Summary
Dit protocol toont injectie van een retrogradely vervoerbare virale vector in rat ruggenmerg weefsel. De vector is overgenomen in de synaps en vervoerd naar de cel lichaam van doel neuronen. Dit model is geschikt voor retrograde tracering van belangrijke spinale trajecten of targeting cellen voor gen-therapie-toepassingen.
Abstract
Invoering van proteïnen van belang in cellen in het zenuwstelsel is uitdagend als gevolg van aangeboren biologische barrières die de toegang tot de meeste moleculen beperken. Injectie rechtstreeks in het ruggenmerg weefsel omzeilt deze belemmeringen, toegang tot cel organen of synapses waar moleculen kunnen worden opgenomen. Virale vector technologie combineren met deze methode zorgt voor het binnenbrengen van doelgenen zenuwweefsel ten behoeve van gentherapie of tractus tracering. Hier is een virus dat is ontworpen voor zeer efficiënte retrograde vervoer (HiRet) geïntroduceerd op de synapsen van propriospinal interneuronen (PNs) ter bevordering van specifieke vervoer naar neuronen in het ruggenmerg en de kernen van de hersenstam. Gericht op de PNs profiteert van de talrijke verbindingen die zij van motor trajecten zoals de rubrospinal en reticulospinal traktaten, evenals hun interconnectie met elkaar hele segmenten van het ruggenmerg ontvangen. Representatieve tracering met behulp van de vector HiRet met de constitutively actieve groen fluorescente proteïne (GFP) toont HiFi details voor cel organen, axonen en dendritische arbors in thoracale PNs en in de reticulospinal neuronen in de pontine Formatio vorming. HiRet integreert goed in de hersenstam trajecten en PNs maar toont van de leeftijd afhankelijke integratie in corticospinal tract neuronen. Kortom is ruggenmerg injectie met behulp van virale vectoren een geschikte methode voor het binnenbrengen van neuronen van gerichte traktaten van proteïnen van belang.
Introduction
Virale vectoren zijn belangrijke biologische hulpmiddelen die genetisch materiaal kunnen introduceren in cellen om te compenseren voor defecte genen, upregulate belangrijke groei eiwitten of marker eiwitten die wijzen op de structuur en de synaptische Connecties van vervaardiging hun doelstellingen. Dit artikel richt zich op directe injectie van een zeer efficiënte retrogradely vervoerbare lentivirale vector in het ruggenmerg rat om te benadrukken grote motor trajecten met fluorescerende tracering. Deze methode is ook zeer geschikt voor axonale regeneratie en hergroei studies te introduceren van proteïnen van belang in diverse populaties van neuronen en heeft geweest tweedehands voor zwijgen neuronen voor functionele toewijzing studies1,2.
Veel van de anatomische details voor spinale motor trajecten werden toegelicht door middel van directe inspuiting studies met klassieke traceurs zoals BDA en fluoro-goud3,4,,5,,6,7 , 8. deze verklikstoffen worden beschouwd als gouden standaard maar wellicht bepaalde nadelen zoals opname door beschadigde axonen of axonen in de passage in de witte stof rondom een injectie site9,10,11 . Dit kan kan leiden tot onjuiste interpretaties van traject connectiviteit en een nadeel in regeneratie studies waar de kleurstof absorptie door beschadigd of afgehakte axonen voor het regenereren van de vezels tijdens latere analyse12kon vergissen.
Lentivirale vectoren zijn populair in gen therapie onderzoeken, zoals zij stabiele expressie in neuronale populaties13,14,15,16,17,18 leveren ,19. Echter, traditioneel verpakte lentivirale vectoren kunnen hebben beperkte retrograde vervoer en kan leiden tot immuunsysteem reactie wanneer gebruikt in vivo4,20,21. Een uiterst efficiënte retrograde vervoer vector genoemd HiRet opgesteld door Kato et al. door aanpassing van de virale envelop met een rabiës virus glycoproteïne maken een hybride-vector die retrograde vervoer22,23 verbetert.
Retrograde tracering introduceert een vector in de synaptische ruimte van een target neuron, waardoor het te worden in beslag genomen door de axon van die cel naar de cel lichaam vervoerd. Succesvolle vervoer van HiRet is gebleken uit de neuronale synapsen in de hersenen van muizen en primaten23,24 en de spier in motorische neuronen22. Dit protocol toont injectie in de lumbale ruggemerg, specifiek gericht zijn op de synaptische terminals van propriospinal interneuronen en hersenstam neuronen. PNs ontvangen van verbindingen van vele verschillende spinale routes en kunnen dus worden gebruikt om een diverse bevolking van neuronen in het ruggenmerg en hersenstam richten. Gelabelde neuronen in deze studie vertegenwoordigen schakelingen innervating motor neuron zwembaden met betrekking tot stuk motor functie. Robuuste labeling is te zien in het ruggenmerg en hersenstam, met inbegrip van high-fidelity details van dendritische arbors en axon terminals. Wij hebben deze methode ook gebruikt in eerdere studies binnen het cervicale ruggenmerg aan het label propriospinal en hersenstam reticulospinal trajecten25.
Dit protocol toont injectie van een virale vector in de lumbale ruggemerg van een rat. Zoals te zien in de film 1, wordt de incisie wordt gericht door het identificeren van de L1 wervel attractiepark van de laatste rib. Dit wordt gebruikt als een caudal mijlpaal voor een incisie voor 3-4 cm die de daaraan gehechte spiermassa over het ruggenmerg L1-L4 bloot. Laminectomies van de dorsale aspecten van de wervels T11-T13 worden uitgevoerd en een schuine glazen naald is gericht 0.8 mm lateraal van de middellijn en verlaagde 1,5 mm diep in de grijze stof te injecteren van virus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle volgende chirurgische en dierlijke verzorging procedures zijn goedgekeurd door de zorg van het dier en gebruik Comité van Temple University.
1. vooraf chirurgische preparaten
- Bereiden getrokken glas naalden voor virale injectie een paar dagen voor de ingreep met behulp van 3,5 nanoliter glazen capillaire pipetten ontworpen voor nanoliter injectoren. Trek elke pipet op een trekker naald in twee stappen volgens de instructies van de fabrikant om twee naald-sjablonen te maken.
- Verfijn het puntje van de naald-Sjablonen door het afsnijden van ongeveer 1-2 mm van overtollige glas met microscissors. Maatregel geschatte apertuurgrootte onder een microscoop met een microscoopglaasje kalibratie te isoleren van de naalden met 30-40 µm openingen.
- Met de naald 30 ° gepositioneerd, maak een micropipet beveller een tip met een diafragma van 30-40 µm en een schuine hoek van 45°. Controleer of diafragma breedte met de schuifmaat schaal op de dia kalibratie. Water en ethanol passeren door de naald van de glazen met behulp van een spuit met een flexibele naald bijlage wegwassen van puin en markeren van de naald op gezette tijden met een zwarte marker.
- Plaats de naalden in een overdekte petrischaal eerder gereinigd met 70% ethanol en steriliseren gedurende 30 min. in een bioveiligheid kap onder UV-licht.
- HiRet lentivirus voorbereiden door een geschikt volume verwijderen uit de vriezer onmiddellijk voorafgaand aan de procedure.
Opmerking: Een geschikt volume omvat het bedrag dat nodig is voor injectie (1 µL per injectie x aantal injecties) plus een kleine hoeveelheid extra volume pipetteren en laden van verliezen. Vervoer en opslag van het virus op ijs wanneer niet in gebruik. - Bereid de injector door de stekker in de micropump en plaatsen het in een micromanipulator met een schuifmaat schaal.
- Uitgerust met een flexibele naald om te bereiden de naald van glas, zorgvuldig het laden van een gekleurde kleurstof zoals rode olie met een injectiespuit. Ervoor zorgen dat er geen luchtbellen in de naald blijven. Gebruik van aseptische techniek bij het verwerken van de naald, en zich onthouden van het aanraken van het uiteinde.
- De glas-naald invoegen de injector, ervoor te zorgen dat de naald correct in de sluitringen zit, het GLB injector is geschroefd strak, en de stalen injector naald is uitgebreid ongeveer ¾ de lengte van de naald van glas. Virussen kan worden geladen in de naald in een latere stap.
2. de anesthesie en de chirurgische bouwrijp
- Het dier op een digitale weegschaal wegen. Record het pre-operatieve gewicht kunnen bepalen van de omvang van de verdoving nodig en kunnen voor de controle van gewicht na chirurgie. Vrouwelijke Sprague-Dawley ratten ongeveer 200-250 g werden gebruikt in dit protocol.
- Anesthetize van de rat met Isofluraan inademing of een ingespoten ketamine/xylazine-oplossing (k / x). Hier, wordt ketamine geïnjecteerd intraperitoneally op een 67 mg/kg en xylazine bij een dosering van 6,7 mg/kg.
- Bevestig een passende verdoving vliegtuig door het knijpen van de voet stevig. Als reflexief terugtrekking optreedt, wacht u enkele extra minuten voordat u verdergaat.
Opmerking: Let ook op de snorharen, ogen en ademhalingstarief voor tekenen van bewustzijn. Als de snorharen zijn spiertrekkingen, het oog knippert wanneer zachtjes aangeraakt of ademhaling snelle en ondiepe is, wacht totdat de verdoving vliegtuig dieper is te gaan met het protocol. Ook controleren deze borden gedurende de operatie laminectomie en injectie. Als het dier wordt weergegeven een ondiepe verdoving vliegtuig, beheren een booster shot van ketamine-alleen equal in ½ de oorspronkelijke k / x dosering. - De rat langs de dorsale middellijn vanaf de heupen naar de inferieure hoek van de scapulae scheren. Trek de huid van het dier strak voor een eenvoudiger en nauwkeuriger scheerbeurt.
- Ophthalmic zalf toepassen op beide ogen.
- Toepassing antiseptische aan de geschoren gebied te steriliseren van de site. Geniet voor de eerste scrub, steriel gaas met een 5% jodiumoplossing en veeg weg alle haren en puin. Volg dit met een unidirectionele vegen met steriel gaas gedrenkt in 70% ethanol, zodat geen enkel terrein is twee keer gecontacteerd. Deze zelfde techniek gebruiken met afwisselende jodium en ethanol doordrenkte gaas tweemaal meer.
3. chirurgische instrument voor veld en voorbereiding
- Bereid een reeks van gesteriliseerde met autoclaaf chirurgische tools die een scalpel, rongeurs, rat tand pincet, schaar van de lente, hemostats, middellange punt gebogen pincet en oprolmechanismen of gewogen haken door het uitpakken van de steriele wrap als een steriel veld wilt maken.
- Open een pakket van steriele chirurgische handschoenen en de steriele handschoen wrap plaats op de tafel. Gebruik dit als een extra steriel veld voor gebruikte hulpmiddelen ter voorkoming van verontreiniging van de steriele wrap.
- Een #10 scalpel blad in het steriel veld neerzet. Beveilig het mes met een handvat met hemostats. Positie steriele zoutoplossing, 4.0 chromic catgut hechtdraad en materialen te controleren bloeden zoals een cauterizer, steriel gaas, steriele katoen-tipped applicators (voor spier overvloeien), of gelfoam of bonewax (voor bot overvloeien) op een toegankelijke plaats.
- Ophalen van het dier en stel deze in op een steriele doek. Gaas onder de blaas verzamelt urine plaats. Het doelgebied met een opgerolde handdoek onder de buik overeind. Indien beschikbaar, plaatst u een chirurgische verwarming pad onder de steriele doek, met name voor langere procedures.
Opmerking: Steriliteit is belangrijk tijdens overleving chirurgie. Houd een spray fles van 70% ethanol aan kant te handhaven steriliteit van gehandschoende handen en een gebruik kraal sterilisator indien instrument steriliteit in gevaar komt, of tussen individuele operaties.
4. het blootstellen van de wervelkolom en het identificeren van de laminectomie-site
- Identificeren van het gebied waar een huid snede gemaakt zal worden door de vingers zachtjes op de laatste rib te vinden van de L1 wervel. Gebruiken van dit als een mijlpaal, maken een huid incisie van 3-4 cm met een chirurgische scalpel van #10 eindigt net inferieur aan L1 bloot van de spier. De huid strak te houden door het verspreiden van de zachte en druk stevig met de scalpel mes om een schone snede.
- Gesneden en uitgespreid oppervlakkige vet met Tang en schaar indien nodig. (Afhankelijk van de doelstelling de wervel, er kan dan niet een groot vet pad oppervlakkig naar de spier).
- Gevoel voor de processen van de spinous met de flat van het scalpel blad of een vinger. Vaak zal het gebied schouderstreek worden aangegeven door een "V" van witte fascia aan weerszijden. Een kleine rostraal snede om de kamer te grijpen veilig op een bovenste proces met een rat tand Tang, dan bezuinigen 2 lange, diepe zo dicht mogelijk bij de processen mogelijk te maken. Op het diepste punt van het deelstuk uitmaakt, kan het dorsale oppervlak van de wervels worden gevoeld met het scalpel blad.
- Houd de laterale spieren opzij met oprolmechanismen of de gewogen haken om zichtbaarheid te verbeteren. Duidelijke spieren rond de processen met een scalpel, voorjaar schaar of rongeurs om te bepalen van de vorm van hun hoofd.
Nota: Herinner me dat het ruggenmerg verlengt niet de volledige lengte van de wervelkolom, zoals ruggenmerg weefsel stopt eerder in ontwikkeling dan bot groeit. Dit betekent dat het streefniveau van de wervelkolom onder een verschillend benoemde wervel kan zijn. - Zoek de T11 en de aangrenzende T12 en T13 processen.
Opmerking: Hulp in doelgerichtheid juiste Vertebrale niveaus kan worden gevonden in een rat ruggenmerg atlas en eerdere studies waarin monumenten in de muis, die een zeer vergelijkbaar heeft Vertebrale structuur6,33. Laat een rostraal spinous proces zoals T9 ongestoord te geven een middellijn mijlpaal.
5. uitvoeren van een laminectomie
- Zodra het doelgebied correct is vastgesteld, laminectomies van de dorsale aspecten van T11-T13 uitvoeren Zachtjes verspreid de wervels te onthullen lat. ligamenten, die zijn goede plaatsen om in te voegen van rongeurs voor de eerste hap van bot. Houd de rongeurs in een half gesloten positie te verhogen van fijne controle.
- Verwijder de spinous processen en het dorsale aspect van de wervels door middel van kleine hapjes met de rongeurs. Wees voorzichtig niet om beschadiging van het ruggenmerg of verstoren van de dura. Lift iets met de rat tand verlostang om te helpen trekken het ruggenmerg uit de buurt van de wervels en de neiging om te raken van ruggenmerg weefsel afnemen.
- Duidelijke bot weg vanaf de middellijn zodat de middellijn bloedvat kan worden waargenomen. Laat een venster dat duidelijk toont het ruggenmerg weefsel en is vrij van vuil.
- Zachtjes aanraken het ruggenmerg met een tang. Sommige dieren kunnen reflexively springen, zelfs als hun verdoving vliegtuig diep is. Een paar druppels van een numbing agent zoals lidocaïne rechtstreeks toepassen op het ruggenmerg om te voorkomen dat springen tijdens de injectie-procedure.
- Beveilig het dier in een spinale houder door bevestiging van stabiliserende pincet te spinous processen rostraal en caudal naar het venster laminectomie. Verhogen van de buik van het dier met behulp van de spinale houder te ontkennen van het effect van de ademhaling van bewegingen. Dit zal verhogen naald stabiliteit en zorgen voor passende diepte van injectie.
6. veilig laden virus en positionering van de injector
- Virus in de injector laadt door ongeveer 5 µL op een stuk van parafilm pipetteren en positionering van de naald, zodat het puntje binnen de daling is.
- Gebruik de micropump terug te trekken tot 4 µL van het virus met een snelheid van 20-100 nL/s.
- Instellen van de controller te injecteren en laat een kleine hoeveelheid virus vanuit de naald om ervoor te zorgen dat het topje van de naald niet wordt geblokkeerd. Veeg overtollige virus met het wissen van een laboratorium.
Opmerking: Een Hamilton spuit met een stalen naald kan worden gebruikt als alternatief voor getrokken glas pipetten. - Plaats de micromanipulator zodat de Vernier schaal zichtbaar is en plaats de naald op de middellijn van het ruggenmerg.
Opmerking: De middellijn kan soms worden gevonden door een groot bloedvat draait op het voorste oppervlak van het ruggenmerg. Echter dit kan verschillen in individuele ratten en middellijn targeting dient bevestigd te worden ten opzichte van een intact spinous proces. - Direct de naald lateraal door 0.8 mm met behulp van de Vernier-schaal op de micromanipulator.
- Verlaag de naald naar het ruggenmerg totdat het is inspringen, maar niet prikken, de dura. Punctie met behulp van een snel draaiende beweging, de dura met de naald totdat het is gedaald tot een diepte van 1.5 mm.
7. het injecteren van virus in het ruggenmerg
- Zodra de naald in de plaats is, de injector te injecteren met een snelheid van 400 nL/min. bevestigen dat virus programma is het invoeren van het ruggenmerg door het observeren van de voortgang van de voorkant van de kleurstof. Moet er geen voor de hand liggende lekkage of bolling van ruggenmerg weefsel. Indien lekkage wordt waargenomen, kan dit soms worden verlicht door het verminderen van de snelheid van de injectie tot 200 nL/min.
- Zodra de injectie is voltooid, zodat de naald om uit te rusten in het ruggenmerg voor 2-5 minuten (afhankelijk van geïnjecteerd volume) om verspreiding van het virus.
- Langzaam trekt de naald en verplaatsen naar de volgende injectieplaats. Injecteren 1 µL van virus in elk van 6 gelijkmatig verdeelde sites ongeveer 1 mm uit elkaar langs de lengte van de spinale weefsels van L1-L4. De dezelfde naald kan worden gebruikt voor elke injectie zolang het blijft functioneren.
8. gekronkeld sluiting en postoperatieve zorg
- Verwijderen van het dier uit de spinale houder en neem uit de oprolmechanismen of haken gebruikt voor het verspreiden van laterale spier. Zorg ervoor dat de wond duidelijk van alle vuil alvorens af te sluiten is.
- Suture van de spier met behulp van een 4.0 chromic catgut hechtdraad. Knip draden van de hechtdraad dicht bij de knoop te verminderen kans op interne huidirritatie.
- Nieten de huid gesloten 9 mm wond clips gebruiken. Als u wilt toestaan voor optimale genezing, line-up de randen van de huid voor nieten.
- Plaats het dier op een water convectie opwarming pad en monitor totdat wakker.
- Injecteren van 5-10 mL steriele zoutoplossing subcutaan te vullen vloeistoffen en een antibioticum zoals cefazolin om infectie te voorkomen. Wanneer het dier is ambulant, plaats het terug in zijn kooi en bieden eerste analgetica. Toezicht op de rats voor enig teken van ongerief en pijn en behandelen volgens de procedure van uw IACUC goedgekeurd voor verlichting van pijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Succesvolle injectie en vervoer van de virale vector moeten resulteren in signaaltransductie van een robuuste bevolking van unilaterale neuronen in het ruggenmerg, en in bepaalde kernen van de hersenstam. Figuur 1 toont de stereotiepe etikettering van neuronen en axonen in het thoracale ruggenmerg en in de pontine Formatio vorming van de hersenstam op vier weken na injectie. Belangrijke GFP expressie wordt gezien in de neuronen in de grijze stof van het thoracale ruggenmerg aan de kant ipsilaterale om de injectie (figuur 1A, boxed gebied). Een paar neuronen worden ook waargenomen aan de contralaterale zijde, met name in de buurt van de middellijn. In de witte stof, is GFP expressie waargenomen in axonen in de ipsilaterale snoer (figuur 1A, pijlen en pijlpunten), met name in gebieden typerend is voor propriospinal axonen (pijlpunten). Figuur 1A' toont een hogere vergroting van de doos gebied in A, demonstrerende typische expressie in neuronale cel organen en dendrites. GFP expressie in neuronen kan ook worden waargenomen in de kernen van de hersenstam zoals de pontine Formatio vorming (figuur 1B, hogere vergroting van de doos gebied in figuur 1B').
Figuur 1: transductie van neuronen in het ruggenmerg en hersenstam. (A) GFP expressie in neuronen (boxed gebied), de axonen van neuronen van de propriospinal (pijlpunten) en de axonen van andere traktaten (pijlen) in het thoracale ruggenmerg. (A') Hogere vergroting van neuronale expressie in de doos gebied van A. (B) de pontine Formatio vorming in de hersenstam GFP-geëtiketteerden neuronen en dendrites uitspreken. (B') Hogere vergroting van de doos gebied in B. Schaal bars: (A) = 500 μm; (B) = 1 mm; (A'), (B') = 50 μm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Filmpje 1: Gericht op de injectie in de lumbale ruggemerg van de rat. Deze video samenvattingen de basisprincipes van de doelgerichtheid en de injectie van een virale vector in het ruggenmerg rat. Gelieve Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Genetische manipulatie van neuronen in de hersenen en het ruggenmerg heeft gediend om te markeren zintuiglijke, motorische en autonome trajecten via fluorescerende tracering en hergroei mogelijkheden verkennen van neuronale traktaten na letsel27,28, 29 , 30 , 31 , 32 , 33. directe injectie van een retrogradely vervoerbare virale vector in het ruggenmerg populaties van de neuronale via hun synaptic verbindingen, waardoor deze methode een uitstekende keuze voor toewijzing trajecten in het centrale zenuwstelsel kan richten. De vector HiRet toont specifiek selectieve opname op de neuronale synaps22,24,25, en vorige traceren met op soortgelijke wijze gestructureerde vectoren toonde geen verspreiding in benadeelde axonen of ongerelateerde cellen 34 , 35, die strookt met de resultaten die met de HiRet constructie22,23,25. Directe inspuiting van HiRet als een retrograde tracer is dus een ideale methode voor het verkennen van interneuronal circuits die plasticiteit ondergaan na blessure.
Er zijn twee kritieke begrippen betrokken bij succesvolle injectie van een virale vector in het ruggenmerg. De eerste is de oprichting van de juiste doelgroep met de glas-naald, en de tweede is het waarborgen van adequate stroom van het virus van de naald in het weefsel. Als dit protocol retrograde tracering gaat, vereist gericht op het juiste gebied een grondige kennis van de synaptische aansluitingen van de neuronale bevolking van belang. Propriospinal en reticulospinal neuronen verbinden met het lumbale ruggenmerg zijn hier gericht. Deze neuronen zijn verspreid over de hersenstam en het ruggenmerg van de cervicale en thoracale segmenten, met de meerderheid van PNs gelokaliseerd op laminae V-VII binnen de grijze stof. Om ervoor te zorgen transductie van een voldoende aantal neuronen, zijn zes virale injecties gemaakt over een gebied verspreid over vier spinale segmenten. De L1-L4-segmenten zijn gekozen vanwege de aanwezigheid van de centrale patroon generatoren, en hun bekende connecties naar andere gebieden van het ruggenmerg. Zodra de juiste spinale segmenten aan de betreffende bedrijfsactiviteit en laminae bekend zijn, is de fysieke locatie van deze doelstellingen via anatomische bezienswaardigheden cruciaal. Atlassen gedetailleerde anatomische structuur en vertebrale vorm kunnen nuttig zijn om te bevestigen targeting bezienswaardigheden8,36. Opgemerkt moet worden dat de meerderheid van dit protocol het zelfde blijft of een injectie of zes zijn gemaakt; het verschil is alleen in het aantal spinale segmenten blootgesteld via laminectomie, en het feit dat u zult moeten herladen de naald glas met extra virus als meer dan 4 µL injecteren. Het protocol kan ook worden gemakkelijk aangepast voor de muis. Als gevolg van zijn kleinere formaat, de hoeveelheid virus geïnjecteerd in het snoer moet naar beneden worden aangepast en de metingen die nodig zijn om te raken van de juiste spinale laminae aangepast. Verschillende video's van soortgelijke operaties op de muis zijn eerder gepubliceerde37,,38.
De volgende overweging is voldoende verspreiding in het weefsel. Zorgvuldige voorbereiding van de naald is noodzakelijk om ervoor te zorgen dat het diafragma voldoende voor de virale schorsing is te stromen naar buiten en dat vuil worden niet geblokkeerd voor de tip, en visualisatie van de stroom van de naald in het ruggenmerg via een front van gekleurde kleurstof nuttig om te bevestigen dat de opschorting is de doordringing van het weefsel. Zodra de opschorting is rondgedeeld in het weefsel, het handhaven van de naald in het ruggenmerg voor 2-5 minuten zal ervoor zorgen voldoende verspreiding.
Succesvolle transductie van een doelgroep kan ook afhangen van de intrinsieke eigenschappen van het virus geïnjecteerd zoals titer, serotype en infectie efficiëntie. Wij vinden een genomic kopie titer van ten minste 1010 GC/mL voor HiRet lentivirus goed te werken voor in vivo experimenten. Hogere titers of injectie volumes hoger labeling index kunnen tonen, maar zorg moet worden genomen, aangezien het virus uit het beoogde gebied, of in het contralaterale ruggenmerg kan verspreiden. Aandacht moet ook uitgaan naar het type van vector geschikt voor labeling cellen van belang op basis van hun tropisme. Bepaalde virale serotypen wellicht beter infectie en transductie tarieven in verschillende populaties van neuronen39. Traditionele lentivirale vectoren is bekend dat het infecteren van een breed scala aan celtypes als gevolg van de VSV-G envelop eiwitten, maar wijzigingen aan deze vector invloed op haar tropisme40 hebben kunnen. De HiRet-constructie wijzigt de envelop door pseudotyping met een fusion-glycoproteïne (FuG-B) van het rabiësvirus, die zorgt voor uiterst efficiënte retrograde vervoer22,23 , en is effectief in het transducing propriospinal en reticulospinal traktaten, met neuronale aantallen vergelijkbaar met tract traceren via methoden zoals fluorogold en microruby4,41 (voor meer informatie over de bouw van het HiRet vector Zie Hirano et al.) 22. maar het deed niet voldoende label de volwassen corticospinal tract in deze experimenten, maar het de CST bij pasgeborenen met een hoog rendement in andere studies1label. Het is mogelijk dat receptoren nodig voor opname van de HiRet op de gerichte synapsen, zoals NCAM of p75NTR, zijn slechts zwak uitgedrukt op volwassen CST neuronen42,43, hoewel dit nog steeds wordt onderzocht. In ieder geval blijkt hieruit het belang om te bepalen of de vector wordt gebruikt geschikt voor de gerichte cellen is. In dit experiment, werden hersenen en ruggenmerg weefsel verwerkt en peilden na vier weken om overvloedige tijd voor versterking en vervoer van de lumbale koord tot alle hersengebieden. HiRet wordt vervoerd via snel retrograde axonale vervoer en dus een kortere proefperiode kan dienstig zijn als de afgelegde afstand minder, zoals is als de injectie-gebied in het cervicale ruggenmerg is.
Directe inspuiting chirurgie is een nuttig instrument voor de invoering van virale vector technologie in het ruggenmerg. Gebruik van HiRet voor genetische experimenten gunstig is als het toelaat testing, lang blijvende transgenic expressie, en is niet-toxisch aan neuronen. In dit experiment werd geen GFP labeling gezien in neuronen die niet direct synaptic verbindingen naar het gebied van de injectie maken. Dit klopte ook in eerdere studies bij dieren met een thoracale kneuzingen letsel25. Bovendien kon HiRet-GFP label spinale motorische neuronen of achterwortelganglia ganglion neuronen wanneer geïnjecteerd in de Transient demyelinated nervus ischiadicus (niet-gepubliceerde opmerkingen). Samen, suggereren deze gegevens dat HiRet niet gemakkelijk via axonen betreden en efficiënt transduces neuronen door opname van de vector op de synapsen, die een meer gedetailleerde en hifi-kaart van neuronale verbindingen van de gerichte bevolking. Dit is een voordeel ten opzichte van andere retrogradely vervoerbare virale vectoren zoals retrograde adeno-associated virus (rAAV-retro), waarvan bekend is dat worden overgenomen door axonen in passage44 en maakt HiRet vooral nuttig bij studies mapping regenereren en reconnecting circuits in de gewonde ruggenmerg. HiRet de voordelen kunnen ook toestaan voor specifieke targeting van neuronale populaties voor zwijgen of ablatie studies25,44,45,46,47.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door een subsidie van de National Institute of Neurological Disorders en beroerte R01 R01NS103481 en het Shriners ziekenhuis voor pediatrisch onderzoek verleent SHC 84051 en SHC 86000 en het ministerie van defensie (SC140089).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #10 Scalpel Blades | Roboz | RS-9801-10 | For use with the scalpel. |
| 1 mL Syringes | Becton, Dickinson and Company | 309659 | For anesthetic IP injection, potential anesthetic booster shots, and antibiotic injections. |
| 10mL Syringes | Becton, Dickinson and Company | 309604 | For injecting saline into the animal, post-surgery. |
| 4.0 Chromic Catgut Suture | DemeTECH | NN374-16 | To re-bind muscle during closing. |
| 48000 Micropipette Beveler | World Precision Instruments | 32416 | Used to bevel the tips of the pulled glass capillary tubes to form functional glass needles. |
| 5% Iodine Solution | Purdue Products L.P. | L01020-08 | For use in sterilzation of the surgical site. |
| 70% Ethanol | N/A | N/A | For sterilization of newly prepared glass needles, animal models during surgical preparation, and surgeon's hands during surgery, as well as all other minor maintainances of sterility. |
| Anesthetic (Ketamine/Xylazine Solution) | Zoetis | 240048 | For keeping the animal in the correct plane of consciousness during surgery. |
| Antibiotic (Cefazolin) | West-Ward Pharmaceuticals | NPC 0143-9924-90 | To be injected subcutaneously to prevent infection post-surgery. |
| Bead Sterilizer | CellPoint | 5-1450 | To heat sterilize surgical instruments. |
| Bonewax | Fine Science Tools | 19009-00 | To seal up bone in the case of bone bleeding. |
| Cauterizer | Fine Science Tools | 18010-00 | To seal any arteries or veins severed during surgery to prevent excessive blood loss. |
| Digital Scale | Okaus | REV.005 | For weighing the animal during surgical preparation. |
| Flexible Needle Attachment | World Precision Instruments | MF34G-5 | For cleaning glass needles and loading red oil into glass needles. |
| Gelfoam | Pfizer | H68079 | To seal up bone in the case of bone bleeding. |
| Glass Capillary Tubes | World Precision Instruments | 4878 | For pulled glass needles - should be designed for nanoliter injectors. |
| Hair Clippers | Oster | 111038-060-000 | For clearing the surgical site of hair. |
| Hemostats | Roboz | RS-7231 | For general use in surgery. |
| Kimwipes | Kimtech | 34155 | For general use in surgery. |
| Medium Point Curved Forceps | Roboz | RS-5136 | For general use in surgery. |
| Micromanipulator with a Vernier Scale | Kanetec | N/A | For precise targeting during surgery. |
| Microscissors | Roboz | RS-5621 | For cutting glass whisps off of freshly pulled glass capillary tubes. |
| Microscope with Light and Vernier Scale Ocular | Leitz Wetzlar | N/A | Used to visualize and measure beveling of pulled glass capillary tubes into functional glass needles. |
| MicroSyringe Pump Controller | World Precision Instruments | 62403 | To control the rate of injection. |
| Nanoliter 2000 Pump Head Injector | World Precision Instruments | 500150 | To load and inject virus in a controlled fashion. |
| Needle Puller | Narishige | PC-100 | To heat and pull apart glass capillary tubes to form glass needles. |
| Ophthalamic Ointment | Dechra Veterinary Products | RAC 0119 | To protect the animal's eyes during surgery. |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | To assist with loading virus into the nanoinjector. |
| PrecisionGlide Needles (25G x 5/8) | Becton, Dickinson and Company | 305122 | For use with the 1mL and 10 mL syringes to allow injection of the animal model. |
| Rat Tooth Forceps | Roboz | RS-5152 | For griping spinous processes. |
| Red Oil | N/A | N/A | To provide a front for visualization of virus entering tissue during injection. |
| Retractors | Roboz | RS-6510 | To hold open the surgical wound. |
| Rimadyl Tablets | Bio Serv | MP275-050 | For pain management post-surgery. |
| Rongeurs | Roboz | RS-8300 | To remove muscle from the spinal column during surgery. |
| Scalpel Blade Handle | Roboz | RS-9843 | To slice open skin and fat pad of animal model during surgery. |
| Scissors | Roboz | RS-5980 | For general use in surgery. |
| Stainless Steal Wound Clips | CellPoint | 201-1000 | To bind the skin of the surgical wound during closing. |
| Staple Removing Forceps | Kent Scientific | INS750347 | To remove the staples, should they be applied incorrectly. |
| Sterile Cloth | Phenix Research Products | BP-989 | To provide a sterile surface for the operation. |
| Sterile Cotton-Tipped Applicators | Puritan | 806-WC | To soak up blood in the surgical wound while maintaining sterility. |
| Sterile Gauze | Covidien | 2146 | To clean the surgical area and surgical tools while maintaining sterility. |
| Sterile Saline | Baxter Healthcare Corporation | 281324 | For use in blood clearing, and for replacing fluids post-surgery. |
| Surgical Gloves | N/A | N/A | For use by the surgeon to maintain sterile field during surgery. |
| Surgical Heating Pad | N/A | N/A | For maintaining the body temperature of the animal model during surgery. |
| Surgical Microscope | N/A | N/A | For enhanced visualization of the surgical wound. |
| Surgical Stapler | Kent Scientific | INS750546 | To apply the staples. |
| T/Pump Heat Therapy Water Pump | Gaymar | TP500C | To pump warm water into the water convection warming pad. |
| Water Convection Warming Pad | Baxter Healthcare Corporation | L1K018 | For use in the post-operational recovery area to maintain the body temperature of the unconscious animal. |
| Weighted Hooks | N/A | N/A | To hold open the surgical wound. |
References
- Wang, X., et al. Deconstruction of corticospinal circuits for goal-directed motor skills. Cell. 171 (2), 440-455 (2017).
- Kinoshita, M., et al. Genetic dissection of the circuit for hand dexterity in primates. Nature. 487 (7406), 235-238 (2012).
- Brichta, A. M., Grant, G. Cytoarchitectural organization of the spinal cord. The rat nervous system. Vol. 2, hindbrain and spinal cord. , Academic Press. (1985).
- Liang, H., Paxinos, G., Watson, C. Projections from the brain to the spinal cord in the mouse. Brain Structure & Function. 215 (3-4), 159-186 (2011).
- Rexed, B. The cytoarchitectonic organization of the spinal cord in the cat. The Journal of Comparative Neurology. 96 (3), 414-495 (1952).
- Schmued, L. C., Fallon, J. H. Fluoro-gold: A new fluorescent retrograde axonal tracer with numerous unique properties. Brain Research. 377 (1), 147-154 (1986).
- Veenman, C. L., Reiner, A., Honig, M. G. Biotinylated dextran amine as an anterograde tracer for single- and double-labeling studies. Journal of Neuroscience Methods. 41 (3), 239-254 (1992).
- Watson, C., Paxinos, G., Kayalioglu, G., Heise, C. Atlas of the rat spinal cord. The spinal cord. , 238-306 (2009).
- Brandt, H. M., Apkarian, A. V. Biotin-dextran: A sensitive anterograde tracer for neuroanatomic studies in rat and monkey. Journal of Neuroscience Methods. 45 (1-2), 35-40 (1992).
- Geed, S., van Kan, P. L. E. Grasp-based functional coupling between reach- and grasp-related components of forelimb muscle activity. Journal of Motor Behavior. 49 (3), 312-328 (2017).
- Reiner, A., Veenman, C. L., Medina, L., Jiao, Y., Del Mar, N., Honig, M. G. Pathway tracing using biotinylated dextran amines. Journal of Neuroscience Methods. 103 (1), 23-37 (2000).
- Steward, O., Zheng, B., Banos, K., Yee, K. M., et al. Response to: Kim et al., "axon regeneration in young adult mice lacking nogo-A/B." neuron 38, 187-199. Neuron. 54 (2), 191-195 (2007).
- Brown, B. D., et al. A microRNA-regulated lentiviral vector mediates stable correction of hemophilia B mice. Blood. 110 (13), 4144-4152 (2007).
- Lo Bianco, C., et al. Lentiviral vector delivery of parkin prevents dopaminergic degeneration in an alpha-synuclein rat model of parkinson's disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (50), 17510-17515 (2004).
- Malik, P., Arumugam, P. I., Yee, J. K., Puthenveetil, G. Successful correction of the human cooley's anemia beta-thalassemia major phenotype using a lentiviral vector flanked by the chicken hypersensitive site 4 chromatin insulator. Annals of the New York Academy of Sciences. 1054, 238-249 (2005).
- Pawliuk, R., et al. Correction of sickle cell disease in transgenic mouse models by gene therapy. Science. 294 (5550), 2368-2371 (2001).
- Wang, G., et al. Feline immunodeficiency virus vectors persistently transduce nondividing airway epithelia and correct the cystic fibrosis defect. The Journal of Clinical Investigation. 104 (11), R55-R62 (1999).
- Liang, H., Paxinos, G., Watson, C. The red nucleus and the rubrospinal projection in the mouse. Brain Structure & Function. 217 (2), 221-232 (2012).
- Abdellatif, A. A., et al. delivery to the spinal cord: comparison between lentiviral, adenoviral, and retroviral vector delivery systems. Journal of Neuroscience Research. 84 (3), 553-567 (2010).
- DePolo, N. J., et al. VSV-G pseudotyped lentiviral vector particles produced in human cells are inactivated by human serum. Molecular Therapy. 2 (3), 218-222 (2000).
- Higashikawa, F., Chang, L. Kinetic analyses of stability of simple and complex retroviral vectors. Virology. 280 (1), 124-131 (2001).
- Hirano, M., Kato, S., Kobayashi, K., Okada, T., Yaginuma, H., Kobayashi, K. Highly efficient retrograde gene transfer into motor neurons by a lentiviral vector pseudotyped with fusion glycoprotein. PLoS One. 8 (9), e75896 (2013).
- Kato, S., et al. A lentiviral strategy for highly efficient retrograde gene transfer by pseudotyping with fusion envelope glycoprotein. Human Gene Therapy. 22 (2), 197-206 (2011).
- Kato, S., et al. Selective neural pathway targeting reveals key roles of thalamostriatal projection in the control of visual discrimination. The Journal of Neuroscience. 31 (47), 17169-17179 (2011).
- Sheikh, I. S., Keefe, K. M., et al. Retrogradely transportable lentivirus tracers for mapping spinal cord locomotor circuits. Frontiers in Neural Circuits. 12, 60 (2018).
- Harrison, M., et al. Vertebral landmarks for the identification of spinal cord segments in the mouse. NeuroImage. 68, 22-29 (2013).
- Tang, X. Q., Heron, P., Mashburn, C., Smith, G. M. Targeting sensory axon regeneration in adult spinal cord. The Journal of Neuroscience. 27 (22), 6068-6078 (2007).
- Cameron, A. A., Smith, G. M., Randall, D. C., Brown, D. R., Rabchevsky, A. G. Genetic manipulation of intraspinal plasticity after spinal cord injury alters the severity of autonomic dysreflexia. The Journal of Neuroscience. 26 (11), 2923-2932 (2006).
- Liu, Y., Keefe, K., Tang, X., Lin, S., Smith, G. M. Use of self-complementary adeno-associated virus serotype 2 as a tracer for labeling axons: Implications for axon regeneration. PLoS One. 9 (2), e87447 (2014).
- Chamberlin, N. L., Du, B., de Lacalle, S., Saper, C. B. Recombinant adeno-associated virus vector: Use for transgene expression and anterograde tract tracing in the CNS. Brain Research. 793 (1-2), 169-175 (1998).
- Filli, L., et al. Bridging the gap: A reticulo-propriospinal detour bypassing an incomplete spinal cord injury. The Journal of Neuroscience. 34 (40), 13399-13410 (2014).
- Williams, R. R., Pearse, D. D., Tresco, P. A., Bunge, M. B. The assessment of adeno-associated vectors as potential intrinsic treatments for brainstem axon regeneration. The Journal of Gene Medicine. 14 (1), 20-34 (2012).
- Smith, G. M., Onifer, S. M. Construction of pathways to promote axon growth within the adult central nervous system. Brain Research Bulletin. 84 (4-5), 300-305 (2011).
- Morcuende, S., Delgado-Garcia, J. M., Ugolini, G. Neuronal premotor networks involved in eyelid responses: Retrograde transneuronal tracing with rabies virus from the orbicularis oculi muscle in the rat. The Journal of Neuroscience. 22 (20), 8808-8818 (2002).
- Ugolini, G. Specificity of rabies virus as a transneuronal tracer of motor networks: Transfer from hypoglossal motoneurons to connected second-order and higher order central nervous system cell groups. The Journal of Comparative Neurology. 356 (3), 457-480 (1995).
- Gelderd, J. B., Chopin, S. F. The vertebral level of origin of spinal nerves in the rat. The Anatomical Record. 188 (1), 45-47 (1977).
- Inquimbert, P., Moll, M., Kohno, T., Scholz, J. Stereotaxic injection of a viral vector for conditional gene manipulation in the mouse spinal cord. Journal of Visualized Experiments. 73, e50313 (2013).
- Carbajal, K. S., Weinger, J. G., Whitman, L. M., Schaumburg, C. S., Lane, T. E. Surgical transplantation of mouse neural stem cells into the spinal cords of mice infected with neurotropic mouse hepatitis virus. Journal of Visualized Experiments. 53, e2834 (2011).
- Snyder, B. R., et al. Comparison of adeno-associated viral vector serotypes for spinal cord and motor neuron gene delivery. Human Gene Therapy. 22 (9), 1129-1135 (2011).
- Cronin, J., Zhang, X. Y., Reiser, J. Altering the tropism of lentiviral vectors through pseudotyping. Current Gene Therapy. 5 (4), 387-398 (2005).
- Reed, W. R., Shum-Siu, A., Onifer, S. M., Magnuson, D. S. Inter-enlargement pathways in the ventrolateral funiculus of the adult rat spinal cord. Neuroscience. 142 (4), 1195-1207 (2006).
- Mao, X., Schwend, T., Conrad, G. W. Expression and localization of neural cell adhesion molecule and polysialic acid during chick corneal development. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (3), 1234-1243 (2012).
- Charles, P., et al. Negative regulation of central nervous system myelination by polysialylated-neural cell adhesion molecule. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (13), 7585-7590 (2000).
- Tervo, D. G., et al. A designer AAV variant permits efficient retrograde access to projection neurons. Neuron. 92 (2), 372-382 (2016).
- Tohyama, T., et al. Contribution of propriospinal neurons to recovery of hand dexterity after corticospinal tract lesions in monkeys. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (3), 604-609 (2017).
- Liu, Y., et al. A sensitized IGF1 treatment restores corticospinal axon-dependent functions. Neuron. 95 (4), 817-833 (2017).
- Kinoshita, M., et al. Genetic dissection of the circuit for hand dexterity in primates. Nature. 487 (7406), 235-238 (2012).
