Summary
Este protocolo muestra la inyección de un vector viral retrogradely transportable en tejido de médula espinal de rata. El vector es tomado en la sinapsis y transportado al cuerpo celular de las neuronas de destino. Este modelo es adecuado para rastreo retrógrada de importantes vías espinales o dirigidos a las células para usos de la terapia génica.
Abstract
Introducir proteínas de interés en las células en el sistema nervioso es difícil debido a las barreras biológicas innatas que limitan el acceso a la mayoría de las moléculas. Inyección directamente en el tejido de la médula espinal pasa por alto estas barreras, proporcionando acceso a los cuerpos de la célula o sinapsis donde las moléculas pueden ser incorporadas. Combinando tecnología de vector viral con este método permite la introducción de genes de la blanco en tejido nervioso con el fin de la terapia génica o el trazado de vías. Aquí se introduce un virus diseñado para un transporte retrógrado altamente eficiente (HiRet) en las sinapsis de interneuronas propiospinal (PNs) para fomentar el transporte específico para neuronas en la médula espinal y los núcleos del médula oblonga. Dirigidas a PNs aprovecha las numerosas conexiones que reciben de los caminos del motor como los tractos rubroespinal y reticulospinal, así como su interconexión con los demás a lo largo de los segmentos de la médula espinal. Representante de seguimiento utilizando el vector de HiRet con detalles de alta fidelidad de espectáculos constitutivamente activa proteína verde fluorescente (GFP) de cuerpos celulares, axones y cenadores dendríticos PNs torácicas y reticulospinal neuronas en la formación reticular del pontine. HiRet incorpora en vías del médula oblonga y PNs pero muestra integración dependiente de edad en las neuronas del tracto corticoespinal. En Resumen, la inyección de médula espinal usando vectores virales es un método adecuado para la introducción de proteínas de interés en las neuronas de las zonas específicas.
Introduction
Vectores virales son importantes herramientas biológicas que pueden introducir material genético en las células con el fin de compensar los genes defectuosos, proteínas de crecimiento importante de alza o fabricar proteínas marcadoras que ponen de relieve la estructura y conexiones sinápticas del sus objetivos. Este artículo se centra en la inyección directa de un vector lentivirales retrogradely transportable muy eficiente en la médula espinal de rata para resaltar los caminos importantes del motor con trazo fluorescente. Este método también es muy apropiado para estudios de regeneración y regeneración axonales a introducir proteínas de interés en diversas poblaciones de neuronas y se ha utilizado para silenciar a las neuronas para mapeo funcional estudios1,2.
Muchos de los detalles anatómicos de las vías motor espinales fueron aclados mediante estudios de inyección directa con marcadores clásicos como la BDA y fluoro-oro3,4,5,6,7 , 8. estos marcadores se consideran patrón oro pero pueden tener ciertas desventajas como la absorción por axones dañados, o axones en pasaje de la materia blanca circundante una inyección sitio9,10,11 . Esto podría llevar a interpretaciones incorrectas de la conectividad vía y puede ser un inconveniente en los estudios de regeneración donde podría confundir con absorción de tinte por axones dañados o cortadas para regenerar las fibras durante el más adelante análisis12.
Vectores lentivirales son populares en estudios de terapia génica, ya que proporcionan la expresión estable y a largo plazo en poblaciones neuronales13,14,15,16,17,18 ,19. Sin embargo, tradicionalmente envasados vectores lentivirales puede haber limitado el transporte retrógrado y dispare la respuesta del sistema inmunitario cuando se utiliza en vivo4,20,21. Un vector de transporte retrógrado muy eficiente llamado HiRet ha sido producido por Kato et mediante la modificación de la envuelta viral con una glicoproteína del virus rabia para crear un vector híbrido que mejora el transporte retrógrado22,23.
Trazado retrógrado introduce un vector en el espacio sináptico de la neurona de destino, lo que le permite ser tomado por el axón de la célula y transportados al cuerpo de la célula. Ha demostrado éxito transporte de HiRet de sinapsis neuronales en los cerebros de ratones y primates23,24 y de los músculos en las neuronas de motor22. Este protocolo muestra la inyección en la médula espinal lumbar, específicamente dirigidos a los terminales sinápticos de propiospinal interneuronas y las neuronas del tronco encefálico. PNs reciban conexiones de muchos diferentes vías espinales y por lo tanto pueden ser utilizados para una diversa población de neuronas en la médula espinal y tronco encefálico. Etiquetado las neuronas en este estudio representan circuitos inervan motoneuronas piscinas relativos a la función motora del miembro posterior. Etiquetado sólido se observa en la médula espinal y tronco encefálico, incluyendo datos de alta fidelidad de cenadores dendríticos y terminales de axón. También hemos utilizado este método en estudios anteriores de la médula espinal cervical para etiqueta propiospinal y del médula oblonga reticulospinal vías25.
Este protocolo muestra la inyección de un vector viral en la médula espinal lumbar de una rata. Como se ve en la película 1, la incisión es dirigida por la identificación de la vértebra L1 situada en la última costilla. Esto se utiliza como una señal caudal para una incisión de 3-4 cm que expone la musculatura sobre la médula espinal de L1-L4. Laminectomies de los aspectos dorsales de las vértebras T11-T13 se realizan y se dirige una aguja de vidrio biselado 0.8 mm lateral de la línea media y reducido 1,5 mm en la materia gris para inyectar virus.
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Protocol
Todos los procedimientos de atención quirúrgica y animales han sido aprobados por el cuidado Animal y el Comité de uso de la Universidad de Temple.
1. pre-quirúrgicos preparados
- Preparar el vidrio tirado agujas para inyección viral unos días antes de la cirugía usando 3,5 nanoliter capilares pipetas de vidrio diseñados para nanoliter inyectores. Tire de cada pipeta en un extractor de aguja de dos pasos según las instrucciones del fabricante para crear dos plantillas de aguja.
- Afinar la punta de las plantillas de la aguja de corte aproximadamente 1-2 mm de exceso de vidrio con microscissors. Tamaño de apertura aproximada de medida bajo un microscopio con un portaobjetos calibrado para aislar las agujas con las aberturas de 30-40 μm.
- Con la aguja colocada a 30°, utilice un biselador de micropipeta para crear una punta con una abertura de 30-40 μm y un ángulo biselado de 45°. Verificar el ancho de la abertura con el nonio en la diapositiva de calibración. Pasar agua y etanol a través de la aguja de vidrio utilizando una jeringa con un accesorio de aguja flexible para limpiar escombros y marque la aguja a intervalos regulares con un marcador negro.
- Colocar las agujas en un plato de Petri cubierto previamente limpiadas con etanol al 70% y esterilizar durante 30 minutos en una campana de bioseguridad bajo luz UV.
- Preparar HiRet lentivirus eliminando un volumen adecuado del congelador inmediatamente antes del procedimiento.
Nota: Un volumen adecuado incluye la cantidad necesaria para la inyección (inyección de 1 μl x número de inyecciones) más un poco de volumen extra para tener en cuenta para el pipeteo y pérdidas de carga. Transportar y almacenar el virus en el hielo cuando no esté en uso. - Preparar el inyector, conectando al Microbomb y colocarlo en un instrumental quirúrgico con una escala Vernier.
- Preparar la aguja de vidrio, cuidadosamente cargar un tinte color como rojo aceite con una jeringa equipada con una aguja flexible. Asegurar que no hay burbujas en la aguja. Utilizar técnica aséptica al manipular la aguja y abstenerse de tocar la punta.
- Inserte la aguja de vidrio en el inyector, asegurándose que la aguja está colocada correctamente en las arandelas de la tapa del inyector esté bien apretado y la aguja del inyector de acero se extiende aproximadamente ¾ la longitud de la aguja de vidrio. Virus puede ser cargado en la aguja en un paso posterior.
2. anestesia y preparación del sitio quirúrgico
- Pesar al animal en una escala digital. Registrar el peso preoperatorio para determinar el volumen de anestésico necesaria y para permitir un control de después de la cirugía peso. Ratas Sprague-Dawley hembras aproximadamente 200 – 250 g fueron utilizados en el presente Protocolo.
- Anestesiar la rata mediante inhalación isoflurano o una solución de ketamina/xilacina inyectada (k / x). Aquí, la ketamina se inyecta por vía intraperitoneal a 67 mg/kg y xilacina a 6,7 mg/kg dosis.
- Confirmar un adecuado plano anestésico pellizcando los pies firmemente. Si se produce la retirada reflexiva, esperar unos minutos adicionales antes de proceder.
Nota: Observe también los bigotes, ojos y la frecuencia respiratoria signos de conciencia. Si los bigotes son fasciculaciones, el ojo parpadea cuando se toca suavemente o la respiración es rápida y poco profunda, espere a que el plano anestésico es más profundo para continuar con el protocolo. También monitorizar estas señales a través de la cirugía laminectomía e inyección. Si el animal muestra un plano anestésico superficial, administrar una vacuna de refuerzo de ketamina sólo igual a 1/2 la original k / x dosis. - Afeitarse la rata a lo largo de la línea media dorsal desde la cadera hasta el ángulo inferior de la escápula. Tire de la piel del animal tenso para un afeitado más fácil y más preciso.
- Aplicar pomada oftálmica en ambos ojos.
- Aplicar antiséptico en la zona depilada para esterilizar el sitio. Para la primera limpieza, empape una gasa estéril con una solución de yodo al 5% y limpie a todo cabello y los residuos. Siga esto con un suave movimiento circular unidireccional con una gasa estéril empapada en etanol al 70%, por lo que ningún área se pone en contacto dos veces. Utilice esta misma técnica con alternancia de yodo y gasas empapadas de etanol dos veces más.
3. quirúrgica preparación campo e instrumento
- Preparar un conjunto de herramientas quirúrgicas en autoclave que incluyan un bisturí, gubias, pinzas de diente de rata, primavera tijeras, pinzas hemostáticas, pinzas de punto medio curvado y retractores o los ganchos ponderadas por desenvolver la envoltura estéril para crear un campo estéril.
- Abra un paquete de guantes quirúrgicos estériles y coloque la envoltura de guante estéril sobre la mesa. Utilice esto como un campo estéril adicional para herramientas usadas para prevenir la contaminación de la envoltura estéril.
- Caída de una hoja de bisturí #10 sobre el campo estéril. Fije la hoja a un mango con un hemostato. Solución salina estéril posición 4,0 sutura catgut crómico y materiales para control de sangrado como un cauterizador, gasa estéril, aplicadores con punta de algodón estériles (para hemorragias del músculo), o gelfoam o bonewax (para hemorragias de hueso) en un lugar accesible.
- Recuperar al animal y ponerlo en un paño estéril. Colocar una gasa debajo de la vejiga para recoger la orina. Apuntalar la zona de destino con una toalla enrollada debajo del abdomen. Si está disponible, coloque una almohadilla de calefacción quirúrgica debajo el paño estéril, especialmente para procedimientos más largos.
Nota: Esterilidad es importante durante la cirugía de la supervivencia. Mantenga una botella de spray de etanol al 70% en la mano para mantener la esterilidad de las manos enguantadas y un esterilizador de bolas de uso si se compromete la esterilidad de los instrumentos, o entre cirugías individuales.
4. exponer la columna vertebral e identificar el sitio de laminectomía
- Identificar el área donde se realizará una incisión en la piel presionando los dedos suavemente en la última costilla a localizar la vértebra L1. Usando esto como una señal, hacer una incisión en la piel 3-4 cm con un bisturí #10 terminando apenas inferior a la L1 para exponer el músculo. Sostenga la piel tensa por separarse suavemente y presione firmemente con la hoja de bisturí para asegurar una limpia incisión.
- Corte y extensión superficial grasa con fórceps y tijeras si es necesario. (Dependiendo de vértebra de destino, puede o no ser una gran almohadilla grasa superficial al músculo).
- Siento por las apófisis espinosas con la parte plana de la hoja de bisturí o un dedo. A menudo el área de la línea media se esbozarse una "v" de la faja blanca a cada lado. Hacer un pequeño corte rostral para dejar espacio agarrar firmemente en un proceso superior con pinzas de diente de rata, y luego hacer 2 cortes largos y profundos cerca de los procesos como sea posible. En el punto más profundo del corte, la superficie dorsal de las vértebras se puede sentir con la hoja de bisturí.
- Mantenga los músculos laterales a un lado con separadores o ganchos ponderados para mejorar la visibilidad. Músculo claro alrededor de los procesos con un bisturí, tijeras de muelle o gubias para determinar la forma de sus cabezas.
Nota: Recuerde que la médula espinal no se extiende a toda la longitud de la columna vertebral, como paradas de tejido médula espinal creciente anteriormente en el desarrollo de hueso. Esto significa que el nivel de la columna vertebral puede ser debajo de una vértebra diferente nombre. - Localice el T11 y los procesos adyacentes de T12 y T13.
Nota: Ayuda en la orientación correcta niveles vertebrales se puede encontrar en un atlas de la médula espinal de rata y estudios previos sobre puntos de interés en el ratón, que tiene una muy parecida estructura vertebral6,33. Deje una apófisis rostral como T9 dar un punto de referencia la línea media.
5. realizar una laminectomía
- Una vez que el área de la blanco ha sido correctamente identificado, realizar laminectomies de los aspectos dorsales de T11-T13. Extender suavemente las vértebras para revelar los ligamentos intervertebrales, que son buenos sitios para insertar gubias para la picadura inicial del hueso. Sujete las gubias en posición medio cerrado para aumentar el control de la multa.
- Eliminar los procesos espinosos y el aspecto dorsal de las vértebras por tomar pequeños bocados con las gubias. Tenga cuidado de no dañar la médula espinal o molestar a la duramadre. Levante ligeramente con las pinzas de diente de rata para ayudar a tirar la médula espinal de las vértebras y disminuir la tendencia a golpear el tejido de la médula espinal.
- Quitar hueso de la línea media para que se observan los vasos sanguíneos de la línea media. Deja una ventana que claramente muestra el tejido de la médula espinal y está libre de residuos.
- Toque suavemente la médula espinal con el fórceps. Algunos animales pueden saltar reflexivamente aunque su plano anestésico es profundo. Aplicar unas gotas de un agente anestésico como la lidocaína directamente a la médula espinal para evitar saltos durante el procedimiento de inyección.
- Asegure el animal en un soporte de columna de sujeción pinzas estabilizadoras a apófisis rostrales y caudales a la ventana de laminectomía. Levantar el abdomen del animal usando el soporte espinal para negar el efecto de los movimientos de respiración. Esto aumenta la estabilidad de la aguja y asegurar la adecuada profundidad de la inyección.
6. carga del virus y el posicionamiento del inyector
- Cargar virus en el inyector de pipeteo aproximadamente 5 μl sobre un trozo de parafilm y posicionando la aguja para que la punta está dentro de la gota.
- Utilizar el microbomb para retirar hasta 4 μL del virus a una tasa de 20 – 100 nL/s.
- Ajuste el regulador a inyectar y suelte una pequeña cantidad del virus de la aguja para asegurar que la punta de la aguja se obstruya. Limpiar virus de exceso con una toallita de laboratorio.
Nota: Una jeringa Hamilton con una aguja de acero puede usarse como alternativa a las pipetas de vidrio tiradas. - Coloque el instrumental quirúrgico para que la escala Vernier está visible y coloque la aguja en el midline de la médula espinal.
Nota: La línea media puede situarse a veces por un vaso sanguíneo grande en la superficie anterior de la médula espinal. Sin embargo, esto puede variar en ratas individuales, y dirigidos a la línea media deben ser confirmado por comparación con un proceso espinoso intacto. - Dirigir la aguja lateralmente por 0,8 mm utilizando la escala de nonio en el micromanipulador.
- Baje la aguja en la médula espinal hasta que es sangría, pero no pinchar, la dura. Usando un movimiento de giro rápido, punción la duramadre con la aguja hasta que se ha hundido a una profundidad de 1,5 mm.
7. inyectar el virus en la médula espinal
- Una vez que la aguja esté en su lugar, programa el inyector para inyectar a una velocidad de 400 nL/min Confirm que el virus entra en la médula espinal, observando el avance del frente del tinte. Debe haber ninguna obvia salida o protrusión de tejido de la médula espinal. Si se observa fuga, a veces esto puede paliar mediante la reducción de la velocidad de inyección a 200 nL/min.
- Una vez terminada la inyección, que la aguja en la médula espinal 2 – 5 minutos (dependiendo del volumen inyectado) para facilitar la difusión del virus.
- Lentamente retire la aguja y pasar al siguiente sitio de la inyección. Inyectar 1 μl del virus en cada uno de los 6 sitios uniformemente espaciados aproximadamente 1 mm de separación a lo largo de la longitud de los tejidos espinales L1-L4. Puede utilizarse la misma aguja para cada inyección mientras continúa funcionar correctamente.
8. cuidado post quirúrgico y cierre de la herida
- Quitar el animal del soporte del espinal y quitar separadores o ganchos utilizados para extender el músculo lateral. Asegúrese de que la herida esté libre de todos escombros antes de cerrar.
- Suturar el músculo utilizando una sutura de catgut crómico 4.0. Cortar hilos de sutura cerca del nudo para reducir la probabilidad de irritación de la piel interna.
- Sujete con grapa la piel cerrada usando los clips de 9 mm de la herida. Para lograr la curación óptima, alinee los bordes de la piel antes de grapar.
- Coloque el animal en una convección de agua calienta el pad y el monitor hasta que despierto.
- Inyectar 5-10 mL de solución salina estéril por vía subcutánea para reponer líquidos y un antibiótico como cefazolina para prevenir la infección. Cuando el animal es ambulatoria, coloque en su jaula casera y proporcionar analgésicos iniciales. Controlar las ratas para cualquier signo de dolor y angustia y tratar según su procedimiento IACUC aprobado para el alivio del dolor.
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Representative Results
Transducción de una población robusta de unilaterales neuronas en la médula espinal y en ciertos núcleos del tronco encefálico deben resultar exitosa inyección y transporte de los vectores virales. Figura 1 muestra etiquetas estereotipadas de las neuronas y los axones de la médula espinal torácica y en la formación reticular del pontine del médula oblonga en inyección después de cuatro semanas. Significativa expresión de GFP se observa en las neuronas en la sustancia gris de la médula espinal torácica en el lado ipsilateral a la inyección (figura 1A, zona en caja). Algunas neuronas también se observan en el lado contralateral, especialmente cerca de la línea media. En la materia blanca, expresión de GFP se observa en axones en el cordón ipsilateral (figura 1A, flechas y puntas de flecha), especialmente en las zonas típica de axones propiospinal (flecha). Figura 1A' muestra un aumento mayor de la zona en caja en A, demostrar expresión típica en los cuerpos celulares neuronales y dendritas. También se pueden observar expresión de GFP en las neuronas en los núcleos del médula oblonga como la formación reticular del pontine (figura 1B, el aumento mayor de la zona en caja de figura 1B').
Figura 1: transducción de señales de las neuronas de la médula espinal y tronco encefálico. (A) GFP expresión en las neuronas (en área), axones de las neuronas propiospinal (puntas de flecha) y los axones de otras zonas (flechas) en la médula espinal torácica. (A') Mayor aumento de la expresión neuronal en el área de caja de A. (B) la formación reticular del pontine en el médula oblonga expresando GFP marcado con neuronas y dendritas. (B') Aumento mayor de la zona en caja en B. Barras de escala: (A) = 500 μm; (B) = 1 mm; (A'), (B') = 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Pelicula 1: a la inyección en la médula espinal lumbar de la rata. Este vídeo resúmenes de los conceptos básicos de la segmentación y la inyección de un vector viral en la médula espinal de rata. Por favor haga clic aquí para ver este video. (Clic derecho para descargar)
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Discussion
Manipulación genética de las neuronas en el cerebro y la médula espinal ha servido para destacar sensorial, motor y autonómicas vías mediante trazo fluorescente y explorar potencial de rebrote de tractos neuronales después de lesiones27,28, 29 , 30 , 31 , 32 , 33. dirigir la inyección de un vector viral retrogradely transportable en la médula espinal puede dirigirse a poblaciones neuronales a través de sus conexiones sinápticas, haciendo este método una excelente elección para vías de la cartografía en el sistema nervioso central. El vector de HiRet específicamente muestra absorción selectiva en la sinapsis neuronal22,24,25y trazo anterior con vectores semejantemente estructurados no demostradas se propague en los axones lesionados o relacionado con las células 34 , la construcción de 35, que es consistente con los resultados con el HiRet22,23,25. Así, la inyección directa de HiRet como trazador retrógrado es un método ideal para explorar circuitos interneuronal que plasticidad después de lesión.
Hay dos conceptos fundamentales involucrados en inyección acertada de un vector viral en la médula espinal. El primero es establecer el objetivo correcto con la aguja de vidrio, y el segundo es garantizar un flujo adecuado del virus de la aguja en el tejido. Como este protocolo trata de trazado retrógrado, dirigidos a la zona correcta requiere un conocimiento profundo de las conexiones sinápticas de la población neuronal de interés. Las neuronas propiospinal y reticulospinal conecta a la médula espinal lumbar se dirigen aquí. Estas neuronas se distribuyen a lo largo de la médula oblonga y los segmentos cervicales y torácicos de la médula espinal, con la mayoría de los SNP localizado en láminas V-VII dentro de la materia gris. Para asegurar la transducción de una adecuada población de neuronas, seis inyecciones virales se hacen sobre un área que abarca cuatro segmentos espinales. Los segmentos L1-L4 son elegidos debido a la presencia de los generadores centrales del patrón y sus conocidas conexiones a otras áreas de la médula espinal. Una vez que se conocen los segmentos espinales correcta y láminas, ubicación física de estos objetivos a través de puntos anatómicos es crucial. Atlas que muestra detalles de la estructura anatómica y la forma vertebral pueden ser útiles para confirmar objetivos hitos8,36. Cabe señalar que la mayoría de este protocolo es el mismo si se hacen una inyección o seis; la diferencia está sólo en el número de segmentos espinales expuestos mediante laminectomía y el hecho de que usted tendrá que volver a cargar la aguja de vidrio con virus adicional si inyectar μl más de 4. El protocolo también se puede adaptar fácilmente para el ratón. Debido a su tamaño más pequeño, el volumen de virus inyectados en el cable debe ajustarse hacia abajo y las mediciones necesarias para golpear las láminas espinales correcto ajustado. Varios videos de cirugías similares en el ratón han sido previamente publicados37,38.
La siguiente consideración es adecuada difusión en el tejido. Preparación cuidadosa de la aguja es necesaria garantizar que la apertura es suficiente para la suspensión viral fluir hacia el exterior y que residuos no bloquean la punta, y la visualización del flujo de la aguja en la médula espinal a través de un frente de tinte color es útil para confirmar que la suspensión es penetrar en el tejido. Una vez que la suspensión se ha distribuido en el tejido, manteniendo la aguja dentro de la médula espinal durante 2-5 minutos garantizará la difusión adecuada.
Transduction acertado de una población puede depender también de propiedades intrínsecas del virus inyectado como la eficiencia de titulación, el serotipo y la infección. Nos encontramos con un título de copia genomic de al menos 1010 GC/mL para HiRet lentivirus a trabajar bien para la experimentación in vivo. Títulos más altos o los volúmenes de inyección podrían mostrar mayor índice de etiquetado, pero cuidado debe ser tomado ya que el virus podría difundir fuera de la zona o en la médula espinal contralateral. Debe prestarse atención al tipo de vector apropiado para el etiquetado de las células de interés basándose en su tropismo. Ciertos serotipos virales pueden tener infección mejor y tipos de transducción de señales en diferentes poblaciones de neuronas39. Vectores lentivirales tradicionales son conocidos por infectar a una amplia gama de tipos de la célula por la proteína VSV-G, sin embargo modificaciones a este vector pueden influir en su tropismo40. La construcción de HiRet modifica la dotación por pseudotyping con una glicoproteína de fusión (FuG-B) de virus de la rabia, que permite el transporte retrógrado eficientes22,23 y es eficaz en transducing propiospinal y tracto reticulospinal, con números neuronales comparables al trazo de las vías a través de métodos como fluorogold y microruby4,41 (para los detalles de la construcción de la sede de vector HiRet Hirano et al.) 22. sin embargo, lo no suficientemente etiqueta corticoespinal adulto en estos experimentos, aunque etiqueta el CST en recién nacidos con alta eficiencia en otros estudios1. Es posible que los receptores necesarios para la absorción de HiRet en las sinapsis específicas, como NCAM o p75NTR, son sólo débilmente expresado en adultos CST neuronas42,43, aunque esto está todavía siendo investigado. En cualquier caso, esto demuestra la importancia de determinar si el vector que se utiliza es adecuado para las células apuntadas. En este experimento, cerebro y médula espinal del tejido fueron procesados y sondeados después de cuatro semanas para asegurar tiempo abundante para la amplificación y transporte desde el cordón de la lumbar a todas las áreas del cerebro. HiRet es transportado a través de transporte axonal retrógrado rápido, y así un período más corto experimental puede ser apropiado si la distancia recorrida es menor, como si la zona de inyección es en la médula espinal cervical.
Inyección directa la cirugía es una herramienta útil para la introducción de la tecnología de vector viral en la médula espinal. El uso de HiRet para experimentación genética es ventajoso ya que permite estable, larga duración transgene expresión y no es tóxico para las neuronas. En este experimento, no etiquetado GFP fue visto en las neuronas que no hacen directa conexiones sinápticas a la zona de inyección. Esto también fue cierto en estudios anteriores en animales con una contusión torácica lesiones25. Además, HiRet-GFP no pudo etiquetar neuronas de motor espinales o neuronas de ganglio de raíz dorsal cuando se inyecta en el nervio ciático transitoriamente demyelinated (observaciones no publicadas). Juntos, estos datos sugieren que la HiRet no entra fácilmente a través de axones y absorbe eficientemente las neuronas por la absorción del vector en las sinapsis, proporcionando un mapa más detallado y de alta fidelidad de las conexiones neuronales de la población objetivo. Esto es una ventaja sobre otros vectores virales retrogradely transportables como retrógrada virus adeno-asociado (rAAV-retro), que se sabe para ser tomado por axones en pasaje44 y hace especialmente útil en estudios de mapeo de regeneración HiRet y volver a conectar el circuito de la médula espinal lesionada. Ventajas de HiRet también pueden permitir ataques específicos contra poblaciones neuronales para silenciar o ablación estudios25,44,45,46,47.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por una subvención del Instituto Nacional de trastornos neurológicos y accidente cerebrovascular R01 R01NS103481 y el Hospital de Shriners for Pediatric Research otorga SHC 84051 y SHC 86000 y el Departamento de defensa (SC140089).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #10 Scalpel Blades | Roboz | RS-9801-10 | For use with the scalpel. |
| 1 mL Syringes | Becton, Dickinson and Company | 309659 | For anesthetic IP injection, potential anesthetic booster shots, and antibiotic injections. |
| 10mL Syringes | Becton, Dickinson and Company | 309604 | For injecting saline into the animal, post-surgery. |
| 4.0 Chromic Catgut Suture | DemeTECH | NN374-16 | To re-bind muscle during closing. |
| 48000 Micropipette Beveler | World Precision Instruments | 32416 | Used to bevel the tips of the pulled glass capillary tubes to form functional glass needles. |
| 5% Iodine Solution | Purdue Products L.P. | L01020-08 | For use in sterilzation of the surgical site. |
| 70% Ethanol | N/A | N/A | For sterilization of newly prepared glass needles, animal models during surgical preparation, and surgeon's hands during surgery, as well as all other minor maintainances of sterility. |
| Anesthetic (Ketamine/Xylazine Solution) | Zoetis | 240048 | For keeping the animal in the correct plane of consciousness during surgery. |
| Antibiotic (Cefazolin) | West-Ward Pharmaceuticals | NPC 0143-9924-90 | To be injected subcutaneously to prevent infection post-surgery. |
| Bead Sterilizer | CellPoint | 5-1450 | To heat sterilize surgical instruments. |
| Bonewax | Fine Science Tools | 19009-00 | To seal up bone in the case of bone bleeding. |
| Cauterizer | Fine Science Tools | 18010-00 | To seal any arteries or veins severed during surgery to prevent excessive blood loss. |
| Digital Scale | Okaus | REV.005 | For weighing the animal during surgical preparation. |
| Flexible Needle Attachment | World Precision Instruments | MF34G-5 | For cleaning glass needles and loading red oil into glass needles. |
| Gelfoam | Pfizer | H68079 | To seal up bone in the case of bone bleeding. |
| Glass Capillary Tubes | World Precision Instruments | 4878 | For pulled glass needles - should be designed for nanoliter injectors. |
| Hair Clippers | Oster | 111038-060-000 | For clearing the surgical site of hair. |
| Hemostats | Roboz | RS-7231 | For general use in surgery. |
| Kimwipes | Kimtech | 34155 | For general use in surgery. |
| Medium Point Curved Forceps | Roboz | RS-5136 | For general use in surgery. |
| Micromanipulator with a Vernier Scale | Kanetec | N/A | For precise targeting during surgery. |
| Microscissors | Roboz | RS-5621 | For cutting glass whisps off of freshly pulled glass capillary tubes. |
| Microscope with Light and Vernier Scale Ocular | Leitz Wetzlar | N/A | Used to visualize and measure beveling of pulled glass capillary tubes into functional glass needles. |
| MicroSyringe Pump Controller | World Precision Instruments | 62403 | To control the rate of injection. |
| Nanoliter 2000 Pump Head Injector | World Precision Instruments | 500150 | To load and inject virus in a controlled fashion. |
| Needle Puller | Narishige | PC-100 | To heat and pull apart glass capillary tubes to form glass needles. |
| Ophthalamic Ointment | Dechra Veterinary Products | RAC 0119 | To protect the animal's eyes during surgery. |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | To assist with loading virus into the nanoinjector. |
| PrecisionGlide Needles (25G x 5/8) | Becton, Dickinson and Company | 305122 | For use with the 1mL and 10 mL syringes to allow injection of the animal model. |
| Rat Tooth Forceps | Roboz | RS-5152 | For griping spinous processes. |
| Red Oil | N/A | N/A | To provide a front for visualization of virus entering tissue during injection. |
| Retractors | Roboz | RS-6510 | To hold open the surgical wound. |
| Rimadyl Tablets | Bio Serv | MP275-050 | For pain management post-surgery. |
| Rongeurs | Roboz | RS-8300 | To remove muscle from the spinal column during surgery. |
| Scalpel Blade Handle | Roboz | RS-9843 | To slice open skin and fat pad of animal model during surgery. |
| Scissors | Roboz | RS-5980 | For general use in surgery. |
| Stainless Steal Wound Clips | CellPoint | 201-1000 | To bind the skin of the surgical wound during closing. |
| Staple Removing Forceps | Kent Scientific | INS750347 | To remove the staples, should they be applied incorrectly. |
| Sterile Cloth | Phenix Research Products | BP-989 | To provide a sterile surface for the operation. |
| Sterile Cotton-Tipped Applicators | Puritan | 806-WC | To soak up blood in the surgical wound while maintaining sterility. |
| Sterile Gauze | Covidien | 2146 | To clean the surgical area and surgical tools while maintaining sterility. |
| Sterile Saline | Baxter Healthcare Corporation | 281324 | For use in blood clearing, and for replacing fluids post-surgery. |
| Surgical Gloves | N/A | N/A | For use by the surgeon to maintain sterile field during surgery. |
| Surgical Heating Pad | N/A | N/A | For maintaining the body temperature of the animal model during surgery. |
| Surgical Microscope | N/A | N/A | For enhanced visualization of the surgical wound. |
| Surgical Stapler | Kent Scientific | INS750546 | To apply the staples. |
| T/Pump Heat Therapy Water Pump | Gaymar | TP500C | To pump warm water into the water convection warming pad. |
| Water Convection Warming Pad | Baxter Healthcare Corporation | L1K018 | For use in the post-operational recovery area to maintain the body temperature of the unconscious animal. |
| Weighted Hooks | N/A | N/A | To hold open the surgical wound. |
References
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