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Biochemistry

取り込みと培養細胞における機能性 Nanobodies を用いたトランスゴルジ ネットワークへの逆行性輸送の解析

Published: February 21, 2019 doi: 10.3791/59111
Automatic Translation
1, 1
1Biozentrum, University of Basel

Summary

ゴルジ体細胞表面からタンパク質の逆行輸送は膜の恒常性を維持するために不可欠です。ここでは、HeLa 細胞における機能性 nanobodies を用いた組換えタンパク質の細胞表面にゴルジ体輸送を生化学的解析法について述べる。

Abstract

タンパク質とゴルジ体内外細胞表面膜の輸送は、恒常性、細胞小器官アイデンティティおよび生理学に不可欠です。逆行性プロテイン トラフィックを研究、細胞表面から固定しライブの細胞イメージング、電子顕微鏡検査、または生化学的、ゴルジ複合体への輸送を分析するための多彩な生物学: ナノボディでベースのツールキットを最近開発しました。我々 設計機能抗緑の蛍光蛋白質 (GFP) nanobodies-小さな、単量体、高親和性タンパク質バインダー-細胞外の GFP 部分と利子の膜蛋白質を表現する細胞へ適用することができます。GFP レポーターにバインドし誘導体化 nanobodies 具体的に内在化されているし、記者の並べ替えルートに沿ってピギーバック輸送。Nanobodies 蛍光顕微鏡による逆行性輸送に従うとライブ イメージング、アスコルビン酸ペルオキシダーゼ 2 電子記者生物学: ナノボディで複合体の電顕的局在を調べる (APEX2) fluorophores が付いている修飾されました。顕微鏡とトランスゴルジ ネットワーク (TGN) 到着の動態を評価するためにチロシン硫酸化 (TS) をモチーフにしました。この方法論の記事で細菌によって表現し、機能性 nanobodies を浄化する一般的な手順の概要を説明します。取り込みや TGN 到着貨物蛋白質を分析する mCherry と TS 変更 nanobodies を使用して私たちのツールの強力な使用をについて説明します。

Introduction

タンパク質や細胞表面からさまざまな細胞内コンパートメントに脂質の逆行のトラフィックは分泌を相殺して前向性輸送機械1のコンポーネントを再利用する膜の恒常性の維持のために重要,2内面化クラスリン依存または独立したエンドサイトーシスを介して、以下貨物蛋白質と脂質を設定初期エンドソームからさらには細胞膜にリサイクル、遠藤ライソゾーム システムに沿っていずれかをリダイレクト。または、トランスゴルジ ネットワーク (TGN) にターゲットを絞った。前向性膜貫通貨物受容体、カチオン依存性および陽イオンに依存しないマンノース-6-リン酸受容体 (CDMPR ・ CIMPR) などの多数の機能サイクルの一部である、TGN にエンドソームや細胞表面からリサイクルを提供します。後期エンドソーム、リソソーム3,4、5ソーティリンと SorLA6、7トランスゴルジ (WLS) 細胞表面に Wnt リガンドを輸送、TGN からライソゾーム加水分解酵素を合成しました。8,9,10,11.、TGN に戻るを取得する他の蛋白質は TGN46 とその関連アイソ フォーム12,13,14スネア (可溶性Nエチルマレイミド感受性融合因子添付ファイル受容体)15,16,17、アミロイド前駆体タンパク質 (APP)18,19、進歩的な強直 (アンク) 蛋白質20、金属トランスポーター ATP7A/B または DMT121,22, などと膜貫通酵素カルボキシペプチダーゼ D、風鈴 BACE123,24,25などを処理します。これらの内因性のタンパク質から離れて細菌植物毒素 (例えば、滋賀とコレラ毒素、リシン、アブリン) ハイジャックに細胞質26,27、retrotranslocation の小胞体に到達する逆行輸送機械 28,29。

逆行性のトラフィックを直接分析するために以前にラベルを貨物蛋白質を細胞表層から細胞内コンパートメント30に従ってください生物学: ナノボディでベースのツールキットを開発しました。Nanobodies は、タンパク質バインダー量重鎖だけ抗体 (hcAbs) ラクダ科動物、軟骨魚類の31,32で発生する自然由来の新しいファミリを表します。HcAbs の変数の重鎖のドメイン (VHH) を構成し、従来の抗体 (Igg など) に比べて多くの利点がある: 彼らは単量体、小さな (~ 15 kDa)、非常に溶ける、二硫化物結束を欠いている細菌によって表される、選択することができます高親和性結合33,34,35,36。私たちの生物学: ナノボディでツールをするためには、汎用性と広く適用/内腔細胞外ドメインに GFP が付いた表面ラベルとトラックのタンパク質機能抗 GFP nanobodies を採用しました。(APEX2) アスコルビン酸ペルオキシダーゼ 2 mCherry と nanobodies の機能化によって真正な貨物の膜貫通タンパク質の37、またはチロシン硫酸化 (TS) シーケンスの逆行輸送どちらか固定で分析することができますなど、ライブセル イメージングで電子顕微鏡検査、または生化学的。チロシン硫酸化チロシン硫酸化硫酸転移酵素 (TPST1 および TPST2) で媒介はトランス Golgi に制限修飾 TGN、直接勉強できるトランスポートおよびこれに細胞表層の興味の蛋白質の動態/細胞ゴルジ区画38,39,40。

この方法の記事で哺乳類セル30における逆行性輸送を分析するアプリケーションの数に適した機能性 nanobodies (VHH 2xTS、- APEX2、- mCherry 誘導体) の生産の容易さについて述べる。我々 は主に硫酸化のコンパートメントに細胞表層から細胞内トラフィックの分析のための TS サイト変更生物学: ナノボディでの使用に焦点を当てます。

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Protocol

1. 細菌変換機能 Nanobodies

注:このプロトコルは、前述の30式、浄化、機能性抗 GFP nanobodies の解析に最適化されています。他の蛋白質の鎖誘導体化は、この標準的なプロトコルの変更を必要があります。

  1. 蛋白質の表現に適しています chemocompetent 細菌 (~ 100 μ L) を解凍 (例えば、エシェリヒア属大腸菌ロゼッタ BL21 (DE3) 細胞) 氷の上にそれらを配置することによって。
    注:Chemocompetent 標準的な実習の手順に従って細菌セルを準備します。また、化学的に有能な細菌セルも市販することができます。
  2. 50 追加エンコード機能 nanobodies プラスミドの ng。生物学: ナノボディで記者のサイト固有ビオチン化十分な細菌の表現の中に、また追加三重過剰 (150 ng) ビオチン リガーゼ ・ ビラをエンコーディング細菌発現プラスミドの (また見なさいテーブル 1プラスミドについて)。優しく上下ピペット。
    注:生物学: ナノボディでビオチン化は必要ではありませんまたは生物学: ナノボディで記者がビオチン受容体ペプチド (BAP) を欠いているが、エンコード ・ ビラ プラスミドと共同の変換は必要ありません。
  3. 氷の上で 30 分間細菌細胞を孵化させなさい。
  4. 熱水浴または加熱ブロックの 42 ° C で 1 分のそれらを配置することによって細菌の細胞に衝撃を与えます。
  5. 室温 (RT) の 1 つの mL を追加ルリア スープ (LB) 媒体と抵抗性遺伝子の形質発現を許可する 37 ° C で 1 時間の thermoshaker で変換された細菌を孵化させなさい。1 L LB を準備するには、中、バランス 5 g 酵母の抽出、10 g トリプトンと, 塩化ナトリウム 10 g を水で埋めるし、オートクレーブに入れることによって殺菌しなさい。場合機能生物学: ナノボディでいるされて subcloned アンピシリン/carbenicillin への抵抗を含む表現のベクトルで、1.5 のステップを省略できます。
  6. 1 分 11,000 x gで細菌を餌し、新鮮な LB 培地の 100 μ L で再懸濁します。
  7. (例えばで 50 μ g/mL カナマイシンおよび 50 μ G/ml carbenicillin (ステップ 1.2) 上記のように細菌は co 生物学: ナノボディで記者と・ ビラ変形させたきたとき) それぞれの抗生物質を含んでいる LB の版に浮遊菌をプレートします。
  8. 37 ° C でインキュベーターでポンドのプレートを配置し、成長させる一夜 (O/N)。
    注:プロトコルは 4 ° C で成長したコロニーで LB プレートを格納することによってここで一時停止できます。ポンドのプレートをシールにパラフィルムを使用します。

2. 細菌の液体培養と機能生物学: ナノボディで式の誘導

  1. プレートからの興味のベクトルを含む細菌のコロニーをピックアップし、抗生物質 O/N 37 ° C で動揺のインキュベーターで LB 培の 20 mL の入ったフラスコを育てましょう (ステップ 1.7 選択の抗生物質についても参照)。
  2. 次の日は選択の抗生物質で LB 培地 1 L フラスコに成長 20 mL の細菌培養を希釈します。
  3. 37 ° C で培養をインキュベート 0.6 〜 0.7 の OD600に達するまで続けます。タンパク質の発現を誘導する前に RT にクールダウンする文化を許可します。
  4. 1 M イソプロピル-β-d-thiogalactopyranosid (IPTG) (1:1, 000 の希釈) インデューサの 1 mM の最終的な集中の 1 mL の添加により機能性 nanobodies ・ ビラのタンパク質発現を誘導します。また官能 nanobodies (また見なさいテーブル 1プラスミドについて) に BAP エピトープのビオチン化できるように培地に 200 μ M d ビオチンの結果 20 mM d-ビオチン ストック溶液 10 mL を追加します。
    注:D-ビオチン原液は ddH2O し 500 mM NaH2PO4の添加によってソリューションに持ち込まれました。また、d-ビオチンは、DMSO で溶解することができます。Nanobodies APEX2 に融合を生成する (VHH APEX2)、ヘムの結合を促進するため 1 mM 5-アミノレブリン酸 (ダラ) 塩酸 LB 培地を加えて補完必要があります。ダラを作製し、100 mM の原液 ddH2o.
  5. 1 L の IPTG 誘導培養 VHH 2xTS 4 h の 30 ° c、20 ° C または RT O/N VHH APEX2、および 16 をインキュベート ° C O/N VHH mCherry (また見なさいテーブル 1プラスミドについて)。
    注:新しい生物学: ナノボディでコンス トラクターの式の条件は、実験者によって最適化されなければなりません。
  6. 1 L 遠心ボトルにフラスコから細菌培養を転送し 4 ° C、45 分上清をデカントで 5,000 × gで細胞のペレット、浄化が続きます。
    注: プロトコルは、-80 ° C で細菌のペレットを無期限に格納することによってここで休止できます。VHH APEX2 または VHH mCherry 用ペレットは、それぞれ (のために組み込まれたヘム) 茶色やピンク、通常。

3. 機能性 Nanobodies の精製

  1. 必要に応じて、解凍冷凍氷細菌ペレット (2.6 の手順を参照してください)。
  2. 細菌の細胞ペレットに 30 mL の冷たい結合バッファー (1 × PBS で 20 mM のイミダゾール) を追加し、上下にピペッティングによって再懸濁します。ラベル付きの 50 mL チューブに再懸濁の細菌を転送します。
  3. 30 mL の結合バッファー 200 μ G/ml リゾチーム、20 μ G/ml DNase を私、1 mM MgCl2 1 mM 特異フッ化物 (PMSF) 最初の常温では、10 分放置、エンド オーバー エンド シェーカー 4 ° C で 1 時間インキュベートを補足。
  4. 機械的に懸濁液に先端の超音波発生装置を置くことで 50 mL のチューブの細菌細胞を溶解させます。1 分冷却期間の間一定の 3 x 1 分パルスを適用します。
  5. 細菌の破片とそのままなセルのペレットへ 45 分の 4 ° C で 15,000 × gで lysate を遠心します。どちらの遠心分離に適切な遠心ボトルに熱量の細菌細胞ライセートを転送または卓上遠心分離のためのいくつかの 5 mL チューブにライセートを分割します。
  6. 新しい 50 mL のチューブに上清を移すし、小球形にされた破片を破棄します。
  7. クリアを格納固定化金属アフィニ ティー ・ クロマトグラフィー (IMAC) で浄化を準備しながら氷の溶解液。ヒスチジン-タグ付け機能性 nanobodies を分離する採用単回使用 (材料表参照) 彼の列高速かつ単純な重力流浄化を許可します。
    注:また、商業列の代わりにバッチ浄化を使用してすることができますも。
  8. 金属製のスタンドで彼のコラムに装着します。
    1. 列のストレージ ソリューションは、先細りし、彼を平衡 10 ml の結合バッファー (1 × PBS で 20 mM のイミダゾール) の列。
    2. 重力流 (流れを破棄することができます) によって空。
  9. 徐々 にロード、クリアされた細菌ライセート (~ 30 mL) 列に。重力流 (流れを破棄することができます) によって空。
  10. 彼を洗う 2 列 x 10 mL の結合バッファー (1 × PBS で 20 mM のイミダゾール)。
  11. 2 mL の溶出バッファー (1x PBS で 500 mM のイミダゾール) と nanobodies を 2 mL チューブに溶出し、バッファー交換を適用します。
  12. バッファー交換。
    1. 平衡、脱塩 5 mL の 1x PBS で 5 回 50 mL チューブ列アダプターに配置されて列 (材料の表を参照してください)。
    2. 充填層を入力するバッファーを許可します。流れを破棄します。
    3. 5 番目の PBS 平衡後 1,000 x g 2 分の位置にある列をスピンします。
    4. 流れを破棄します。
    5. 新しい 50 mL チューブにアダプターを持つ列を配置します。溶出機能生物学: ナノボディで (ステップ 3.11) から PBS 平衡脱塩カラムと 2 分間 1,000 x gでスピンに 2 mL を負荷し、溶出液を収集します。
      注:商業の脱塩列の代わりに、バッファー組成を交換する透析を適用できます。
  13. ビシンコニン (BCA) または製造元の指示に従ってブラッドフォードの試金を使用して溶出液のタンパク質 (生物学: ナノボディで) 濃度を決定します。
    注:GFP レポーター細胞株による生物学: ナノボディで取り込みアッセイ、2 ~ 10 mg/mL のストック濃度が最適です。

4. 機能性生物学: ナノボディで式 (クマシー染色) の検証

  1. ナトリウム ドデシル硫酸ポリアクリルアミド電気泳動 (SDS-PAGE) 標準のプロトコルに従って 10 12.5% ゲルを準備します。
    注:また、市販のプレキャスト勾配ゲルを使用します。
  2. 1.5 mL チューブにサンプル バッファー 95 ° C、5 分で沸騰機能生物学: 精製ナノボディでのピペット 20 μ g。
    注:例として 2 x サンプルバッファーの 10 μ L で 1.5 mL チューブに 2 mg/mL 生物学: ナノボディで原液の 10 μ L を追加します。ボリュームが小さすぎる場合、さらにサンプルバッファーを追加する前に PBS で生物学: ナノボディでを希釈する必要があります。
  3. SDS ポリアクリルアミドのゲルにサンプル バッファーで煮て精製生物学: ナノボディでをロードし、参照色素 (例えば、ブロモフェノール ブルー) がクマシー染色後、分離ゲルの終わりに達するまでページの標準プロトコルに従って実行し、染め色。
  4. Coomassie ゲル染色と染め色。
    1. ゲルを uncast、Coomassie 染色液 (10 g/l ddH2O 10% 酢酸と 45% メタノールで Coomassie 原液 5%) 移動動揺のプラットホームの RT で 20-30 分のためにそれを汚します。ゲルは、染色液で完全にカバーされなければなりません。
    2. 脱色する 2-3 回とさらに染め色の O/N ゲルを離れる前に常温では、1 時間のためのソリューション (ddH2O で 7.5% 酢酸と 15% メタノール) をすすぐ。
      注: 過剰 Coomassie できますに効率的に浸しゲルの周りキッチン ペーパー タオルを置くことによって。
  5. 画像を撮像素子やカメラで選択のゲル。
    注:生物学: ナノボディで式は、(また見なさい図 1 a) 抗体のエピトープをターゲットを用いたイムノ プロット解析でさらに検証できます。

5. 培養細胞の蛍光染色による機能性 Nanobodies の取り込み

  1. 種子 ~ 400,000 に 500,000 HeLa 細胞の抗生物質 (ダルベッコ イーグルの変更中、DMEM を含む完全培地で 18 mm ガラス coverslips (号 1.5 H) 35 mm 料理または 6 ウェル クラスターでの記者の GFP 付けられた蛋白質を安定に発現する細胞文化フードで10% 牛胎児血清 (FCS)、100 単位/ml ストレプトマイシン、2 mM l-グルタミン、、ピューロマイシン 1.5 μ G/ml を添加した)。
    注:ここでは、説明のため EGFP カルネキシン、EGFP CDMPR、TfR EGFP を安定発現 HeLa 細胞を使用してください。安定したセルラインから離れても一時的に transfected HeLa 細胞を使用できます。安定したセルラインは直接比較のため、親非導入 HeLa 細胞でこの手順で共同栽培することができます。
  2. 増殖する 7.5% CO2インキュベーターで 37 ° C でセル O/N を孵化させなさい。
    注:セルは、次の日に 〜 80% の confluency に必要です。
  3. 2 ピペット 2 mL の完全培地を含む 15 または 50 mL のチューブに 2 mg/mL 生物学: ナノボディで原液の μ L (このボリュームは 35 mm ディッシュや 6 もクラスターの 1 つの井戸をカバー、媒体の生物学: ナノボディでより多くの細胞文化 d を含むように比例して音量を調整するための十分な幸せ経済社会研究またはクラスター)。
    注:例示では、我々 ここで使用 VHH-mCherry、さらに抗体の汚損の生物学: ナノボディで (図 2を参照) EGFP 記者によって内面化を参照してくださいする必要はありませんので。
  4. 細胞から成長培地を削除し、35 mm ディッシュまたは 6 ウェル単位あたり 2 μ g/mL 機能生物学: ナノボディでを含む prewarmed 完全培地 2 mL を追加します。
  5. 細胞生物学: ナノボディで記者を介した通風管を許可する 7.5% CO2インキュベーターで 37 ° C で 1 時間インキュベートします。
    注:計画の実験によって生物学: ナノボディで取り込みの時は調整が必要です。ここに示す実験の 1 h は EGFP CDMPR、TfR EGFP の生物学: ナノボディで吸収の定常状態に到達するのに十分です。
  6. メディアを取り出して、1 mL の 1x PBS 室温で 2-3 回セルを洗浄して
  7. 1 ml 室温 10 分間 3% パラホルムアルデヒド (PFA) のセルを修復します。
  8. PFA ソリューションを削除し、1 ml 50 mM NH4室温 5 分 1x PBS で Cl の残り定着剤を癒す
    注: 3 %pfa 別途として定着性廃棄物処分すべき。
  9. 1 mL の 1x PBS 室温で 3 回セルを洗浄して
  10. 1 ml 0.1% のセルを permeabilize 室温 10 分の 1 × PBS でトリトン X-100
    注:透過は不要です、その後セルは、メディアをマウントに埋め込まれているとき EGFP と mCherry の蛍光は良いです。
  11. 1 mL の 1x PBS 室温で 3 回セルを洗浄して
  12. 室温 5 分の 5 μ g/mL DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole) を含む 1x PBS で 1 %bsa のドロップ (~ 100 μ L) の鉗子で、coverslips を配置します。
  13. 料理/ウェルに戻し、coverslips、1 mL の 1x PBS 室温で 3 回洗浄
  14. スライド ガラスをラベル付けしてマウント Fluoromount g. と細胞3-4 時間暗闇の中で強化して光保護下の 4 ° C でスライド ガラスを格納メディアをマウントをしましょう。
  15. 染色パターンの選択 (例えば、点走査型共焦点正立顕微鏡) の顕微鏡を使用してのイメージ。

6 (硫酸化分析用) 培養細胞による機能性 Nanobodies の取り込み

  1. 細胞文化フード種子 ~ 400,000 に 500,000 HeLa 細胞が GFP 付けられたレポーター蛋白質 35 mm 料理または完全な媒体含む抗生物質 (ダルベッコ イーグルの変更中、10% ウシ胎仔を DMEM で 6 もクラスターを安定に発現します。血清 (FCS)、100 単位/ml ストレプトマイシン、2 mM l-グルタミン、1.5 μ G/ml ピューロマイシン)。
    注:前述のように、我々 はここで説明のため EGFP カルネキシン、EGFP CDMPR、TfR EGFP を安定発現 HeLa 細胞を使用します。安定したセルラインから離れても一時的に transfected hela 細胞を使用できます。
  2. 増殖する 7.5% CO2インキュベーターで 37 ° C でセル O/N を孵化させなさい。
    注:翌日 ~ 80% の confluency セルが必要です。
  3. 完全培地を削除、RT で 1x PBS で 2 回を洗浄し、7.5% の CO2インキュベーターで 37 ° C で 1 時間 (SFM) 硫酸フリー培地で細胞を飢えさせます。
    注:SFM は、ワシのバランスの取れた塩 500 mL に MEM アミノ酸 (50 x) 液、L-グルタミン (200 mM)、5 mL のビタミン溶液 (100 倍)、および CaCl2·2H2O の 900 μ L の 5 mL の 10 mL を追加することによって準備されます。0.22 μ m のフィルターそして因数を通過します。
  4. 換気フード、放射能作業用に指定されたベンチで SFM でナトリウム塩として 0.5 mCi/mL [35S] 硫酸を含有する培地をラベリング硫酸を準備します。
    注意:放射能が含まれているすべてのソリューションを慎重に処理します。指定されたフードやベンチでのみ動作します。すべての素材 (ヒント、チューブ、プレート等) または放射能との接触の洗浄バッファーを収集し、別に処分があります。同様のすべてのステップ (ステップ 6.5 6.20) の下にこれを行います。
  5. 1x PBS で VHH 2xTS を硫酸 2 μ G/ml の最終的な集中する媒体のラベルに追加します。
    注:コントロールとして VHH std または TS サイトに欠けているもう一つ生物学: ナノボディで特殊にラベリングを示すことがあります。
  6. 硫酸中含む mCi/0.5 mL [35S] 硫酸と 2 μ G/ml VHH 2xTS ラベル付け 0.7 mL で SFM を交換し、認定作業放射能 7.5% CO2インキュベーターで 37 ° C で 1 時間細胞をインキュベートします。
    注:計画の実験によって生物学: ナノボディで硫酸化の時間を調整する必要があります。また、TGN 到着速度を決定するを実行して、(たとえば、10 分、20 分、30 分など) 別の回のラベルです。
  7. 標識培地を取り除き、冷却板や氷で冷えた 1x PBS で 2-3 回セルを洗浄します。
  8. 換散バッファー (PBS 含んでいる 1% トリトン X-100 と 0.5% デオキシ コール酸) 2 mM PMSF とプロテアーゼ阻害剤のカクテル 1 補足の 1 mL を追加し、4 ° C でロッキング プラットフォーム上で 10-15 分間細胞をインキュベート
  9. こすりと 1.5 mL チューブ、ライセート、渦にライセートを転送し、4 ° C でエンド オーバー エンド回転子に 10-15 分のための場所
  10. 準備、postnuclear 4 ° C で 10 分間、10,000 × gで遠心分離によってライセート
  11. 新しい 1.5 mL のチューブを使用して、1.5 mL チューブのニッケルのスラリーの 20-30 μ L を準備し、優しく 1 分 1,000 x gでそれらをペレット化による 1x PBS で 1 回洗浄します。
    注:ニッケルではなく、ビーズ、ストレプトアビジン ビーズ (生物学: ナノボディでが場合ビオチン化) または生物学: ナノボディで (T7 または HA タグ) のエピトープに対する igg 抗体タンパク質 A ビーズを使用できます。
  12. 転送、postnuclear 1.5 mL チューブに lysate を含むニッケル ビーズと、nanobodies を分離するエンド オーバー エンド回転子の 4 ° C で 1 時間インキュベートします。因数 (50-100 μ L)、postnuclear のライセートを外し、SDS サンプルバッファーの総細胞の生物学: ナノボディで、GFP レポーターおよびコントロールを読み込みその後イムノブロット分析で沸騰します。
  13. 軽く 1 分 1,000 x gでペレット化によって PBS または換散バッファー x 1 にビードを 3 回洗浄しなさい。
    注:ビーズのより厳格な洗浄のため PBS または換散バッファーに 20 mM のイミダゾールを含めることができます。
  14. 慎重にビーズ洗浄バッファーのすべてを削除、サンプル バッファー x 2 の 50 μ L を追加、95 ° C で 5 分間沸騰させる
  15. 両方の負荷は 12.5 %sds ページのゲルおよび参照色素 (例えば、ブロモフェノール ブルー) が分離ゲルの終わりに達するまで、ページの標準プロトコルに従って実行 midi にビーズをゆでた。
    注:ミニの 12.5% を使用して、総細胞の生物学: ナノボディで、GFP レポーターおよびコントロールの読み込みのイムノブロット解析を実行できる SDS-PAGE またはプレキャスト勾配ゲル。
  16. 〜 30 mL の RT で 1 時間固定バッファー (ddH2O 10% 酢酸と 45% メタノール) の分離ゲルを修正、3 回 〜 50 mL の脱イオン水でゲルを洗浄し、ゲル乾燥の準備します。
  17. SDS ページのゲルを乾燥します。
    1. 慎重に伸ばしてしがみつくフィルム固定ジェル、プレカットのフィルター ペーパーでそれをカバーします。
    2. 乾燥のプラットフォーム上に、ろ紙をゲルを置く、真空のカバーに置き、ゲル乾燥の真空ポンプのスイッチします。3-5 h のためのゲルを乾燥させます。
    3. しがみつくフィルムを取り出し、蛍光体スクリーン装備オートラジオグラフィー カセットに乾燥ゲルを置きます。
  18. 画像オートラジオグラフィー蛍光体スクリーンの撮像素子を使用しています。メーカーの指示に従ってください。
    注:信号の強さに応じて蛍光体スクリーンに長くさらされるゲル必要を乾燥しました。

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Representative Results

様々 な細胞内の目的地への逆行性蛋白輸送を調べるためには、ラベルを付けると、セル表面30から組換え融合蛋白質に従ってください抗 GFP 生物学: ナノボディでベースのツールを開設します。ここでは、このような細菌の生産 nanobodies 誘導体し、硫酸化解析による TGN 到着を調査する彼らの使用と同様、蛍光顕微鏡と免疫ブロット、取り込みを研究への応用を実証を示します。後者のアプリケーションは、このプロトコルの方法論の対象です。

我々 は標準的な分子クローニング30によって共通の機能と異なる機能性抗 GFP nanobodies のツールボックスを生成しています。私たち最も単純な (標準) 生物学: ナノボディで、VHH std、特異抗体、c 末端 hexahistidine (His6) による VHH ドメイン、T7 およびそれ以降の検出のための HA エピトープを含む-精製・ ビオチン受容体ペプチド (BAP) 一連のタグビオチン化及び高親和性ストレプトアビジン プルダウン ・実験 (図 1 a)。VHH std の誘導体化には、生化学的、固定および生きている細胞のイメージングと電子顕微鏡による取り込みと逆行性輸送を検討する異なる生物学: ナノボディでバリエーションが得られます。

トランス ゴルジ膜からタンパク質トラフィックを評価するために/TGN、我々 はこれらのコンパートメントでチロシン硫酸化硫酸転移酵素の排他的な局在化の利点を取ったし、したがって VHH std を派生したタンデム チロシン硫酸化サイト (2xTS) に変更ラット procholecystokinin41。電子顕微鏡を用いた研究、細胞コンパートメントができます mCherry VHH std の変更により、固定およびライブ細胞イメージング、APEX237など、ペルオキシダーゼと機能化による逆行性輸送の直接可視化アブレーション、または近接依存ビオチン化反応。また、胸の谷間のサイトの挿入タバコ etch ウイルス (TEV) プロテアーゼは生化学的細胞内と表面結合の nanobodies (図 1 a) を区別するためにできます。生物学: ナノボディでバインド EGFP CDMPR、TfR EGFP30のエンドサイトーシス リサイクル動態を監視する以前 VHH tev を使いました。細胞表面で吸収後の生物学: ナノボディで再現は単に細胞外応用組換え TEV プロテアーゼ生物学: ナノボディでの c 末端エピトープ カセットの逆損失を引き起こすを追うことで評価できます。MCherry または APEX2 生物学: ナノボディで融合で胸の谷間のサイトを含む、VHH-tev を同様の方法で生きているセルイメージ投射による EGFP 記者のリサイクル機構を研究や細胞内コンパートメントに細胞化学的反応をそれぞれ制限する便利です。他のタンパク質ドメイン (その他のフルオロまたは酵素など) またはターゲット シーケンスで機能化プラスミッドにそれぞれ挿入を subcloning でその他の修飾を容易に実現することができますベクトル符号化 VHH std (また見なさい表 1プラスミドについて) 利用できる SpeI、EcoRI 制限のサイトを使用して。

前述のように、プロトコルを使用して、ここで示したすべての nanobodies は高純度・収量 (図 1 b) を分離できます。のみ mCherry 融合タンパク質ドメインのマイナーなクリッピングを示した投稿浄化 (図 1 b、レーン 7-8 を参照)。・ ビラ式がない場合は、私たちが得られた VHH std、VHH 2xTS tev 変更相手に 25-35 mg または 〜 20 mg VHH APEX2 VHH mCherry とその tev を含む誘導体。私たちの経験では、・ ビラ共発現が 3 分半に生物学: ナノボディで収量を低下させることを示しています。

生物学: ナノボディで記者を介した取り込みを示すためには、EGFP カルネキシン (CNX)、EGFP-CDMPR、TfR EGFP (図 2 a および B) を安定に発現する HeLa 細胞ラインを使用しました。EGFP を溶かしただった (すなわちの間の信号と記者のシーケンス CNX または CDMPR)、各蛋白質の細胞外/内腔側の端におよび細胞質分別信号を遮るもののないまま出生率の carboxyterminus に。すべてこれら EGFP タグ貨物分子の ER をターゲット後異なる細胞内人身売買コースがあります。EGFP カルネキシンが ER に居住して通常ポストゴルジ コンパートメントに到達していないので、それは潜在的な非特異的な生物学: ナノボディで取り込みのネガティブ コントロールとして機能します。対照的に、EGFP CDMPR と TfR EGFP ゴルジ体を超えて輸送機能を持っている、こうして着実に原形質膜に表示。どおり、VHH mCherry 未変更の hela 細胞と EGFP 窒化炭素を安定に発現する細胞の混合された人口に追加するとき生物学: ナノボディで内面も示さなかったどちらの場合。ただし、EGFP CDMPR と TfR EGFP の両方細胞表面で VHH mCherry を捕獲し、記者のホーミング コンパートメント (図 2) にピギーバック輸送。

常駐 TGN マーカー VHH mCherry ハラーゼは、TGN 到着を評価するために原則的にされる可能性があります。我々 はまだ、チロシン硫酸化に基づく生化学的アプローチを確立します。トランス-ゴルジ体で発生するこの変更の利点を取るために nanobodies された修飾と TGN/TS サイト (図 1 a)。特異性とこれらの蛋白質のバインダーの機能を示すためには、未変更の HeLa 細胞と放射性硫酸の存在下で 1 時間 EGFP CNX、EGFP CDMPR、VHH std または VHH 2xTS TfR EGFP を安定発現細胞を培養しました。VHH 2xTS のカイネティックスと、記者はそれがチロシン硫酸化機械にさらされている TGN に逆行性生物学: ナノボディで輸送するときのみ発生します。EGFP CNX とその親細胞を表現する hela 細胞はない生物学: ナノボディで取り込み、したがってない硫酸化を表示します。EGFP CDMPR と TfR EGFP 内面 nanobodies、後者はかなり前者より。それにもかかわらず、唯一 EGFP-CDMPR 発生する硫酸化する VHH 2xTS (図 3 a)。これは CDMPR の逆行輸送、TGN に効率的な細胞表面からを確認し、(、いくつか研究42,43に示唆されている)、TGN に戻る TfR に不利な証拠を提供します。

内面化の動力学とレポーター蛋白質の TGN 到着は時間帯生物学: ナノボディで取り込みや硫酸化後のセル lysates を分析することによっても確認できます。〜 15 分の遅れの期間の後にのみ開始して飽和に到達する硫酸化がわかった EGFP CDMPR を使用すると、記者として、後にのみ > 75 分 (図 3 bレーン 1-6、および C、正方形の記号)。吸収と硫酸化動態登場、TGN への輸送を反映して、ほぼ 30 分でシフト。さらに、メソッドは、MPR 輸送に関わるタンパク質ノックダウン、ノックアウト、または knocksideways などのアプローチをサイレンシングの薬理学的干渉や仕分けの機械を調査することができます。ここでは、一般的に、TGN に逆行性輸送を妨害するブレフェルジン A (BFA)、いくつかの Arf Gtpase のグアニン ヌクレオチド交換要因 (一種) の阻害剤を使用しました。BFA に扱われたとき硫酸化完全に廃止された、吸収速度と範囲 (図 3 b7-12 の車線と円形の記号 C) の両方に影響が残った一方。

Figure 1
図 1: 設計と機能性 nanobodies の生産 EGFP 変更細胞表層タンパク質を追跡する.(A) derivatized nanobodies の模式図。標準の生物学: ナノボディでは、GFP 固有 VHH ドメイン、T7 と HA の epitope の札、BAP および hexahistidine (His6) の精製タグで構成されます。他の nanobodies はまた 2 TSs、APEX2、または胸の谷間サイト TEV プロテアーゼ (tev) の有無にかかわらず各 mCherry を構成します。スケール バーは、アミノ酸 (aa) です。(B) が細菌によって表現されると精製 nanobodies (50 μ g) をグラデーション SDS ゲル電気泳動で分析し、Coomassie のステンド グラスします。KDa の分子量が付いているマーカー蛋白質は、左側に表示されます。VHH mCherry と VHH tev mCherry のみ、VHH と mCherry ドメインの最小限のクリッピングを示した。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 2
図 2: 摂取量と異なる EGFP レポーター蛋白質によって VHH mCherry の細胞内局在。EGFP の融合蛋白質の模式図 (A)。分泌膜タンパク質から派生したシーケンスは N ターミナル信号ペプチドと黄色で内部の膜貫通セグメントと黒で表示され、EGFP が緑色で示されています。EGFP はフルレングスの CDMPR、出生率、およびカルネキシン (CNX) 融解する.アミノ酸 (aa) のスケール バー。EGFP CDMPR、TfR EGFP 説明30をされています。EGFP 記者タンパク質を安定に発現する細胞が収穫された、(B) の hela 細胞を溶解し, SDS ゲル電気泳動と抗 GFP および抗アクチン抗体を用いたイムノブロット分析.KDa の分子量は、右側に表示されます。(C) HeLa 細胞蛋白質が 5 μ g/ml VHH mCherry 孵化親の HeLa 細胞と混合された EGFP タグ記者 (~ 100 nM) の 1 37 ° C で h および蛍光顕微鏡に処理されます。スケール バー = 10 μ m。取り込みは、細胞表面に露出 EGFP と記者を発現する細胞でのみ発生します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 3
図 3: 硫酸化解析と TS タグ nanobodies を使用して TGN への逆行性輸送の動力学。(A) 育児・ HeLa 細胞タンパク質は 2 μ g/mL VHH std または VHH 2xTS 60 分 0.5 mCi/mL [35S] 硫酸を使用してラベル付けされた EGFP 変更レポーターを安定に発現します。Nanobodies は、ニッケル ビーズ、オートラジオグラフィーによって、12.5 %sds ページの分離を使用して分離しました。セル lysates の因数は、ニッケルのプルダウンと細胞の生物学: ナノボディで (His6)、EGFP、アクチンにエスディーエスの前に集められました。(BとC) EGFP CDMPR を安定して発現 HeLa 細胞は 2 μ g/mL VHH 2xTS (A) と同様に分析前に 2 μ g/mL BFA と存在下で最大 75 分 0.5 mCi/mL [35S] 硫酸で付けられました。VHH 2xTS 摂取量と 3 つの独立した実験から硫酸化の定量は、75 分 (平均と SD) 後 BFA なし値のパーセントで表示されます。黒正方形、BFA; なし灰色の円、BFA;シンボルを開いて吸収;いっぱい記号、硫酸化。この数字を変更してからバサー et al.、2018、PNAS30を拡張します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

表 1: 本研究で示す機能性 nanobodies のタンパク質配列。灰色、オレンジ色、赤、TEV のプロテアーゼ切断部位の紫色で、マゼンタで、myc エピトープの hexahistidine (His6) で青、BAP 順番黒、HA エピトープで VHH で T7 エピトープ チロシン硫酸化は、黄色、緑色で APEX2 とピンクの mCherry でシーケンスします。これら機能性抗 GFP nanobodies をエンコード表現のベクトルが寄託されている (また見なさいテーブル 1プラスミドについて)。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。

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Discussion

Nanobodies は、従来の抗体に比べて多くの利点を持つタンパク質バインダー足場の新たなクラスを表す: 彼らは小さく、安定した、単量体、高親和性と不足のジスルフィド結合33,35,のために選択できます。44,45細胞培養システムと生物発生生物学46,47,48,49, 結晶化として引率するよう、多くのアプリケーションで使用。阻害剤や酵素54,55、活動変調器として構造生物学50,51,52,53, 立体配座の状態が安定します。 56,57の生化学的解析について免疫組織学的試薬としてまたは「セカンダリ nanobodies"として immunoblots と蛍光抗体法58抗マウスと反ウサギ免疫グロブリンを検出します。私たちの以前の研究で培ってきたと応用機能性 nanobodies ラベル表面蛋白質に細菌の表現によって生成され、TGN30特に様々 なコンパートメントに細胞内経路を追跡します。抗 GFP 生物学を: ナノボディでを使ってターゲット融合蛋白質 GFP の細胞外、YFP、または使用可能で特徴づけられる既にかもしれない mCerulean に汎用性の高い、ことができるツールを作るです。変更 mCherry、APEX2、TS に抗 GFP nanobodies のサイトに電顕記者吸収を固定し、生きている細胞のイメージング、によって監視することができました視覚化逆行輸送コンパートメント、これらのコンパートメントをアブレーションするまたはトランスポートを勉強するには速度論、TGN に。私たちのツールの 1 つの欠点は、機能性抗 GFP nanobodies を適用する前にターゲット細胞 (安定した式またはタグ内因性) の組換えの変更が必要にことです。機能化コースも適用できる合成 VHH のリボソームを表示およびバクテリオファージの表示の選択によって動物の免疫によって設置タグ内因性ターゲット蛋白質に対して指示される nanobodies の急速に増加するライブラリ59。Nanobodies TS サイト (例えば、VHH 2xTS) で変更を使用して、トランスポートおよび多様な EGFP 変更ターゲット蛋白質の TGN 到着の体内動態を直接測定できます我々。我々 は研究の貢献アダプター蛋白質複雑な 1 (AP-1) 与えられた輸送機械30の急速な不活性化を許可する knocksideways 細胞における直接の速度論的解析による MPRs の逆行性輸送に VHH 2xTS を適用しています。生物学: ナノボディで硫酸化と EGFP ラベル MPRs のため逆行性輸送完全にではなく部分的にブロックされました。TGN 到着センサーとして硫酸化を使用して私たちの生物学: ナノボディでベースのアプローチがエンドソーム-TGN 逆送17,60、AP-1 の機能貢献を示す他の研究室の前の結果を確認 61。Sulfatable nanobodies はこのように他の逆行輸送機械、epsinR、Rab9/TIP47 snx--バー/レトロマー複合体、ゲノム、遺伝的または化学的操作によってタンパク質貨物などの貢献を分析する有用な生化学的ツールを提供できます。ここで提示されたプロトコルでは、どのようにターゲット コンパートメント、経路を決定する一般に機能性 nanobodies の使用し、培養細胞における動態を輸送することができますの基礎を提供しています。

他のグループはすでに TS を利用したセルから交通機関サイト、TGN に表面。リシン、滋賀や百日咳毒素のサブユニットは以前 TGN62,63,64,65,66までの輸送経路を示すための硫酸化サイトに変更されています。また、GFP CIMPR と TGN67,68に内因性の TGN46 の逆行性輸送を試金する Igg に TS ペプチドが化学的に結合されても。私たちの sulfatable nanobodies は、シンプルで再現性のある細菌の生産と標的タンパク質を 1:1 の化学量論の利点を持っています。逆に、例えばよく知られている Igg、することができます架橋などの 2価タンパク質バインダーが細胞の表面の蛋白質とエンドサイトーシス69,70, 後、リソソームに自分の細胞内輸送を変更の強調表示、既存のメソッドに関して単量体蛋白質バインダーの意義。私たちの技術の重要なステップは、放射能の処理は硫酸塩の nanobodies のラベル付けを実行する必要です。ただし、TGN 到着を勉強する TS サイトと機能性 nanobodies の私たちのツール可能性がありますなしを適用できる抗 sulfotyrosine 抗体を用いた放射能。

以前示唆その生物学: ナノボディで硫酸化は、MPRs の硫酸化まだ至っていない最大 75 分後にもかかわらず、45 分30後生物学: ナノボディで吸収が飽和するので、非常に効率的ではありません。その他自然の TS サイトのためのスクリーニング硫酸化効率の向上可能性があります。また、硫酸化効率を高める可能性のある、硫酸化機械自体を TPST1、TPST2 などのコンポーネントを過剰発現がします。確かに、以前使用されている過剰発現トランスポーター 3'-phoshoadenosine-5'-phosphosulfate (PAPS) を提供することの 1 つのゴルジ体内腔に細胞質からの TPSTs、基板はプロテオグリカンの硫酸化状態を変えることができます。71。

Sulfatable の nanobodies から離れて、他の derivatizations では、エンドサイトーシス コンパートメントを経由して、TGN にトレース輸送ができるにように。APEX2 は近接依存ビオチン化逆行輸送のプロテオーム解析のための無差別標識酵素として適用できます。興味の貨物レポーターによって内面化 APEX2 生物学: ナノボディでは、近接ターゲットのコンパートメント内にあるタンパク質が表示されます。比較プロテオミクス エンドソームと、生物学: ナノボディでアクセス TGN の種類でその他の内因性蛋白質を識別できるようにする必要があります。その標的蛋白質との組み合わせで nanobodies の多くのバリエーションが考えられます。最近の報告では、例えば、ここで説明した逆アプローチを適用: GFP の誘導体は研究および前向性および植物の逆行性コンパートメントに cellularly 表現した抗 GFP タグ付きの生物学: ナノボディで空胞並べ替え受容をトラップに使用されました。内システム72。同様に、キャプチャし、逆行性輸送中の別のコンパートメントに EGFP 変更記者を蓄積する哺乳類の細胞培養系で機能生物学: ナノボディでトラップを設計可能性があります。

私たちのここの提示方法と TS サイト タグ nanobodies にフォーカスを持つプロトコルによりエンドサイトーシス コンパートメントおよび培養細胞 TGN に細胞表面から貨物蛋白質の量的・質的なトラッキング。

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Disclosures

著者が明らかに何もありません。

Acknowledgments

この作品は、スイスの全米科学財団による助成金 31003A 162643 によって支えられました。ニコール Beuret とサポート Biozentrum イメージング コア施設 (IMCF) に感謝します

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-GFP antibody Sigma-Aldrich 118144600001 Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche
Anti-His6 antibody Bethyl Laboratories A190-114A
Anti-actin antibody EMD Millipore MAB1501
Goat anti-rabbit HRP Sigma-Aldrich A-0545
Goat anti-mouse HRP Sigma-Aldrich A-0168
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Sigma-Aldrich D9542 dissolved in 1x PBS/1%BSA
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Applichem A3672
D-biotin Sigma-Aldrich B4501 dissolved in sterile 500 mM NaH2PO4 or DMSO
5-aminolevuilnic acid (dALA) hydrochloride Sigma-Aldrich A3785 dissolved in sterile water
DNase I Applichem A3778 dissolved in sterile water
Lysozyme Sigma-Aldrich 18037059001 Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche
Brefeldin A (BFA) Sigma-Aldrich B5936
Puromycin Invivogen ant-pr-1
Penicillin/Streptomycin Bioconcept 4-01F00-H
L-glutamine Applichem A3704
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) Sigma-Aldrich D5796
Fetal calf serum (FCS) Biowest S181B-500
Sulfur-35 as sodium sulfate Hartmann Analytics ARS0105 Product contains 5 mCi
Earle's balanced salts Sigma-Aldrich E6267
MEM amino acids (50x) solution Sigma-Aldrich M5550
MEM vitamin solution (100x) Sigma-Aldrich M6895
cOmplete, Mini Protease inhibitor cocktail Sigma-Aldrich 11836153001 Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) Applichem A1008 dissolved in sterile water, stock is 1 M
Carbenicillin disodium salt Applichem A1491 dissolved in sterile water, stock is 100 mg/mL
Kanamycin sulfate Applichem A1493 dissolved in sterile water, stock is 100 mg/mL
Coomassie-R (Brilliant Blue) Sigma-Aldrich B-0149
Paraformaldehyde (PFA) Applichem A3813
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich A2153
Fluoromount-G Southern Biotech 0100-01
Ni Sepharose High Performance GE Healthcare 17-5268-01
His GraviTrap columns GE Healthcare GE11-0033-99
His buffer kit GE Healthcare GE11-0034-00
Disposable PD10 desalting columns GE Healthcare GE17-0851-01
Mini-Protean TGX gels, 4-20%, 15-well Bio-Rad 456-1096
Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) w/o Ca2+/Mg2+ Sigma-Aldrich D8537
35 mm dishes Falcon 353001
6-well plates TPP 92406
Glass coverslips (No. 1.5H) VWR 631-0153
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Applichem A0999.0025 dissolved in 40% DMSO 60% isopropanol, stock in 500 mM
Tryptone Applichem A1553
Yeast extract Applichem A1552
Magnesium chloride hexahydrate Merck Millipore 105833 dissolved in sterile water, stock is 1 M
Calcium chloride dihydrate Merck Millipore 102382 dissolved in sterile water, stock is 1 M
Sodium chloride Merck Millipore 106404 dissolved in sterile water, stock is 5 M

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免疫学、感染症、問題 144、nanobodies、逆送、ゴルジ複合体、チロシン硫酸化、カイネティックス、EGFP HeLa 細胞細菌の表現
取り込みと培養細胞における機能性 Nanobodies を用いたトランスゴルジ ネットワークへの逆行性輸送の解析
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Buser, D. P., Spiess, M. Analysis of … More

Buser, D. P., Spiess, M. Analysis of Endocytic Uptake and Retrograde Transport to the Trans-Golgi Network Using Functionalized Nanobodies in Cultured Cells. J. Vis. Exp. (144), e59111, doi:10.3791/59111 (2019).

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