternativamente, purificação de lote em vez de colunas comerciais pode ser usada também. -
Montagem de suas colunas em uma base de Metal.
- Estabilizarem a solução de armazenamento das colunas e equilibrar a sua coluna com 10 mL de tampão de ligação (imidazol 20mm em 1X PBS).
- Vazio por fluxo de gravidade (o escoamento pode ser descartada).
- Gradualmente, carrega o apuradas bacteriana lisado (~ 30 mL) para a coluna. Vazio por fluxo de gravidade (o escoamento pode ser descartada).
- Lave a sua coluna 2 x com 10 mL de tampão de ligação (imidazol 20mm em 1X PBS).
- Eluir o nanobodies com 2 mL de tampão de eluição (imidazol 500mm em 1X PBS) para um tubo de 2 mL e aplicar uma troca de amortecedor.
-
Troca de amortecedor.
- Equilibrar uma dessalinização coluna (ver Tabela de materiais) colocado em um adaptador de coluna de tubo de 50 mL 5 vezes com 5 mL de 1X PBS.
- Permitir que o buffer entrar na cama embalada. Descarte o escoamento.
- Após a quinta equilibração de PBS, gire a coluna a 1.000 x g por 2 min.
- Descarte o escoamento.
- Coloque a coluna com o adaptador para um novo tubo de 50 mL. Carregar a 2 mL de eluted nanobody funcionalizado (da etapa 3.11) para a coluna do desalting PBS-equilibrado e girar a 1.000 x g por 2 min e recolher o eluato.
Nota: Em vez de colunas do desalting comerciais, diálise pode ser aplicado para a composição do tampão de troca.
- Determine a concentração de proteína (nanobody) do eluato usando o bicinchoninic (BCA) ou ensaio de Bradford, de acordo com as instruções do fabricante.
Nota: Para ensaios de absorção de nanobody por linhas de células GFP repórter, uma concentração das ações de 2-10 mg/mL é ideal.
4. a validação da expressão Nanobody funcionalizados (coloração Coomassie)
- Prepare-se 10-12,5% géis para sódio Dodecil sulfato de sódio-poliacrilamida electroforese do gel (SDS-PAGE) de acordo com protocolos padrão.
Nota: Como alternativa, use géis gradientes pré-fabricado comercialmente disponíveis. - Pipetar 20 µ g de nanobody funcionalizado purificado em um tubo de 1,5 mL e fervura no amortecedor da amostra a 95 ° C por 5 min.
Nota: Por exemplo, adicione 10 µ l de uma solução de reserva de nanobody de 2 mg/mL em um tubo de 1,5 mL com 10 µ l de tampão de amostra x 2. Se o volume é muito pequeno, dilua ainda mais nanobody em PBS antes de adicionar o amortecedor da amostra. - Carregar o nanobody purificado fervido no amortecedor da amostra em um gel de poliacrilamida-SDS e executado de acordo com o protocolo padrão da página até que o corante de referência (por exemplo, o bromofenol) atingiu o fim do gel de separação, seguido pela coloração Coomassie e a descoloração.
-
Coomassie Gel, coloração e descoloração.
- Uncast gel e manchá-la com solução coloração Coomassie (5% de uma solução estoque de Coomassie em 10% ácido acético e 45% de metanol em ddH2O 10g/L) para 20-30 min em RT em uma plataforma de agitação em movimento. O gel deve ser completamente coberto na solução de coloração.
- Destain o gel 2 - 3 vezes com destain solução (7,5% ácido acético e 15% metanol em ddH2O) para 1 h no RT, antes de deixar o gel O/N para mais descoloração.
Nota: Excesso Coomassie pode ser eficientemente embebido colocando toalhas de papel de cozinha em torno do gel.
- O gel com uma câmera ou câmera de escolha de imagem.
Nota: Expressão de Nanobody pode ser ainda mais validado pelo immunoblot análise usando anticorpos direcionando seus resumos (ver também figura 1A).
5. absorção de Nanobodies funcionalizados por culturas de células para a coloração de fluorescência
- Numa vizinhança de cultura celular, as células de HeLa semente ~ 400.000 a 500.000 estàvel expressar uma proteína GFP-etiquetado repórter sobre as lamelas de vidro de 18 mm (n º 1,5 H) em pratos de 35 mm ou 6-poços clusters com meio completo contendo antibióticos (meio Eagle modificado de Dulbecco, DMEM suplementado com 10% de soro fetal bezerro (FCS), 100 unidades/mL estreptomicina, 2 mM l-glutamina e puromicina 1,5 µ g/mL).
Nota: Aqui, usamos as células HeLa estàvel expressando EGFP-Calnexin, EGFP-CDMPR e TfR-EGFP para fins ilustrativos. Além de linhas de célula estável, podem ser usadas também transitoriamente transfectadas células HeLa. Linha celular estável pode ser co cultivada neste passo com parental não transfectadas células HeLa, por comparação direta. - Incube as celulas O/N a 37 ° C numa incubadora 7,5% CO2 a proliferar.
Nota: As células devem ter uma confluência de ~ 80% no dia seguinte. - Pipetar 2 µ l de uma solução de reserva de nanobody de 2 mg/mL em um tubo de 15 ou 50 mL contendo 2 mL de meio completo (este volume é suficiente para cobrir um prato de 35mm ou um bem de um cluster de 6-poço, ajustar o volume do meio e nanobody proporcionalmente para incluir mais d de cultura celular ishes ou clusters).
Nota: Para fins de ilustração, nós aqui usamos VHH-mCherry, desde que nenhuma mancha de anticorpo adicional é necessário para ver nanobody internalizada pelos repórteres EGFP (ver Figura 2). - Remover o meio de crescimento das células e adicionar 2 mL de meio completo escaldado contendo 2 nanobody µ g/mL acrescida por prato de 35mm ou unidade 6-poços.
- Incube as celulas para 1 h a 37 ° C numa incubadora 7,5% CO2 para permitir a absorção mediada por repórter nanobody.
Nota: Dependendo da experiência planejada, o tempo de absorção de nanobody precisa ser ajustada. Para o experimento mostrado aqui, 1h é suficiente para atingir o estado estacionário de absorção de nanobody pelo CDMPR-EGFP e TfR-EGFP. - Retire o meio e lave-as células de 2 - 3 vezes com 1 mL de 1X PBS em RT
- Consertar as células com 1 mL de 3% paraformaldeído (PFA) durante 10 minutos a RT
- Remover a solução PFA e saciar fixador restante com 1 mL de 50mm NH4Cl em 1X PBS durante 5 min à RT
Nota: 3% PFA deve ser descartado de resíduos separadamente como fixador. - Lavar as células 3 vezes com 1 mL de 1X PBS em RT
- Permeabilize as células com 1 mL de 0.1% Triton X-100 em 1X PBS durante 10 minutos a RT
Nota: Embora nenhum permeabilização é necessária, EGFP e mCherry de fluorescência é melhor quando depois que as células são incorporadas no meio de montagem. - Lavar as células 3 vezes com 1 mL de 1X PBS em RT
- Coloque as lamelas com pinças em uma gota (~ 100 µ l) de 1% de BSA em 1X PBS contendo 5 µ g/mL DAPI (4, 6-diamidino-2-phenylindole) durante 5 min à RT
- Coloque o prato/poço as lamelas e lavar 3 vezes com 1 mL de 1X PBS em RT
- Rotular as lâminas de vidro e montar as células com Fluoromount-G. Deixe o meio de montagem endurecer no escuro por 3-4 h e armazenar as lâminas de vidro a 4 ° C, sob a proteção de luz.
- Padrões de coloração usando um microscópio de escolha (por exemplo, ponto varredura Confocal microscópio vertical) da imagem.
6. absorção de funcionalizados Nanobodies por células cultivadas (para análise de sulfatação)
- Numa vizinhança de cultura celular, as células de HeLa ~ 400.000 a 500.000 estàvel expressar uma proteína GFP-etiquetado repórter em pratos de 35mm ou em clusters 6-poços com antibióticos contendo médios completos (meio de Eagle modificado de Dulbecco, DMEM, suplementado com 10% de vitela fetal da semente soro (FCS), 100 unidades/mL estreptomicina, 2 mM l-glutamina e puromicina 1,5 µ g/mL).
Nota: Como mencionado acima, nós aqui usamos células HeLa estàvel expressando EGFP-Calnexin, EGFP-CDMPR e TfR-EGFP para fins de ilustração. Além de linhas de célula estável, pode ser usado também transitoriamente transfectada HeLa. - Incube as celulas O/N a 37 ° C numa incubadora 7,5% CO2 a proliferar.
Nota: As células devem ter uma confluência de ~ 80% no dia seguinte. - Remover o meio completo, lave 2 vezes com 1X PBS em RT e morrer de fome as células com sulfato livre médio (SFM) por 1 h a 37 ° C numa incubadora 7,5% CO2 .
Nota: SFM é preparado pela adição de 10 mL de solução de MEM aminoácidos (50x), 5 mL de L-glutamina (200 mM), 5 mL da solução de vitamina (100 x) e 900 µ l de CaCl2·2H2O a 500 mL de sais equilibradas da águia. Passe por um 0,22 µm filtro e alíquota. - Em uma campânula ventilada ou banco designado para o trabalho de radioactividade, prepare sulfato de rotulagem meio contendo sulfato de sódio 0,5 mCi/mL [35S] como sal de sódio de SFM.
Atenção: Manipule com cuidado todas as soluções que contenham radioatividade. Só funcionam em capas designadas ou bancos. Todo material (dicas, tubos, chapas, etc.) ou buffers de lavagem em contato com a radioatividade tem que ser recolhidos e eliminados separadamente. Fazer isso para todas as etapas abaixo (passo 6.5-6.20) também. - Adicione VHH-2xTS em 1X PBS em sulfato de rotulagem médio para uma concentração final de 2 µ g/mL.
Nota: Como controle, também incluem o VHH-std ou outro nanobody desprovido de sites TS para demonstrar a rotulagem específica. - Substituir o SFM por 0,7 mL de sulfato de rotulagem contendo médio 0,5 mCi/mL [35S] sulfato e 2 µ g/mL VHH-2xTS e incube as celulas para 1 h a 37 ° C numa incubadora 7,5% CO2 designada para o trabalho com radioactividade.
Nota: Dependendo da experiência planejada, o tempo de nanobody sulfatação precisa ser ajustada. Além disso, para determinar a cinética de chegada TGN, rotulagem é executada para momentos diferentes (por exemplo, para 10 min, 20 min, 30 min, etc.). - Retire o meio de rotulagem e lave as células de 2 - 3 vezes com PBS 1x gelada sobre uma placa de refrigeração ou gelo.
- Adicionar 1 mL de tampão de lise (PBS contendo 1% Triton X-100 e 0,5% Deoxycholate do) suplementado com 2 mM PMSF e 1 x coquetel de inibidor de protease e incube as celulas por 10-15 min em uma plataforma de balanço a 4 ° C.
- Raspe e transfira o lisado em um tubo de 1,5 mL, vórtice o lisado e coloque por 10-15 min em um rotador completa sobre a 4 ° C.
- Preparar um pós-nucleares lisado por centrifugação a 10.000 x g durante 10 minutos a 4 ° C.
- Usando um novo tubo de 1,5 mL, preparar 20-30 µ l de uma suspensão de grânulos de níquel em um tubo de 1,5 mL e lave uma vez com PBS 1x por granulação-os delicadamente a 1.000 x g por 1 min.
Nota: Em vez de níquel, miçangas, contas de estreptavidina (se nanobody é biotinilado) ou grânulos de A proteína com uma IgG contra um epítopo da nanobody (T7 - ou HA-tag) podem ser usados. - Transferir o pós-nucleares lisado em um tubo de 1,5 mL contendo grânulos de níquel e incubar durante 1 h a 4 ° C em uma extremidade-sobre-extremidade rotador para isolar o nanobodies. Retire uma alíquota (50-100 µ l) do pós-nucleares lisada e ferva em tampão de amostra SDS para análise de immunoblot subsequentes de total associada a célula nanobody, repórter GFP e controle de carregamento.
- Lave os grânulos 3 vezes com tampão PBS ou lise 1x por granulação suavemente a 1.000 x g por 1 min.
Nota: Para lavar mais rigorosa dos grânulos, imidazol 20mm pode ser incluído em tampão PBS ou Lise. - Cuidadosamente remova tampão de lavagem todos os grânulos, adicionar 50 µ l de 2x do amortecedor da amostra e ferva por 5 min à 95 ° C.
- Carga ambos cozidos grânulos em um midi 12,5% SDS-PAGE gel e executado de acordo com o protocolo padrão da página até que o corante de referência (por exemplo, o bromofenol) atingiu o fim do gel de separação.
Nota: Immunoblot análise de total associada a célula nanobody, repórter GFP e controle de carga também pode ser realizada usando um mini 12,5% SDS-PAGE ou gel gradiente pré-moldado. - Corrigir o gel de separação em ~ 30 mL de tampão de fixação (10% de ácido acético e 45% metanol em ddH2O) por 1h no RT, lave o gel três vezes com ~ 50 mL de água desionizada e prepare-se para a secagem de gel.
-
Secagem geles de SDS-PAGE.
- Cuidadosamente coloque o gel fixo na película aderente esticada e cubra com papel de filtro pré-cortados.
- Coloque o gel com o papel de filtro para baixo sobre a plataforma de secagem, coloque a tampa de vácuo e ligar a bomba de vácuo para secagem do gel. Seca o gel para 3-5 h.
- Retire a película aderente e coloque o gel seco dentro de um estojo de autoradiografia, equipado com uma tela de fósforo.
- Autoradiograph de imagem usando um gerador de imagens de tela de fósforo. Siga as instruções do fabricante.
Nota: Dependendo da força do sinal, secas géis precisam ser expostos mais com écrans de fósforo.
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Representative Results
Para investigar o transporte retrógrado proteína para vários destinos intracelulares, nós temos estabelecido recentemente uma ferramenta baseada em nanobody de anti-GFP para rotular e siga as proteínas recombinantes de fusão entre a superfície celular30. Aqui, demonstramos a produção bacteriana de tais derivatizado nanobodies e demonstrar sua aplicação para estudar endocítica absorção por microscopia de fluorescência e immunoblotting, bem como a sua utilização para investigar a chegada de TGN por análise de sulfatação. O último aplicativo é o enfoque metodológico do presente protocolo.
Nós têm gerado uma caixa de ferramentas de nanobodies de diferentes anti-GFP funcionalizados com características comuns, clonagem molecular padrão30. Nossa mais simples nanobody (padrão), VHH-std, contém o domínio VHH, um T7 e um epítopo HA para a deteção subsequente por anticorpos específicos, um hexahistidine de carboxyterminal (His6)-marca para purificação e uma sequência de peptídeo (BAP) do aceitador de biotina para Biotinylation e alta afinidade streptavidin suspenso experimentos (figura 1A). Derivatização de VHH-std produz nanobody diferentes variantes para examinar endocítica captação e transporte retrógrado bioquimicamente, pela imagem latente da pilha fixos e ao vivo e por microscopia electrónica.
Para avaliar o tráfego de proteínas de membrana plasmática para o trans-Golgi/TGN, aproveitou-se da localização exclusiva do tyrosylprotein sulfotransferases esses compartimentos e assim modificado VHH-std com um site de sulfatação de tirosina do tandem (2xTS) derivado de rato procholecystokinin41. Enquanto a modificação do VHH-std com mCherry permite a visualização directa de transporte retrógrado por célula fixa e ao vivo de imagens, functionalization com uma peroxidase, tais como APEX237, permite estudos de microscopia eletrônica, compartimento citoquímicos ablação, ou reações biotinylation dependente da proximidade. Além disso, inserção de um local de clivagem para o tabaco etch protease do vírus (TEV) permite distinguir bioquimicamente intracelular e ligados a superfície nanobodies (figura 1A). Anteriormente nós usamos VHH-PEV para monitorar endocítica cinética reciclagem de nanobody-limite EGFP-CDMPR e TfR-EGFP30. Reaparecimento de Nanobody na superfície da célula após absorção podia ser avaliado simplesmente por perseguir com extracelularmente aplicada protease TEV recombinante, causando uma perda inversa de gaveta de epítopo do nanobody carboxyterminal. Incluindo um local de clivagem no mCherry ou APEX2 nanobody fusão é útil para estudar a cinética de reciclagem de repórteres EGFP por imagens de células vivas em uma maneira similar ao VHH-PEV, ou limitar citoquímicos reações aos compartimentos intracelulares, respectivamente. Functionalization com outros domínios da proteína (por exemplo, outros fluorophores ou enzimas) ou sequências de destino para outras modificações posttranslational podem ser facilmente alcançadas por subcloning uma inserção respectiva para o plasmídeo vetor codificação VHH-std (Veja também Tabela 1 para obter informações do plasmídeo) usando sites de restrição SpeI e EcoRI disponíveis.
Usando o protocolo como descrito acima, todos os nanobodies ilustrados aqui pode ser isolados de alta pureza e rendimento (figura 1B). Só mCherry fusões mostrou menor recorte de domínios da proteína pós purificação (figura 1B, consulte lanes 7-8). Na ausência de expressão de BirA, normalmente obtivemos 25-35 mg por VHH-std, VHH-2xTS e os seus homólogos do PEV-modificado, ou ~ 20 mg para VHH-APEX2 e VHH-mCherry e seus derivados que contenham tev. Nossa experiência mostra que BirA coexpression reduz o rendimento de nanobody em um terço a um meio.
Para ilustrar a absorção mediada por repórter nanobody, usamos linhas de célula HeLa estàvel expressando EGFP-Calnexin (CNX), EGFP-CDMPR e TfR-EGFP (Figura 2A e B). EGFP foi fundido à extremidade extracelular/lumenal de cada proteína (ou seja, entre o sinal e repórter sequência de CNX ou CDMPR) e para o carboxyterminus do TfR, deixando os sinais de classificação citosólico desobstruída. Todas essas moléculas de carga com tag EGFP têm diferentes itinerários de tráfico intracelulares após ER direcionamento. Desde EGFP-Calnexin é residente na emergência e normalmente não alcança compartimentos post-Golgi, serve como um controle negativo para a absorção de nanobody potencial e inespecífica. Em contraste, tanto EGFP-CDMPR e TfR-EGFP têm funções de transporte além do Golgi e, assim, constantemente aparecem na membrana plasmática. Como esperado, quando VHH-mCherry foi adicionado para uma população mista de não modificado HeLa e celulas que expressam estàvel EGFP-CNX, não internalização de nanobody podia ser observada em ambos os casos. No entanto, ambos EGFP-CDMPR e TfR-EGFP capturaram VHH-mCherry na superfície da célula e os transportou às cavalitas para compartimentos de localização do repórter (Figura 2).
VHH-mCherry colocalization com um marcador TGN residente poderia ser usada em princípio para avaliar chegada TGN. Ainda, nós estabelecemos uma abordagem bioquímica baseada na sulfatação de tirosina. Para aproveitar essa modificação ocorre na trans-Golgi/TGN, nanobodies foram acrescida com sites de TS (figura 1A). Para demonstrar a especificidade e a funcionalidade destas pastas de proteína, estamos incubados não modificadas células HeLa e celulas que expressam estàvel EGFP-CNX, EGFP-CDMPR e TfR-EGFP com VHH-std ou VHH-2xTS por 1h na presença de sulfato radioativo. Radioativos de VHH-2xTS ocorre somente quando um repórter transporta o nanobody retrogradely para o TGN exposto para a maquinaria de sulfatação de tirosina. HeLa, expressando suas células parentais e EGFP-CNX exibe nenhuma absorção de nanobody e, portanto, sem sulfatação. Ambos EGFP-CDMPR e TfR-EGFP internalizada nanobodies, este último consideravelmente mais do que o anterior. No entanto, apenas EGFP-CDMPR causada VHH-2xTS ser sulfatados (Figura 3A). Isto confirma o eficiente transporte retrógrado de CDMPR da superfície da célula para o TGN e fornece provas contra TfR, retornando para o TGN (como foi sugerido em alguns estudos42,43).
Cinética da internalização e TGN chegada de proteínas repórter também podem ser determinados através da análise de lisados celulares após diferentes tempos de absorção de nanobody e sulfatação. Usando EGFP-CDMPR como repórter, encontramos sulfatação iniciar somente após um período de defasagem de ~ 15 min e atingir a saturação só depois > 75 min (Figura 3B, faixas 1-6 e C, símbolos quadrados). Cinética de absorção e sulfatação apareceu deslocada por quase 30 min, refletindo o transporte para o TGN. Além disso, o método permite investigar a classificação máquinas envolvidas no transporte MPR por interferência farmacológica ou proteína silenciar abordagens tais como knocksideways, nocaute ou nocaute. Aqui, nós costumávamos brefeldin A (BFA), um inibidor de factores de intercâmbio de nucleotídeo guanina (GEFs) de vários Arf GTPases, para geralmente interferir com transporte retrógrado para o TGN. Quando tratados com BFA, sulfatação foi abolida completamente, enquanto captação permaneceu inalterada em cinética e em extensão (Figura 3B, faixas 7-12 e C, símbolos redondos).
Figura 1: concepção e produção de nanobodies funcionais para rastrear as proteínas de superfície celular modificado EGFP. (A) representação esquemática do pyrazole nanobodies. O padrão nanobody consiste no domínio específico GFP VHH, T7 e Tag do resumo HA, um BAP e uma marca de purificação de hexahistidine (His6). Outros nanobodies além disso compreendem dois TSs, APEX2 ou mCherry, cada um com ou sem um local de clivagem por protease do PEV (tev). Barra de escala é em aminoácidos (aa). (B) cloroplasto expressas e nanobodies purificados (50 μg) foram analisados por eletroforese em gel de SDS gradiente e corados com Coomassie. Proteínas de marcador com massa molecular em kDa são mostradas à esquerda. Só o VHH-mCherry e o VHH-tev-mCherry mostraram recorte mínimo entre o VHH e os domínios de mCherry. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: captação e localização intracelular do VHH-mCherry por diferentes proteínas de repórter EGFP. (A) representação esquemática de proteínas da fusão EGFP. Sequências derivadas de proteínas de membrana secretora são mostradas em preto com peptídeos de sinal do N-terminal e segmentos transmembranares internos em amarelo, e EGFP é ilustrado em verde. EGFP foi fundido a longa-metragem CDMPR, TfR e Calnexin (CNX). Barra de escala em aminoácidos (aa). CDMPR-EGFP e TfR-EGFP têm sido descritos30. (B) HeLa foram colhidas células estàvel expressando proteínas de repórter EGFP, lysed e analisado por eletroforese em gel de SDS e immunoblotting com anticorpos anti-GFP e anti actina. Massa molecular em kDa é indicada à direita. (C) HeLa células estàvel expressando o repórter EGFP-tag proteínas foram misturadas com as células HeLa parentais, incubadas com 5 μg/mL VHH-mCherry (~ 100 nM) para 1 h a 37 ° C e processadas para microscopia de fluorescência. Barra de escala = 10 μm. Absorção ocorre somente por células expressando um repórter com EGFP exposto na superfície da célula. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: análise de sulfatação e cinética de transporte retrógrado para o TGN usando TS-com a tag nanobodies. (A) Parental e HeLa células expressando estàvel repórter EGFP-modificado proteínas foram rotuladas usando sulfato de sódio 0,5 mCi/mL [35S] para 60 min com 2 μg/mL VHH-std ou VHH-2xTS. Nanobodies foram isolados usando grânulos de níquel, separados em um 12,5% SDS-PAGE seguido por autoradiografia. Alíquotas de lisados celulares foram coletadas antes da tração de níquel para baixo e immunoblotted para celular-associado nanobody (His6), EGFP e actina. (B e C) as células HeLa estàvel expressando EGFP-CDMPR foram rotuladas com sulfato de sódio 0,5 mCi/mL [35S] para até 75 min. na presença de μg/2ml VHH-2xTS com e sem 2 μg/mL BFA antes da análise como em (A). Quantificação da captação VHH-2xTS e sulfatação de três experimentos independentes é mostrada em percentagem do valor sem BFA depois de 75 min (média e SD). Quadrados pretos, sem BFA; círculos cinzas, com BFA; Abra símbolos, absorção; cheia de símbolos, sulfatação. Esta figura foi modificada e estendida de Buser et al., 2018, PNAS30. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela 1: sequências de proteínas do nanobodies funcionalizados mostrado neste estudo. Epítopo T7 em cinzento, VHH em preto, HA epítopo em azul, sequência BAP em laranja, hexahistidine (His6) em vermelho, o local de clivagem de protease TEV em roxo, o myc epítopo em magenta, a sulfatação tirosina sequenciar em amarelo, APEX2 em verde e mCherry-de-rosa. Os vetores de expressão codificação estes anti-GFP funcionalizados nanobodies tenham sido depositados (ver também a tabela 1 para obter informações do plasmídeo). Clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
Nanobodies representam uma classe emergente de andaimes de proteína ligante com muitas vantagens sobre anticorpos convencionais: eles são pequenos, estável, monomérico, podem ser selecionados para alta afinidade e falta dissulfeto títulos33,35, 44 , 45. são usados em muitas aplicações, tais como nos sistemas de cultura de células e organismos em biologia do desenvolvimento46,47,,48,,49, como cristalização controla a estabilizar estados conformacionais em biologia estrutural50,,51,52,53, como inibidores ou moduladores da atividade de enzimas54,55, 56, como reagentes de imuno-histoquímica para análises bioquímicas57, ou como "nanobodies secundária" para detectar imunoglobulinas anti-rato e anticoelho na immunoblots e imunofluorescência58. Em nosso estudo anterior, temos desenvolvido e aplicado funcionalizados nanobodies produzido pela expressão bacteriana de proteínas de superfície-rótulo e rastrear sua rota intracelular para vários compartimentos, em particular para o TGN30. Fazíamos um anti-GFP nanobody a ferramenta versátil, capaz de proteínas alvo da fusão com GFP extracelular, YFP ou mCerulean que pode já estar disponível e caracterizadas. Modificação de anti-GFP nanobodies com mCherry, APEX2 ou TS sites nos permitiu monitorar captação de repórter pela imagem latente da pilha de fixos e ao vivo, para ultrastructurally Visualizar compartimentos de transporte retrógrado, para retirar esses compartimentos, ou para estudar o transporte cinética para o TGN. Uma desvantagem da nossa ferramenta é que recombinante modificação de linhas de células alvo (expressão estável ou endógena de marcação) é necessária antes funcionalizados anti-GFP nanobodies pode ser aplicado. Functionalization claro pode ser também aplicado para o número rapidamente crescente de nanobodies dirigido contra as proteínas alvo endógena sem marcas de formatação estabelecidas pela imunização animal ou pela seleção Ribossoma-exposição e exibição do fago do VHH sintético bibliotecas de59. Usando nanobodies modificado com sites de TS (por exemplo, VHH-2xTS), podemos diretamente medir transporte e cinética da chegada de TGN de proteínas do alvo diversificado EGFP-modificado. Nós aplicamos VHH-2xTS para estudar a contribuição da proteína do adaptador 1 complexo (AP-1) no transporte retrógrado do MPRs por análise cinética direta nas células knocksideways, permitindo rápida inativação do determinado transporte máquinas30. Nanobody sulfatação e retrógrada, portanto, transporte de EGFP-rotulado MPRs foi parcialmente, mas não completamente bloqueado. Nossa abordagem baseada em nanobody usando sulfatação como sensor de chegada TGN confirmou resultados anteriores de outros laboratórios indicando uma contribuição funcional do AP-1 em transporte retrógrado do endossomo-para-TGN17,60, 61. Nanobodies sulfatable, portanto, pode fornecer uma ferramenta útil e bioquímica para dissecar a contribuição de outras máquinas de transporte retrógrado, como epsinR, Rab9/TIP47 ou SNX-BAR/retromer complexos, proteínas de carga por manipulações de genômicas, genéticas ou químicas. O protocolo apresentado aqui oferece uma base de como pode-se fazer usar de nanobodies funcionais em geral para determinar compartimentos de destino, caminhos e cinética em pilhas de transporte.
Outros grupos já fizeram uso de TS sites para acompanhar o transporte da célula de superfície para o TGN. Subunidades de toxina ricina, Shiga ou coqueluche anteriormente foram modificadas com sites de sulfatação para demonstrar uma rota de transporte através da TGN62,63,64,,65,66. Além disso, peptídeos TS tinham também sido quimicamente acoplados ao IgGs a ensaiar o transporte retrógrado de GFP-CIMPR e TGN46 endógeno para o TGN67,68. Nossas nanobodies sulfatable têm a vantagem de produção bacteriana simples e reprodutível e de uma estequiometria de 1:1 com a proteína do alvo. Pelo contrário, por exemplo é bem sabido que ligantes de proteína divalentes, tais como IgGs, lata crosslink proteínas de superfície de células e alteram seu tráfico intracelular de lisossomos após endocitose69,,70, destacando o significado de aglomerantes de proteína monomérica com respeito a métodos existentes. Uma etapa fundamental de nossa técnica é que a manipulação com radioactividade é necessário para executar a rotulagem de sulfato de nanobodies. No entanto, nossa ferramenta de nanobodies funcionalizados com sites de TS para estudar a chegada de TGN pode potencialmente ser aplicada sem radioatividade usando anticorpos anti-sulfotyrosine.
Nosso estudo anterior sugere que sulfatação nanobody não são muito eficientes, desde que a sulfatação do MPRs ainda não tinha chegado no máximo depois de 75 min, apesar de captação de nanobody estava saturada após 45 min30. Triagem para outros sítios naturais de TS pode melhorar a eficiência de sulfatação. Como alternativa, para potencialmente melhorar a eficiência de sulfatação, componentes da maquinaria sulfatação em si, como TPST1 e TPST2, podem ser overexpressed. Com efeito, anteriormente mostrou que a superexpressão de dentre os transportadores entregando 3'-phoshoadenosine-5'-phosphosulfate (PAPS), o substrato para a TPSTs, do citosol para o lúmen do Golgi poderia alterar o status de sulfatação de proteoglicanos 71.
Além de sulfatable, nanobodies, outros derivatizations também permitem transporte de rastreamento por compartimentos endocítica e para o TGN. APEX2 pode ser aplicada como uma enzima promíscua de rotulagem para biotinylation dependente da proximidade para análise proteômica de transporte retrógrado. Nanobody de APEX2 que é internalizada por um repórter de carga de interesse rotulará proteínas na proximidade dentro dos compartimentos do alvo. Proteômica comparativa deve permitir identificar outras proteínas endógenas nos diferentes tipos de endossomos e o TGN que acessa o nanobody. Muitas variações de nanobodies em combinação com a proteína do alvo são concebíveis. Um relatório recente, por exemplo, aplicada uma abordagem invertida para aquele descrito aqui: pyrazole GFP foi usado para estudar e armadilha anti-GFP celularmente expressa nanobody-tag vacuolar classificação receptores no anterógrada e retrógrados compartimentos da planta de sistema endomembranoso72. Da mesma forma, funcionalizadas nanobody-armadilhas podem ser criadas em sistemas de cultura de células de mamíferos para capturar e acumular repórteres EGFP-modificado em compartimentos diferentes durante o transporte retrógrado.
Nossa aqui apresentado método e protocolo com o foco na TS local-com a tag nanobodies permite o acompanhamento quantitativo e qualitativo das proteínas de carga de superfície celular para compartimentos endocítica e o TGN em culturas de células de mamíferos.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por Grant 31003A-162643 pela Fundação de ciência nacional suíço. Agradecemos a Nicole Beuret e o Biozentrum Imaging Core Facility (IMCF) pelo apoio.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-GFP antibody | Sigma-Aldrich | 118144600001 | Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche |
| Anti-His6 antibody | Bethyl Laboratories | A190-114A | |
| Anti-actin antibody | EMD Millipore | MAB1501 | |
| Goat anti-rabbit HRP | Sigma-Aldrich | A-0545 | |
| Goat anti-mouse HRP | Sigma-Aldrich | A-0168 | |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | dissolved in 1x PBS/1%BSA |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Applichem | A3672 | |
| D-biotin | Sigma-Aldrich | B4501 | dissolved in sterile 500 mM NaH2PO4 or DMSO |
| 5-aminolevuilnic acid (dALA) hydrochloride | Sigma-Aldrich | A3785 | dissolved in sterile water |
| DNase I | Applichem | A3778 | dissolved in sterile water |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | 18037059001 | Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche |
| Brefeldin A (BFA) | Sigma-Aldrich | B5936 | |
| Puromycin | Invivogen | ant-pr-1 | |
| Penicillin/Streptomycin | Bioconcept | 4-01F00-H | |
| L-glutamine | Applichem | A3704 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Biowest | S181B-500 | |
| Sulfur-35 as sodium sulfate | Hartmann Analytics | ARS0105 | Product contains 5 mCi |
| Earle's balanced salts | Sigma-Aldrich | E6267 | |
| MEM amino acids (50x) solution | Sigma-Aldrich | M5550 | |
| MEM vitamin solution (100x) | Sigma-Aldrich | M6895 | |
| cOmplete, Mini Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | 11836153001 | Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche |
| Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) | Applichem | A1008 | dissolved in sterile water, stock is 1 M |
| Carbenicillin disodium salt | Applichem | A1491 | dissolved in sterile water, stock is 100 mg/mL |
| Kanamycin sulfate | Applichem | A1493 | dissolved in sterile water, stock is 100 mg/mL |
| Coomassie-R (Brilliant Blue) | Sigma-Aldrich | B-0149 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Applichem | A3813 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Ni Sepharose High Performance | GE Healthcare | 17-5268-01 | |
| His GraviTrap columns | GE Healthcare | GE11-0033-99 | |
| His buffer kit | GE Healthcare | GE11-0034-00 | |
| Disposable PD10 desalting columns | GE Healthcare | GE17-0851-01 | |
| Mini-Protean TGX gels, 4-20%, 15-well | Bio-Rad | 456-1096 | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) w/o Ca2+/Mg2+ | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| 35 mm dishes | Falcon | 353001 | |
| 6-well plates | TPP | 92406 | |
| Glass coverslips (No. 1.5H) | VWR | 631-0153 | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Applichem | A0999.0025 | dissolved in 40% DMSO 60% isopropanol, stock in 500 mM |
| Tryptone | Applichem | A1553 | |
| Yeast extract | Applichem | A1552 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Merck Millipore | 105833 | dissolved in sterile water, stock is 1 M |
| Calcium chloride dihydrate | Merck Millipore | 102382 | dissolved in sterile water, stock is 1 M |
| Sodium chloride | Merck Millipore | 106404 | dissolved in sterile water, stock is 5 M |
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