Summary
Qui, presentiamo un protocollo per la creazione di un iCR immunocompetente (Istituto di ricerca sul cancro) modello murino di infezione del sistema nervoso centrale per visualizzare lo sviluppo della neuropatia. Il monitoraggio dei disturbi encefalitici virali con punteggi di malattia identici potrebbe essere eseguito per mostrare la neuropatia indotta dal virus dengue in vivo.
Abstract
Il virus dengue (DENV), un virus trasmesso da artrodi trasmesso dalle zanzare, può causare la grave malattia nota come febbre emorragica dengue, caratterizzata da complicazioni letali dovute a perdite di plasma, asciti, effusioni pleuriche, grave emorragia e compromissione dell'organo. Alcuni casi di infezione Da DENV presentano manifestazioni neurologiche; tuttavia, gli studi non hanno esplorato ulteriormente la neuropatogene indotta da DENV. In questo studio, presentiamo un protocollo per utilizzare un topo ICR (Istituto di ricerca sul cancro) immunocompetente per studiare l'induzione dell'infezione del sistema nervoso centrale (SNC) con DENV, seguito dalla progressione di encefalite virale acuta malattia.
Introduction
DENV, un virus artropode della famiglia Flaviviridae, contiene un genoma di RNA a senso positivo che codifica tre proteine strutturali virali (capside, premembrana e busta) e sette proteine non strutturali virali (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B e NS5). I quattro sierotipi di DENV (DENV1-4), che infettano circa 390 milioni di persone ogni anno, causano un onere globale anche se i governi hanno diretto notevoli sforzi verso il controllo dei vettori e delle malattie delle zanzare1. Attualmente, i vaccini protettivi e i farmaci antivirali terapeutici sono in fase di sviluppo e richiedono un'ulteriore convalida a lungo termine2. Nella pratica clinica, anche se un paziente dengue con infezione da SNC è raro, deve essere ulteriormente esplorato per comprendere la diversità dello sviluppo della malattia dengue3. Sono necessarie ulteriori indagini e validazioni; in particolare, l'Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) ha incluso il coinvolgimento del compromissione del SNC, come il danno cognitivo, le convulsioni, l'encefalopatia e l'encefalite, nella classificazione della dengue grave3,4. La costruzione di modelli animali di infezione da DENV è indispensabile per esplorare la neuropatogenesi dell'infezione da DENV.
Per generare l'infezione da CNS da parte di DENV, diversi studi hanno eseguito diverse vie di infezione da DENV, tra cui (1) l'inoculazione intracerebrale di topi C57BL/6 che hanno ricevuto 4 x 103 unità di formazione di placche (PFU) di DENV35non adattati, 6, (2) inoculazione intraperitoneale di topi BALB/c che hanno ricevuto 7 x 104 PFU di DENV47in vitro , (3) inoculazione intracerebrale di topi svizzeri che hanno ricevuto 1 x 105 PFU di DENV18in vivo e (4) co-inoculazione intracerebrale e intraperitale dei topi da allattamento ICR che hanno ricevuto 1 x 106 PFU di DENV29 nonadattati . Secondo i risultati di questi studi5,6,7,8,9, infezione DENV nei topi provocare la replicazione virale nel cervello, portando a virale acuta sindromi simili all'encefalite, cambiamenti comportamentali accompagnati da paralisi degli arti e instabilità posturale, neurotossicità e infiammazione del SNC, perdite plasmatiche generali e localizzate attraverso la barriera emato-encefalica (BBB) e letalità. Tutti i risultati di questi studi5,6,7,8,9hanno dimostrato la capacità di DENV di infettare il SNC e l'induzione di encefalite virale acuta malattia a seguito di infezione.
Sulla base dei nostri risultati attuali9,10,11,12,13,14,15, abbiamo creato un modello murino di infezione DENV come un in vivo per esaminare l'efficacia terapeutica di agenti/fattori mirati contro la replicazione virale, nonché la neurotossicità. Qui, riportiamo il protocollo utilizzato per creare un topo ICR immunocompetente per studiare l'infezione da CnS e per monitorare lo sviluppo di neuropatie con diverse gravità causate da DENV. I risultati mostrano la progressione significativa della malattia simile all'encefalite nei topi infetti da DENV in modo dipendente dal tempo.
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Protocol
I protocolli sperimentali di studio sugli animali sono stati approvati dal Comitato Istituzionale per la cura degli animali e l'utente del National Defense Medical Center (numero IACUC: 16-261), secondo le linee guida stabilite dal Ministero della Scienza e della Tecnologia di Taiwan.
1. Procedura di infezione
- Preparare le scorte non adattate dENV2 (strain PL046)9 (originariamente ottenute dai Centers for Disease Control di Taiwan, che vanno da 2,5 x 107 a 1 x 109 PFU/mL).
- Diluire lo stock di virus a 1 x 106 PFU con Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medio per un volume totale di 40 .L.
- Riempire una siringa da 0,3 mL dotata di un ago da 30 G con 10 x 105 PFU di virus diluito, e riempire un'altra siringa da 0,3 mL dotata di un ago da 30 G con 30 (7,5 x 105 PFU) di virus diluito.
-
Tenere il topo da urlo ICR di 7 giorni e seguire i seguenti passaggi.
- Per l'iniezione intracerebrale, tenere il mouse in una posizione prona premendo l'auricolare tra l'indice e il pollice, e intracerebralmente iniettare 10 L di virus diluito nell'area lambda, il punto all'intersezione della sutura sagittale e lambdoid 16.
- Dopo l'iniezione intracerebrale, tenere il topo in posizione supina utilizzando l'indice e il pollice e iniettare intraperitonealmente 30 L di virus diluito delicatamente nell'addomel murino.
NOTA: Per evitare il cannibalismo, il 75% di alcol viene utilizzato per creare una perdita temporanea della sensazione olfattiva della madre. Inoltre, si suggerisce di coprire le cucciolate con le feci e l'urina della madre.
- Posare i topi da latte nelle loro gabbie e attendere 5 min per controllare la loro poststimolazione di sicurezza con l'avidità dei topi, tra cui camminare e latte materno succhiare.
NOT: Molto spesso, i topi dimostrano una normale poststimolazione dell'attività e non sembrano esserci effetti nocivi a seguito della sfida tecnica. Durante questo esperimento, gli animali sono stati mantenuti dal Institutional Animal Care e User Committee del National Defense Medical Center, Taiwan. - Valutare il progresso giornaliero dei topi in termini di peso corporeo (utilizzando un equilibrio in microgrammo), malattia virale acuta (con il punteggio della malattia come descritto nella sezione 2), e il tasso di sopravvivenza9,10,11 ,12,13,14,15.
2. Punteggio di malattia
- Monitorare il grado di encefalite virale acuta malattie simili. Assegnare un punteggio pari a 0 ai mouse sani; 1 ai topi con sintomi di malattia minore, tra cui perdita di peso, mobilità ridotta e un orientamento del corpo gobbo; 2 ai topi che presentano crisi limbiche; 3 ai topi la debolezza limbica del dado, compreso il movimento con difficoltà e la debolezza dell'arto anteriore o dell'arto posteriore; 4 per la paralisi; 5 per la morte.
NOT: Una volta che il punteggio raggiunge 3, i sintomi della malattia sono considerati in rapida evoluzione. - Tracciare il punteggio della malattia, secondo il punto 2.1, per ogni giorno come una cifra basata sulla curva utilizzando la media SD dei punteggi dei test giornalieri in ogni gruppo.
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Representative Results
Gravi complicazioni neurologiche associate alla dengue sono state segnalate nei pazienti per la patogenesi dengue4. Anche se questi casi sono rari in clinica, la creazione di un modello murino immunocompetente di infezione Da DENV può essere utilizzato non solo per studiare l'immunopatogene, ma anche per esplorare l'infezione da SNC, la neuroinfiammazione, la neurotossicità e il virale acuto una malattia simile all'encefalite. In questo studio, secondo il nostro attuale modello9,10,11,12,13,14,15, 7 giorni vecchi i topi da latte ICR sono stati inoculati contemporaneamente a DENV2 attraverso una microiniezione intracerebrale (2,5 x 105 PFU) e un'iniezione intraperitale (7,5 x 105 PFU) (Figura 1). Dopo l'infezione, abbiamo eseguito numerose analisi per mostrare la presenza di replicazione del dsRNA, espressione proteina virale e rilascio di virus nel cervello infettato da DENV9,10,11,12 ,13,14,15. Questi esperimenti hanno dimostrato che è stato stabilito un modello in vivo di successo di infezione, replicazione e rilascio di DENV.
Per valutare l'induzione di malattie acute simili all'encefalite virale9,10,11,12,13,14,15, abbiamo monitorato i cambiamenti peso corporeo nei topi infettati da DENV. Rispetto ai cambiamenti di peso corporeo nel gruppo fittizio (dove i topi sono stati inoculati solo con il supporto RPMI), la figura 2 mostra un aumento del gruppo fittizio ma una significativa (P < 0.01) diminuzione del peso corporeo nei topi infetti. Secondo i sintomi di malattie simili all'encefalite, tra cui la postura di gobbo, la crisi limbica, la debolezza limbica, la paralisi e la morte, come si manifesta nei topi infetti da DENV, la figura 3 mostra un aumento significativo (P < 0,05) punteggio clinico nei topi infetti da DENV. Il saggio di sopravvivenza nella Figura 4 mostra una riduzione dipendente dal tempo del tasso di sopravvivenza (P < 0.001) dei topi infettati da DENV. I dati indicano l'istituzione di un modello infettivo di DENV nel SNC, che mostra la progressione di malattie acute simili all'encefalite virale.
Figura 1: Progettazione sperimentale per l'infezione da virus dengue (DENV) nei topi da allattamento. Sette topi da allattamento iCR di un giorno sono stati inoculati con DENV2 PL046 da iniezioni intracraniche e intraperitiche simultanee. Abbiamo misurato i cambiamenti nel peso corporeo, nel punteggio della malattia e nella mortalità. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Il peso corporeo nei topi da allattamento durante l'infezione da dengue virus (DENV). Nei topi da allattamento iCR infetti da DENV2(n - 12), le variazioni del peso corporeo sono state misurate al giorno. Dopo un test di rango con segno Wilcoxon, i valori vengono presentati come la media : SD. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Il punteggio della malattia encefalitica nei topi da allattamento durante l'infezione da virus dengue (DENV). In seguito all'infezione da DENV2 nei topi da allattamento in ICR (n - 12), sono stati misurati cambiamenti cinetici temporali nei punteggi clinici per la postura gobbo (punteggio 1), convulsioni limbiche (punteggio 2), debolezza limbica (punteggio 3), paralisi (punteggio 4) e morte (punteggio 5). Dopo un test di rango con segno Wilcoxon, i valori vengono presentati come media : SD. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Il tasso di sopravvivenza nei topi da allattamento durante l'infezione da virus dengue (DENV). Le variazioni cinetiche nel tempo nei tassi di sopravvivenza sono state misurate nei topi da allattamento ICR infettati da DENV2 (n - 12). Dopo un test di log-rank, i valori vengono presentati come la media : SD. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
L'infezione da DENV è stata rilevata nel SNC di pazienti con dengue grave3,17, suggerendo la possibilità della manifestazione di encefalite virale acuta avvenuta durante la patogenesi dengue. Qui, riportiamo un modello murino in vivo dell'infezione da DENV per studiare il coinvolgimento della disfunzione del SNC nella dengue grave, in particolare con un focus sulle malattie acute simili all'encefalite acuta indotta da DENV. Rispetto ai modelli precedenti, in particolare per l'infezione a una strada (solo per via endovenosa, solo intraperitonetale o solo intracerebrale), un titro estremamente elevato (1 x 108 PFU) di DENV è utilizzato in topi immunocompetenti. Tuttavia, nei topi immunocompromessi, un titer relativamente basso ma variante (1 x 105 a 1 x 108 PFU) di DENV può essere eseguito18,19,20. In questo studio, abbiamo usato l'infezione a due strade per indurre il SNC simultaneo e l'infezione sistemica con un titro basso (intracranico: 2,5 x 105 PFU; intraperitoneale: 7,5 x 105 PFU) di DENV in topi da allattamento immunocompetenti ICR. La progressione della malattia simile all'encefalite è completamente riproducibile9,10,11,12,13,14,15 . La possibile limitazione di questo studio è, quindi, mitigata utilizzando un'iniezione intracranica e intraperitinale simultanea. Anche se è artificiale-tuttavia, coerente con le opere precedenti di altri5,6,7,8 e noi9,10,11, 12,13,14,15-DENV è attivamente replicato nel cervello murino sperimentale9,10,11, 12 mila , 13 del sistema , 14 Del sistema , 15, e i possibili effetti dei fattori virali e delle risposte dell'ospite sulla neuroinfiammazione, così come sulla neurotossicità, sono quindi di interesse.
Per la neuropatogenesi, la stimolazione dell'apoptosi delle cellule neuronali è innescata dall'infezione da DENV e dall'infiammazione del SNC, come l'attivazione delle cellule microgliali seguita dalla produzione di necrosi tumorale citochina infiammatoria8, 12,15. Si ritiene che la neurotossicità diretta causata dall'infezione da DENV e dalla neuroinfiammazione indiretta avviata dalle risposte immunitarie dell'ospite sia coinvolta nell'encefalite dengue. L'encefalite virale acuta è causata da infiammazione del SNC indotta da virus del cervello3,21. Sintomi clinici comuni sono febbre alta, mal di testa, collo e schiena rigida, vomito e confusione, mentre i casi gravi sviluppano anche convulsioni, paralisi e coma21. Monitorando i cambiamenti nei punteggi con postura gobbo, sequestro limbico, debolezza limbica, paralisi e morte, lo sviluppo di queste malattie mostra la progressione della malattia acuta virale simile all'encefalite nei topi infettati da DENV9, 10 del sistema , 11 Del sistema di , 12 mila , 13 del sistema , 14 Del sistema , 15.In generale, i topi infetti da DENV con un punteggio di 3 (secondo il metodo di punteggio della malattia presentato nel protocollo) hanno rapidamente progredito alla paralisi e alla morte. I meccanismi patogeni che causano queste malattie richiedono ulteriori indagini; tuttavia, si ipotizza che la disfunzione neuronale seguita dall'induzione della neuropatia sia coinvolta21. Mirare alla replicazione virale, così come l'infiammazione del SNC mediata da TNF10,11,12,13,14, almeno in parte, conferisce effetti terapeutici contro la progressione della malattia acuta dell'encefalite virale associata alla dengue. Il protocollo di questo studio potrebbe essere utilizzato per creare un modello patologico simile all'encefalite dell'infezione Da DENV.
Alcuni studi hanno descritto l'induzione dell'emorragia intracerebrale indotta dall'infezione da DENV nel cervello22,23. In precedenza abbiamo mostrato l'induzione di interruzioni BBB nei topi infettati da DENV9. Anche se DENV non è riconosciuto come un virus neurotropico, DENV può produrre un'infezione efficace nelle cellule neuronali in vivo e in vitro8,11. Il recettore D2 della dopamina (D2R) si ipotizza che sia un recettore neuronale per l'infezione da DENV, e il targeting farmacologico D2R riduce efficacemente l'infezione da DENV nelle cellule neuronali in vivo e in vitro, nonché le malattie encefalitiche indotte da DENV11, 24. Possibili strategie terapeutiche contro l'encefalite virale acuta sono importanti da sviluppare in modo che possano essere trattati casi di dengue gravi con complicanze neurologiche. Per la sua futura applicazione, questo protocollo di un modello di malattia che utilizza l'infezione Da DENV nel cervello può diventare una piattaforma in vivo per vagliare non solo i fattori virali e ospiti associati alla neuropatogenesi, ma anche possibili farmaci antivirali e anti-encefalitici. Per quanto riguarda l'incidenza di disturbi neurologici varianti causati dall'infezione DaENV25 da questo protocollo stabilito, la differenza tra i tipi di variabili e/o ceppi di DENV per causare disfunzione neurologica è necessaria per la convalida.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni del Ministero della Scienza e della Tecnologia (MOST107-2321-B-038-001) e dal finanziamento intramurale 106TMU-CIT-01-2, Taipei, Taiwan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Roswell Park Memorial Institute 1640 medium (RPMI) | Gibco | 11875-085 | Diluting virus |
| 0.3 mL Insulin Syringe | BD Ultra-FineII | 328838 | Intracerebral and intraperitoneal injection |
| Microbalance | METTLER TOLEDO's LabX | AL104 | Weight mouse |
| Non-adapted DENV2 (strain PL046) | The Centers for Disease Control of Taiwan | - | Infect mouse |
| Institute of Cancer Research (ICR) suckling mouse | BioLASCO Taiwan Co., Ltd | - | Our murine model |
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