Retrograd transporten av proteiner från cellytan till Golgi är viktigt att upprätthålla membran homeostas. Här, beskriver vi en metod för att analysera biokemiskt cell surface-till-Golgi transport av rekombinanta proteiner med functionalized nanobodies i HeLa cells.
Transport av proteiner och membran från cellytan till Golgi och därefter är viktigt för homeostas, organell identitet och fysiologi. För att studera retrograd protein trafik, har vi nyligen utvecklat en mångsidig nanobody-baserade verktyg för att analysera transport från cellytan till Golgi komplexet, antingen genom fasta och levande cell imaging, genom elektronmikroskopi eller biokemiskt. Vi konstruerade functionalized anti grönt fluorescerande protein (GFP) nanobodies – små, monomer, hög affinitet protein bindemedel — som kan tillämpas på cellinjer som uttrycker membranproteiner intresse med en extracellulär GFP biexponentiellt. Derivatized nanobodies bunden till GFP reportrar är specifikt internaliserats och transporteras piggyback längs de reportrarna sortering rutter. Nanobodies var functionalized med fluorophores att följa retrograd transport genom fluorescensmikroskopi och leva imaging, med askorbat peroxidas 2 (APEX2) att undersöka ultrastrukturella lokaliseringen av reporter-nanobody komplex av elektron Mikroskopi, och med tyrosin sulfatering (TS) motiv att bedöma kinetik av trans-Golgi nätverk (TGN) ankomst. I denna metodologiska artikel beskriva vi det allmänna förfarandet för att bacterially express och rena functionalized nanobodies. Vi illustrerar den kraftfulla användningen av vårt verktyg använder de mCherry – och TS-modifierat nanobodies att analysera endocytic upptag och TGN ankomsten av last proteiner.
Retrograd trafik av proteiner och lipider från cellytan till olika intracellulära fack är avgörande för underhåll av membran homeostas motvikt sekretion och att återvinna komponenter anterograd transport maskinerier1 , 2. efter internalisering via clathrin-beroende eller -oberoende endocytos, protein och lipid last först fylla tidigt endosomes från där de är ytterligare Omdirigerad antingen längs endo-lysosomala systemet, återvinns till plasmamembranet, eller riktade till nätverkets trans-Golgi (TGN). Återvinning från endosomes eller cellytan till TGN är en del av funktionell cykel av ett antal anterograd transmembrana last receptorer som katjon-beroende och katjon-oberoende mannos-6-fosfat receptorerna (CDMPR och CIMPR) att leverera Nyligen syntetiseras lysosomala hydrolaser från TGN till sena endosomes och lysosomer3,4,5, sortilin och SorLA6,7, och Wntless (WLS) transportera Wnt ligander till cellytan 8 , 9 , 10 , 11. andra proteiner som Hämtad tillbaka till TGN är TGN46 och dess relaterade isoformer12,13,14, snaror (lösliga N– ethylmaleimide-känslig fusion faktor fastsättning receptorer) 15 , 16 , 17, amyloid prekursor protein (APP)18,19, progressiv fixation (ANK) protein20, metall transportörer såsom ATP7A/B eller DMT121,22, och transmembrana bearbetning enzymer inklusive karboxypeptidas D, furin eller BACE123,24,25. Förutom dessa kroppsegna proteiner kapa bakteriell och växt toxiner (t.ex. Shiga och kolera toxin, ricin och abrin) retrograd transport maskinerier för att nå ER för retrotranslocation in i det cytosol26,27, 28,29.
För att direkt analysera retrograd trafik, har vi tidigare utvecklat en nanobody-baserad verktygslåda för att märka och följ last proteiner från cellytan till intracellulär fack30. Nanobodies representerar en ny familj av protein bindemedel härrör från homodimeric heavy-kedja-bara antikroppar (hcAbs) som förekommer naturligt i kameldjur och broskfiskar31,32. De utgör variabeln heavy-kedjan domän (VHH) hcAbs och har många fördelar jämfört med konventionella antikroppar (t ex IgG): de är monomer, små (~ 15 kDa), lättlösligt, saknar disulfide obligationer, kan bacterially uttryckt och valts för hög affinitet bindande33,34,35,36. För att göra vår nanobody verktyg mångsidigt och brett tillämpliga, anställt vi functionalized anti-GFP nanobodies till ytan-etikett och spår proteiner taggade med GFP på sin extracellulära/lumenal domän. Av funktionalisering av nanobodies med mCherry, askorbat peroxidas 2 (APEX2)37eller tyrosin sulfatering (TS) sekvenser, retrograd transport av bonafide transmembrana last proteiner kan analyseras genom att antingen fast och leva cell imaging, genom elektronmikroskopi, eller biokemiskt. Eftersom tyrosin sulfatering medieras av tyrosylprotein sulfotransferaser (TPST1 och TPST2) är en posttranslationell modifiering är begränsad till de trans-Golgi/TGN, kan vi direkt studera transport och kinetik av proteiner av intresse från cellytan till detta intracellulära Golgi fack38,39,40.
I den här metoder artikeln beskriver vi lättheten av produktion av functionalized nanobodies (VHH-2xTS, – APEX2, – mCherry och derivat) lämpad för ett antal applikationer att analysera retrograd transport i däggdjursceller30. Vi fokuserar huvudsakligen på användningen av TS webbplats-modifierat nanobody för analys av intracellulära trafik från cellytan till utrymmet av sulfatering.
Nanobodies representerar en framväxande klass av proteinet binder ställningar med många fördelar jämfört med konventionella antikroppar: de är små, stabil, monomer, kan väljas för hög affinitet och brist disulfide obligationer33,35, 44 , 45. de används i ett antal applikationer, såsom i cellsystem kultur och organismer i utvecklingsbiologi46,<sup …
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöds av Grant 31003A-162643 av den schweiziska National Science Foundation. Vi tackar Nicole Beuret och Basels Imaging Core Facility (IMCF) för support.
Anti-GFP antibody | Sigma-Aldrich | 118144600001 | Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche |
Anti-His6 antibody | Bethyl Laboratories | A190-114A | |
Anti-actin antibody | EMD Millipore | MAB1501 | |
Goat anti-rabbit HRP | Sigma-Aldrich | A-0545 | |
Goat anti-mouse HRP | Sigma-Aldrich | A-0168 | |
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | dissolved in 1 x PBS/1%BSA |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Applichem | A3672 | |
D-biotin | Sigma-Aldrich | B4501 | dissolved in sterile 500 mM NaH2PO4 or DMSO |
5-aminolevuilnic acid (dALA) hydrochloride | Sigma-Aldrich | A3785 | dissolved in sterile water |
DNase I | Applichem | A3778 | dissolved in sterile water |
Lysozyme | Sigma-Aldrich | 18037059001 | Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche |
Brefeldin A (BFA) | Sigma-Aldrich | B5936 | |
Puromycin | Invivogen | ant-pr-1 | |
Penicillin/Streptomycin | Bioconcept | 4-01F00-H | |
L-glutamine | Applichem | A3704 | |
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5796 | |
Fetal calf serum (FCS) | Biowest | S181B-500 | |
Sulfur-35 as sodium sulfate | Hartmann Analytics | ARS0105 | Product contains 5 mCi |
Earle's balanced salts | Sigma-Aldrich | E6267 | |
MEM amino acids (50 x) solution | Sigma-Aldrich | M5550 | |
MEM vitamin solution (100 x) | Sigma-Aldrich | M6895 | |
cOmplete, Mini Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | 11836153001 | Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche |
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) | Applichem | A1008 | dissolved in sterile water, stock is 1 M |
Carbenicillin disodium salt | Applichem | A1491 | dissolved in sterile water, stock is 100 mg/mL |
Kanamycin sulfate | Applichem | A1493 | dissolved in sterile water, stock is 100 mg/mL |
Coomassie-R (Brilliant Blue) | Sigma-Aldrich | B-0149 | |
Paraformaldehyde (PFA) | Applichem | A3813 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | |
Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
Ni Sepharose High Performance | GE Healthcare | 17-5268-01 | |
His GraviTrap columns | GE Healthcare | GE11-0033-99 | |
His buffer kit | GE Healthcare | GE11-0034-00 | |
Disposable PD10 desalting columns | GE Healthcare | GE17-0851-01 | |
Mini-Protean TGX gels, 4-20%, 15-well | Bio-Rad | 456-1096 | |
Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) w/o Ca2+/Mg2+ | Sigma-Aldrich | D8537 | |
35-mm dishes | Falcon | 353001 | |
6-well plates | TPP | 92406 | |
Glass coverslips (No. 1.5H) | VWR | 631-0153 | |
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Applichem | A0999.0025 | dissolved in 40% DMSO 60% isopropanol, stock in 500 mM |
Tryptone | Applichem | A1553 | |
Yeast extract | Applichem | A1552 | |
Magnesium chloride hexahydrate | Merck Millipore | 105833 | dissolved in sterile water, stock is 1 M |
Calcium chloride dihydrate | Merck Millipore | 102382 | dissolved in sterile water, stock is 1 M |
Sodium chloride | Merck Millipore | 106404 | dissolved in sterile water, stock is 5 M |