Summary
Detta protokoll visar injektion av ett retrogradely transportabla virala vektorn i råtta ryggmärgsvävnad. Vektorn tas upp vid synapsen och transporteras till cellkroppen av målet nervceller. Denna modell är lämplig för retrograd spårning av viktiga spinal vägar eller inriktning celler för gen terapi program.
Abstract
Att införa proteiner av intresse i celler i nervsystemet är utmanande på grund av medfödda biologiska hinder som begränsar tillgång till de flesta molekyler. Injektion direkt i ryggmärgsvävnad förbi dessa hinder, som ger tillgång till cellen organ eller synapser där molekyler kan införlivas. Att kombinera virala vektorn teknik med denna metod möjliggör införsel av målgener nervvävnad i syfte att genterapi eller tarmkanalen spårning. Här introduceras ett virus konstruerade för högeffektiva retrograd transport (HiRet) på synapserna av propriospinal interneuroner (PNs) att främja särskilda transporter till nervceller i ryggmärgen och hjärnstammen atomkärnor. Inriktning PNs utnyttjar de talrika anslutningar som de får från motoriska vägar såsom de rubrospinal och reticulospinal skrifter, liksom deras sammankoppling med varandra under hela ryggmärgen segmenten. Representativa spårning med HiRet vector med konstitutivt aktiv grönt fluorescerande protein (GFP) visar HiFi Detaljer för cell organ, axoner och dendritiska arbors i bröstkorg PNs och reticulospinal nervceller i pontine reticular formation. HiRet innehåller väl in i hjärnstammen vägar och PNs men visar ålder beroende integreras corticospinal tarmkanalen nervceller. Sammanfattningsvis är spenat snore injektion med virala vektorer en lämplig metod för införandet av proteiner av intresse i nervceller av riktade skrifter.
Introduction
Virala vektorer är viktiga biologiska verktyg som kan införa genetiska materialet i celler för att kompensera för defekta gener, upregulate viktig tillväxt proteiner eller tillverka markör proteiner som framhäver strukturen och synapsförbindelser av sina mål. Denna artikel fokuserar på direkt injektion av en högeffektiv retrogradely transportabla lentiviral vektor i råtta ryggmärgen för att belysa större motoriska vägar med fluorescerande spårning. Denna metod är också mycket lämplig för axonal föryngring och återväxt studier att införa proteiner av intresse i olika populationer av nervceller och har använts för att tysta nervceller för funktionell kartläggning studier1,2.
Många av de anatomiska detaljerna för spinal motoriska vägar var klarlagd genom direkt injektion studier med klassiskt spårämnen såsom BDA och fluoro-guld3,4,5,6,7 , 8. dessa spårämnen anses guldmyntfoten men kan ha vissa nackdelar såsom upptag av skadade axoner, eller axoner i passage i den vita substansen kring en injektion webbplats9,10,11 . Detta kan leda till felaktiga tolkningar av väg anslutning och kan vara en nackdel i regenerering studier där färgämne absorption av skadade eller avhuggna axoner kan misstas för regenererande fibrer under senare analys12.
Lentiviral vektorer är populära i gen terapi studier, eftersom de ger stabil, långsiktig uttryck i neuronala populationer13,14,15,16,17,18 ,19. Men traditionellt paketerade lentiviral vektorer kan ha begränsad retrograd transport och kan utlösa immunsystemet när den används i vivo4,20,21. En mycket effektiv retrograd transport vektor kallas HiRet har producerats av Kato et al. genom att ändra virala kuvertet med en rabies virus glykoprotein att skapa en hybrid-vektor som förbättrar retrograd transport22,23.
Retrograd spårning introducerar en vektor i synaptiska utrymmet av en target neuron, så att den kan tas av cellens axon och transporteras till cellkroppen. Framgångsrika transport av HiRet har påvisats från nervcellernas synapser i hjärnan hos möss och primater23,24 och från muskeln till motoriska nervceller22. Detta protokoll visar injektion i ländryggen ryggmärgen, särskilt inriktad på propriospinal interneuronen och hjärnstammen nervceller synaptiska terminaler. PNs ta emot anslutningar från många olika spinal vägar och kan således användas för att rikta en mångskiftande befolkningen av nervceller i ryggmärgen och hjärnstammen. Märkt nervceller i denna studie utgör kretsar innervating motorneuronen pooler avser bakbenet motorik. Robust märkning ses i ryggmärgen och hjärnstammen, inklusive HiFi Detaljer för dendritiska arbors och axon terminaler. Vi har också använt denna metod i tidigare studier inom den cervikala ryggmärgen för att märka propriospinal och hjärnstammen reticulospinal vägar25.
Detta protokoll visar injektion av en viral vektor i ländryggen ryggmärgen på en råtta. Som kan ses i filmen 1, riktar snittet genom att identifiera den L1-kotan som ligger på revbenet. Detta används som ett kaudala landmärke för en 3-4 cm snitt som exponerar muskulatur över L1-L4 ryggmärgen. Laminectomies av de dorsala aspekterna av T11-T13 kotorna utförs och avfasade glas nål är riktad 0,8 mm i sidled från mittlinjen och sänkt 1,5 mm djupt in i den grå substans att injicera viruset.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla följande kirurgiska och djurs vård förfaranden har godkänts av djur vård och användning kommittén vid Temple University.
1. före kirurgiska preparat
- Förbereda drog glas nålar viral injektionsvätska några dagar före operationen med 3,5 nliter glas kapillär pipetter avsedda för nliter spridare. Dra varje pipett en två-stegs nål avdragare enligt tillverkarens instruktioner för att skapa två nål mallar.
- Förfina spetsen på nålen mallarna genom att skära av ca 1-2 mm av överskjutande glas med microscissors. Åtgärd ungefärliga bländare storlek under ett Mikroskop med en kalibrering objektglas att isolera nålar med 30-40 µm öppningar.
- Med nålen placerad vid 30°, Använd en mikropipett beveller för att skapa ett tips med en 30-40 µm bländare och en avfasad 45°-vinkel. Verifiera bländare bredd med nonie i kalibrering bilden. Passera vatten och etanol glas nålen med en spruta med en flexibel nål bifogad att skölja bort skräp och markera nålen med jämna mellanrum med en svart markering.
- Placera nålar i en övertäckt petriskål tidigare rengöras med 70% etanol och sterilisera i 30 min i en biosäkerhet huva i UV-belysning.
- Förbered HiRet lentivirus genom att ta bort en lämplig volym från frysen omedelbart före ingreppet.
Obs: En lämplig volym innehåller beloppet för injektion (1 µL per injektion x antal injektioner) plus en liten mängd extra volym redogöra för pipettering och lastning förluster. Transportera och lagra viruset på is när inte i använda. - Förbereda injektorn genom att ansluta den till micropump och placera det i en micromanipulator med en nonie.
- Utrustad med en flexibel nål att förbereda glas nålen, noggrant lasta ett färgat färgämne såsom röd olja med en spruta. Se till att inga bubblor kvar i nålen. Använd aseptisk teknik vid hantering av nålen, och avstå från att röra spetsen.
- Nålen glas i injektorn, se till att nålen sitter korrekt i brickorna, injektor locket skruvas på tight, och stål injektionsnålen förlängs cirka ¾ längd glas nålen. Virus kan laddas in nålen i ett senare steg.
2. anestesi och kirurgiska iordningställande
- Väga djuret på en digital skala. Spela in preoperativ vikt att bestämma volymen av bedövningsmedel som krävs och att möjliggöra övervakning av vikt efter operationen. Kvinnliga Sprague-Dawley-råttor cirka 200 – 250 g användes i detta protokoll.
- Söva råttan använder antingen isofluran inandning eller injicerade Ketamin/xylazin lösning (k / x). Här, injiceras Ketamin intraperitonealt på en 67 mg/kg och xylazin vid en 6,7 mg/kg DOS.
- Bekräfta ett lämpligt bedövningsmedel plan genom att nypa foten ordentligt. Om reflexiva uttag inträffar, vänta flera ytterligare minuter innan du fortsätter.
Obs: Även iaktta morrhår, ögon och andningsfrekvens för tecken på medvetande. Om morrhår ryckningar, ögat blinkar när rörde försiktigt eller andningen är snabb och ytlig, vänta tills bedövningsmedel planet är djupare för att fortsätta med protokollet. Även övervaka dessa tecken under hela operationen laminektomi och injektion. Om djuret visar ett grunt bedövningsmedel plan, administrera en booster shot av Ketamin-bara är lika till ½ den ursprungliga k / x dosering. - Raka råtta längs dorsala mittlinjen från höfterna till scapulae sämre vinkel. Dra huden på djuret spänd för en enklare och exaktare rakning.
- Tillämpa oftalmologiska salva i båda ögonen.
- Applicera antiseptisk till den rakade området att sterilisera webbplatsen. För det första scrub, Blötlägg steril gasbinda med en 5% jodlösning och torka bort alla hår och skräp. Följ detta med en enkelriktad känga med steril gasbinda indränkt i 70% etanol, så att inget område är kontaktade två gånger. Använd denna samma teknik med omväxlande jod och etanol-indränkt kompress dubbelt mer.
3. kirurgiska instrument och fält förberedelse
- Förbereda en uppsättning Ånghärdad kirurgiska verktyg som inkluderar en skalpell, rongeurs, råtta tand pincett, våren sax, Peanger, medellång punkt böjd pincett och upprullningsdon eller vägda krokar av uppackning sterila wrap för att skapa ett sterilt fält.
- Öppna ett paket med sterila operationshandskar och placera sterila handske wrap på bordet. Används som ytterligare ett sterilt fält för verktyg som används för att förhindra kontaminering av den sterila wrapen.
- Släpp en #10 skalpell blad på det sterila fältet. Säkra bladet till ett handtag med Peanger. Ställning steril koksaltlösning, 4.0 kromsyra katgut suturen och material att kontrollera blödning såsom en cauterizer, steril gasbinda, sterila bomull spets applikatorer (för muskel blödningar), eller gelfoam eller bonewax (för ben utfall) på en lättillgänglig plats.
- Hämta djuret och ställ den på en steril duk. Placera gasbinda under urinblåsan att samla urin. Stötta upp målområdet med valsade handduk under buken. Om tillgängligt, placera en kirurgisk värmedyna under den sterila duk, särskilt för längre procedurerna.
Obs: Sterilitet är viktigt under överlevnad operation. Hålla en sprayflaska med 70% etanol å att upprätthålla sterilitet av handskar på händerna och en användning pärla sterilizer om instrumentet sterilitet äventyras, eller mellan individuella operationer.
4. utsätta ryggraden och att identifiera webbplatsen laminektomi
- Identifiera området där en huden snitt kommer att göras genom att trycka fingrarna försiktigt vid revbenet att lokalisera den L1-kotan. Använder detta som ett landmärke, göra en 3-4 cm huden snitt med en #10 kirurgisk skalpell slutar bara sämre än L1 att utsätta muskeln. Håll huden spänd av mild spridning och tryck fast med skalpell bladet att garantera ett rent snitt.
- Skär och ytligt fett med pincett och sax vid behov. (Beroende på målet kotan, kan det eller vara inte en stor fet pad ytliga till muskeln).
- Känsla för spindelkrabba processer med platt bladet skalpell eller ett finger. Ofta kommer området mittlinjen att beskrivas av en V-av vita fascia på vardera sidan. Gör ett litet rostralt snitt att ge utrymme att greppa ordentligt på en övre process med råtta tand pincett, sedan göra 2 långa, djupa nedskärningar så nära processerna som möjligt. Vid den djupaste punkten i snittet, kan den dorsala ytan av Kotor kännas med skalpell bladet.
- Håll de laterala musklerna åt sidan med upprullningsdon eller vägda krokar att förbättra sikten. Tydliga muskler runt processerna med en skalpell, våren sax eller rongeurs att bestämma formen på sina huvuden.
Obs: Kom ihåg att ryggmärgen inte omfattar hela längden av kotpelare, som ryggmärgen vävnad slutar växa tidigare i utvecklingen än ben. Detta innebär att spinal målnivån kan vara under en annorlunda namngivna kotan. - Leta upp T11 och de angränsande T12 och T13 processerna.
Obs: Stöd rikta rätt vertebrala nivåer kan hittas i en råtta ryggmärgen atlas och tidigare studier beskriver sevärdheter i musen, som har en mycket liknande vertebrala struktur6,33. Lämna en rostralt spindelkrabba process såsom T9 ostörda ge ett mittlinjen landmärke.
5. utför en laminektomi
- När målområdet har identifierats korrekt, utför laminectomies av de dorsala aspekterna av T11-T13. Försiktigt isär kotorna för att avslöja intervertebral ligament, som är bra platser att infoga rongeurs för första tuggan av ben. Håll rongeurs halvslutna kunna öka fina kontroll.
- Ta bort spindelkrabba processerna och den dorsala aspekten av kotorna genom att ta små tuggor med rongeurs. Var noga med att inte skada ryggmärgen eller störa dura. Lyft lite med råtta tand tången att hjälpa dra ryggmärgen från kotorna och minska tendensen att slå ryggmärgsvävnad.
- Rensa bort ben från mittlinjen så att mittlinjen blodkärl kan observeras. Lämna ett fönster som tydligt visar ryggmärgsvävnad och är fria från skräp.
- Försiktigt tryck på ryggmärgen med pincett. Vissa djur kan reflexmässigt hoppa även om deras bedövningsmedel plan är djup. Applicera några droppar av en bedövande medel såsom lidokain direkt till ryggmärgen att förhindra hoppning under förfarandet för injektion.
- Säkra djur i en spinal hållare med fästskruvarna stabiliserande pincett spindelkrabba processer rostralt och stjärtfenan till fönstret laminektomi. Höja buken av djuret med spinal innehavaren för att förneka effekten av andas rörelser. Detta kommer att öka nål stabiliteten och säkerställa lämpligt djup injektion.
6. lastning virus och positionering injektorn
- Läsa in virus i injektorn genom pipettering ca 5 µL på en bit parafilm och positionering nålen så att spetsen är inuti drop.
- Använda micropump att ta ut upp till 4 µL av virus med en hastighet av 20 – 100 nL/s.
- Ange den registeransvarige att injicera och släpper en liten mängd virus från nålen att se till att spetsen på nålen inte blockeras. Torka bort överflödigt virus med en laboratorium torka.
Obs: En Hamilton spruta med en stålsättavisare kan användas som ett alternativ till draget glas pipetter. - Placera micromanipulator så att nonie är synlig och placera nålen vid mittlinjen av ryggmärgen.
Obs: Mittlinjen kan ibland placeras genom ett stort blodkärl som körs på den främre ytan av ryggmärgen. Men detta kan variera hos enskilda råttor och mittlinjen inriktning bör bekräftas genom jämförelse med en intakt spindelkrabba process. - Rikta nålen sidled av 0,8 mm med nonie på micromanipulator.
- Sänka nålen till ryggmärgen tills det är indraget, men inte punktera, dura. Använda en snabb vridande rörelse, punktera dura med nålen tills det har sjunkit till ett djup på 1,5 mm.
7. injicera viruset i ryggmärgen
- När nålen är på plats, in program injektorn att injicera med en hastighet av 400 nL/min. bekräfta att virus i ryggmärgen genom att observera förloppet för dye framsidan. Det bör finnas inga uppenbara läckage eller utbuktningen av ryggmärgsvävnad. Om läckage observeras, kan detta ibland lindras genom att minska den injektion-hastigheten till 200 nL/min.
- När injektionen är klar, låt nålen till vila i ryggmärgen för 2 – 5 min (beroende på volym injiceras) att underlätta spridningen av viruset.
- Långsamt dra ut injektionsnålen och flytta till nästa injektionsstället. Injicera 1 µL av virus i var och en av 6 jämnt fördelade platser cirka 1 mm mellanrum längs längden av L1-L4 spinal vävnaden. Samma nålen kan användas för varje injektion så länge den fortsätter att fungera korrekt.
8. sår stängning och postoperativ vård
- Ta bort djuret från spinal innehavaren och ta ut upprullningsdon eller krokar som används för att sprida laterala muskel. Se till att såret är tydligt från allt skräp före stängning.
- Sutur muskeln med en 4.0 kromsyra katgut sutur. Skär suturen trådar nära Knut att minska sannolikheten för interna hudirritation.
- Häfta huden stängas med 9 mm sår klipp. För att möjliggöra optimal läkning, rada upp kanterna på huden innan häftning.
- Placera djuret på ett vatten konvektion uppvärmningen pad och övervaka tills vaken.
- Injicera 5-10 mL steril koksaltlösning subkutant för att fylla på vätska och antibiotika såsom cefazolin att förhindra infektion. När djuret är ambulatorisk, placera den tillbaka i dess buren och ge inledande analgetika. Övervaka råttorna för tecken på smärta och ångest och behandla enligt din IACUC godkänt förfarande för lindring av smärta.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Framgångsrika injektion och transport av virala vektorn bör resultera i transduktion av en robust befolkningen av ensidiga nervceller i ryggmärgen och i vissa kärnor i hjärnstammen. Figur 1 visar stereotypa märkning av neuron och axoner i bröstkorg ryggmärgen och i pontine reticular bildandet av hjärnstammen på fyra veckor efter injektionen. Betydande GFP uttryck ses i nervceller i den grå substans av bröstkorg ryggmärgen på sida ipsilaterala till injektion (figur 1A, boxed område). Några nervceller observeras också på den kontralaterala sidan, speciellt nära mittlinjen. I den vita substansen observeras GFP uttryck i axoner i ipsilaterala sladden (figur 1A, pilar och pilspetsar), särskilt i områden som typiska för propriospinal axoner (pilspetsar). Figur 1A' visar en högre förstoring av området förpackad i A, demonstrerande typiska uttryck i neuronala cellen organ och dendriter. GFP uttryck i nervceller kan också observeras i hjärnstammen kärnor såsom den pontine reticular formationen (figur 1B, högre förstoring av förpackad i figur 1B').
Figur 1: transduktion av nervceller i ryggmärgen och hjärnstammen. (A), GFP uttryck i nervceller (boxed område), axoner av propriospinal nervceller (pilspetsar) och axoner av andra skrifter (pilar) i bröstkorg ryggmärgen. (A') Högre förstoring av neuronala uttryck i området boxed av A. (B) den pontine reticular formationen i hjärnstammen uttrycker GFP-märkta nervceller och dendriter. (B) Högre förstoring av området förpackad i B. Skala barer: (A) = 500 μm. (B) = 1 mm; (A'), (B) = 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Movie 1: Inriktning en injektion i ländryggen ryggmärgen råttans. Denna video sammanfattningar grunderna i inriktningen och injektion av en viral vektor i råtta ryggmärgen. Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Genmanipulation av nervceller i hjärnan och ryggmärgen har tjänat till att markera sensorisk, motorisk och autonoma vägar via fluorescerande spårning och att utforska återväxt potential av neuronala skrifter efter skada27,28, 29 , 30 , 31 , 32 , 33. direkt injektion av ett retrogradely transportabla virala vektorn i ryggmärgen kan rikta neuronala populationer via deras synapsförbindelser, gör denna metod ett utmärkt val för mappning vägar i centrala nervsystemet. HiRet vector visar särskilt selektiv upptag vid neuronala synapsen22,24,25, och tidigare spårning med liknande struktur vektorer visade ingen spridning till skadade axoner eller orelaterade celler 34 , 35, vilket överensstämmer med resultaten med HiRet konstruera22,23,25. Direktinsprutning av HiRet som retrograd spårämne är således en idealisk metod för att utforska interneuronal kretsar som genomgår plasticitet efter skada.
Det finns två kritiska begrepp inblandade i framgångsrika injektion av en viral vektor i ryggmärgen. Först är att fastställa rätt mål med glas nålen och andra är att säkerställa tillräckligt flöde av viruset från nålen in i vävnaden. Eftersom detta protokoll innebär bakåtsträvande spårning, kräver inriktning rätt område en grundlig förståelse av synaptic anslutningarna av neuronala befolkningen av intresse. Propriospinal och reticulospinal nervceller ansluta till ländryggen ryggmärgen riktar här. Dessa nervceller är spridda i hela hjärnstammen och hals och bröstkorg ryggmärgen segmenten, med majoriteten av PNs lokaliserad till bladskivan V-VII inom den grå substans. För att säkerställa transduktion av en lämplig population av nervceller, görs sex viral injektioner över ett område som spänner över fyra spinal segment. L1-L4 segment väljs på grund av de centrala mönsterritare och deras kända anslutningar till andra områden av ryggmärgen. När den rätta spinal rörelsegren och bladskivan är kända, är fysiska placeringen av dessa mål via anatomiska landmärken avgörande. Atlaser som visar Detaljer för anatomiska struktur och vertebrala form kan vara bra att bekräfta inriktning sevärdheter8,36. Det bör noteras att majoriteten av detta protokoll är densamma oavsett om en injektion eller sex görs; skillnaden är bara i antalet spinal segment exponeras via laminektomi, och det faktum att du kommer att behöva ladda glas nålen med ytterligare ett virus om injicera mer än 4 µL. Protokollet kan också enkelt anpassas för musen. På grund av sin mindre storlek, mängden virus injiceras i sladden bör justeras nedåt och de mätningar som behövde träffa de rätta spinal bladskivan justeras. Flera videor av liknande operationer på musen har tidigare varit publicerade37,38.
Det nästa övervägandet är tillräckligt diffusion in i vävnaden. Noggrann förberedelse av nålen är nödvändigt att säkerställa att bländaren är tillräcklig för viral flöde utåt och att skräp blockerar inte spetsen och visualisering av flödet från nålen in i ryggmärgen via en front av färgade färgämne bra att bekräfta att suspensionen tränger in i vävnaden. När suspensionen har delats ut i vävnaden, kommer att upprätthålla nålen inom ryggmärgen för 2-5 minuter säkerställa tillräcklig diffusion.
Framgångsrika transduktion av en målgrupp kan också bero på inneboende egenskaper av virus injiceras som titer, serotyp och infektion effektivitet. Vi hitta en genomisk kopia titer på minst 1010 GC/mL för HiRet lentivirus att fungera bra för Invivo experiment. Högre titrar eller injektionsvolymer kan visa högre märkning index, men försiktighet måste vidtas eftersom virus kunde diffundera ut ur avsedda området eller till kontralaterala ryggmärgen. Hänsyn bör också tas till typen av vektor lämplig för märkning celler av intresse utifrån deras tropism. Vissa virala serotyper kan ha bättre infektion och priser transduktion i olika populationer av nervceller39. Traditionella lentiviral vektorer är kända för att infektera ett stort antal celltyper på grund av VSV-G kuvertet protein, men ändringar av denna vektor kan påverka dess tropism40. Den HiRet konstruktionen ändrar kuvertet av pseudotyping med en fusion glykoprotein (FuG-B) av rabiesvirus, vilket möjliggör mycket effektiv retrograd transport22,23 och är effektiv i transducing propriospinal och reticulospinal skrifter, med neuronala siffror jämförbara med tarmkanalen spårning via metoder såsom fluorogold och microruby4,41 (för Detaljer för konstruktion av HiRet vektor se Hirano et al.) 22. men det inte tillräckligt etikett i vuxen corticospinal tarmkanalen i dessa experiment, även om det märka CST hos nyfödda med hög effektivitet i andra studier1. Det är möjligt att receptorer som är nödvändiga för HiRet upptag på riktade synapserna, såsom NCAM eller p75NTR, är endast svagt uttryckt på vuxen CST nervceller42,43, även om detta utreds fortfarande. I alla fall, visar detta vikten av huruvida den vektor som används är lämpliga för de rikta cellerna. I detta experiment, var hjärnan och ryggmärgsvävnad bearbetas och sökt efter fyra veckor att säkerställa riklig tid för förstärkning och transport från ländryggen sladden till alla områden i hjärnan. HiRet transporteras via snabbt retrograd axonal transport, och således en kortare experimentell period kan vara lämpligt om tillryggalagd sträcka är mindre, såsom om injektionsstället i cervikala ryggmärgen.
Direktinsprutning kirurgi är ett användbart verktyg för införandet av virala vektorn tekniken i ryggmärgen. Användning av HiRet för genetiska experiment är fördelaktigt eftersom det tillåter stabil, lång varaktig transgenens uttryck och är giftfri till nervceller. I detta experiment sågs ingen god Jordbrukarsed märkning i nervceller som inte gör direkt synapsförbindelser till injektionsstället. Detta gällde även i tidigare studier på djur med en bröstkorg kontusion skada25. Dessutom HiRet-GFP inte kunde märka spinal motoriska nervceller eller dorsalrotsganglier ganglion nervceller när injiceras i normalnivå demyeliniserade ischiasnerven (opublicerade observationer). Tillsammans, tyder dessa data på att HiRet inte lätt in genom axoner och effektivt transduces nervceller genom upptag av vektorn i synapser, som ger en mer detaljerad och naturtrogen karta över neuronala anslutningar av Målpopulationen. Detta är en fördel över andra retrogradely transportabla virala vektorer som retrograd adeno-associerade (rAAV-retro), virus som är kända för att tas upp av axoner i passage44 och gör HiRet speciellt användbar i studier mappning regenererande och återansluta kretsar i den skadade ryggmärgen. Hirets fördelar kan också för viss inriktning av neuronala populationer för ljuddämpning eller ablation studier25,44,45,46,47.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete finansierades genom ett bidrag från de nationella institutet för neurologiska sjukdomar och Stroke R01 R01NS103481 och Shriners sjukhuset för pediatrisk forskning bidrag SHC 84051 och SHC 86000 och försvarsdepartementet (SC140089).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #10 Scalpel Blades | Roboz | RS-9801-10 | For use with the scalpel. |
| 1 mL Syringes | Becton, Dickinson and Company | 309659 | For anesthetic IP injection, potential anesthetic booster shots, and antibiotic injections. |
| 10mL Syringes | Becton, Dickinson and Company | 309604 | For injecting saline into the animal, post-surgery. |
| 4.0 Chromic Catgut Suture | DemeTECH | NN374-16 | To re-bind muscle during closing. |
| 48000 Micropipette Beveler | World Precision Instruments | 32416 | Used to bevel the tips of the pulled glass capillary tubes to form functional glass needles. |
| 5% Iodine Solution | Purdue Products L.P. | L01020-08 | For use in sterilzation of the surgical site. |
| 70% Ethanol | N/A | N/A | For sterilization of newly prepared glass needles, animal models during surgical preparation, and surgeon's hands during surgery, as well as all other minor maintainances of sterility. |
| Anesthetic (Ketamine/Xylazine Solution) | Zoetis | 240048 | For keeping the animal in the correct plane of consciousness during surgery. |
| Antibiotic (Cefazolin) | West-Ward Pharmaceuticals | NPC 0143-9924-90 | To be injected subcutaneously to prevent infection post-surgery. |
| Bead Sterilizer | CellPoint | 5-1450 | To heat sterilize surgical instruments. |
| Bonewax | Fine Science Tools | 19009-00 | To seal up bone in the case of bone bleeding. |
| Cauterizer | Fine Science Tools | 18010-00 | To seal any arteries or veins severed during surgery to prevent excessive blood loss. |
| Digital Scale | Okaus | REV.005 | For weighing the animal during surgical preparation. |
| Flexible Needle Attachment | World Precision Instruments | MF34G-5 | For cleaning glass needles and loading red oil into glass needles. |
| Gelfoam | Pfizer | H68079 | To seal up bone in the case of bone bleeding. |
| Glass Capillary Tubes | World Precision Instruments | 4878 | For pulled glass needles - should be designed for nanoliter injectors. |
| Hair Clippers | Oster | 111038-060-000 | For clearing the surgical site of hair. |
| Hemostats | Roboz | RS-7231 | For general use in surgery. |
| Kimwipes | Kimtech | 34155 | For general use in surgery. |
| Medium Point Curved Forceps | Roboz | RS-5136 | For general use in surgery. |
| Micromanipulator with a Vernier Scale | Kanetec | N/A | For precise targeting during surgery. |
| Microscissors | Roboz | RS-5621 | For cutting glass whisps off of freshly pulled glass capillary tubes. |
| Microscope with Light and Vernier Scale Ocular | Leitz Wetzlar | N/A | Used to visualize and measure beveling of pulled glass capillary tubes into functional glass needles. |
| MicroSyringe Pump Controller | World Precision Instruments | 62403 | To control the rate of injection. |
| Nanoliter 2000 Pump Head Injector | World Precision Instruments | 500150 | To load and inject virus in a controlled fashion. |
| Needle Puller | Narishige | PC-100 | To heat and pull apart glass capillary tubes to form glass needles. |
| Ophthalamic Ointment | Dechra Veterinary Products | RAC 0119 | To protect the animal's eyes during surgery. |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | To assist with loading virus into the nanoinjector. |
| PrecisionGlide Needles (25G x 5/8) | Becton, Dickinson and Company | 305122 | For use with the 1mL and 10 mL syringes to allow injection of the animal model. |
| Rat Tooth Forceps | Roboz | RS-5152 | For griping spinous processes. |
| Red Oil | N/A | N/A | To provide a front for visualization of virus entering tissue during injection. |
| Retractors | Roboz | RS-6510 | To hold open the surgical wound. |
| Rimadyl Tablets | Bio Serv | MP275-050 | For pain management post-surgery. |
| Rongeurs | Roboz | RS-8300 | To remove muscle from the spinal column during surgery. |
| Scalpel Blade Handle | Roboz | RS-9843 | To slice open skin and fat pad of animal model during surgery. |
| Scissors | Roboz | RS-5980 | For general use in surgery. |
| Stainless Steal Wound Clips | CellPoint | 201-1000 | To bind the skin of the surgical wound during closing. |
| Staple Removing Forceps | Kent Scientific | INS750347 | To remove the staples, should they be applied incorrectly. |
| Sterile Cloth | Phenix Research Products | BP-989 | To provide a sterile surface for the operation. |
| Sterile Cotton-Tipped Applicators | Puritan | 806-WC | To soak up blood in the surgical wound while maintaining sterility. |
| Sterile Gauze | Covidien | 2146 | To clean the surgical area and surgical tools while maintaining sterility. |
| Sterile Saline | Baxter Healthcare Corporation | 281324 | For use in blood clearing, and for replacing fluids post-surgery. |
| Surgical Gloves | N/A | N/A | For use by the surgeon to maintain sterile field during surgery. |
| Surgical Heating Pad | N/A | N/A | For maintaining the body temperature of the animal model during surgery. |
| Surgical Microscope | N/A | N/A | For enhanced visualization of the surgical wound. |
| Surgical Stapler | Kent Scientific | INS750546 | To apply the staples. |
| T/Pump Heat Therapy Water Pump | Gaymar | TP500C | To pump warm water into the water convection warming pad. |
| Water Convection Warming Pad | Baxter Healthcare Corporation | L1K018 | For use in the post-operational recovery area to maintain the body temperature of the unconscious animal. |
| Weighted Hooks | N/A | N/A | To hold open the surgical wound. |
References
- Wang, X., et al. Deconstruction of corticospinal circuits for goal-directed motor skills. Cell. 171 (2), 440-455 (2017).
- Kinoshita, M., et al. Genetic dissection of the circuit for hand dexterity in primates. Nature. 487 (7406), 235-238 (2012).
- Brichta, A. M., Grant, G. Cytoarchitectural organization of the spinal cord. The rat nervous system. Vol. 2, hindbrain and spinal cord. , Academic Press. (1985).
- Liang, H., Paxinos, G., Watson, C. Projections from the brain to the spinal cord in the mouse. Brain Structure & Function. 215 (3-4), 159-186 (2011).
- Rexed, B. The cytoarchitectonic organization of the spinal cord in the cat. The Journal of Comparative Neurology. 96 (3), 414-495 (1952).
- Schmued, L. C., Fallon, J. H. Fluoro-gold: A new fluorescent retrograde axonal tracer with numerous unique properties. Brain Research. 377 (1), 147-154 (1986).
- Veenman, C. L., Reiner, A., Honig, M. G. Biotinylated dextran amine as an anterograde tracer for single- and double-labeling studies. Journal of Neuroscience Methods. 41 (3), 239-254 (1992).
- Watson, C., Paxinos, G., Kayalioglu, G., Heise, C. Atlas of the rat spinal cord. The spinal cord. , 238-306 (2009).
- Brandt, H. M., Apkarian, A. V. Biotin-dextran: A sensitive anterograde tracer for neuroanatomic studies in rat and monkey. Journal of Neuroscience Methods. 45 (1-2), 35-40 (1992).
- Geed, S., van Kan, P. L. E. Grasp-based functional coupling between reach- and grasp-related components of forelimb muscle activity. Journal of Motor Behavior. 49 (3), 312-328 (2017).
- Reiner, A., Veenman, C. L., Medina, L., Jiao, Y., Del Mar, N., Honig, M. G. Pathway tracing using biotinylated dextran amines. Journal of Neuroscience Methods. 103 (1), 23-37 (2000).
- Steward, O., Zheng, B., Banos, K., Yee, K. M., et al. Response to: Kim et al., "axon regeneration in young adult mice lacking nogo-A/B." neuron 38, 187-199. Neuron. 54 (2), 191-195 (2007).
- Brown, B. D., et al. A microRNA-regulated lentiviral vector mediates stable correction of hemophilia B mice. Blood. 110 (13), 4144-4152 (2007).
- Lo Bianco, C., et al. Lentiviral vector delivery of parkin prevents dopaminergic degeneration in an alpha-synuclein rat model of parkinson's disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (50), 17510-17515 (2004).
- Malik, P., Arumugam, P. I., Yee, J. K., Puthenveetil, G. Successful correction of the human cooley's anemia beta-thalassemia major phenotype using a lentiviral vector flanked by the chicken hypersensitive site 4 chromatin insulator. Annals of the New York Academy of Sciences. 1054, 238-249 (2005).
- Pawliuk, R., et al. Correction of sickle cell disease in transgenic mouse models by gene therapy. Science. 294 (5550), 2368-2371 (2001).
- Wang, G., et al. Feline immunodeficiency virus vectors persistently transduce nondividing airway epithelia and correct the cystic fibrosis defect. The Journal of Clinical Investigation. 104 (11), R55-R62 (1999).
- Liang, H., Paxinos, G., Watson, C. The red nucleus and the rubrospinal projection in the mouse. Brain Structure & Function. 217 (2), 221-232 (2012).
- Abdellatif, A. A., et al. delivery to the spinal cord: comparison between lentiviral, adenoviral, and retroviral vector delivery systems. Journal of Neuroscience Research. 84 (3), 553-567 (2010).
- DePolo, N. J., et al. VSV-G pseudotyped lentiviral vector particles produced in human cells are inactivated by human serum. Molecular Therapy. 2 (3), 218-222 (2000).
- Higashikawa, F., Chang, L. Kinetic analyses of stability of simple and complex retroviral vectors. Virology. 280 (1), 124-131 (2001).
- Hirano, M., Kato, S., Kobayashi, K., Okada, T., Yaginuma, H., Kobayashi, K. Highly efficient retrograde gene transfer into motor neurons by a lentiviral vector pseudotyped with fusion glycoprotein. PLoS One. 8 (9), e75896 (2013).
- Kato, S., et al. A lentiviral strategy for highly efficient retrograde gene transfer by pseudotyping with fusion envelope glycoprotein. Human Gene Therapy. 22 (2), 197-206 (2011).
- Kato, S., et al. Selective neural pathway targeting reveals key roles of thalamostriatal projection in the control of visual discrimination. The Journal of Neuroscience. 31 (47), 17169-17179 (2011).
- Sheikh, I. S., Keefe, K. M., et al. Retrogradely transportable lentivirus tracers for mapping spinal cord locomotor circuits. Frontiers in Neural Circuits. 12, 60 (2018).
- Harrison, M., et al. Vertebral landmarks for the identification of spinal cord segments in the mouse. NeuroImage. 68, 22-29 (2013).
- Tang, X. Q., Heron, P., Mashburn, C., Smith, G. M. Targeting sensory axon regeneration in adult spinal cord. The Journal of Neuroscience. 27 (22), 6068-6078 (2007).
- Cameron, A. A., Smith, G. M., Randall, D. C., Brown, D. R., Rabchevsky, A. G. Genetic manipulation of intraspinal plasticity after spinal cord injury alters the severity of autonomic dysreflexia. The Journal of Neuroscience. 26 (11), 2923-2932 (2006).
- Liu, Y., Keefe, K., Tang, X., Lin, S., Smith, G. M. Use of self-complementary adeno-associated virus serotype 2 as a tracer for labeling axons: Implications for axon regeneration. PLoS One. 9 (2), e87447 (2014).
- Chamberlin, N. L., Du, B., de Lacalle, S., Saper, C. B. Recombinant adeno-associated virus vector: Use for transgene expression and anterograde tract tracing in the CNS. Brain Research. 793 (1-2), 169-175 (1998).
- Filli, L., et al. Bridging the gap: A reticulo-propriospinal detour bypassing an incomplete spinal cord injury. The Journal of Neuroscience. 34 (40), 13399-13410 (2014).
- Williams, R. R., Pearse, D. D., Tresco, P. A., Bunge, M. B. The assessment of adeno-associated vectors as potential intrinsic treatments for brainstem axon regeneration. The Journal of Gene Medicine. 14 (1), 20-34 (2012).
- Smith, G. M., Onifer, S. M. Construction of pathways to promote axon growth within the adult central nervous system. Brain Research Bulletin. 84 (4-5), 300-305 (2011).
- Morcuende, S., Delgado-Garcia, J. M., Ugolini, G. Neuronal premotor networks involved in eyelid responses: Retrograde transneuronal tracing with rabies virus from the orbicularis oculi muscle in the rat. The Journal of Neuroscience. 22 (20), 8808-8818 (2002).
- Ugolini, G. Specificity of rabies virus as a transneuronal tracer of motor networks: Transfer from hypoglossal motoneurons to connected second-order and higher order central nervous system cell groups. The Journal of Comparative Neurology. 356 (3), 457-480 (1995).
- Gelderd, J. B., Chopin, S. F. The vertebral level of origin of spinal nerves in the rat. The Anatomical Record. 188 (1), 45-47 (1977).
- Inquimbert, P., Moll, M., Kohno, T., Scholz, J. Stereotaxic injection of a viral vector for conditional gene manipulation in the mouse spinal cord. Journal of Visualized Experiments. 73, e50313 (2013).
- Carbajal, K. S., Weinger, J. G., Whitman, L. M., Schaumburg, C. S., Lane, T. E. Surgical transplantation of mouse neural stem cells into the spinal cords of mice infected with neurotropic mouse hepatitis virus. Journal of Visualized Experiments. 53, e2834 (2011).
- Snyder, B. R., et al. Comparison of adeno-associated viral vector serotypes for spinal cord and motor neuron gene delivery. Human Gene Therapy. 22 (9), 1129-1135 (2011).
- Cronin, J., Zhang, X. Y., Reiser, J. Altering the tropism of lentiviral vectors through pseudotyping. Current Gene Therapy. 5 (4), 387-398 (2005).
- Reed, W. R., Shum-Siu, A., Onifer, S. M., Magnuson, D. S. Inter-enlargement pathways in the ventrolateral funiculus of the adult rat spinal cord. Neuroscience. 142 (4), 1195-1207 (2006).
- Mao, X., Schwend, T., Conrad, G. W. Expression and localization of neural cell adhesion molecule and polysialic acid during chick corneal development. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (3), 1234-1243 (2012).
- Charles, P., et al. Negative regulation of central nervous system myelination by polysialylated-neural cell adhesion molecule. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (13), 7585-7590 (2000).
- Tervo, D. G., et al. A designer AAV variant permits efficient retrograde access to projection neurons. Neuron. 92 (2), 372-382 (2016).
- Tohyama, T., et al. Contribution of propriospinal neurons to recovery of hand dexterity after corticospinal tract lesions in monkeys. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (3), 604-609 (2017).
- Liu, Y., et al. A sensitized IGF1 treatment restores corticospinal axon-dependent functions. Neuron. 95 (4), 817-833 (2017).
- Kinoshita, M., et al. Genetic dissection of the circuit for hand dexterity in primates. Nature. 487 (7406), 235-238 (2012).
