Summary
이 프로토콜에서는 쥐 척수 조직으로 retrogradely 운송할 수 있는 바이러스 성 벡터의 주입을 보여 줍니다. 벡터는 시 냅 스에서 찍은 이며 대상 뉴런의 세포 체에 이송. 이 모델은 중요 한 척추 경로 또는 유전자 치료 응용 프로그램에 대 한 대상 셀의 역행 추적에 적합 합니다.
Abstract
신 경계에 있는 세포에 관심사의 단백질을 도입 하는 것은 대부분 분자에 대 한 액세스를 제한 하는 타고 난 생물학적 장벽 때문 도전적 이다. 척수 조직에 직접 주입 셀 시체에 대 한 액세스를 제공 하는 이러한 장벽을 무시 하거나 synapses 분자를 포함 될 수 있습니다. 이 방법으로 바이러스 성 벡터 기술 결합 유전자 치료 또는 요로 추적을 위해 신경 조직으로 대상 유전자의 도입에 대 한 수 있습니다. 여기 바이러스 고효율 역행 전송 (HiRet)에 대 한 설계는 propriospinal 수 (PNs) 척수 및 brainstem 핵 뉴런에 특정 전송 격려의 시 냅 스에서 소개 된다. PNs를 대상으로 rubrospinal 및 reticulospinal 책자 뿐만 아니라 척추 세그먼트에 걸쳐 서로 그들의 상호 모터 통로에서 받은 수많은 연결의 활용. HiRet 벡터를 사용 하 여 constitutively 활성 녹색 형광 단백질 (GFP) 쇼 고화질 세부 셀 시체, 축 삭 및 수지상 버는 흉부 PNs와 pontine reticular 형성에 reticulospinal 신경의 대표적인 추적 HiRet은 brainstem 경로 및 PNs에 잘 통합 하지만 corticospinal 지역 신경으로 나이 종속 통합을 보여줍니다. 요약 하자면, 척수 주입 바이러스 성 벡터를 사용 하 여 대상된 책자의 뉴런으로 관심사의 단백질의 도입에 대 한 적합 한 방법입니다.
Introduction
바이러스 성 벡터는 결함 유전자, upregulate 중요 한 성장 단백질에 대 한 보상 또는 제조 마커 단백질 구조와 시 냅 스의 연결을 강조 하는 세포로 유전 물질을 발생 시킬 수 있는 중요 한 생물 학적 도구 그들의 목표입니다. 이 문서는 형광 추적 주요 모터 통로 강조 하기 위해 고효율 retrogradely 이동식 lentiviral 벡터의 쥐 척수에 직접 주입에 집중 한다. 이 방법은 매우 적절 한 뉴런의 다양 한 인구에 관심사의 단백질을 소개 axonal 재생 및 regrowth 연구 이며 또한 신경 기능 매핑 연구1,2에 대 한 침묵 하는 데 사용 되었습니다.
대부분의 척추 모터 통로의 해 부 세부 BDA 등 불 화-골드3,,45,,67 클래식 추적기와 직접 주입 연구를 통해 해명 했다 , 8. 이러한 추적기 금 간주 됩니다 하지만 손상 된 축 삭에 의해 통풍 관 등 특정 단점이 있을 수 있습니다 또는 백색 질 주사를 주변에 통과에 축 삭 사이트9,10,11 . 이 통로 연결의 잘못 된 해석으로 이어질 수 있는 고 어디 손상 되거나 절단 축 삭으로 염료 흡수 나중 분석12동안 섬유 재생에 대 한 오해 수 재생 연구에 단점이 될 수 있습니다.
그들은 신경 인구13,14,15,,1617,18에에서 안정적이 고 장기적인 식 제공 lentiviral 벡터는 유전자 치료 연구에서 인기 ,19. 그러나, 전통적으로 포장된 lentiviral 벡터 역행 전송 제한 수 및 실행할 수 있는 면역 체계가 반응을 사용 하는 경우4,,2021 vivo에서. HiRet 되 나 매우 효율적인 역행 전송 벡터 역행 전송22,23향상 하이브리드 벡터 만들려고 광견병 바이러스 당단백질으로 바이러스 성 봉투를 수정 하 여 카토 외에 의해 제작 되었습니다.
퇴행 성 추적 해당 셀의 축 삭에 의해 촬영 하 고 세포 체에 수송을 대상 신경의 시 냅 스 공간으로 벡터를 소개 합니다. HiRet의 성공적인 전송 모터 뉴런22에 근육 및 쥐 및 대주교23,24 의 두뇌에 신경 시 냅 스에서 입증 되었습니다. 이 프로토콜에서는 특별히 propriospinal 수 및 brainstem 신경 세포의 시 냅 스 터미널을 대상으로 요 추 척수에 주입을 보여 줍니다. PNs는 많은 다른 척추 경로에서 연결을 수신 하 고 따라서 척수 및 brainstem에 있는 신경 세포의 다양 한 인구를 대상으로 이용 될 수 있다. 이 연구에서 레이블이 신경 회로 innervating hindlimb 모터 기능에 관련 된 모터 신경 풀을 나타냅니다. 강력한 라벨 척수 및 brainstem, 포함 고 충실도 수지상 아 버 및 축 삭 맨끝에서 볼 수 있다. 우리 또한 경부 척수 내에서 이전 연구에서 propriospinal 및 brainstem reticulospinal 통로25를이 방법을 사용 했습니다.
이 프로토콜에는 바이러스 성 벡터는 쥐의 요 추 척수에 주입 방법을 보여 줍니다. 영화 1 에서 보듯이 절 개 마지막 갈비뼈에 있는 L1 척추 식별 대상 이다. L1-L4 척수를 통해 근육을 노출 하는 3-4 cm 절 개에 대 한 꼬리 랜드마크로 사용 됩니다. T11-T13 척추의 등 쪽 측면의 laminectomies 수행 되 고 beveled 유리 바늘 0.8 m m 중간 인하 1.5 m m에서 측면 이동은 바이러스 삽입 회색 문제에 깊은.
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Protocol
다음 수술 및 동물 치료 절차의 모든 동물 관리 및 사용 위원회의 사원 대학에 의해 승인 되었습니다.
1. 미리 수술 준비
- 가져온된 유리 바늘 바이러스 주입 3.5 nanoliter 유리 모 세관 펫 nanoliter 인젝터에 대 한 설계를 사용 하 여 수술 전에 몇 일을 위한 준비. 두 바늘 템플릿을 만들 제조업체의 지침에 따라 2 단계 바늘 끌어당기는 사람에 각 피 펫을 당겨.
- Microscissors 초과 유리의 약 1-2 m m 절단 하 여 바늘의 팁을 구체화 합니다. 30 ~ 40 µ m 가늠 구멍으로 바늘을 현미경 교정 슬라이드 현미경 측정 대략 조리개 크기입니다.
- 30 °에 위치 하는 바늘 micropipette beveller 30-40 µ m 조리개와 45 ° 경사진된 각도 팁을 만드는 데 사용 합니다. 교정 슬라이드에 버 니 어 규모와 조리개 너비를 확인 합니다. 물과 에탄올 파편을 멀리 세척 하 고 정기적으로 블랙 마커는 바늘 표시를 유연한 바늘 첨부와 주사기를 사용 하 여 유리 바늘을 통해 전달 합니다.
- 이전에 70% 에탄올으로 청소 대상된 페 트리 접시에 바늘을 놓고 자외선 아래 Biosafety 두건에서 30 분 동안 소독 합니다.
- HiRet lentivirus 절차 직전 냉장고에서 적당 한 볼륨을 제거 하 여 준비 합니다.
참고: 적합 한 볼륨 포함 사출에 필요한 금액 (1 µ L 당 주입 주사의 수 x) 작은 양의 여분의 볼륨 pipetting 및 로드 하는 손실에 대 한 계정에 플러스. 전송 하 고 사용에 얼음에 바이러스를 저장 합니다. - 버 니 어 가늠 micromanipulator에 그것을 배치 하는 micropump에 그것을 연결 해 인젝터를 준비 합니다.
- 유리 바늘 준비, 신중 하 게 주사기와 레드 오일 등 착 색된 염료를 로드 하는 유연한 바늘으로 복. 아니 거품 바늘에 남아 확인 하십시오. 바늘, 처리할 때 무 균 기술을 사용 하 여을 팁 감동 자제 합니다.
- 인젝터, 바늘 세탁기에 올바르게 장착 되어, 인젝터 모자에 꽉, 끝장 이다 고 철강 인젝터 바늘 확장에 유리 바늘 삽입 약 ¾ 유리 바늘의 길이. 바이러스는 이후 단계에서 바늘에 로드 될 수 있습니다.
2. 마 취와 수술 사이트 준비
- 디지털 스케일에 동물을 무게. 필요한 마 취의 볼륨을 결정 하 고 수술 후 체중의 모니터링을 위한 수술 체중을 기록 합니다. 여성 Sprague-Dawley 쥐 약 200-250 g이이 프로토콜에 사용 되었다.
- 쥐 isoflurane 흡입 또는 주사 마 취 제/xylazine 솔루션 중 하나를 사용 하 여 anesthetize (k / x). 여기, 케 타 민 intraperitoneally 67 mg/kg 및 6.7 mg/kg의 복용량에 xylazine에 주입 됩니다.
- 단단히 발을 곤란 하 게 하 여 적절 한 마 취 비행기를 확인 합니다. 재귀 철수 경우 진행 하기 전에 몇 가지 추가 분을 기다립니다.
참고: 또한 수염, 눈 및 의식의 표시 호흡 속도 관찰 합니다. 수염은 꿈 틀, 눈 깜박임, 부드럽게 만질 때 또는 빠르고 얕은 호흡은, 경우 마 취 비행기 깊은 프로토콜 진행 하는 때까지 기다립니다. 또한 laminectomy 주입 수술을 통해 이러한 징후를 모니터링 합니다. 동물 마 취 얕은 평면 표시, 관리 케 타 민 전용 평등의 부스터 샷 ½에 원래 k / 복용량 x. - 쉐이브는 견의 열 등 한 각도를 엉덩이에서 등 쪽 midline 따라 쥐. 쉽고 더 정확 하 게 면도 긴장 된 동물의 피부를 당겨.
- 두 눈에 안과 연 고를 적용 합니다.
- 살 균 소독 사이트 면도 영역에 적용 됩니다. 첫 번째 스크럽 모든 머리카락과 파편 5% 요오드 솔루션 및 지우기 멀리 멸 균 거 즈를 담가. 이 단방향 슬쩍 70% 에탄올에 배어 무 균 거 즈와 그렇게 따릅니다 아무 영역에 두 번 연결. 이 같은 기술을 사용 하 여 교류 요오드와 에탄올에 젖은 거 즈를 두 번 더.
3. 수술 필드 및 악기 준비
- 압력가 마로 소독 외과 도구 살 균 필드를 만드는 살 균 포장 풀기으로 메스, rongeurs, 쥐 이빨 집게, 봄이 위, hemostats, 중간 지점 곡선 겸 자 및 견인 기 또는 가중치 후크를 포함 하는 세트를 준비 합니다.
- 메 마른 외과 장갑의 패키지를 열고 메 마른 장갑 랩 테이블에 배치 합니다. 무 균 포장의 오염을 방지 하기 위해 사용 되는 도구에 대 한 추가적인 살 균 필드로 사용 합니다.
- 살 균 필드에 #10 메스 블레이드를 놓습니다. Hemostats와 핸들에 블레이드를 보호 합니다. 위치 멸 균 식 염 수, 4.0 크롬 다 봉합 및 재료 제어는 cauterizer, 멸 균 거 즈, (근육 출혈)에 대 한 살 균 면 밀고 도포 또는 접근 가능한 장소 (뼈 물림)에 대 한 bonewax gelfoam 등 출혈.
- 동물을 검색 하 고 메 마른 헝겊에 그것을 설정 합니다. 소변 수집 하 방광 아래 거 즈를 놓습니다. 복 부 아래 압 연된 수건으로 대상 영역을 버팀대. 사용 가능한 경우 특히 더 절차에 대 한 살 균 옷감 밑 수술 난방 패드를 놓습니다.
참고: 무 균 생존 수술 시 중요 하다입니다. 또는 개별 수술 장갑 낀된 손, 그리고 사용 구슬 균 악기 불 임이 손상 된 경우의 불 임을 유지 하기 위해 손에서 70% 에탄올 스프레이 병을 유지 합니다.
4. 척추 열 노출과 laminectomy 사이트 식별
- L1 척추를 찾으려고 피부 절 개를 마지막 갈비뼈에서 손가락을 부드럽게 눌러 만들 수는 있는 영역을 식별 합니다. 랜드마크로 이것을 사용 하 여 만들 3-4 cm 피부 절 개를 끝 #10 수술 메스 그냥 열 등 근육을 노출 하는 L1. 부드러운 확산에 의해 피부를 긴장 늦추지 잡고 누르고 단단히 메스 블레이드와 깨끗 한 절 개를 보장 하기 위해.
- 잘라내어 집게와가 위 필요한 경우 표면 지방 확산. (대상 척추에 따라 거기 수 있습니다 또는 큰 지방 패드가 근육을 표면 수 없습니다).
- 메스 블레이드 또는 손가락의 평면 spinous 프로세스에 대 한 느낌. 종종 중간 지역 어느 한쪽에 백색 근 막의 "V"에 의해 설명 될 것입니다. 쥐 이빨 집게, 상위 프로세스에 안전 하 게 잡아 다음 가능한 프로세스에 가까운 2 긴, 깊은 상처를 확인 하 실 수 있도록 작은 rostral 상처를 확인 하십시오. 컷의 깊은 지점에는 척추의 등 쪽 표면 메스 블레이드와 함께 느낄 수 있습니다.
- 브래킷으로와 가시성을 개선 하기 위해 가중치 걸 제쳐두고 옆 근육을 잡아. 메스, 봄이 위 또는 그들의 머리의 모양을 결정 하 rongeurs 프로세스 주위 명확한 근육.
주: 척수 척수 조직 중지 이전 개발 뼈 보다 성장으로 척추 칼럼의 전체 길이 연장 하지 않습니다 기억 하십시오. 즉, 대상 척추 수준 다르게 명명 된 척추 아래 있을 수 있습니다. - T11 및 인접 T12, T13 프로세스를 찾습니다.
참고: 올바른 척추 레벨을 대상으로 지원 쥐 척수 아틀라스와 매우 비슷한이 마우스에서 개요 이전 연구에서 찾을 수 있습니다 척추 구조6,33. T9 같은 rostral spinous 프로세스 중간 랜드마크 줄 그대로 둡니다.
5. 한 laminectomy 수행
- 대상 영역 올바르게 식별 되 면 laminectomies T11 T13의 등 쪽 측면의 수행 합니다. 부드럽게 척추 척추 인 대, 뼈의 초기 물린 rongeurs 삽입 하 좋은 사이트는 공개를 확산. 정밀한 제어를 증가 하는 반 폐쇄 위치는 rongeurs 잡으십시오.
- rongeurs와 작은 물린 취하여 spinous 프로세스와 척추의 등 쪽 부분을 제거 합니다. 수 척수 손상 또는 경질을 방해 하지 않도록 주의 하십시오. 약간 풀 수 있도록 쥐 이빨 집게와 척추에서 척수 들어올린 척수 조직을 공격 하는 경향이 감소.
- 선택을 취소 뼈 멀리는 중간에서 중간 혈관 관찰 될 수 있도록 합니다. 명확 하 게 표시 척수 조직 하 고는 무료로 파편 창 남겨 주세요.
- 집게와 척수를 부드럽게 터치 합니다. 그들의 마 취 비행기 깊은 경우에 일부 동물 뛰어 유연 수 있습니다. Lidocaine 같은 마비 에이전트의 몇 방울 주입 절차 동안 점프 방지 하기 위해 척수에 직접 적용 됩니다.
- Spinous 프로세스 rostral와 laminectomy 창 꼬리에 고정 집게를 고정 하 여 척추 홀더에 동물을 확보. 움직임을 호흡의 효과 부정 하는 척추 홀더를 사용 하 여 동물의 복 부를 올립니다. 이 바늘 안정성을 증가 하 고 주입의 적절 한 깊이 보장.
6. 바이러스 로딩과 인젝터 위치
- Parafilm의 조각에 약 5 µ L를 pipetting는 팁 드롭 안에 바늘을 위치 하는 인젝터에 바이러스를 로드 합니다.
- 20-100 nL/s의 속도에서 바이러스의 최대 4 µ L를 철회 하는 micropump를 사용 합니다.
- 주사 바늘의 팁이 차단 되지 않습니다 보장 하기 위해 바늘에서 바이러스의 작은 금액을 출시 하는 컨트롤러를 설정 합니다. 실험실 지우기와 초과 바이러스를 닦아내십시오.
참고: 강철 바늘으로 해밀턴 주사기는 가져온된 유리 펫을 사용할 수 있습니다. - 버 니 어 눈금 표시 되도록는 micromanipulator를 놓고 바늘 척수의 중간에 위치 합니다.
참고: 중간 선 때로는 척수의 앞쪽 표면에서 실행 하는 큰 혈관에 의해 찾을 수 있습니다. 그러나,이 개별 쥐, 다를 수 있습니다 그리고 중간 대상으로 비교해보면 그대로 spinous 프로세스를 확인 해야 합니다. - 0.8 m m는 micromanipulator에 버 니 어 규모를 사용 하 여 옆으로 바늘을 직접.
- 들여쓰기, 하지만 하지 puncturing, 경질까지 척수에 바늘을 낮춥니다. 그것은 1.5 m m의 깊이에 침 몰 될 때까지 경질 바늘 찔린 빠른 트위스트 동작을 사용 합니다.
7. 척수에 바이러스를 주입
- 일단 바늘 장소에 프로그램 400 nL/분 확인 그 바이러스의 속도로 주입 하는 인젝터가 염료의 진행을 관찰 하 여 척수를 입력. 분명 한 누설 또는 척수 조직의 돌출 되어야 한다. 누설, 관찰 하는 경우이 때로는 200 nL/분 사출 속도 감소 시켜 해소 수 있습니다.
- 주입이 완료 되 면, 허용 2-5 분 (에 따라 볼륨 주입) 척수에 바늘은 바이러스의 확산을 촉진 하기 위하여.
- 천천히 바늘을 철회 하 고 주입 사이트로 이동 합니다. 각 6 개의 사이트 약 1 m m L1-L4 척추 조직의 길이 따라 간격으로 바이러스의 1 µ L를 주사. 동일한 바늘으로 제대로 작동 하 고 각 주입에 대 한 사용할 수 있습니다.
8. 상처 폐쇄 및 수술 후 관리
- 척추 홀더에서 동물을 제거 하 고 견인 기 또는 측면 근육을 확산 하는 데 사용 하는 걸 꺼내. 닫기 전에 모든 파편의 분명히 상처 인지 확인 합니다.
- 4.0 크롬 다 봉합 사를 사용 하 여 근육 봉합 봉합 스레드 내부 피부 자극의 가능성을 줄이기 위해 매듭에 가까이 잘라.
- 피부 상처 9 mm 클립을 사용 하 여 닫을 주식. 있도록 최적의 치유, 스테이플링 전에 피부의 가장자리를 라인.
- 패드와 모니터까지 반쯤 온난화 물 대류에 동물을 놓습니다.
- 유체와 감염을 방지 하기 위해 cefazolin와 같은 항생제를 피하 메 마른 염 분의 5-10 mL를 주사. 동물 때 외래, 가정 그것의 감 금에 다시 배치 하 고 초기 진통제를 제공 합니다. 고통을 고 통과의 어떤 표시 든 지에 대 한 쥐를 모니터링 하 고 통증의 완화에 대 한 당신의 IACUC 승인 절차에 따라 치료.
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Representative Results
성공적인 주입 및 전송 바이러스 성 벡터의 일방적인 신경 척수 및 brainstem 핵 특정의 강력한 인구의 변환 될 합니다. 그림 1 에서는 신경 세포와 axons 흉부 척수 및 brainstem에서 4 주 후 주입의 pontine reticular 형성의 틀에 박힌 라벨을 보여 줍니다. 상당한 GFP 식 주입 (그림 1A, 박스형된 지역)에 동측 측에 흉부 척수의 회색 문제에 신경 세포에서 볼 수 있다. 몇 가지 신경 contralateral 측면, 특히 정중 선 근처에 관찰 된다. 백색 질에서 GFP 식 관찰 됩니다 (그림 1A, 화살표 및 화살표), 동측 코드에서 축 삭에 특히 지역에서에서 전형적인 propriospinal 축 삭 (화살촉). 그림 1A' a, 신경 셀 시체와 모 수석에서 보여주는 전형적인 식 박스형 영역의 더 높은 확대를 보여줍니다. 뉴런에 GFP 식 또한 brainstem 핵 pontine reticular 형성 등에서 관찰 될 수 있다 (그림 1B, 더 높은 확대에 박스형 영역의 그림 1B').
그림 1: 척수 및 Brainstem에 뉴런의 변환. (A) GFP 식 신경 (박스형된 지역), propriospinal (화살촉)의 축 삭 및 흉부 척수에서 다른 책자 (화살표)의 축 삭. (A') GFP 라는 신경 세포와 모 수석 brainstem에 a (B) pontine reticular 대형 박스형된 영역에서 신경 식의 높은 확대. (B') B에서박스 영역의 더 높은 확대. 스케일 바: (A) = 500 μ m; (B) = 1 밀리미터; (A'), (B') = 50 μ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
영화 1: 는 쥐의 요 추 척수에 주사를 대상으로. 타겟팅의 기본 및 바이러스 성 벡터의 쥐 척수에 주입이 비디오 요약. 이 비디오를 보려면 여기 클릭 하십시오 (다운로드 오른쪽 클릭.)
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Discussion
두뇌 및 척수에 있는 신경 세포의 유전자 조작 하이라이트 감각, 모터 및 자율 경로 부상27,28, 후 신경 책자의 재 성장 잠재력을 탐구 하 고 형광 추적 통해 역임 했다 29 , 30 , 31 , 32 , 33. 직접 척수에 주입 retrogradely 운송할 수 있는 바이러스 성 벡터의 중앙 신경 조직에이 방법을 매핑 경로 대 한 탁월한 선택을 만들고 그들의 시 냅 스 연결을 통해 신경 인구를 타겟팅 할 수 있습니다. HiRet 벡터는 특별히 보여준다 선택적인 통풍 관 신경 시 냅 스22,,2425, 이전 추적에서 마찬가지로 구조적된 벡터 부상된 축 삭 또는 없는 셀에 아무 확산을 보였다 34 , 35, HiRet 구문22,,2325를 갖춘 결과와 일치 하는. 따라서, 역행 추적 프로그램으로 HiRet의 직접 분사 부상 후 소성을 받아야 하는 interneuronal 회로 탐험을 위한 이상적인 방법입니다.
척수에는 바이러스 성 벡터의 성공적인 주입에 관련 된 두 가지 중요 한 개념 있다. 첫 번째 유리 바늘, 올바른 목표 수립은 고 두 번째 조직에 바늘에서 바이러스의 적절 한 흐름을 보장. 이 프로토콜에는 역행 추적 관련 된, 올바른 영역을 대상으로 관심의 인구는 신경의 시 냅 스 연결의 철저 한 이해를 필요로 합니다. 요 추 척수에 연결 하는 Propriospinal 및 reticulospinal 신경 세포는 여기의 대상. 이 신경은 brainstem PNs 하기 V-7은 회 백 질 내로의 대다수와 자 궁 경부 및 흉부 척수 세그먼트에 걸쳐 퍼진다. 신경의 적절 한 인구 변환 수 있도록, 6 바이러스 성 주사 4 척추 세그먼트에 걸친 지역 만들어집니다. L1-L4 세그먼트는 중앙 패턴 발생기 및 척수의 다른 지역에 그들의 알려진된 연결의 존재로 인해 선택 됩니다. 일단은 올바른 척추 부합 하기 알려져 있습니다, 해부학 적 랜드마크를 통해 이러한 대상의 실제 위치는 결정적 이다. 해 부 구조와 척추 모양의 세부 정보를 표시 하는 지도 확인 대상 건축물8,36유용할 수 있습니다. 이 프로토콜의 대부분 동일 하나 주입 또는 6 만들어집니다; 여부 주목 한다 차이점은 척추 세그먼트 laminectomy, 및 이상의 4 µ L를 주입 하는 경우 추가 바이러스 유리 바늘을 다시 로드 해야 하는 사실을 통해 노출 수에만. 프로토콜 쉽게 마우스에 맞게 수 있습니다. 작은 크기로 인해 바이러스 코드를 주입의 볼륨을 아래로 조정 해야 하 고 올바른 척추 하기를 명 중 하는 데 필요한 측정 조정 합니다. 마우스에 비슷한 수술의 여러 동영상 이전 게시37,38되었습니다.
다음 고려 사항은 조직에 적절 한 보급 이다. 바늘의 주의 준비는 조리개 바깥쪽 그리고 파편에 팁, 차단 하지 및 색된 염료의 전면을 통해 척수에 바늘에서 흐름의 시각화는 바이러스 성 정지에 대 한 충분 한 인지 확인 하는 데 필요한 정지 조직을 관통 하 고 그 확인에 도움이 되는. 일단 정지를 조직에 배포 척수 내에서 바늘 2-5 분 동안 유지 적절 한 보급을 보장 합니다.
타깃 집단의 성공적인 변환 수 있습니다 또한 바이러스 titer, serotype 및 감염 효율성 등 주입의 기본 속성에 따라 달라 집니다. 우리는 적어도 10의 게놈 복사 titer 찾을10 GC/mL HiRet lentivirus 위한 vivo에서 실험을 위해 잘 작동. 높은 titers 또는 주입 볼륨 높은 라벨 인덱스, 표시 될 수 있습니다 하지만 주의 의도 지역 또는 contralateral 척수로 바이러스 확산 수 이후 촬영 합니다. 고려 또한 벡터의 차 있는 굴곡 운동에 따라 관심의 레이블 셀에 대 한 적절 한 형식으로 주어져야 한다. 특정 바이러스 serotypes 뉴런39의 다른 인구에 있는 더 나은 감염 및 변환 속도 할 수 있습니다. 그러나이 벡터에 대 한 수정 수 있습니다 영향을 그것의 차 있는 굴곡 운동40전통적인 lentiviral 벡터 VSV G 봉투 단백질으로 인해 세포 유형의 광범위 감염으로 알려져 있습니다. HiRet 구조는 매우 효율적인 역행 전송22,23 허용 하 고 propriospinal 시험에서 효과적 이다 광견병 바이러스의 퓨전 당단백질 (막힐-B)와 pseudotyping에 의해 봉투 수정 및 reticulospinal 책자, 신경 숫자 비교로 추적 방법을 통해 fluorogold 및 microruby4,41 등 (HiRet 벡터 참조 히라노 외의 건설의 세부.) 그러나 22., 그것은 않았다 하지 충분히 라벨 이러한 실험에 성인 corticospinal로 비록 다른 연구1높은 효율으로 신생아에 중부 표준시를 레이블을지 않습니다. 그것은 가능한 그 수용 대상된 시 냅 스, 보안 등 p75에서 HiRet 이해에 필요한NTR만 약하게 이것은 아직도 조사 되 고 비록 성인 중부 표준시 뉴런42,의43에 표현. 어떤 경우에,이 사용 되 고 벡터 대상된 셀에 대 한 적절 한 결정의 중요성을 보여 줍니다. 이 실험에서 뇌와 척수 조직 처리 되었고 증폭 및 모든 뇌 영역에 허리 코드에서 전송에 대 한 풍부한 시간을 보장 하기 위해 4 주 후 조사. HiRet는 빨리 역행 axonal 교통을 통해 수송 된다 그리고 이렇게 짧은 실험 기간 주행 거리 적은와 같은 경우 자 궁 경부 척수에 주입 영역 경우 적절 한 수 있습니다.
직접 주입 수술은 척수에 바이러스 성 벡터 기술 도입에 대 한 유용한 도구입니다. 유전자 실험은 유리한 안정 허용으로 HiRet의 사용, 지속적인 transgene 식, 오래 이며 비 독성 신경에. 이 실험에서 아무 GFP 라벨을 하지 않습니다 직접 주입 지역에 시 냅 스 연결 하는 신경에 모습 이었다. 이것은 또한 흉부 타 박상 부상25를 가진 동물에 이전 학문에서. 또한, HiRet-GFP 척추 모터 신경 또는 지 루트 ganglion 신경 정도 demyelinated 좌 골 신경 (게시 되지 않은 관찰)에 주입 하는 경우 라벨을 수 없었다. 함께, 이러한 데이터 HiRet 축 삭을 통해 쉽게 입력 하지 않습니다 고 효율적으로 transduces 신경의 시 냅 스에 벡터에 의해 대상 인구의 신경 연결의 더 상세 하 고 충실도 높은 지도 제공 하는 것이 좋습니다. 이 역행 adeno 관련 바이러스 (rAAV-레트로), 통로44 에서 축 삭에 의해 채택 되기 위하여 알려 지는 다른 retrogradely 운송할 수 있는 바이러스 벡터에 비해 우위 이며 HiRet 재생성 매핑 연구에서 특히 유용 하 고 척수 손상된에서 회로 다시 연결. HiRet의 장점 또한 침묵 또는 절제 연구25,44,45,,4647신경 인구의 특정 대상에 대 한 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품은 신경 성 질환의 국가 학회 및 치기 R01 R01NS103481에서 교부 금에 의해 투자 되었다 고 소아과 연구에 대 한 슈 라 이너 스 병원 SHC 84051와 SHC 86000 국방부 (SC140089)를 부여 합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #10 Scalpel Blades | Roboz | RS-9801-10 | For use with the scalpel. |
| 1 mL Syringes | Becton, Dickinson and Company | 309659 | For anesthetic IP injection, potential anesthetic booster shots, and antibiotic injections. |
| 10mL Syringes | Becton, Dickinson and Company | 309604 | For injecting saline into the animal, post-surgery. |
| 4.0 Chromic Catgut Suture | DemeTECH | NN374-16 | To re-bind muscle during closing. |
| 48000 Micropipette Beveler | World Precision Instruments | 32416 | Used to bevel the tips of the pulled glass capillary tubes to form functional glass needles. |
| 5% Iodine Solution | Purdue Products L.P. | L01020-08 | For use in sterilzation of the surgical site. |
| 70% Ethanol | N/A | N/A | For sterilization of newly prepared glass needles, animal models during surgical preparation, and surgeon's hands during surgery, as well as all other minor maintainances of sterility. |
| Anesthetic (Ketamine/Xylazine Solution) | Zoetis | 240048 | For keeping the animal in the correct plane of consciousness during surgery. |
| Antibiotic (Cefazolin) | West-Ward Pharmaceuticals | NPC 0143-9924-90 | To be injected subcutaneously to prevent infection post-surgery. |
| Bead Sterilizer | CellPoint | 5-1450 | To heat sterilize surgical instruments. |
| Bonewax | Fine Science Tools | 19009-00 | To seal up bone in the case of bone bleeding. |
| Cauterizer | Fine Science Tools | 18010-00 | To seal any arteries or veins severed during surgery to prevent excessive blood loss. |
| Digital Scale | Okaus | REV.005 | For weighing the animal during surgical preparation. |
| Flexible Needle Attachment | World Precision Instruments | MF34G-5 | For cleaning glass needles and loading red oil into glass needles. |
| Gelfoam | Pfizer | H68079 | To seal up bone in the case of bone bleeding. |
| Glass Capillary Tubes | World Precision Instruments | 4878 | For pulled glass needles - should be designed for nanoliter injectors. |
| Hair Clippers | Oster | 111038-060-000 | For clearing the surgical site of hair. |
| Hemostats | Roboz | RS-7231 | For general use in surgery. |
| Kimwipes | Kimtech | 34155 | For general use in surgery. |
| Medium Point Curved Forceps | Roboz | RS-5136 | For general use in surgery. |
| Micromanipulator with a Vernier Scale | Kanetec | N/A | For precise targeting during surgery. |
| Microscissors | Roboz | RS-5621 | For cutting glass whisps off of freshly pulled glass capillary tubes. |
| Microscope with Light and Vernier Scale Ocular | Leitz Wetzlar | N/A | Used to visualize and measure beveling of pulled glass capillary tubes into functional glass needles. |
| MicroSyringe Pump Controller | World Precision Instruments | 62403 | To control the rate of injection. |
| Nanoliter 2000 Pump Head Injector | World Precision Instruments | 500150 | To load and inject virus in a controlled fashion. |
| Needle Puller | Narishige | PC-100 | To heat and pull apart glass capillary tubes to form glass needles. |
| Ophthalamic Ointment | Dechra Veterinary Products | RAC 0119 | To protect the animal's eyes during surgery. |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | To assist with loading virus into the nanoinjector. |
| PrecisionGlide Needles (25G x 5/8) | Becton, Dickinson and Company | 305122 | For use with the 1mL and 10 mL syringes to allow injection of the animal model. |
| Rat Tooth Forceps | Roboz | RS-5152 | For griping spinous processes. |
| Red Oil | N/A | N/A | To provide a front for visualization of virus entering tissue during injection. |
| Retractors | Roboz | RS-6510 | To hold open the surgical wound. |
| Rimadyl Tablets | Bio Serv | MP275-050 | For pain management post-surgery. |
| Rongeurs | Roboz | RS-8300 | To remove muscle from the spinal column during surgery. |
| Scalpel Blade Handle | Roboz | RS-9843 | To slice open skin and fat pad of animal model during surgery. |
| Scissors | Roboz | RS-5980 | For general use in surgery. |
| Stainless Steal Wound Clips | CellPoint | 201-1000 | To bind the skin of the surgical wound during closing. |
| Staple Removing Forceps | Kent Scientific | INS750347 | To remove the staples, should they be applied incorrectly. |
| Sterile Cloth | Phenix Research Products | BP-989 | To provide a sterile surface for the operation. |
| Sterile Cotton-Tipped Applicators | Puritan | 806-WC | To soak up blood in the surgical wound while maintaining sterility. |
| Sterile Gauze | Covidien | 2146 | To clean the surgical area and surgical tools while maintaining sterility. |
| Sterile Saline | Baxter Healthcare Corporation | 281324 | For use in blood clearing, and for replacing fluids post-surgery. |
| Surgical Gloves | N/A | N/A | For use by the surgeon to maintain sterile field during surgery. |
| Surgical Heating Pad | N/A | N/A | For maintaining the body temperature of the animal model during surgery. |
| Surgical Microscope | N/A | N/A | For enhanced visualization of the surgical wound. |
| Surgical Stapler | Kent Scientific | INS750546 | To apply the staples. |
| T/Pump Heat Therapy Water Pump | Gaymar | TP500C | To pump warm water into the water convection warming pad. |
| Water Convection Warming Pad | Baxter Healthcare Corporation | L1K018 | For use in the post-operational recovery area to maintain the body temperature of the unconscious animal. |
| Weighted Hooks | N/A | N/A | To hold open the surgical wound. |
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