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微聚焦 X 射线 CT (微CT) 阿克蒂尼亚 equina (Cnidaria),哈莫特霍sp. (安妮利达) 和Xenoturbella japonica (西纳科洛莫卡) 成像

Published: August 6, 2019 doi: 10.3791/59161
Automatic Translation
1, 2, 3, 3
1Mammalian Genetics Laboratory, National Institute of Genetics, 2Misaki Marine Biological Station, The University of Tokyo, 3Shimoda Marine Research Center, University of Tsukuba

Summary

在这里,详细介绍了对三种海洋无脊椎动物进行微聚焦X射线计算机断层成像(微CT)成像的协议。本研究描述了样品固定、染色、安装、扫描、图像重建和数据分析等步骤。还就如何针对不同的样本调整协议提出了建议。

Abstract

传统上,生物学家不得不依靠破坏性方法,如切片,以调查不透明生物的内部结构。非破坏性微焦 X 射线计算机断层扫描 (microCT) 成像已成为生物学中一个强大而新兴的协议,这是由于样品染色方法的技术进步以及微CT硬件、处理计算机和数据的创新分析软件。然而,该协议并不普遍使用,因为它是在医疗和工业领域。这种有限使用的原因之一是缺乏一个简单而易于理解的手册,涵盖了所有必要的步骤:样品收集、固定、染色、安装、扫描和数据分析。另一个原因是元类动物,特别是海洋无脊椎动物的多样化。由于海洋无脊椎动物的尺寸、形态和生理条件各不相同,因此根据样品,在每一步调整实验条件和硬件配置至关重要。在这里,微CT成像方法使用三种植物遗传多样性的海洋无脊椎动物详细解释:Actinia equina(安索佐亚,尼达里亚),哈莫特霍sp.(波利查塔,安妮利达),和Xenoturbella japonica((西诺图贝利达,西纳科洛莫法)。提出了对各种动物进行微CT成像的建议。

Introduction

生物研究人员通常不得不进行薄截面,并通过光或电子显微镜进行观察,以调查不透明生物体的内部结构。然而,这些方法是破坏性的,当应用于稀有或有价值的标本时,是破坏性的和有问题的。此外,该方法中的几个步骤(如嵌入和切片)非常耗时,并且可能需要几天时间才能观察样本,具体取决于协议。此外,在处理许多部分时,始终有可能损坏或丢失某些部分。组织清除技术可用于一些标本1,2,3,4,5,但还不适用于许多动物物种。

为了克服这些问题,一些生物学家已经开始使用微焦X射线计算机断层扫描(微CT)成像6,7,8,9,10,11, 12,13,14,15.在 X 射线 CT 中,标本从围绕样品移动的 X 射线源产生不同角度的 X 射线进行照射,并且传输的 X 射线由探测器进行监测,该探测器也在样品周围移动。对获得的X射线传输数据进行了分析,以重建标本的横截面图像。此方法可以观察内部结构,而不会破坏样品。由于其安全性和方便性,它常用于医疗和牙科应用,CT 系统可在全球的医院和牙科中心找到。此外,工业X射线CT还经常用于观察工业领域的非医学样品,用于检查和计量。与X射线源和探测器移动的医学CT不同,这两个部分固定在工业CT中,样品在扫描过程中旋转。工业CT通常比医疗CT产生更高的分辨率图像,被称为微CT(微米级分辨率)或纳米CT(纳米级分辨率)。最近,使用微CT的研究在生物学的各个领域迅速增加,14,15,16,17,18,1920,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34.

使用CT的生物研究最初针对内部结构,主要由硬组织,如骨。使用各种化学剂染色技术的进步使各种生物体中的软组织可视化6、7、8、9、14、15 ,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34.在这些试剂中,碘基造影剂相对安全、价格低廉,可用于各种生物体中软组织的可视化7、14。关于海洋无脊椎动物,微CT已广泛应用于软体动物,如软体动物6,25,32,33,安妮利德18,19,20,28,和阿特霍波德21,23,29,31 。然而,很少有关于其他动物的报导,如布约佐斯6,异种动物26,和仙人掌24,30。一般来说,对海洋无脊椎动物使用微CT的研究比对脊椎动物的研究要少。这种对海洋无脊椎动物的有限使用,一个主要原因是这些动物观察到的巨大多样性。由于其不同的大小、形态和生理,每个物种对不同的实验程序有不同的反应。因此,在样品制备过程中,选择最合适的固定和染色试剂,并为每个物种调整每个步骤设置条件至关重要。同样,还需要为每个样品设置适当的扫描配置,如安装方法、电压、电流、机械放大速率和空间分辨率功率。为了克服这个问题,一份简单而易懂的手册涵盖了所有必要的步骤,解释了如何根据样本调整每个步骤,并展示来自多个样本的详细示例至关重要。

在本研究中,我们使用三种海洋无脊椎动物物种,逐步描述了从样品固定到数据分析的微CT成像方案。在东京大学Misaki海洋生物站附近采集了海葵阿基尼亚埃奎纳(安佐佐亚,Cnidaria)的标本。他们有一个球形,柔软的身体,直径约2厘米(图1A-C)。哈莫特霍(波利查塔,安妮利达)样本也在米萨基海洋生物站附近采集。它们是长约1.5厘米的细长蠕虫,整个身体都存在坚韧的沙塔(图1D)。第13次JAMBIO海岸生物联合调查期间,在筑波大学Shimoda海洋研究中心附近采集了一个Xenoturbella japonica35(西诺韦利达,西纳科洛莫卡)标本。它是一种软体蠕虫,长约0.8厘米(图1E)。详细说明了对每个样品的条件和配置所做的调整。我们的研究就如何对海洋无脊椎动物进行微CT成像提供了几点建议,我们希望这将激励生物学家利用这个方案进行研究。

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Protocol

1. 固定

  1. 对于Actinia equina,在室温下,在10%MgCl2海水中放松动物约15分钟。转移到70%乙醇,并在室温下储存。
  2. 对于Harmothoe sp.,通过在冰冷的海水中放置动物进行约15分钟的麻醉,将10%(v/v)正式溶液与海水一起转移到,并在室温下储存。
  3. 对于异位肌醇酶,在淡水中使用7%的MgCl2来放松动物。在过滤的海水中过夜4%的甲醛(PFA)。放入70%乙醇,储存在4°C。
    注意:PFA 是危险的,必须小心处理。

2. 染色

  1. 将样品转移到50%乙醇,在室温下储存15小时,用25%乙醇代替50%乙醇,在室温下储存2小时。
    注:对于使用海水的 10% (v/v) 形式溶液中的Harmothoe sp. 样品,这是不必要的。
  2. 用蒸馏水 (DW) 替换溶液,并将样品在室温下储存 2 小时。重复此步骤三次。
  3. 使用 DW 将库存溶液(下图)稀释至 25%,制备 25% Lugol 溶液。库存溶液(100%Lugol溶液)含有10克KI和5克I 2,经DW调整至100mL。
    注:Lugol 解决方案是感光的,因此可以存储和处理防光解决方案。遵守各国和机构关于碘处理和废物处理的规定。
  4. 从样品中抽取 DW,并倒入 25% 的 Lugol 溶液中。在室温下染色24小时。

3. 舞台安装

  1. 在微波炉(800 W,约1-3分钟)的250 mL锥形烧瓶中溶解500毫克甘蔗,在100 mL的DW中溶解0.5%的甘蔗。保持室温可冷却至约30-40°C。
    注意:加热时不要过热或完全密封烧瓶,以防止胶着沸腾。
  2. 使用 50 mL 管安装大型样品,如A. equina。
    注:使用 50 mL 管安装不适合在 1,000 μL 微吸液器"蓝色"尖端中的大样品。
    1. 将染色样品放入带有 DW 的 60 毫米盘中,以从表面冲洗过多的染色溶液。
    2. 将 5 mL 的 0.5% 甘蔗放入 50 mL 管中,在冰上硬化角质。小心不要在蔗因中产生气泡。
    3. 轻轻地将20 mL的0.5%角质甘蔗加入50 mL管中,放在冰上,直到角质开始变硬。使用钳子将试样放在 0.5% 的甘蔗内。小心不要在蔗因中产生气泡。
    4. 用钳子调整样品的位置和方向,在冰上硬化角质。
    5. 将粘土放在微CT安装台上,并将50 mL管设置在粘土上(图2A)。
  3. 使用 1,000 μL 微吸液器"蓝色"尖端安装小样品,如Harmothoe sp. 和 X. japonica。
    注:对于较小的样品,可以使用200 μL微移液器"黄色"尖端。在这种情况下,使用30μL的甘蔗为插头,并添加200μL的甘蔗或蒸馏水。
    1. 将 100 μL 的 0.5% 角胶放入 1,000 μL 微管液器"蓝色"尖端中,通过将吸头举过冰,使尖端插入插头(图 2B-a),使角质硬化角质。
    2. 将染色样品放入 60 毫米的盘中,无需使用钳子。
    3. 使用环钳将样品轻轻转移到另一个带 DW 的 60 毫米盘中,以从表面冲洗过量的染色溶液。
    4. 使用微移液器将 1,000 μL 的 0.5% 角胶或 DW 添加到插入的尖端(步骤 3.3.1)。
      注意:建议使用0.5%的甘蔗,但使用DW用于应避免使用甘蔗的易碎或珍贵样品。
    5. 使用环钳将样品从 60 mm 盘中轻轻地转移到插入插头的尖端的角玫瑰或 DW 中。
    6. 用细尖针或精密钳子轻轻调整样品的位置和方向。小心不要在安装介质中产生气泡。当 DW 用作安装介质时,确保样品在尖端壁之间保持稳定(图 2D-b)。将尖端放在冰上,如果用作安装介质,则将其硬化。
    7. 切断新的 1,000 μL 微吸管"蓝色"尖端(图 2B-b,c),并将插入的尖端插入新尖端。
    8. 将粘土放在微CT安装台上,并将样品放在粘土上,并将吸头放在粘土上(图2C,D)。
      注:一旦样品放入DW中,染色溶液将开始洗掉样品,因此请立即执行下一个扫描步骤。

4. 微CT扫描

  1. 以 80 kV、100 μA 打开 X 射线光束。
  2. 在观察屏幕中心的 X 射线传输图像(图 3A)时,移动舞台,以便通过单击X和Z 轴按钮(图 3A)并手动查看整个样本调整安装台上的 Y 轴旋钮 (图 3B)。设置图像的对比度,以便通过调整对比度条件来观察内部结构(图 3A:图像对比度)。
  3. 通过改变粘土中的管/尖的角度来调整样品的方向(图2A)。通过将旋转轴(图 3A) 设置为 90 并单击相对移动按钮(图 3A)来旋转舞台 90°。执行相同的操作四次以完成完全旋转。
    注:每次打开样品门时,手动关闭 X 射线光束,除非系统自动将其关闭。
  4. 通过单击Z 轴按钮(图 3A)和手动调整安装台上的 Y 轴旋钮(图 3B),移动舞台,使样本位于视图的中心。将舞台转动 90°,然后执行相同的操作。转动舞台 360°,从各个方向检查样品是否位于视图的中心。
  5. 通过单击X 轴按钮(图 3A)将舞台沿 X 轴向 X 射线光束源移动,以放大样本并根据需要进行调整,使其正好适合视图(图3C)。
  6. 转动舞台 360°并根据需要进行调整,使样品适合从各个方向查看。
  7. 调整扫描条件,如表1所示。
  8. 开始扫描;大约需要10分钟。

5. 图像重建

  1. 启动 microCT 系统的附件软件(参见材料表)并打开扫描的数据。
  2. 在扫描过程中,通过单击自动移位值计算按钮(图 4A: 绿色框)调整样本旋转轴的差异。
  3. 通过旋转橙色箭头来调整图像的方向 (图 4B)。如果方向已更改,请重复步骤 5.2。
  4. 单击区域选项卡(图4C:洋红色框)和修剪不存在样品的区域(图 4C:黄色框)。
  5. 单击重新配置选项卡(图4D: 品红色框),然后按如下方式设置滤波器以消除噪音。环伪影减少滤波器:中值滤波器-3;噪声消除滤波器:平均滤波器-1。
  6. 单击重新配置按钮(图 4D:绿色框)执行重新配置。
  7. 通过将黑白值设置为黑色值 0、白色值 250(图 4D:蓝色框)来调整图像亮度和对比度。
  8. 单击保存按钮,将重建的 TIFF 图像数据集另存为 8 位 TIFF。将 TIFF 文件重命名为:Date_sample_分辨率 (μm)_数字.tiff。
    注:本研究的原始微CT数据集可在Figshare存储库中查阅,doi:10.6084/m9.figshare.767083736。

6. 数据分析

  1. 启动数据分析软件(参见材料表),并通过单击数据库图标(图5A:洋红色框)并关闭图5B所示的框来启用TIFF文件的导入。
  2. 单击导入图标(图5C:洋红色框),选择保存在第 5 节中的数据集,然后单击"打开"。
  3. 单击复制链接按钮 (图 5D) 导入数据。
  4. 通过单击2D 查看器图标(图 5C: 蓝色框)显示 2D 横截面。
  5. 通过单击3D 查看器选项卡(图 5E: 洋红色框)并在扫描时输入分辨率值(本研究中为 0.018 =图 5F+)来校准数据集。
  6. 单击亮度/对比度图标(图5E绿色框)。通过在显示的 2D 图像内移动光标并更改窗口级别和窗口宽度来调整亮度和对比度(图 5G)。
  7. 通过移动滚动条(图 5G:框)检查其他横截面图像。
  8. 通过单击方向图标(图 5E: 蓝色框)更改横截面的方向,并检查所有方向的图像(图5H)。
  9. 单击显示的图像,然后选择导出选项卡来存储横截面图像。

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Representative Results

在用25%的卢戈尔溶液染色样品后,我们对A.equina(安索佐亚、尼尼达)、哈莫特霍(波利查塔、安妮利达)和X.japonica(西诺韦利达,西纳科洛莫卡)进行了微CT成像。 染色成功地增强了所有标本内部结构的对比度,从而能够观察内部软组织(图6)。连同过去的报告6,7,16,19,22,23,24,25,26,28,30,31,32,33,这表明微CT可用于各种海洋无脊椎动物的形态,包括软内部组织。即使X.japonica标本,其表皮严重受损(图6F,G),也获得清晰的图像,表明该方法适用于具有外部损伤的易碎标本。

扫描仅感兴趣区域,与较宽的区域相比,大大提高了图像的清晰度和分辨率(相比之下图 6F和图 6G)。但是,从不同(但重叠)上执行的多次扫描为Harmothoe sp.(图 6C) 和X. japonica (图 6F)重建了整个样本的单个高分辨率数据集标本的一部分。每次扫描之间的接缝在重建的图像中不显眼。研究表明,单高分辨率图像可以通过锥束微CT系统获得。通过以高分辨率扫描更大的区域,可以较小的风险来俯瞰小结构。另一个优点是,更容易找到相距甚远的结构的相对位置,例如长长的安妮利的前和后尖。

Figure 1
图 1:在这项研究中观察到的海洋无脊椎动物。(A-C)阿蒂尼亚·埃奎纳(安索佐亚,尼达里亚)。(A) 活体动物的远端在 10% MgCl2海水中放松。远 (B) 和近端 (C) 在固定在 70% 乙醇后结束.(D) 活体麻醉哈莫特霍(波利查塔,安妮利达),背观与前在左边。目前,大部分埃利特拉人已经失踪,只剩下四个在后端附近。(E)西诺图贝拉贾波尼卡(西诺韦里达, 西纳科洛莫法) 固定在 70% 乙醇中.右视图,前到顶部。由于收集的情况,它的表皮开始脱落。比例尺 = 3 mm。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 2
图 2:在微聚焦X射线计算机断层扫描系统上安装样品。(A) 使用粘土在 50 mL 管中安装样品。样品的方向可以使用粘土进行调整。(B) 制备 1,000 μL 微移液器"蓝色"尖端,用于安装小样品。a: 尖端,其末端插入100 μL 0.5%的角玫瑰(对角线)。样品被放置在这个提示中。样品的尖端入另一个 1 , 000 μL微管器蓝色尖端 ( b , c ) 进行安装。b 用于Xenoturbella japonica,c 用于哈莫特霍sp. (C) 安装X. japonica样品, 概述 (左) 和特写 (右).X 射线源可以在样品的右侧看到。(D) 用于在 1,000 μL 微移液器"蓝色"尖端安装样品的示意图。a: 蒸馏水中的X.贾波尼卡样品。b:样品与尖端壁(箭头)接触,因此在扫描时不会移动。c: Harmothoe sp. 样品在 0.5% 甘蔗素中。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 3
图 3:在微聚焦X射线计算机断层扫描系统上扫描样本。(A) 在扫描微焦 X 射线计算机断层扫描系统时操作屏幕,显示Actinia equina试样 X 射线传输图像。使用左下角的"图像对比度"调整对比度和亮度。(B) 显示 Y 轴旋钮的安装阶段视图。(C) 安装阶段移近X射线光束源后,A.equina试样的X射线传输图像。 请注意,与 (A) 中心的图像相比,它放大了。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 4
图 4:图像重建系统的操作屏幕。(A) 用于在扫描过程中调整样品旋转轴的差异的屏幕,显示Actinia equina试样。品红色框:移位选项卡;绿色框:自动移位值计算按钮。(B) 用于调整图像方向的屏幕,并显示Harmothoe sp.(C) 在A. equina的图像重建过程中进行屏幕,修剪黄色框外没有样品的区域。品红色框:区域选项卡 (D) 图像重建期间的屏幕,显示A. equina的重建图像。品红色框:重新配置选项卡;绿色框:重新配置按钮;蓝色框:黑白值调整。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 5
图 5:图像分析系统的操作屏幕。(A) 首选项窗口.单击数据库图标(洋红色圆圈)以打开数据库文件管理窗口。(B) 数据库文件管理窗口.在此软件中,使用箭头显示的框需要关闭以启用导入 TIFF 文件。(C) 数据库屏幕的菜单和工具栏。品红色框 = 导入图标;蓝色框 = 2D 查看器图标。(D) 数据集导入窗口。品红色圆圈 = 复制链接按钮。(E) 2D 查看器屏幕的菜单和工具栏。品红色框 = 3D 查看器选项卡;绿色框 = 亮度/对比度图标;蓝色框 = 方向图标。(F) 校准设置窗口。在洋红色框中的列中输入所需的分辨率值。(G) 在 2D 查看器窗口中显示的Actinia equina样本的横截面,用于调整亮度和对比度。品红色框:用于检查其他横截面的滚动条。(H) 在 2D 查看器窗口中显示的A. equina的横截面,其方向与 (G) 不同。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 6
图 6:扫描和重建海洋无脊椎动物的图像。(A) Actinia equina的横向和 (B) 纵向部分。(B) 中的虚线黄色框内的区域在内窥中放大。缩写:dm,一对指令性符号;m,一对完美的美人;mf, 美肠灯丝;p, 咽部;si, 虹吸诗;t, 触手;箭头,口腔圆盘;白色箭头,踏板盘;黑色箭头,括约肌。比例为 A、 B = 3 mm. (C-E)哈莫特霍(C ) 前部分的射手部分。(D, E)虚线 d 和 e 在 (C) 处的横向部分。缩写:aci = aciculum;acim = 眼部肌肉;coe = coelom;dlm = 背纵向肌肉;埃尔普 = 人流;眼睛 + 眼睛;内脏 = 肠;钳口 = 钳口;曼特 = 中位天线;莫 = 嘴;mp = 前体肌肉;触觉 = 触觉;pha = 咽部;prob = 前体;vlm = 腹腔纵向肌肉;vnc = 腹腔神经线。刻度条:C = 1 mm;D, E = 0.3 毫米 (F, G) Xenoturbella japonica. .(F) 整个样品的射手部分.(G) 前部分的射手部分.bl = 基底拉米纳;内脏 = 肠;ml = 肌肉层;莫 = 嘴;nn = 皮内神经网;白色箭头 = 停滞;黑色箭头 = 前孔;白色箭头 = 腹腔体网络;黑色箭头 = 卵母细胞。刻度条:F = 1 mm,G = 0.5 mm。请点击此处查看此图的较大版本。

Table 1
表1:每个试样样品制备和扫描方案。

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Discussion

使用形式辛的固定剂,如本研究中使用的海水中的10%(v/v)形式化溶液,已知能保存各种海洋无脊椎动物的形态,并常用于微CT成像18、24、25 ,26,28,30,33.然而,近年来,一些国家对使用这种化学品的限制变得严格,可以使用甲醛或谷醛等替代品。如果有在扫描后提取DNA的计划,最好避免使用形式化作为固定剂,因为它已知会分裂DNA。在这种情况下,建议使用固定剂,以保存DNA,如70%乙醇。在这项研究中,使用70%乙醇固定了cnidarian A.equina,并从70%乙醇固定样品中获得了清晰的微CT图像(图6A,B)。

在先前对各种单核分类进行微CT扫描的研究中,许多样品在100%乙醇中脱水,有些在扫描24前是临界点干燥。虽然在研究中成功地观察到了软内器官,如触角簇、肌肉和风角,但已知脱水和干燥过程会导致软组织变形和收缩等主要人工制品11,21.在本研究中,我们能够观察到固定在70%乙醇和染色25%Lugol溶液(图6A,B)的cnidarian A.equina的内部结构。我们的方案,没有任何脱水或干燥步骤,是可取的,应尽可能执行,以减少在扫描过程中损坏标本和文物的风险。

Lugol 溶液、碘溶液和磷酸 (PTA) 是通常在微CT成像6、7、9、14、16中生物样品中使用的染色溶液。 17,20,26,27,38。根据我们使用各种生物样品的经验,Lugol 解决方案为许多样品提供了最佳结果,在相对短的时间内进行深色染色。碘溶液只产生非常弱的污渍,PTA需要很长时间才能充分染色,染色的标本表现出强烈的收缩。因此,在这项研究中,所有标本都沾上了卢戈尔溶液。然而,虽然推荐使用 Lugol 溶液,但适当的染色溶液在试样之间有所不同,我们建议在有足够的试样时使用其他染色溶液进行试验。无论染色溶液如何,样品在染色37、38过程中会收缩,因此保持染色时间缩短非常重要。

微CT扫描的一个关键步骤是安装样品,以防止其移动。在这项研究中,这分两个步骤进行,首先使用甘蔗作为直接安装介质,然后用粘土将含有样品的管子安装到舞台上。第一步,在以前的研究中使用了各种低密度安装介质,包括乙醇6、17、20、25、30、甘蔗9、29,和花泡沫15,22,31 。阿加玫瑰是在这项研究中被选中的,因为它是一种低成本的化学物质,可以在全世界使用。Agarose 的缺点是,在扫描后可能很难从硬化的角贺玫瑰中检索样品,但使用低熔点角甘蔗使检索步骤更容易。对于第二步,钳口夹或螺钉经常使用6,9,17。在本研究中选择粘土,因为它能够对样品的方向和角度进行精细调整。对于扫描时间长的实验,需要谨慎,因为使用粘土而不是钳口夹或螺钉时,样品移动的可能性更高。

先前的研究对7个体长为2-8毫米的多聚体进行了微CT扫描,比本研究中使用的Harmothoe sp.小。他们能够生成高分辨率的图像,并显示器官,如血管系统和个别的蔡塔比本研究更清晰。造成这种差异的主要原因不是协议,而是所使用的微CT系统的规格。前一项研究中使用的系统配备了一个1100万像素的电荷耦合设备摄像头(4000 x 2672像素),最大分辨率为<0.8 μm/像素16。本研究中使用的系统活动图像矩阵大小为992 x 992像素,最大分辨率为>5 μm/像素。因此,本研究中使用的微CT系统的空间分辨率低于Faulwetter等人16中使用的高性能微CT系统。当扫描小于 8 mm 的样本时,这种差异尤其明显,在扫描样本时,我们遇到分辨率不足(未显示数据)。然而,由于在这项研究中扫描过程中获得的数据较少,扫描时间比以前的研究16短得多(数据:分别为992 x 992和4000 x 2672像素;扫描时间:10至26分钟和30分钟到几个小时,分别)。短的扫描时间减少了碘染色的变色,允许使用Lugol溶液,这是一个很好的染色溶液,渗透率高,但很容易在DW34中扩散。扫描时间短也降低了样品在扫描过程中移动的可能性,这使得使用Agarose或DW的简单安装方法成为可能(图2)。扫描时间越长,图像中可能样品收缩模糊的缺点也大为不同。在长时间扫描期间可能出现的其他一些机械和硬件问题也已经报告39。因此,在使用微CT系统时,必须准确理解每个系统的规格,并在试样尺寸或研究目标方面选择正确的系统。在某些情况下,低分辨率的微CT系统可能就足够了。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

我们要感谢石破茂在研究期间给予的帮助和提供的研究环境。我们感谢Yanagi和TakatoIzumi就A.equina和Masaatsu Tanaka提供关于Harmothoe sp.标本的建议。我们要感谢筑波大学石田海洋研究中心和东京大学三崎海洋生物站的工作人员在样品采集方面的帮助。我们要感谢编辑(www.editage.jp)的英语语言编辑。这项工作得到了日本青年科学家援助资助组织(JP26711022)和日本海洋生物协会JAMBIO的支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
250-ml Erlenmeyer flask Corning CLS430183
5-ml Sampling tube ST-500 BIO-BIK 103010
50-ml Polypropylene tube Greiner Bio One International 227261
60-mm Non-treated Dish IWAKI 1010-060
Agarose Promega V3125
Ecological grade tip (blue) 1000 µl BMBio BIO1000RF
Ethanol Wako Pure Chemical Industries 057-00451
Formalin Wako Pure Chemical Industries 061-00416
Iodine Wako Pure Chemical Industries 094-05421
Magnesium chloride hexahydrate Wako Pure Chemical Industries 135-00165
OsiriX DICOM Viewer Pixmeo SARL OsiriX MD v10.0 https://www.osirix-viewer.com
Paraformaldehyde Wako Pure Chemical Industries 163-25983
Petiolate needle AS ONE 2-013-01
Pipetman P200 Micropipette GILSON F123601
Pipetman P1000 Micropipette GILSON F123602
Potassium iodide Wako Pure Chemical Industries 166-03971
Precision tweezers 5 DUMONT 0302-5-PS
QuickRack MultI fit tip (yellow) 200 ul Sorenson 10660
Razor blades Feather FA-10
Ring tweezers NAPOX A-26
Stereoscopic microscope Leica MZ95
X-ray Micro-CT imaging system Comscantechno ScanXmate-E090S105

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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环境科学 问题 150 微CT 卢戈尔溶液 碘,阿斯蒂尼亚 克尼达里亚,哈莫特霍,安妮利达,西诺图贝拉,西纳科洛莫塔 无脊椎动物
微聚焦 X 射线 CT (微CT) 阿克<em>蒂尼亚 equina</em> (Cnidaria),<em>哈莫特霍</em>sp. (安妮利达) 和<em>Xenoturbella japonica</em> (西纳科洛莫卡) 成像
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Maeno, A., Kohtsuka, H., Takatani,… More

Maeno, A., Kohtsuka, H., Takatani, K., Nakano, H. Microfocus X-ray CT (microCT) Imaging of Actinia equina (Cnidaria), Harmothoe sp. (Annelida), and Xenoturbella japonica (Xenacoelomorpha). J. Vis. Exp. (150), e59161, doi:10.3791/59161 (2019).

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