Summary
פרוטוקול זה מדגים הזרקה של וקטור ויראלי יביל retrogradely לתוך רקמות חוט השדרה חולדה. וקטור שצולמו הסינפסה, מועברים לגוף התא של נוירונים היעד. מודל זה מתאים רטרוגרדית העקיבה של מסלולים בעמוד השדרה חשוב או תאים מיקוד ליישומים טיפול גנטי.
Abstract
היכרות עם חלבונים עניין לתוך תאים במערכת העצבים הוא מאתגר עקב המונעים ביולוגית מולדת להגביל את הגישה רוב המולקולות. הזרקה ישירות לתוך חוט השדרה רקמות עוקף מחסומים אלה, והיא מספקת גישה אל גוף התא או synapses איפה ניתן לשלב מולקולות. שילוב טכנולוגיה וקטור ויראלי בשיטה זו מאפשר החדרת גנים היעד לתוך רקמות עצבים לצורך ריפוי גנטי או מערכת עקיבה. כאן וירוס מהונדס להעברה רטרוגרדית יעילים ביותר (HiRet) הוא הציג את הסינפסות של propriospinal interneurons (מערכת העצבים ההיקפית) כדי לעודד תחבורה ספציפית את הנוירונים בחוט השדרה, גזע המוח גרעינים. פילוח מערכת העצבים ההיקפית מנצל הקשרים רבים שהמוענק להם מסלולים מוטוריים נרחבים של rubrospinal ו- reticulospinal, כמו הקישוריות שלהם אחד עם השני לאורך חוט השדרה מקטעים. נציג מעקב באמצעות וקטור HiRet בפרטים צורונים פעילים חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) מראה דיוק גבוה של תא גופות, אקסונים ו דנדריטים ובשבילים מערכת העצבים ההיקפית בית החזה, reticulospinal נוירונים ב רשתית pontine. HiRet משלבת גם לתוך משעולים גזע המוח, מערכת העצבים ההיקפית, אבל מראה והשתלבות נוירונים בדרכי corticospinal תלוי גיל. לסיכום, הזרקת חוט השדרה באמצעות וקטורים ויראלי הוא שיטה מתאימה על ההקדמה של חלבונים עניין לתוך הנוירונים של יישוב שטחים.
Introduction
וקטורים ויראלי הם כלים ביולוגי חשוב יכול להציג חומר גנטי לתוך התאים על מנת לפצות על גנים פגומים, upregulate צמיחה חשוב חלבונים או מייצרים חלבונים סמן המדגישות את המבנה ואת קשרים סינפטיים של המטרות שלהם. מאמר זה מתמקד הזרקה ישירה של וקטור lentiviral retrogradely הניתנים להעברה יעילה במיוחד לתוך חוט השדרה חולדה כדי לסמן מסלולים מוטוריים הגדולות עם עקיבה פלורסנט. שיטה זו גם מאוד מתאים ללימודי רגנרציה ומחזור לצמיחה מחודשת עצב להציג חלבונים עניין לתוך אוכלוסיות מגוונות של נוירונים, נעשה שימוש כדי להשתיק את הנוירונים עבור מיפוי פונקציונלי מחקרים1,2.
חלק מהפרטים האנטומי של מסלולים מוטוריים בעמוד השדרה היו מבואר דרך הזרקה ישירה מחקרים עם המשדרים קלאסית כגון BDA ופטור-זהב3,4,5,6,7 , 8. המשדרים הללו נחשבים תקן הזהב, אבל אולי יש חסרונות מסוימים כגון ספיגת מאת אקסונים פגומים או אקסונים בקטע של החומר הלבן שמסביב זריקה באתר9,10,11 . זה יכול להוביל פירושים שגויים של מסלול קישוריות, יכול להיות חיסרון במחקרים התחדשות איפה לצבוע הקליטה על-ידי אקסונים פגומים או קטוע אפשר לטעות, ולשם רגנרציה סיבי במהלך ניתוח מאוחר יותר12.
וקטורים lentiviral פופולריים במחקרים טיפול גנטי, כפי שהם מספקים יציב, לטווח ארוך ביטוי אוכלוסיות עצביים13,14,15,16,17,18 ,19. עם זאת, באופן מסורתי הארוזה וקטורים lentiviral יכול מוגבלת רטרוגרדית תחבורה, עשוי לעורר את התגובה של המערכת החיסונית כאשר נעשה שימוש ב- vivo4,20,21. וקטור תחבורה יעיל רטרוגרדית כינה HiRet הופק על ידי קאטו et al. על-ידי שינוי של מעטפת נגיפית עם גליקופרוטאין וירוס הכלבת ליצירת וקטור היברידית המשפרת תחבורה רטרוגרדית22,23.
עקיבה רטרוגרדית מציג וקטור לתוך מרחב סינפטית של נוירון המטרה, ולאפשר לו להיות נלקח על ידי האקסון של תא זה, מועבר לגוף התא. הובלה מוצלחת של HiRet הוכח הסינפסות עצביים לתוך מוחותיהם של קופים ועכברים23,24 ומן לשריר לתוך מוטורי לגלוקוז22. פרוטוקול זה מדגים הזרקה לתוך חוט השדרה המותני, המכוון את מסופי סינפטית של propriospinal interneurons, גזע המוח נוירונים. מערכת העצבים ההיקפית לקבל חיבורים רבים מסלולים שונים בעמוד השדרה, ובכך יכול להיות מנוצל כדי להתמקד אוכלוסיה מגוונת של הנוירונים בחוט השדרה, גזע המוח. נוירונים שכותרתו במחקר זה מייצגים המעגלים innervating מוטור נוירון בריכות הקשורים בתפקוד המוטורי hindlimb. תיוג חזקים נתפסת חוט השדרה, גזע המוח, כולל פרטים דיוק גבוה של דנדריטים ובשבילים, מסופי האקסון. גם השתמשנו בשיטה זו במחקרים קודמים בתוך חוט השדרה הצווארי לתייג propriospinal, גזע המוח reticulospinal מסלולים25.
פרוטוקול זה מדגים הזרקה של וקטור ויראלי לתוך חוט השדרה המותני של חולדה. כפי שניתן לראות סרט 1, החתך מכוון על ידי זיהוי החוליה L1 הממוקמת הצלע האחרונה. זה משמש כנקודת ציון סימטרית עבור חתך 3-4 ס מ זה חושף את מערכת השרירים מעל חוט השדרה L1-L4. Laminectomies ההיבטים הגבי של החוליות T11-T13 מבוצעים ואת מחט זכוכית משופע מכוונת 0.8 מ מ לרוחב קו האמצע, הוריד 1.5 מ מ עמוק לתוך החומר האפור להחדיר וירוס.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים הבאים כירורגית וטיפול בבעלי חיים אושרו על ידי טיפול בעלי חיים ועל שימוש הוועדה של אוניברסיטת טמפל.
1. בפגישת ההכנות
- הכינו זכוכית משך מחטים להזרקה נגיפית מספר ימים לפני הניתוח באמצעות 3.5 nanoliter זכוכית נימי פיפטות מיועד nanoliter מרססים. משוך כל פיפטה פולר המחט שני שלבים לפי הוראות היצרן כדי ליצור שתי תבניות המחט.
- לחדד את קצה המחט התבניות חותכים כ 1-2 מ מ זכוכית עודף עם microscissors. מדד גודל הצמצם משוער תחת מיקרוסקופ עם מגלשת כיול מיקרוסקופ כדי לבודד מחטים עם 30-40 µm פתחים.
- עם המחט ב 30 מעלות, להשתמש beveller micropipette כדי ליצור קצה עם צוהר מיקרומטר 30-40, בזווית של 45° משופע. ודא רוחב מיפתח צמצם עם קנה המידה ורניה על השקופית כיול. עוברים המחט זכוכית באמצעות מזרק עם קובץ מצורף מחט גמישה כדי לשטוף את הלכלוך ולסמן את המחט במרווחי זמן קבועים עם סמן שחור מים ואתנול.
- מקם את המחטים בצלחת פטרי מכוסה בעבר לנקות עם 70% אתנול ולחטא למשך 30 דקות בשכונה אבטחה תחת אור UV.
- להכין HiRet lentivirus על-ידי הסרת אמצעי אחסון מתאימים מהמקפיא מייד לפני ההליך.
הערה: אמצעי אחסון מתאימים כולל את הסכום הדרוש עבור הזרקה (µL 1 לכל זריקה x מספר זריקות) וגם כמות קטנה של יותר נפח להביא בחשבון pipetting וטעינה הפסדים. להעביר ולאחסן את הוירוס על הקרח כאשר אינו בשימוש. - הכינו את מזרק על ידי חיבורו אל micropump והצבתו לתוך micromanipulator עם קנה מידה ורניה.
- כדי להכין את המחט זכוכית, בזהירות לטעון צבע בצבע כגון שמן אדום עם מזרק לבוש עם מחט גמישה. ודא כי אין בועות יישארו במחט. שימוש בטכניקה אספטית טיפול המחט ולהימנע מלגעת הטיפ.
- את המחט זכוכית לתוך מזרק, המבטיח כי המחט מוכנס כהלכה לתוך הדיסקיות, הכיפה מזרק היא מברזל, מחט מזרק פלדה מורחב כ ¾ אורך המחט זכוכית. וירוס ניתן לטעון לתוך המחט בשלב מאוחר יותר.
2. הכנת האתר כירורגי והרדמה
- שוקלים את החיה בקנה מידה דיגיטלי. להקליט את המשקל שטרם-נותחו כדי לקבוע את עוצמת הקול של הרדמה הנדרש, כדי לאפשר פיקוח על המשקל לאחר הניתוח. חולדות ספראג-Dawley נקבות כ 200 – 250 גרם שהיו בשימוש בפרוטוקול זה.
- עזים ומתנגד העכברוש באמצעות אינהלציה איזופלוריין או פתרון מוזרקים קטמין/חריגות השירותים הווטרינריים (k / x). . קטמין מוזרק intraperitoneally 67 מ"ג/ק"ג, חריגות השירותים הווטרינריים במינון 6.7 מ"ג/ק"ג.
- לאשר מטוס הרדמה המתאים על-ידי התכווצות כף הרגל בחוזקה. אם מתרחשת נסיגה רפלקסיבי, המתן מספר דקות נוספות לפני שתמשיך.
הערה: להתבונן גם שפם, העיניים וקצב נשימה סימנים של התודעה. אם נכון הן בפקעת, העין מהבהבת כאשר נגע בעדינות, או הנשימה היא מהירה ורדודה, המתן עד המטוס הרדמה הוא עמוק יותר כדי להמשיך הפרוטוקול. גם לפקח על הסימנים לאורך כל הניתוח laminectomy, הזרקת. אם החיה מציג מטוס הרדמה שטחית, לנהל זריקת תגבור של קטמין בלבד שווה את ½ את k המקורי / x המינון. - לגלח את החולדה לאורך הקו האמצעי הגבי מן המותניים זווית נחות השכם. משוך את העור של החיה מתוח על גילוח קל יותר ומדויק יותר.
- משחה אופטלמולוגיות חלות על שתי העיניים.
- החל חיטוי לאזור מגולח כדי לעקר את האתר. עבור בסבך שיחים הראשון, משרים גזה סטרילית עם 5% יודיפלור תמיסה, נגבי כל שיער ופסולת. ללכת עם לסחוב חד כיווני עם גזה סטרילית טבולים 70% אתנול, כך אין אזור שתתבצע פניה פעמיים. השתמש את אותה טכניקה עם מתחלפים יוד, ספוג אתנול גזה עוד פעמיים.
3. הכנה השדה ואת כלי כירורגי
- הכנת סט של כלי ניתוח בלוק הכוללים אזמל, rongeurs, עכברוש השן מלקחיים, מעיין מספריים, ועוצרי דימום, נקודת בינוני מעוקל מלקחיים, רטרקטורים או ווים משוקלל על ידי הסרת העטיפה הגלישה סטרילי כדי ליצור שדה סטרילי.
- פתח את חבילת כפפות כירורגי סטרילי ולמקם הגלישה כפפה סטרילית על השולחן. אשתמש במקום שדה סטרילי נוסף לכלים משומשים כדי למנוע זיהום של הגלישה סטרילי.
- ירידה להב סכין #10 בשטח סטרילי. אבטח את הפגיון. כדי אחיזה עם ועוצרי דימום. מיקום מלח סטרילית, 4.0 כרום תפר וחומרים כדי לשלוט הדימום כגון cauterizer, גזה סטרילית, סטרילי applicators שקצהו כותנה (בלידים שריר), או השאיבה או bonewax (בלידים העצם) במקום נגיש.
- להוציא את בעל החיים ולהגדיר אותו על בד סטרילי. במקום גזה מתחת לשלפוחית השתן לאיסוף השתן. להעלות אזור היעד עם מגבת מגולגלת מתחת בבטן. אם הוא זמין, מקם כרית החימום כירורגי מתחת הבד סטרילי, במיוחד עבור הליכים ארוכים יותר.
הערה: עקרות חשוב במהלך ניתוח הישרדות. החזק בקבוק ספריי אתנול 70% על היד כדי לשמור על עקרות של ידיים בכפפות, מעקר חרוז שימוש אם מכשיר עקרות נמצא בסיכון, או בין ניתוחים בודדים.
4. חשיפת בעמודה השדרה וזיהוי באתר laminectomy
- לזהות את האזור שבו חתך בעור ייעשו על-ידי הקשה על האצבעות בעדינות על הצלע האחרונה כדי לאתר החוליה L1. שימוש זה כנקודת ציון, גורם חתך בעור 3-4 ס מ עם אזמל כירורגי #10 סיום רק נחות L1 לחשוף את השריר. להחזיק העור המתוח במריחה עדינה ולחץ בחוזקה עם הלהב האזמל כדי להבטיח חתך נקי.
- לחתוך ולהפיץ שמן שטחית עם מלקחיים ומספריים במידת הצורך. (בהתאם למטרה חוליה, שם או לא להיות כרית השומן גדולה משיטחי להקפיד השריר).
- מרגיש עבור התהליכים קוצניים על הדירה של הלהב באזמל או האצבע. לעיתים קרובות אזור קו האמצע יסומנו על-ידי "V" של fascia לבן משני צדדיו. לעשות חתך קטן rostral כדי לאפשר חדר תתפוס בצורה מאובטחת תהליך העליון עם עכברוש השן מלקחיים, ולאחר מכן לבצע קיצוצים ארוכה, עמוקה 2 קרוב התהליכים ככל האפשר. בנקודה העמוקה ביותר של החתך, ניתן לחוש המשטח הגבי של החוליות עם הלהב ומהדקים.
- החזק את השרירים לרוחב הצידה עם רטרקטורים או ווים משוקלל כדי לשפר את הראות. שרירים ברורה סביב התהליכים עם האזמל, מעיין מספריים או rongeurs כדי לקבוע את צורת הראש שלהם.
הערה: זכור כי חוט השדרה לא להאריך את אורך מלא בעמודה השדרה, בתור חוט השדרה רקמות עצירות גוברת מוקדם בהתפתחות מאשר עצם. משמעות הדבר היא כי רמת בעמוד השדרה היעד עשוי להיות מתחת חוליה אחרת בשם. - אתר את T11 ואת התהליכים טי12 ו- T13 הסמוך.
הערה: סיוע המיקוד הנכון רמות בחוליות ניתן למצוא אטלס חוט השדרה של עכברוש, מחקרים קודמים בהתוויית ציוני דרך בהעכבר, אשר דומה מאוד במבנה בחוליות6,33. השאר תהליך קוצניים rostral כגון T9 ללא הפרעה לתת ציון דרך קו האמצע.
5. ביצוע laminectomy
- ברגע אזור המטרה זוהתה בצורה נכונה, לבצע laminectomies של היבטים הגבי של T11-T13. מורחים בעדינות החוליות כדי לחשוף את הרצועות בין-חולייתי, אשר הם אתרים טובים כדי להוסיף rongeurs עבור הנשיכה הראשונית של העצם. החזק את rongeurs בעמדה עצומות למחצה כדי להגדיל את שליטה טובה.
- להסיר את התהליכים קוצניים ואת ההיבט הגבי של החוליות על ידי לוקח ביסים קטנים עם rongeurs. יש להיזהר לא לגרום נזק לחוט השדרה או להפריע השכבה הקשה של המוח. הרם מעט עם המלקחיים השן עכברוש לעזור למשוך חוט השדרה מן החוליות, להקטין את הנטייה לפגוע בחוט השדרה רקמות.
- לנקות העצם משם מן האמצע כך ניתן לראות את כלי הדם קו האמצע. להשאיר חלון בבירור מציגה את הרקמה חוט השדרה והוא חינם של פסולת.
- לגעת בעדינות את חוט השדרה עם מלקחיים. בעלי חיים שעלולים לקפוץ ניגודיים גם אם המטוס הרדמה עמוקה. להחיל מספר טיפות של חומר מאלחש כגון לידוקאין ישירות על חוט השדרה כדי למנוע קפיצות במהלך ההליך הזרקה.
- לאבטח בעל החיים בעל עמוד השדרה על ידי והידק מלקחיים ייצוב תהליכים קוצניים rostral, סימטרית אל החלון laminectomy. הרימו את הבטן של החיה באמצעות בעל עמוד השדרה כדי לנטרל את השפעת תנועות נשימה. זה להגביר את היציבות המחט ולהבטיח המתאים עומק ההזרקה.
6. טעינת וירוס והמיקום של מזרק
- לטעון וירוס לתוך מזרק pipetting כ 5 µL על חתיכת מצלמות-מיקרוסקופים, מיקום המחט כך הטיפ הוא בתוך הטיפה.
- השתמש את micropump כדי למשוך µL עד 4 של וירוס בקצב של 20 – 100 nL/s.
- להגדיר את בקר להזריק ולשחרר כמות קטנה של הווירוס המחט כדי להבטיח שקצה המחט אינה חסומה. . תנגב את וירוס עודף עם מגבון מעבדה.
הערה: מזרק המילטון עם מחט פלדה עשוי לשמש כחלופה פיפטות זכוכית משך. - מקם את micromanipulator כך שגלוי בסולם ורניה ומקם את המחט בקו האמצע של חוט השדרה.
הערה: האמצע יכול לפעמים להיות ממוקמת על ידי כלי דם גדולים פועל על המשטח הקדמי של חוט השדרה. עם זאת, יכולים להשתנות בחולדות בודדים, קו האמצע מיקוד צריך להיות מאושרות by comparison with תהליכים קוצניים ללא פגע. - לכוון את המחט רוחבית על ידי 0.8 מ מ באמצעות סולם ורניה על micromanipulator.
- להנמיך את המחט בחוט השדרה עד הוא הסטה פנימה, אך לא ניקב, השכבה הקשה של המוח. באמצעות תנועה מהירה ומפותלים, לנקב השכבה הקשה של המוח עם המחט עד הוא שוקע לעומק של 1.5 מ מ.
7. הזרקת את וירוס לתוך חוט השדרה
- ברגע שהמחט נמצאת במקום, התוכנית מזרק להזרקת בקצב של 400 nL לדקה אשר את הוירוס נכנס חוט השדרה על ידי התבוננות התקדמות החזית לצבוע. צריך להיות. אין נזילה ברור או בולטות של חוט השדרה רקמה. אם נוצרת דליפה, ניתן להקל זה לפעמים על-ידי הפחתת מהירות הזרקת ל nL 200/min.
- מרגע סיום ההזרקה, תאפשר את המחט בתוך חוט השדרה למשך 2-5 דקות (בהתאם נפח מוזרק) כדי להקל על דיפוזיה של הנגיף.
- לאט לאט למשוך את המחט ולהעביר אל האתר הזרקת הבא. מזריקים µL 1 של וירוס לתוך כל אחד 6 אתרים המרווחות באופן שווה בערך 1 מ מ אחד מהשני לאורכו של הרקמה בעמוד השדרה L1-L4. באותה המחט עשוי לשמש עבור כל זריקה כל עוד הוא ממשיך לתפקד כראוי.
8. פצע הסגר, שלאחר טיפול
- הסר את החיה ממחזיק בעמוד השדרה, להוציא רטרקטורים או ווים נעשה שימוש כדי להפיץ את השריר לרוחב. ודא הפצע ברורים של כל פסולת לפני הסגירה.
- תפר את השריר באמצעות בתפר לאללה כרום 4.0. לחתוך חוטי תפירה קרוב על מנת להפחית את הסבירות של גירוי בעור הפנים.
- להדק את העור סגור באמצעות קליפים 9 מ מ פצע. כדי לאפשר לריפוי אופטימלי, בשורה את הקצוות של העור לפני הידוק.
- במקום החיה על הסעת חום המים התחממות משטח וצג עד כשקשה לי לישון.
- להזריק 5 – 10 מ ל תמיסת סטרילית subcutaneously לחדש נוזלים, אנטיביוטיקה כגון צפאזולין כדי למנוע זיהום. כאשר החיה אמבולטורי, למקם אותו לכלוב הביתה ומספקים הראשונית משככי כאבים. לנטר את החולדות לסימן של כאב ומצוקה ולנהוג לפי נוהל שלך IACUC אושרה לטיפול של כאב.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הזרקת מוצלחת ותעבורה של וקטור ויראלי צריכה לגרום התמרה חושית של אוכלוסיה חזקה של נוירונים חד-צדדית בחוט השדרה, גרעינים מסויימים גזע המוח. איור 1 מדגים תיוג סטריאוטיפית של נוירונים, אקסונים בחוט השדרה החזי ואת ב רשתית pontine של גזע המוח-הזרקת שלאחר ארבעה שבועות. ביטוי משמעותי GFP נתפסת בנוירונים בתוך החומר האפור של חוט השדרה החזי בצד חולשת על הזריקה (איור 1A, באזור ממוסגר). כמה נוירונים גם הן נצפו בצד contralateral, במיוחד ליד האמצע. בתוך החומר הלבן, ביטוי GFP הוא ציין אקסונים בחוט חולשת (איור 1A, חצים, ראשי חץ), במיוחד באזורים אופייני propriospinal אקסונים (חץ). איור 1A' מראה של הגדלה גבוהה יותר של האזור מסגרת a, המפגינים ביטוי אופייני דנדריטים וגופי תאים עצביים. GFP ביטוי נוירונים יכולים גם להיות נצפתה גרעינים גזע המוח כגון רשתית pontine (איור 1B, הגדלה גבוהה יותר של האזור מסגרת איור 1B').
איור 1: התמרה חושית של הנוירונים בחוט השדרה, גזע המוח. (א) GFP ביטוי נוירונים (באזור ממוסגר), האקסונים של נוירונים propriospinal (חץ), אקסונים של אחרים נרחבים (חיצים) בחוט השדרה החזי. (A') הגדלה גבוהה יותר הביטוי העצבית באזור מסגרת של א (ב') pontine רשתית בגזע המוח לבטא GFP שכותרתו נוירונים ו דנדריטים. (ב') הגדלה גבוהה יותר של האזור מסגרת ב'. גודל ברים: (A) = 500 μm; (B) = 1 מ מ; (A'), (ב') = 50 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
סרט 1: מיקוד ההזרקה לתוך חוט השדרה המותני של העכברוש. סיכומים וידאו זה את היסודות של הפגיעה המכוונת, הזרקה של וקטור ויראלי לתוך חוט השדרה חולדה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הנדסה גנטית של נוירונים במוח ובחוט השדרה שימש גולת חושית, מוטוריים, מסלולים אוטונומי באמצעות מעקב פלורסנט, וכן לבחון את פוטנציאל לצמיחה מחודשת של ספינלי עצביים לאחר פציעה27,28, 29 , 30 , 31 , 32 , 33. ישיר הזרקה של וקטור ויראלי יביל retrogradely לתוך חוט השדרה ניתן לייעד אוכלוסיות עצביים באמצעות קשרים סינפטיים שלהם, הופך את שיטה זו בחירה מצוינת עבור מיפוי מסלולים במערכת העצבים המרכזית. וקטור HiRet במיוחד מציג תפיסה סלקטיבית סינפסה עצביים22,24,25, ו העקיבה הקודם עם וקטורים מובנית באופן דומה הראה אין התפשטות אקסונים פצוע או תאים שאינם קשורים 34 , 35, אשר עולה בקנה אחד עם התוצאות הכוללות את HiRet לבנות22,23,25. לפיכך, הזרקה ישירה של HiRet בתור מכשיר מעקב רטרוגרדית היא שיטה אידיאלית לחקר מעגלים interneuronal עוברים פלסטיות לאחר פציעה.
ישנם שני מושגים קריטי מעורב הזרקה מוצלחת של וקטור ויראלי לתוך חוט השדרה. הראשון הוא הקמת המטרה הנכונה עם המחט זכוכית, השני זה להבטיח זרימה נאותה של הווירוס מהקובץ המחט לתוך הרקמה. כפי פרוטוקול זה כרוך רטרוגרדית עקיבה, פילוח האזור הנכון מחייבת הבנה מעמיקה קשרים סינפטיים באוכלוסייה עצביים של ריבית. הנוירונים Propriospinal ו- reticulospinal מתחבר חוט השדרה המותני אתם על הכוונת פה נוירונים אלה פזורים ברחבי גזע המוח מקטעי חוט השדרה הצווארי, בית החזה, עם הרוב של מערכת העצבים ההיקפית מקומית שנבזזו V-VII בתוך החומר האפור. כדי להבטיח התמרה חושית של אוכלוסיה נאותה של נוירונים, 6 זריקות ויראלי נעשים על פני שטח הנמשכים ארבעה מקטעים בעמוד השדרה. הקטעים L1-L4 נבחרו בשל נוכחותם של הגנרטורים תבנית מרכזי, שלהם קשרים בתחומים אחרים של חוט השדרה. ברגע הנכון segment(s) עמוד השדרה של סחוס ידועים, המיקום הפיזי של מטרות אלה באמצעות ציוני דרך אנטומיים היא קריטית. אטלסים מציג פרטים על מבנה אנטומי וצורה בחוליות יכול להיות מועיל לאשר ציוני דרך מיקוד8,36. יצוין כי הרוב המכריע של פרוטוקול זה נשאר זהה בין אם זריקה אחת או שש נעשים; ההבדל הוא רק ב מספר מקטעי בעמוד השדרה נחשף דרך laminectomy, ואת העובדה כי תצטרך לטעון מחדש את המחט זכוכית עם וירוס נוסף אם הזרקת µL יותר מ-4. ניתן להתאים בקלות אחר העכבר גם הפרוטוקול. בשל גודלו קטן יותר, הנפח של הוירוס מוזרק החוט צריך להיות מותאם כלפי מטה, להתאים המידות צריך להכות את שנבזזו בעמוד השדרה הנכון. כמה קטעי וידאו של ניתוחים דומה על העכבר בעבר כבר פורסם37,38.
השיקול הבא היא נאותה דיפוזיה לתוך הרקמה. הכנה זהירה של המחט הוא הכרחי כדי להבטיח כי הפתח מספיקה עבור ההשעיה ויראלי לזרום כלפי חוץ, כי פסולת אינו חוסם את הטיפ, ויזואליזציה של הזרם מן המחט לתוך חוט השדרה באמצעות כיסוי של צבע בצבע זה מועיל לאשר כי ההשעיה החודר את הרקמה. ברגע ההשעיה הופצה לתוך הרקמה, שמירה על המחט בתוך חוט השדרה 2-5 דקות יבטיח דיפוזיה נאותה.
התמרה חושית מוצלחת של אוכלוסיה היעד יכול גם תלוי מאפיינים מהותיים של הוירוס מוזרק כגון יעילות כייל נוגדנים, serotype, זיהום. אנו מוצאים כייל עותק גנומית לפחות 1010 GC/mL עבור HiRet lentivirus לעבוד טוב לניסויים ויוו. Titers גבוה יותר או אמצעי אחסון הזרקה עלול להציג אינדקס תיוג גבוה יותר, אך טיפול צריך להילקח מאז וירוס יכול לפזר מהאזור המיועד או לתוך חוט השדרה contralateral. השיקול צריך להינתן גם הסוג של וקטור מתאים תיוג תאים עניין בהתבסס על tropism שלהם. אשר נגרמו מהזנים אליהם נגיפיים מסוימים ייתכן זיהום יותר וקצבי התמרה חושית באוכלוסיות שונות של נוירונים39. וקטורים lentiviral המסורתי ידועים כדי להדביק את מגוון רחב של סוגי תאים בגלל החלבון המעטפה VSV-G, אולם שינויים וקטור זה עשוי להשפיע על tropism40. הבונה HiRet משנה את המעטפה על-ידי pseudotyping עם גליקופרוטאין פיוז'ן (ובקקופוניה-B) של וירוס הכלבת, אשר מאפשר תעבורה רטרוגרדית יעיל22,23 והוא יעיל ב- transducing propriospinal, reticulospinal ספינלי, במספרים עצביים להשוות דרכי מעקב באמצעות שיטות כמו4,fluorogold, microruby41 (לפירוט הבנייה של הכס וקטור HiRet הירנו et al.) 22. עם זאת, זה לא מספיק תווית את דרכי corticospinal למבוגרים בניסויים אלה, למרות זה לתייג את CST ב neonates עם יעילות גבוהה מחקרים אחרים1. זה אפשרי את קולטני הכרחי עבור ספיגת HiRet-הסינפסות יישוב, כגון NCAM או p75NTR, הם רק חלש לידי ביטוי למבוגרים CST נוירונים42,43, למרות שזה עדיין נמצא בחקירה. בכל מקרה, זה מדגים את החשיבות של קביעת אם וקטור בשימוש מתאים עבור התאים יישוב. בניסוי זה, המוח ואת חוט השדרה הרקמה היו מעובדים נחקר לאחר ארבעה שבועות כדי להבטיח שפע זמן הגברה ותעבורה של חוט המותני אל כל אזורי המוח. HiRet מועבר באמצעות תחבורה עצב רטרוגרדית מהר, וייתכן לפיכך ניסיוני קצר המתאים אם המרחק נסע פחותה, כמו למשל אם אזור ההזרקה בחוט השדרה הצווארי.
הזרקה ישירה ניתוח הוא כלי שימושי עבור מבוא לטכנולוגיה וקטור ויראלי לתוך חוט השדרה. שימוש HiRet עבור גנטים יש יתרון זה מאפשר יציבה, ארוך טווח הביטוי transgene, אינו רעיל את הנוירונים. בניסוי זה, אין תיוג GFP נראתה בנוירונים שגורמים לא ישיר קשרים סינפטיים לאזור ההזרקה. כך גם היה במחקרים קודמים בבעלי חיים פציעה25החזי החבורה. בנוסף, HiRet-GFP היתה אפשרות תווית בעמוד השדרה מוטורי לגלוקוז או נוירונים גנגליון העזוב שורש כאשר הוא מוזרק בעצב transiently demyelinated (שלא פורסמו תצפיות). יחד, נתונים אלה מראים כי HiRet אינם נכנסים בקלות דרך אקסונים, ביעילות transduces נוירונים על ידי ספיגה של וקטור ב הסינפסות, מתן מפה יותר מפורט, אמינות גבוהה של קשרים עצביים של האוכלוסייה יישוב. זהו יתרון על פני אחרים וקטורים ויראלי יביל retrogradely כגון רטרוגרדית adeno-הקשורים וירוס (rAAV-רטרו), אשר ידוע להיות נלקח על ידי אקסונים, פסקה44 והוא גורם שימושי במיוחד במחקרים מיפוי רגנרציה HiRet ו חיבור מחדש של המעגלים בחוט השדרה הפגוע. היתרונות של HiRet עשוי לאפשר גם מיקוד ספציפי של אוכלוסיות עצביים בשביל להשתיק או אבלציה מחקרים25,44,45,46,47.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו מומן על ידי מענק מן המכון הלאומי של הפרעות נוירולוגיות ו קו R01 R01NS103481 ומענקים החולים שריינרים למחקר בילדים SHC 84051 ואת SHC 86000 משרד ההגנה (SC140089).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #10 Scalpel Blades | Roboz | RS-9801-10 | For use with the scalpel. |
| 1 mL Syringes | Becton, Dickinson and Company | 309659 | For anesthetic IP injection, potential anesthetic booster shots, and antibiotic injections. |
| 10mL Syringes | Becton, Dickinson and Company | 309604 | For injecting saline into the animal, post-surgery. |
| 4.0 Chromic Catgut Suture | DemeTECH | NN374-16 | To re-bind muscle during closing. |
| 48000 Micropipette Beveler | World Precision Instruments | 32416 | Used to bevel the tips of the pulled glass capillary tubes to form functional glass needles. |
| 5% Iodine Solution | Purdue Products L.P. | L01020-08 | For use in sterilzation of the surgical site. |
| 70% Ethanol | N/A | N/A | For sterilization of newly prepared glass needles, animal models during surgical preparation, and surgeon's hands during surgery, as well as all other minor maintainances of sterility. |
| Anesthetic (Ketamine/Xylazine Solution) | Zoetis | 240048 | For keeping the animal in the correct plane of consciousness during surgery. |
| Antibiotic (Cefazolin) | West-Ward Pharmaceuticals | NPC 0143-9924-90 | To be injected subcutaneously to prevent infection post-surgery. |
| Bead Sterilizer | CellPoint | 5-1450 | To heat sterilize surgical instruments. |
| Bonewax | Fine Science Tools | 19009-00 | To seal up bone in the case of bone bleeding. |
| Cauterizer | Fine Science Tools | 18010-00 | To seal any arteries or veins severed during surgery to prevent excessive blood loss. |
| Digital Scale | Okaus | REV.005 | For weighing the animal during surgical preparation. |
| Flexible Needle Attachment | World Precision Instruments | MF34G-5 | For cleaning glass needles and loading red oil into glass needles. |
| Gelfoam | Pfizer | H68079 | To seal up bone in the case of bone bleeding. |
| Glass Capillary Tubes | World Precision Instruments | 4878 | For pulled glass needles - should be designed for nanoliter injectors. |
| Hair Clippers | Oster | 111038-060-000 | For clearing the surgical site of hair. |
| Hemostats | Roboz | RS-7231 | For general use in surgery. |
| Kimwipes | Kimtech | 34155 | For general use in surgery. |
| Medium Point Curved Forceps | Roboz | RS-5136 | For general use in surgery. |
| Micromanipulator with a Vernier Scale | Kanetec | N/A | For precise targeting during surgery. |
| Microscissors | Roboz | RS-5621 | For cutting glass whisps off of freshly pulled glass capillary tubes. |
| Microscope with Light and Vernier Scale Ocular | Leitz Wetzlar | N/A | Used to visualize and measure beveling of pulled glass capillary tubes into functional glass needles. |
| MicroSyringe Pump Controller | World Precision Instruments | 62403 | To control the rate of injection. |
| Nanoliter 2000 Pump Head Injector | World Precision Instruments | 500150 | To load and inject virus in a controlled fashion. |
| Needle Puller | Narishige | PC-100 | To heat and pull apart glass capillary tubes to form glass needles. |
| Ophthalamic Ointment | Dechra Veterinary Products | RAC 0119 | To protect the animal's eyes during surgery. |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | To assist with loading virus into the nanoinjector. |
| PrecisionGlide Needles (25G x 5/8) | Becton, Dickinson and Company | 305122 | For use with the 1mL and 10 mL syringes to allow injection of the animal model. |
| Rat Tooth Forceps | Roboz | RS-5152 | For griping spinous processes. |
| Red Oil | N/A | N/A | To provide a front for visualization of virus entering tissue during injection. |
| Retractors | Roboz | RS-6510 | To hold open the surgical wound. |
| Rimadyl Tablets | Bio Serv | MP275-050 | For pain management post-surgery. |
| Rongeurs | Roboz | RS-8300 | To remove muscle from the spinal column during surgery. |
| Scalpel Blade Handle | Roboz | RS-9843 | To slice open skin and fat pad of animal model during surgery. |
| Scissors | Roboz | RS-5980 | For general use in surgery. |
| Stainless Steal Wound Clips | CellPoint | 201-1000 | To bind the skin of the surgical wound during closing. |
| Staple Removing Forceps | Kent Scientific | INS750347 | To remove the staples, should they be applied incorrectly. |
| Sterile Cloth | Phenix Research Products | BP-989 | To provide a sterile surface for the operation. |
| Sterile Cotton-Tipped Applicators | Puritan | 806-WC | To soak up blood in the surgical wound while maintaining sterility. |
| Sterile Gauze | Covidien | 2146 | To clean the surgical area and surgical tools while maintaining sterility. |
| Sterile Saline | Baxter Healthcare Corporation | 281324 | For use in blood clearing, and for replacing fluids post-surgery. |
| Surgical Gloves | N/A | N/A | For use by the surgeon to maintain sterile field during surgery. |
| Surgical Heating Pad | N/A | N/A | For maintaining the body temperature of the animal model during surgery. |
| Surgical Microscope | N/A | N/A | For enhanced visualization of the surgical wound. |
| Surgical Stapler | Kent Scientific | INS750546 | To apply the staples. |
| T/Pump Heat Therapy Water Pump | Gaymar | TP500C | To pump warm water into the water convection warming pad. |
| Water Convection Warming Pad | Baxter Healthcare Corporation | L1K018 | For use in the post-operational recovery area to maintain the body temperature of the unconscious animal. |
| Weighted Hooks | N/A | N/A | To hold open the surgical wound. |
References
- Wang, X., et al. Deconstruction of corticospinal circuits for goal-directed motor skills. Cell. 171 (2), 440-455 (2017).
- Kinoshita, M., et al. Genetic dissection of the circuit for hand dexterity in primates. Nature. 487 (7406), 235-238 (2012).
- Brichta, A. M., Grant, G. Cytoarchitectural organization of the spinal cord. The rat nervous system. Vol. 2, hindbrain and spinal cord. , Academic Press. (1985).
- Liang, H., Paxinos, G., Watson, C. Projections from the brain to the spinal cord in the mouse. Brain Structure & Function. 215 (3-4), 159-186 (2011).
- Rexed, B. The cytoarchitectonic organization of the spinal cord in the cat. The Journal of Comparative Neurology. 96 (3), 414-495 (1952).
- Schmued, L. C., Fallon, J. H. Fluoro-gold: A new fluorescent retrograde axonal tracer with numerous unique properties. Brain Research. 377 (1), 147-154 (1986).
- Veenman, C. L., Reiner, A., Honig, M. G. Biotinylated dextran amine as an anterograde tracer for single- and double-labeling studies. Journal of Neuroscience Methods. 41 (3), 239-254 (1992).
- Watson, C., Paxinos, G., Kayalioglu, G., Heise, C. Atlas of the rat spinal cord. The spinal cord. , 238-306 (2009).
- Brandt, H. M., Apkarian, A. V. Biotin-dextran: A sensitive anterograde tracer for neuroanatomic studies in rat and monkey. Journal of Neuroscience Methods. 45 (1-2), 35-40 (1992).
- Geed, S., van Kan, P. L. E. Grasp-based functional coupling between reach- and grasp-related components of forelimb muscle activity. Journal of Motor Behavior. 49 (3), 312-328 (2017).
- Reiner, A., Veenman, C. L., Medina, L., Jiao, Y., Del Mar, N., Honig, M. G. Pathway tracing using biotinylated dextran amines. Journal of Neuroscience Methods. 103 (1), 23-37 (2000).
- Steward, O., Zheng, B., Banos, K., Yee, K. M., et al. Response to: Kim et al., "axon regeneration in young adult mice lacking nogo-A/B." neuron 38, 187-199. Neuron. 54 (2), 191-195 (2007).
- Brown, B. D., et al. A microRNA-regulated lentiviral vector mediates stable correction of hemophilia B mice. Blood. 110 (13), 4144-4152 (2007).
- Lo Bianco, C., et al. Lentiviral vector delivery of parkin prevents dopaminergic degeneration in an alpha-synuclein rat model of parkinson's disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (50), 17510-17515 (2004).
- Malik, P., Arumugam, P. I., Yee, J. K., Puthenveetil, G. Successful correction of the human cooley's anemia beta-thalassemia major phenotype using a lentiviral vector flanked by the chicken hypersensitive site 4 chromatin insulator. Annals of the New York Academy of Sciences. 1054, 238-249 (2005).
- Pawliuk, R., et al. Correction of sickle cell disease in transgenic mouse models by gene therapy. Science. 294 (5550), 2368-2371 (2001).
- Wang, G., et al. Feline immunodeficiency virus vectors persistently transduce nondividing airway epithelia and correct the cystic fibrosis defect. The Journal of Clinical Investigation. 104 (11), R55-R62 (1999).
- Liang, H., Paxinos, G., Watson, C. The red nucleus and the rubrospinal projection in the mouse. Brain Structure & Function. 217 (2), 221-232 (2012).
- Abdellatif, A. A., et al. delivery to the spinal cord: comparison between lentiviral, adenoviral, and retroviral vector delivery systems. Journal of Neuroscience Research. 84 (3), 553-567 (2010).
- DePolo, N. J., et al. VSV-G pseudotyped lentiviral vector particles produced in human cells are inactivated by human serum. Molecular Therapy. 2 (3), 218-222 (2000).
- Higashikawa, F., Chang, L. Kinetic analyses of stability of simple and complex retroviral vectors. Virology. 280 (1), 124-131 (2001).
- Hirano, M., Kato, S., Kobayashi, K., Okada, T., Yaginuma, H., Kobayashi, K. Highly efficient retrograde gene transfer into motor neurons by a lentiviral vector pseudotyped with fusion glycoprotein. PLoS One. 8 (9), e75896 (2013).
- Kato, S., et al. A lentiviral strategy for highly efficient retrograde gene transfer by pseudotyping with fusion envelope glycoprotein. Human Gene Therapy. 22 (2), 197-206 (2011).
- Kato, S., et al. Selective neural pathway targeting reveals key roles of thalamostriatal projection in the control of visual discrimination. The Journal of Neuroscience. 31 (47), 17169-17179 (2011).
- Sheikh, I. S., Keefe, K. M., et al. Retrogradely transportable lentivirus tracers for mapping spinal cord locomotor circuits. Frontiers in Neural Circuits. 12, 60 (2018).
- Harrison, M., et al. Vertebral landmarks for the identification of spinal cord segments in the mouse. NeuroImage. 68, 22-29 (2013).
- Tang, X. Q., Heron, P., Mashburn, C., Smith, G. M. Targeting sensory axon regeneration in adult spinal cord. The Journal of Neuroscience. 27 (22), 6068-6078 (2007).
- Cameron, A. A., Smith, G. M., Randall, D. C., Brown, D. R., Rabchevsky, A. G. Genetic manipulation of intraspinal plasticity after spinal cord injury alters the severity of autonomic dysreflexia. The Journal of Neuroscience. 26 (11), 2923-2932 (2006).
- Liu, Y., Keefe, K., Tang, X., Lin, S., Smith, G. M. Use of self-complementary adeno-associated virus serotype 2 as a tracer for labeling axons: Implications for axon regeneration. PLoS One. 9 (2), e87447 (2014).
- Chamberlin, N. L., Du, B., de Lacalle, S., Saper, C. B. Recombinant adeno-associated virus vector: Use for transgene expression and anterograde tract tracing in the CNS. Brain Research. 793 (1-2), 169-175 (1998).
- Filli, L., et al. Bridging the gap: A reticulo-propriospinal detour bypassing an incomplete spinal cord injury. The Journal of Neuroscience. 34 (40), 13399-13410 (2014).
- Williams, R. R., Pearse, D. D., Tresco, P. A., Bunge, M. B. The assessment of adeno-associated vectors as potential intrinsic treatments for brainstem axon regeneration. The Journal of Gene Medicine. 14 (1), 20-34 (2012).
- Smith, G. M., Onifer, S. M. Construction of pathways to promote axon growth within the adult central nervous system. Brain Research Bulletin. 84 (4-5), 300-305 (2011).
- Morcuende, S., Delgado-Garcia, J. M., Ugolini, G. Neuronal premotor networks involved in eyelid responses: Retrograde transneuronal tracing with rabies virus from the orbicularis oculi muscle in the rat. The Journal of Neuroscience. 22 (20), 8808-8818 (2002).
- Ugolini, G. Specificity of rabies virus as a transneuronal tracer of motor networks: Transfer from hypoglossal motoneurons to connected second-order and higher order central nervous system cell groups. The Journal of Comparative Neurology. 356 (3), 457-480 (1995).
- Gelderd, J. B., Chopin, S. F. The vertebral level of origin of spinal nerves in the rat. The Anatomical Record. 188 (1), 45-47 (1977).
- Inquimbert, P., Moll, M., Kohno, T., Scholz, J. Stereotaxic injection of a viral vector for conditional gene manipulation in the mouse spinal cord. Journal of Visualized Experiments. 73, e50313 (2013).
- Carbajal, K. S., Weinger, J. G., Whitman, L. M., Schaumburg, C. S., Lane, T. E. Surgical transplantation of mouse neural stem cells into the spinal cords of mice infected with neurotropic mouse hepatitis virus. Journal of Visualized Experiments. 53, e2834 (2011).
- Snyder, B. R., et al. Comparison of adeno-associated viral vector serotypes for spinal cord and motor neuron gene delivery. Human Gene Therapy. 22 (9), 1129-1135 (2011).
- Cronin, J., Zhang, X. Y., Reiser, J. Altering the tropism of lentiviral vectors through pseudotyping. Current Gene Therapy. 5 (4), 387-398 (2005).
- Reed, W. R., Shum-Siu, A., Onifer, S. M., Magnuson, D. S. Inter-enlargement pathways in the ventrolateral funiculus of the adult rat spinal cord. Neuroscience. 142 (4), 1195-1207 (2006).
- Mao, X., Schwend, T., Conrad, G. W. Expression and localization of neural cell adhesion molecule and polysialic acid during chick corneal development. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (3), 1234-1243 (2012).
- Charles, P., et al. Negative regulation of central nervous system myelination by polysialylated-neural cell adhesion molecule. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (13), 7585-7590 (2000).
- Tervo, D. G., et al. A designer AAV variant permits efficient retrograde access to projection neurons. Neuron. 92 (2), 372-382 (2016).
- Tohyama, T., et al. Contribution of propriospinal neurons to recovery of hand dexterity after corticospinal tract lesions in monkeys. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (3), 604-609 (2017).
- Liu, Y., et al. A sensitized IGF1 treatment restores corticospinal axon-dependent functions. Neuron. 95 (4), 817-833 (2017).
- Kinoshita, M., et al. Genetic dissection of the circuit for hand dexterity in primates. Nature. 487 (7406), 235-238 (2012).
