Summary
Bu iletişim kuralı retrogradely taşınabilir bir viral vektör enjeksiyon sıçan spinal kord doku içine gösterir. Vektör sinaps kapladığı ve hedef nöron hücre gövdesi nakletti. Bu model önemli spinal yolları veya gen terapisi uygulamaları için hedefleme hücrelerin retrograd izleme için uygundur.
Abstract
Sinir sisteminde hücreye proteinler ilgi tanıtan en molekülleri erişimi sınırlamak doğuştan gelen biyolojik engelleri nedeniyle zordur. Spinal kord doku içine doğrudan enjeksiyon hücre organları erişim sağlayan bu engelleri atlar veya nerede molekülleri dahil olmak synapses. Bu yöntemle viral vektör teknoloji birleştiren gen terapisi veya yolu izleme amacıyla sinir dokusu içine hedef genlerin giriş için izin verir. Burada son derece etkili retrograd taşıma (HiRet) için tasarlanmış bir virüs, propriospinal interneurons (PNs omurilik ve beyin sapı çekirdeği nöronlarda için özel taşıma teşvik etmek) sinapslarda geliştirdiler. PNs hedefleme, rubrospinal ve reticulospinal yolları yanı sıra birbirleri ile onların arabağlantı omurilik segmentler boyunca gibi motor yolları üzerinden aldıkları çok sayıda bağlantıları yararlanır. Temsilcisi izleme hücre gövdeleri, akson ve dendritik arbors Torasik PNs ve reticulospinal nöronlarda pontine ağsı yapısal etkin yeşil flüoresan protein (GFP) gösterir yüksek sadakat ayrıntılarını HiRet vektör kullanarak. HiRet birleştirmek de beyin sapı yolları ve PNs ama yaş bağımlı entegrasyon corticospinal yolu nöronların içine gösterir. Özetle, spinal kord enjeksiyon viral vektörler kullanarak ilgi proteinlerin giriş neurons in hedeflenen arazi içine için uygun bir yöntemdir.
Introduction
Viral vektörler genetik materyal arızalı genler, upregulate önemli büyüme proteinler telafi etmek veya yapısı ve sinaptik bağlantıları vurgulamak marker protein üretimi için hücrelere tanıtabilirsiniz önemli biyolojik araçlardır hedefleri. Bu makale floresan izleme büyük motorlu yolları vurgulamak için yüksek verimli retrogradely taşınabilir lentiviral vektör sıçan spinal kord içine direkt enjeksiyon üzerinde duruluyor. Bu yöntem da nöronların farklı nüfus proteinler ilgi tanıtmak aksonal rejenerasyon ve büyütme çalışmaları için son derece uygun ve nöronlar fonksiyonel Haritalama çalışmaları1,2için susturmak için kullandı.
Birçok omurilik motor yolları anatomik ayrıntılarını direkt enjeksiyon çalışmalar ile BDA ve fluoro-altın3,4,5,6,7 gibi klasik tarayıcıları aracılığıyla aydınlatılmamıştır , 8. bu tarayıcıları altın standart olarak kabul edilir ancak bazı dezavantajları alımı gibi tarafından hasarlı aksonlar olabilir veya bir enjeksiyon çevreleyen beyaz madde pasajda akson sitesindeki9,10,11 . Bu yolu bağlantısı yanlış yorumlara neden olabilir ve bir dezavantajı ise yenilenme çalışmaları nerede boya absorpsiyonu ile bozuk veya kesik aksonlar lifleri daha sonra analiz12sırasında yeniden oluşturulması için yanlış olabilir olabilir.
Lentiviral vektörel çizimler nöron popülasyonları13,14,15,16,17,18 istikrarlı, uzun vadeli ifadede sağladıkları gen terapisi çalışmalarda, popüler şunlardır ,19. Ancak, geleneksel olarak paketlenmiş lentiviral vektörler retrograd taşıma sınırlı olan ve kullanıldığında bağışıklık sistemi yanıt tetikleyebilir vivo içinde4,20,21. HiRet olarak adlandırdığı bir yüksek verimli retrograd ulaşım vektör retrograd taşıma22,23geliştirir bir melez vektör oluşturmak için bir kuduz virüsü glikoprotein olan viral zarf değiştirerek Kato vd tarafından hazırlanmıştır.
Retrograd izleme o hücrenin axon tarafından alınan ve hücre vücut nakli izin bir hedef nöron sinaptik uzaya bir vektör tanıtır. Başarılı taşıma HiRet nöronal sinapslarda fareler ve maymunlar23,24 beyinlerinin içine ve motor nöronlar22kasına göstermiştir. Bu iletişim kuralı lomber spinal kord, özellikle propriospinal interneurons ve beyin sapı neurons sinaptik terminallerinin hedef içine enjeksiyon gösterir. PNs bağlantıları birçok farklı spinal yolları almak ve böylece omurilik ve beyin sapı nöronlarda farklı bir nüfusa hedeflemek için yararlı olabilir. Bu çalışmada etiketli nöronlar hindlimb motor işlevleri ile ilgili motor nöron havuzları innerve devreleri temsil eder. Sağlam etiketleme omurilik ve beyin sapı, dendritik arbors ve akson terminalleri yüksek sadakat ayrıntılarını dahil görülür. Biz de bu yöntem servikal spinal kord içinde önceki çalışmalarda propriospinal ve beyin sapı reticulospinal yolları25etiketlemek için kullandık.
Bu iletişim kuralı bir viral vektör enjeksiyon lomber spinal kord sıçan içine gösterir. Film 1 ' de görüldüğü gibi son kaburga bulunan L1 vertebra tanımlayarak belgili tanımlık kesme hedeflenmektedir. Bu kas L1-L4 omurilik üzerinde ortaya çıkaran bir 3-4 cm kesi Kaudal bir dönüm noktası kullanılır. Laminectomies T11-T13 vertebra dorsal yönlerini gerçekleştirilir ve eğimli cam iğne 0.8 mm lateral orta hat ve alçaltılmış 1.5 mm yönlendirilir virüs enjekte etmek için gri madde içine.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Aşağıdaki cerrahi ve hayvan bakımı yordamların tümünü hayvan bakım ve kullanım Komitesi Temple Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.
1. cerrahi öncesi hazırlıklar
- Çekti cam iğneler viral enjeksiyon 3,5 nanoliter cam kapiller Pipetler nanoliter enjektörler için tasarlanmış kullanarak ameliyattan önce bir kaç gün için hazır olun. Bir iki adım iğne çektirmenin iki iğne şablonları oluşturmak için üreticinin yönergelerine uygun olarak her pipet çek.
- Yaklaşık 1-2 mm microscissors ile fazla cam keserek iğne şablonları ucu daraltın. Ölçü yaklaşık diyafram boyutu iğneler 30-40 µm diyafram ile izole etmek mikroskop kalibrasyon kaydıraklı bir mikroskop altında.
- 30 ° konumlandırılmış iğneyle micropipette beveller 30-40 µm diyafram ve 45 ° eğik açı ile bir ipucu oluşturmak için kullanın. Diyafram genişliği ile kalibrasyon slayt Vernier ölçekte doğrulayın. Su ve etanol enkaz silsin ve iğne düzenli aralıklarla siyah bir marker ile işaretlemek için bir esnek iğne eki ile kullanarak cam iğne geçişi.
- İğneler daha önce % 70 etanol ile temizlenmiş kapalı Petri kabına yerleştirin ve 30 dk içinde bir biyogüvenlik başlık UV ışık altında için sterilize.
- HiRet lentivirus hemen önce yordamı dondurucu uygun bir birim kaldırarak hazırlayın.
Not: Uygun bir birim enjeksiyon için gerekli tutar içerir (enjeksiyon başına 1 µL enjeksiyon sayısı x) pipetting ve kayıp yükleme için hesabınıza ilave birim az miktarda artı. Taşıma ve virüs buz kullanılmadığı zaman saklamak. - Enjektör micropump tıkalı ve Vernier ölçekli bir micromanipulator içine yerleştirerek hazırlayın.
- Cam iğne hazırlamak, dikkatle kırmızı petrol gibi renkli bir boya bir şırınga ile yük için esnek bir iğne ile donatılmış. Hava kabarcığı yok iğnede kalmadığından emin olun. Aseptik teknik iğne işlerken kullanın ve ucu dokunmaktan kaçının.
- Cam iğne iğne contalar doğru şekilde oturduğundan, enjektör kapağı üzerinde sıkı vidalı ve çelik enjektör iğne genişletilmiş sağlamak enjektör Ekle yaklaşık ¾ cam iğne uzunluğu. Virüs bir sonraki adımda iğne içine yüklenebilir.
2. anestezi ve cerrahi sitesi hazırlama
- Hayvan dijital bir ölçekte tartın. Kayıt pre-operative kilo ağırlık ameliyat sonrası izlemek için izin veren ve gerekli anestezi seviyesini belirlemek için. Kadın Sprague-Dawley Rat yaklaşık 200-250 g bu protokol için kullanılmıştır.
- İsoflurane inhalasyon veya enjekte ketamin/xylazine çözümünü kullanarak fare anestezi (k / x). Burada, ketamin intraperitoneally 67 mg/kg ve xylazine, 6,7 mg/kg doz enjekte edilir.
- Uygun bir anestezik uçak sıkıca ayak pinching tarafından onaylayın. Yansımalı çekilme ortaya çıkarsa, devam etmeden önce birkaç ek dakika bekleyin.
Not: Ayrıca bıyık, gözleri ve solunum hızı bilinç belirtileri için dikkat. Anestezik uçak protokolü ile devam etmek için daha derin bıyık seğirmesi, hafifçe dokunduğu zaman göz yanıp söner veya hızlı ve sığ nefes alıyor, bekleyin. Ayrıca bu işaretler laminektomi ve enjeksiyon ameliyat boyunca izlemek. Hayvan sığ bir anestezik uçak görüntüleniyorsa, yalnızca ketamin eşit bir booster shot ½ simgesiyle özgün k yönetmek / doz x. - Kalça üzerinden dorsal orta hat scapulae aşağı açı boyunca fare tıraş. Hayvan derinin gergin bir daha kolay ve daha hassas tıraş çek.
- Oftalmik merhem her iki gözde için geçerlidir.
- Site sterilize etmek için traş bölgeye antiseptik uygulanır. İlk fırçalayın için %5 iyot çözüm ve silme uzakta ile steril gazlı bez bütün kıl ve enkaz emmek. Böylece hiçbir alan iki kez temas bu etanol % 70, sırılsıklam steril gazlı bez ile tek yönlü bir tokatlamak ile izleyin. Bu aynı teknikle iyot ve etanol batırılmış gazlı bez iki kez daha fazla alternatif ile kullanın.
3. cerrahi alan ve enstrüman hazırlık
- Neşter, rongeurs, sıçan diş forseps, Bahar makas, hemostats, kavisli orta noktası forseps ve traktör veya ağırlıklı kanca steril bir alan oluşturmak için steril şal unwrapping tarafından dahil autoclaved cerrahi araçlar kümesi hazırlayın.
- Steril cerrahi eldiven paketi açın ve steril eldiven şal masaya koyun. Bu steril Wrap önlemek amacıyla kullanılan araçlar için ek bir steril alanı olarak kullanın.
- #10 neşter bıçak steril alanı bırakın. Bıçak saplı hemostats ile güvenli. Pozisyon steril serum fizyolojik, 4.0 fotokromik akorduna dikiş ve bir cauterizer, steril gazlı bez, steril pamuklu uçlu uygulayıcıları (için kas taşma payları), veya aspirasyon veya erişilebilir bir yerde (için kemik Taşmalar) bonewax gibi kanama kontrolü için malzemeler.
- Hayvan almak ve Steril bez üzerinde ayarlayın. Mesane idrar toplamak için altına gazlı bez koyun. Hedef alanı karın altında bir rulo havlu ile desteklemek. Varsa, cerrahi Isıtma yastığını özellikle uzun yordamları için Steril bez altında yerleştirin.
Not: Kısırlık hayatta kalma ameliyat sırasında önemlidir. Bir yandan kısırlık eldivenli elleri ve enstrüman kısırlık aşılırsa bir kullanım boncuk Sterilizatör veya bireysel ameliyatlar arasında korumak için % 70 etanol sprey şişe tutmak.
4. vertebral sütunun teşhir ve laminektomi siteyi
- Nerede bir cilt kesi parmakları hafifçe son kaburga basarak L1 vertebra bulmak için yapılacak alanı tanımlayın. Bu bir dönüm noktası kullanarak, bir 3-4 cm cilt kesi biten #10 cerrahi neşter ile sadece L1 kas gücü ortaya çıkarmak için daha aşağı olun. Nazik yayarak cilt sıkı tutun ve sıkıca temiz bir kesi sağlamak için neşter bıçakla basın.
- Kesmek ve yüzeysel fat forseps ve makas gerekirse ile yayıldı. (Hedef omur üzerinde bağlı olarak orada olup olmadığı bir büyük yağ yastığı kas için yüzeysel değil).
- Neşter bıçak veya bir parmak düz spinöz işlemlerle için hissediyorum. Genellikle orta hat alan iki tarafında beyaz şerit bir "V" tarafından özetlenen. Sonra güvenli bir şekilde bir üst süreç fare diş Forseps ile yakala gibi işlemleri mümkün olduğunca yakın 2 uzun, derin kesim yapmak izin vermek için küçük bir rostral kesim yapmak. Kesim en derin noktasında vertebra dorsal yüzeyi neşter bıçakla hissedilebilir.
- Yanal kasları ekartör veya görünürlüğünü artırmak için ağırlıklı kanca ile bir kenara tutun. Bir neşter, Bahar makas ya da başlarını şeklini belirlemek için rongeurs işlemlerle etrafında net kas.
Not: omurilik vertebral sütunun tam uzunlukta omurilik doku durur daha kemik gelişiminde daha önce büyüyen olarak kapsamaz unutmayın. Bu hedef spinal düzey altında farklı adlandırılmış bir omur olabilir anlamına gelir. - T11 ve bitişik T12 ve T13 işlemleri bulun.
Not: doğru vertebra düzeyi hedefleme yardım-ebilmek bulunmak içinde bir sıçan spinal kord atlas ve önceki çalışmalar çok benzer olan fareyi simge yapılar ortaya koyan vertebra yapısı6,33. Rostral spinöz proses T9 gibi bir orta hat dönüm noktası vermek için rahatsız bekletin.
5. bir laminektomi gerçekleştirme
- Bir kez hedef alan doğru olarak tespit edilmiştir, laminectomies T11-T13 dorsal yönlerini gerçekleştirin. Omurga kemik ilk ısırık için rongeurs eklemek iyi sitelerdir, intervertebral kasları ortaya çıkarmak için yavaşça yayıldı. Rongeurs ayrıntılı denetimini artırmak için bir yarı-kapalı konumda tutun.
- Spinöz süreçleri ve vertebra dorsal yönünü rongeurs ile küçük alıntılar alarak kaldırın. Spinal kord zarar ya da beyin zarı rahatsız değil dikkatli olun. Biraz omurilik omurga uzak Çekme yardımcı olmak için fare diş Forseps ile Asansör ve spinal kord doku vurmak eğilimi azaltmak.
- Böylece orta hat kan damarı gözlenen kemik uzak orta çizgi temizleyin. Açıkça omurilik doku gösterir ve enkaz serbest olduğundan bir pencere bırakın.
- Yavaşça omurilik Forseps ile dokunun. Anestezik uçaklarını derin olsa bile bazı hayvanlar refleksle atlamak olabilir. Lidokain gibi uyuşturucu bir aracı birkaç damla doğrudan omurilik enjeksiyon işlemi sırasında atlama önlemek için geçerlidir.
- Hayvan bir omurilik tutucu spinöz işlemlere rostral ve Kaudal laminektomi penceresine sabitleme forseps bağlama tarafından güvenli. Karın hareketleri nefes etkisini inkâr için spinal tutucu kullanarak hayvan yetiştirmek. Bu iğne kararlılığı artırır ve enjeksiyon uygun derinlik sağlamak.
6. yükleme virüs ve enjektör konumlandırma
- Virüs Enjektör yaklaşık 5 µL üzerine parafilm bir parça pipetting ve iğne ucu içinde belgili tanımlık damla böylece konumlandırma tarafından yük.
- Micropump virüs 20 – 100 nL/s hızında en fazla 4 µL çekmek için kullanın.
- Enjekte etmek ve virüs--dan iğne iğne ucu engellenmiş değil emin olmak için küçük bir miktar yayın denetleyicisi ayarlayın. Aşırı virüs ile bir laboratuvar silin silin.
Not: Çelik iğne Hamilton şırınga çekti cam Pipetler alternatif olarak kullanılabilir. - Vernier ölçektir micromanipulator konumlandırın ve spinal kord orta hat, iğne pozisyon.
Not: Orta hat bazen büyük bir kan damarı Medulla Spinalis ön yüzeyde çalışan bulunabilir. Ancak, bu bireysel Rat değişebilir ve orta hat hedefleme işlemekte bozulmamış bir spinöz proses onaylanması. - İğne yanal 0.8 mm Vernier ölçek üzerinde micromanipulator kullanarak doğrudan.
- Girintileme, ama değil delinme, beyin zarı dek iğne omurilik için indirin. 1.5 mm derinliğe kadar battı vardır kadar hızlı büküm hareket kullanan, beyin zarı iğneyle delik.
7. omurilik virüs enjekte
- İğneyi yerinde olduğunda, program 400 nL/dak Onayla o virüs oranında enjekte enjektör boya açık ilerlemesini gözlemleyerek omurilik giriyor. Hiçbir belirgin sızıntı veya spinal kord dokusunun şişkin olmalıdır. Sızıntı gözlem yapılırsa, bu bazen 200 nL/dk enjeksiyon hızını azaltarak hafifletti.
- Enjeksiyon işlemi bittiğinde, 2-5 dk (Cilt enjekte) bağlı olarak spinal kord dinlenmek iğne izin Difüzyon virüs kolaylaştırmak için.
- Yavaş yavaş iğne geri çekilin ve sonraki enjeksiyon siteye taşımak. Her biri 6 eşit aralıklı siteleri yaklaşık 1 mm L1-L4 spinal doku uzunluğu boyunca ayrı içine 1 µL virüs enjekte. Düzgün çalışmaya devam eder sürece aynı iğne her enjeksiyon için kullanılabilir.
8. yara kapatma ve post operatif bakım
- Hayvan spinal sahibinden kaldırmak ve traktör veya lateral kas yaymak için kullanılan kanca götürün. Yara kapanmadan önce tüm enkaz açık olduğundan emin olun.
- 4.0 fotokromik akorduna dikiş kullanarak kas dikiş. Dikiş konu yakın iç cildi tahriş olasılığını azaltmak için düğüm kesti.
- 9 mm yara klip kullanarak kapalı cilt zımbala. En iyi şifa için izin vermek için zımbalama önce cilt kenarları hattı.
- Hayvan ısınma pad ve monitör kadar uykusuz bir su konveksiyon yerleştirin.
- 5-10 mL subkutan sıvı ve antibiyotik gibi sülfadiyazin enfeksiyonu önlemek için yeniden doldurmak için steril serum enjekte. Hayvan olduğunda ayaktan, ev onun kafesine geri yerleştirin ve ilk analjezikler sağlayın. Ağrı ve acı bir iz sıçanlara izlemek ve acının azaltılması için onaylı IACUC yordamına uygun davranın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Başarılı enjeksiyon ve viral vektör taşımacılığının iletim tek taraflı nöronların spinal kord ve bazı beyin sapı çekirdek güçlü bir nüfusun sonuçlanmalıdır. Basmakalıp neurons ve akson torasik spinal kord ve beyin sapı, dört hafta sonrası enjeksiyon pontine ağsı etiketlerine göre şekil 1 gösterir. Önemli GFP ifade torasik spinal kord enjeksiyon (şekil 1A, kutulu alan) Ipsilateral tarafında gri madde nöronlarda görülmektedir. Birkaç nöronlar da kontralateral tarafında, özellikle yakın orta hat gözlenir. Beyaz madde GFP ifade aksonlar Ipsilateral Kord (şekil 1A, oklar ve ok uçları), içinde özellikle bölgelerde propriospinal akson (ok uçları) tipik görülmektedir. Şekil 1A' a, nöronal hücre organları ve dendrites gösteren tipik ifade kutulu çevrenin daha yüksek bir büyütme düzeyini gösterir. Nöronlar GFP ifadesinde de görülebilir pontine ağsı gibi beyin sapı çekirdeği (şekil 1B, kutulu alanında daha yüksek büyütme şekil 1B').
Şekil 1: iletim nöronların omurilik ve beyin sapı. (A) GFP ifade nöronlar (kutulu alan), aksonlar propriospinal nöronların (ok uçları) ve akson torasik spinal kord diğer yolları (oklar). (A') Kutulu alanda GFP etiketli nöronlar ve dendrites ifade beyin sapı nöronal ifade a. (B) pontine ağsı daha yüksek büyütme. (B') Bkutulu alanında daha yüksek büyütme. Ölçek çubukları:(a)= 500 mikron; (B) = 1 mm; (A'), (B') = 50 mikron. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Film 1: Lomber spinal kord içine enjeksiyon farenin hedefleme. Bu video özetleri hedefleme temelleri ve viral vektör enjeksiyon sıçan spinal kord içine. Bu videoyu izlemek için lütfen buraya tıklayın. (İndirmek için sağ tıklatın.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Beyin ve omurilik nöronlarda genetik manipülasyon vurgulamak duyusal, motor ve otonomik yolları floresan izleme aracılığıyla ve büyütme potansiyeli nöronal yollarini yaralanma27,28sonra, keşfetmek için hizmet vermiştir 29 , 30 , 31 , 32 , 33. retrogradely taşınabilir bir viral vektör enjeksiyon omurilik içine yapım bu yöntemi eşleme yolları için mükemmel bir seçim merkezi sinir sistemi nöron popülasyonları onların sinaptik bağlantılar üzerinden hedef doğrudan. HiRet vektör nöronal synapse22,24,25ve önceki izleme seçici alımını özellikle yaralı aksonlar veya ilgisiz hücreleri içine hiçbir yayılmış gösterdi benzer şekilde yapılandırılmış vektörel çizimler ile gösterir 34 , HiRet featuring sonuçlarla tutarlı 35,22,23,25oluşturmak. Böylece, HiRet direkt enjeksiyon retrograd bir izleyici olarak plastisite yaralanma sonra tabi interneuronal devreler keşfetmek için ideal bir yöntemdir.
Başarılı bir viral vektör enjeksiyon omurilik içine katılan iki önemli kavram vardır. İlk cam iğne ile doğru hedef kurulması ve ikinci iğne virüsü yeterli akışını dokusuna garanti etmektedir. Bu iletişim kuralı retrograd izleme karıştırmak gibi doğru alan hedefleme ilgi nöronal nüfusunun sinaptik bağlantıları kapsamlı bir anlayış gerektirir. Burada Propriospinal ve reticulospinal nöronlar lomber spinal kord bağlama hedeflenir. Bu nöronlar beyin sapı ve lamina V-VII gri madde içinde için yerelleştirilmiş PNs çoğunluğu servikal ve torasik spinal kord kesimi boyunca yayılır. İletim nöronların yeterli bir nüfusun emin olmak için altı viral enjeksiyonları dört spinal segmentler kapsayan bir alan yapılır. L1-L4 kesimleri Merkezi desen jeneratörler ve omurilik diğer alanlarına bağlantıları bilinen varlığı nedeniyle tercih edilmektedir. Bir kez doğru spinal segment(s) ve lamina bilinir, bu hedefler anatomik yerler ile fiziksel konumunu önemlidir. Anatomik yapısı ve vertebra şekli ayrıntılarını gösteren atlaslar hedefleme yerlerinden8,36onaylamak yararlı olabilir. Bu bir iğne veya altı yapılmış olup bu protokolü çoğunluğu aynı kalır olması gerekmektedir; Sadece laminektomi ve cam iğne ek virüs ile daha--dan 4 µL enjekte Eğer yeniden yüklemek gerekir aslında üzerinden maruz spinal segmentler sayısında farktır. Protokol Ayrıca fareyi için kolayca adapte edilebilir. Onun küçük boyutta nedeniyle kordon enjekte virüs hacmi aşağı doğru ayarlanması gereken ve doğru spinal lamina vurmak için gerekli ölçümler ayarlanır. Birkaç video fare benzer ameliyatları daha önce yayımlanmış37,38olmuştur.
Sonraki dikkate doku içine yeterli Difüzyon naziksiniz. İğne dikkatli hazırlanması diyafram dışa ve enkaz ucu engellemez ve iğne akışından görselleştirme ile renkli boya önü omurilik içine akmaya viral süspansiyon için yeterli olduğundan emin olmak gereklidir süspansiyon doku sızıyor onaylamak yararlı. Süspansiyon dokusu içine dağıtılmış bir kez, 2-5 dakika içinde omurilik iğne Bakımı yeterli Difüzyon sağlayacaktır.
Başarılı iletim hedef popülasyona Ayrıca titresi, serotip ve enfeksiyon verimliliği gibi enjekte virüs içsel özelliklerini bağlıdır. Biz en az 10 genomik kopya titresi bulmak10 GC/mL HiRet lentivirus için de içinde vivo deneyler için çalışmak. Daha yüksek titreleri veya enjeksiyon birimleri daha yüksek etiketleme dizin gösterebilir, ancak bakım virüs hedeflenen alan dışında veya kontralateral spinal kord diffüz beri alınması gerekiyor. Dikkate de vektör ilgi onların tropism dayalı etiketleme hücreler için uygun türü verilmesi gerekir. Bazı viral serotipleri daha iyi enfeksiyon ve iletim hızları nöronlar39farklı nüfus içinde olabilir. Bu vektör değişiklikler onun tropism40etkileyebilir ancak geleneksel lentiviral vektörler geniş bir hücre tiplerinin VSV-G zarf protein nedeniyle enfekte olduğu bilinmektedir. Yüksek verimli retrograd taşıma22,23 için sağlar ve propriospinal transducing etkili olan kuduz virüsünün bir füzyon glikoprotein (Miu-B) ile pseudotyping tarafından zarf HiRet yapısı değiştirir ve nöronal numaraları yolu izleme (ayrıntılı bilgi için HiRet vektör bkz: öğretmen ve ark inşaat.) fluorogold ve microruby4,41 gibi yöntemleri ile karşılaştırılabilir ile reticulospinal yolları 22. diğer çalışmalar1yüksek verimlilik ile ventilasyon CST etiket yok olsa ancak, bu yeterince yetişkin corticospinal yolu bu deneylerde yazdınız mı değil. Bu mümkündür bu reseptörleri NCAM veya p75 gibi hedeflenen sinapslarda, HiRet alımı için gerekliNTR, mısın sadece zayıf olsa da bu hala soruşturuluyor yetişkin CST nöronlar42,43at, ifade. Her durumda, bu kullanılan vektör hedef hücreler için uygun olup olmadığını belirleme önemini göstermektedir. Bu deneyde, beyin ve omurilik doku işlenen ve güçlendirme ve tüm beyin bölgelerine bel kablosu taşıma için bol zaman emin olmak için dört hafta sonra probed. HiRet hızlı retrograd aksonal taşıma yolu ile taşınır ve böylece daha kısa bir deneysel süre mesafe enjeksiyon alan servikal spinal kord ise daha az gibi ise uygun olabilir.
Direkt enjeksiyon cerrahi spinal kord viral vektör teknolojisi giriş için yararlı bir araçtır. Kullanmak HiRet istikrarlı izni olmaksızın genetik deneyler avantajlıdır, uzun ömürlü transgene ifade ve toksik olmayan nöronlar için. Bu deneyde, hiçbir GFP etiketleme doğrudan enjeksiyon bölgesine sinaptik bağlantıları yapmayın nöronlar görülmüş. Bu da bir göğüs yarası yaralanma25ile hayvanlarda önceki çalışmalarda gerçek oldu. Ayrıca, HiRet GFP omurilik motor nöronlar veya geçici demyelinated siyatik sinir (yayınlanmamış gözlemler) enjekte edildiğinde dorsal kök gangliyon nöronlar etiket bulamadı. Birlikte, bu verileri HiRet kolayca aksonlar girmek değildir ve verimli bir şekilde transduces nöronlar sinapslarda, vektörünü alımını tarafından hedeflenen nüfusunun nöronal bağlantıları daha detaylı ve yüksek sadakat Haritası sağlayan göstermektedir. Bu geçiş44 aksonlar tarafından alınması gereken bilinen retrograd adeno ilişkili virüs gibi (rAAV-retro), diğer retrogradely taşınabilir viral vektörler üzerinde bir avantaj ve HiRet yeniden eşleme çalışmalarda özellikle kullanışlı hale getirir ve yaralı spinal kord yeniden bağlantısında kullanılacak devre. HiRet'ın avantajları da susturmak veya ablasyon çalışmaları25,44,45,46,için47nöron popülasyonları özel hedefleme için izin verebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu eser sinir hastalıkları Ulusal Enstitüsü ve kontur R01 R01NS103481 hibe tarafından finanse edildi ve Shriners Hastanesi Pediatrik araştırma hibe SHC 84051 ve SHC 86000 ve Savunma Bakanlığı (SC140089).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #10 Scalpel Blades | Roboz | RS-9801-10 | For use with the scalpel. |
| 1 mL Syringes | Becton, Dickinson and Company | 309659 | For anesthetic IP injection, potential anesthetic booster shots, and antibiotic injections. |
| 10mL Syringes | Becton, Dickinson and Company | 309604 | For injecting saline into the animal, post-surgery. |
| 4.0 Chromic Catgut Suture | DemeTECH | NN374-16 | To re-bind muscle during closing. |
| 48000 Micropipette Beveler | World Precision Instruments | 32416 | Used to bevel the tips of the pulled glass capillary tubes to form functional glass needles. |
| 5% Iodine Solution | Purdue Products L.P. | L01020-08 | For use in sterilzation of the surgical site. |
| 70% Ethanol | N/A | N/A | For sterilization of newly prepared glass needles, animal models during surgical preparation, and surgeon's hands during surgery, as well as all other minor maintainances of sterility. |
| Anesthetic (Ketamine/Xylazine Solution) | Zoetis | 240048 | For keeping the animal in the correct plane of consciousness during surgery. |
| Antibiotic (Cefazolin) | West-Ward Pharmaceuticals | NPC 0143-9924-90 | To be injected subcutaneously to prevent infection post-surgery. |
| Bead Sterilizer | CellPoint | 5-1450 | To heat sterilize surgical instruments. |
| Bonewax | Fine Science Tools | 19009-00 | To seal up bone in the case of bone bleeding. |
| Cauterizer | Fine Science Tools | 18010-00 | To seal any arteries or veins severed during surgery to prevent excessive blood loss. |
| Digital Scale | Okaus | REV.005 | For weighing the animal during surgical preparation. |
| Flexible Needle Attachment | World Precision Instruments | MF34G-5 | For cleaning glass needles and loading red oil into glass needles. |
| Gelfoam | Pfizer | H68079 | To seal up bone in the case of bone bleeding. |
| Glass Capillary Tubes | World Precision Instruments | 4878 | For pulled glass needles - should be designed for nanoliter injectors. |
| Hair Clippers | Oster | 111038-060-000 | For clearing the surgical site of hair. |
| Hemostats | Roboz | RS-7231 | For general use in surgery. |
| Kimwipes | Kimtech | 34155 | For general use in surgery. |
| Medium Point Curved Forceps | Roboz | RS-5136 | For general use in surgery. |
| Micromanipulator with a Vernier Scale | Kanetec | N/A | For precise targeting during surgery. |
| Microscissors | Roboz | RS-5621 | For cutting glass whisps off of freshly pulled glass capillary tubes. |
| Microscope with Light and Vernier Scale Ocular | Leitz Wetzlar | N/A | Used to visualize and measure beveling of pulled glass capillary tubes into functional glass needles. |
| MicroSyringe Pump Controller | World Precision Instruments | 62403 | To control the rate of injection. |
| Nanoliter 2000 Pump Head Injector | World Precision Instruments | 500150 | To load and inject virus in a controlled fashion. |
| Needle Puller | Narishige | PC-100 | To heat and pull apart glass capillary tubes to form glass needles. |
| Ophthalamic Ointment | Dechra Veterinary Products | RAC 0119 | To protect the animal's eyes during surgery. |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | To assist with loading virus into the nanoinjector. |
| PrecisionGlide Needles (25G x 5/8) | Becton, Dickinson and Company | 305122 | For use with the 1mL and 10 mL syringes to allow injection of the animal model. |
| Rat Tooth Forceps | Roboz | RS-5152 | For griping spinous processes. |
| Red Oil | N/A | N/A | To provide a front for visualization of virus entering tissue during injection. |
| Retractors | Roboz | RS-6510 | To hold open the surgical wound. |
| Rimadyl Tablets | Bio Serv | MP275-050 | For pain management post-surgery. |
| Rongeurs | Roboz | RS-8300 | To remove muscle from the spinal column during surgery. |
| Scalpel Blade Handle | Roboz | RS-9843 | To slice open skin and fat pad of animal model during surgery. |
| Scissors | Roboz | RS-5980 | For general use in surgery. |
| Stainless Steal Wound Clips | CellPoint | 201-1000 | To bind the skin of the surgical wound during closing. |
| Staple Removing Forceps | Kent Scientific | INS750347 | To remove the staples, should they be applied incorrectly. |
| Sterile Cloth | Phenix Research Products | BP-989 | To provide a sterile surface for the operation. |
| Sterile Cotton-Tipped Applicators | Puritan | 806-WC | To soak up blood in the surgical wound while maintaining sterility. |
| Sterile Gauze | Covidien | 2146 | To clean the surgical area and surgical tools while maintaining sterility. |
| Sterile Saline | Baxter Healthcare Corporation | 281324 | For use in blood clearing, and for replacing fluids post-surgery. |
| Surgical Gloves | N/A | N/A | For use by the surgeon to maintain sterile field during surgery. |
| Surgical Heating Pad | N/A | N/A | For maintaining the body temperature of the animal model during surgery. |
| Surgical Microscope | N/A | N/A | For enhanced visualization of the surgical wound. |
| Surgical Stapler | Kent Scientific | INS750546 | To apply the staples. |
| T/Pump Heat Therapy Water Pump | Gaymar | TP500C | To pump warm water into the water convection warming pad. |
| Water Convection Warming Pad | Baxter Healthcare Corporation | L1K018 | For use in the post-operational recovery area to maintain the body temperature of the unconscious animal. |
| Weighted Hooks | N/A | N/A | To hold open the surgical wound. |
References
- Wang, X., et al. Deconstruction of corticospinal circuits for goal-directed motor skills. Cell. 171 (2), 440-455 (2017).
- Kinoshita, M., et al. Genetic dissection of the circuit for hand dexterity in primates. Nature. 487 (7406), 235-238 (2012).
- Brichta, A. M., Grant, G. Cytoarchitectural organization of the spinal cord. The rat nervous system. Vol. 2, hindbrain and spinal cord. , Academic Press. (1985).
- Liang, H., Paxinos, G., Watson, C. Projections from the brain to the spinal cord in the mouse. Brain Structure & Function. 215 (3-4), 159-186 (2011).
- Rexed, B. The cytoarchitectonic organization of the spinal cord in the cat. The Journal of Comparative Neurology. 96 (3), 414-495 (1952).
- Schmued, L. C., Fallon, J. H. Fluoro-gold: A new fluorescent retrograde axonal tracer with numerous unique properties. Brain Research. 377 (1), 147-154 (1986).
- Veenman, C. L., Reiner, A., Honig, M. G. Biotinylated dextran amine as an anterograde tracer for single- and double-labeling studies. Journal of Neuroscience Methods. 41 (3), 239-254 (1992).
- Watson, C., Paxinos, G., Kayalioglu, G., Heise, C. Atlas of the rat spinal cord. The spinal cord. , 238-306 (2009).
- Brandt, H. M., Apkarian, A. V. Biotin-dextran: A sensitive anterograde tracer for neuroanatomic studies in rat and monkey. Journal of Neuroscience Methods. 45 (1-2), 35-40 (1992).
- Geed, S., van Kan, P. L. E. Grasp-based functional coupling between reach- and grasp-related components of forelimb muscle activity. Journal of Motor Behavior. 49 (3), 312-328 (2017).
- Reiner, A., Veenman, C. L., Medina, L., Jiao, Y., Del Mar, N., Honig, M. G. Pathway tracing using biotinylated dextran amines. Journal of Neuroscience Methods. 103 (1), 23-37 (2000).
- Steward, O., Zheng, B., Banos, K., Yee, K. M., et al. Response to: Kim et al., "axon regeneration in young adult mice lacking nogo-A/B." neuron 38, 187-199. Neuron. 54 (2), 191-195 (2007).
- Brown, B. D., et al. A microRNA-regulated lentiviral vector mediates stable correction of hemophilia B mice. Blood. 110 (13), 4144-4152 (2007).
- Lo Bianco, C., et al. Lentiviral vector delivery of parkin prevents dopaminergic degeneration in an alpha-synuclein rat model of parkinson's disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (50), 17510-17515 (2004).
- Malik, P., Arumugam, P. I., Yee, J. K., Puthenveetil, G. Successful correction of the human cooley's anemia beta-thalassemia major phenotype using a lentiviral vector flanked by the chicken hypersensitive site 4 chromatin insulator. Annals of the New York Academy of Sciences. 1054, 238-249 (2005).
- Pawliuk, R., et al. Correction of sickle cell disease in transgenic mouse models by gene therapy. Science. 294 (5550), 2368-2371 (2001).
- Wang, G., et al. Feline immunodeficiency virus vectors persistently transduce nondividing airway epithelia and correct the cystic fibrosis defect. The Journal of Clinical Investigation. 104 (11), R55-R62 (1999).
- Liang, H., Paxinos, G., Watson, C. The red nucleus and the rubrospinal projection in the mouse. Brain Structure & Function. 217 (2), 221-232 (2012).
- Abdellatif, A. A., et al. delivery to the spinal cord: comparison between lentiviral, adenoviral, and retroviral vector delivery systems. Journal of Neuroscience Research. 84 (3), 553-567 (2010).
- DePolo, N. J., et al. VSV-G pseudotyped lentiviral vector particles produced in human cells are inactivated by human serum. Molecular Therapy. 2 (3), 218-222 (2000).
- Higashikawa, F., Chang, L. Kinetic analyses of stability of simple and complex retroviral vectors. Virology. 280 (1), 124-131 (2001).
- Hirano, M., Kato, S., Kobayashi, K., Okada, T., Yaginuma, H., Kobayashi, K. Highly efficient retrograde gene transfer into motor neurons by a lentiviral vector pseudotyped with fusion glycoprotein. PLoS One. 8 (9), e75896 (2013).
- Kato, S., et al. A lentiviral strategy for highly efficient retrograde gene transfer by pseudotyping with fusion envelope glycoprotein. Human Gene Therapy. 22 (2), 197-206 (2011).
- Kato, S., et al. Selective neural pathway targeting reveals key roles of thalamostriatal projection in the control of visual discrimination. The Journal of Neuroscience. 31 (47), 17169-17179 (2011).
- Sheikh, I. S., Keefe, K. M., et al. Retrogradely transportable lentivirus tracers for mapping spinal cord locomotor circuits. Frontiers in Neural Circuits. 12, 60 (2018).
- Harrison, M., et al. Vertebral landmarks for the identification of spinal cord segments in the mouse. NeuroImage. 68, 22-29 (2013).
- Tang, X. Q., Heron, P., Mashburn, C., Smith, G. M. Targeting sensory axon regeneration in adult spinal cord. The Journal of Neuroscience. 27 (22), 6068-6078 (2007).
- Cameron, A. A., Smith, G. M., Randall, D. C., Brown, D. R., Rabchevsky, A. G. Genetic manipulation of intraspinal plasticity after spinal cord injury alters the severity of autonomic dysreflexia. The Journal of Neuroscience. 26 (11), 2923-2932 (2006).
- Liu, Y., Keefe, K., Tang, X., Lin, S., Smith, G. M. Use of self-complementary adeno-associated virus serotype 2 as a tracer for labeling axons: Implications for axon regeneration. PLoS One. 9 (2), e87447 (2014).
- Chamberlin, N. L., Du, B., de Lacalle, S., Saper, C. B. Recombinant adeno-associated virus vector: Use for transgene expression and anterograde tract tracing in the CNS. Brain Research. 793 (1-2), 169-175 (1998).
- Filli, L., et al. Bridging the gap: A reticulo-propriospinal detour bypassing an incomplete spinal cord injury. The Journal of Neuroscience. 34 (40), 13399-13410 (2014).
- Williams, R. R., Pearse, D. D., Tresco, P. A., Bunge, M. B. The assessment of adeno-associated vectors as potential intrinsic treatments for brainstem axon regeneration. The Journal of Gene Medicine. 14 (1), 20-34 (2012).
- Smith, G. M., Onifer, S. M. Construction of pathways to promote axon growth within the adult central nervous system. Brain Research Bulletin. 84 (4-5), 300-305 (2011).
- Morcuende, S., Delgado-Garcia, J. M., Ugolini, G. Neuronal premotor networks involved in eyelid responses: Retrograde transneuronal tracing with rabies virus from the orbicularis oculi muscle in the rat. The Journal of Neuroscience. 22 (20), 8808-8818 (2002).
- Ugolini, G. Specificity of rabies virus as a transneuronal tracer of motor networks: Transfer from hypoglossal motoneurons to connected second-order and higher order central nervous system cell groups. The Journal of Comparative Neurology. 356 (3), 457-480 (1995).
- Gelderd, J. B., Chopin, S. F. The vertebral level of origin of spinal nerves in the rat. The Anatomical Record. 188 (1), 45-47 (1977).
- Inquimbert, P., Moll, M., Kohno, T., Scholz, J. Stereotaxic injection of a viral vector for conditional gene manipulation in the mouse spinal cord. Journal of Visualized Experiments. 73, e50313 (2013).
- Carbajal, K. S., Weinger, J. G., Whitman, L. M., Schaumburg, C. S., Lane, T. E. Surgical transplantation of mouse neural stem cells into the spinal cords of mice infected with neurotropic mouse hepatitis virus. Journal of Visualized Experiments. 53, e2834 (2011).
- Snyder, B. R., et al. Comparison of adeno-associated viral vector serotypes for spinal cord and motor neuron gene delivery. Human Gene Therapy. 22 (9), 1129-1135 (2011).
- Cronin, J., Zhang, X. Y., Reiser, J. Altering the tropism of lentiviral vectors through pseudotyping. Current Gene Therapy. 5 (4), 387-398 (2005).
- Reed, W. R., Shum-Siu, A., Onifer, S. M., Magnuson, D. S. Inter-enlargement pathways in the ventrolateral funiculus of the adult rat spinal cord. Neuroscience. 142 (4), 1195-1207 (2006).
- Mao, X., Schwend, T., Conrad, G. W. Expression and localization of neural cell adhesion molecule and polysialic acid during chick corneal development. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (3), 1234-1243 (2012).
- Charles, P., et al. Negative regulation of central nervous system myelination by polysialylated-neural cell adhesion molecule. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (13), 7585-7590 (2000).
- Tervo, D. G., et al. A designer AAV variant permits efficient retrograde access to projection neurons. Neuron. 92 (2), 372-382 (2016).
- Tohyama, T., et al. Contribution of propriospinal neurons to recovery of hand dexterity after corticospinal tract lesions in monkeys. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (3), 604-609 (2017).
- Liu, Y., et al. A sensitized IGF1 treatment restores corticospinal axon-dependent functions. Neuron. 95 (4), 817-833 (2017).
- Kinoshita, M., et al. Genetic dissection of the circuit for hand dexterity in primates. Nature. 487 (7406), 235-238 (2012).
