Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Actinia equina (cnidaria), harmothoe Sp. (Annelida) ve xenoturbella japonica (xenacoelomorpha) Microfocus X-Ray CT (MicroCT) görüntüleme

Published: August 6, 2019 doi: 10.3791/59161
Automatic Translation
1, 2, 3, 3
1Mammalian Genetics Laboratory, National Institute of Genetics, 2Misaki Marine Biological Station, The University of Tokyo, 3Shimoda Marine Research Center, University of Tsukuba

Summary

Burada, üç deniz omurgasız hayvanın microfocus X-ışını bilgisayarlı tomografi (microCT) görüntülenmesi için protokoller ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Bu çalışmada örnek fiktasyon, boyama, montaj, tarama, görüntü yeniden yapılanma ve veri analizleri gibi adımlar açıklanmaktadır. Protokolün farklı örnekler için nasıl ayarlanacağı konusunda öneriler de sağlanmıştır.

Abstract

Geleneksel olarak, biyologlar opak organizmaların iç yapılarını araştırmak için kesitleme gibi yıkıcı yöntemlerle güvenmek zorunda kaldılar. Tahribatsız microfocus X-Ray bilgisayarlı tomografi (microCT) görüntüleme, Mikroct donanımında örnek boyama yöntemleri ve yenilikleri, bilgisayar işleme ve veri teknolojisinde teknolojik gelişmeler nedeniyle biyoloji alanında güçlü ve gelişmekte olan bir protokol haline gelmiştir. analiz yazılımı. Ancak, bu protokol yaygın olarak kullanılmaz, tıbbi ve endüstriyel alanlarda olduğu gibi. Bu sınırlı kullanım nedenlerinden biri, tüm gerekli adımları kapsayan basit ve anlaşılabilir bir manuel eksikliği: örnek toplama, sabitleme, boyama, montaj, tarama, ve veri analizleri. Başka bir nedeni de metazoanların geniş çeşitliliği, özellikle deniz omurgasızlar. Deniz omurgasızlar ' farklı boyutlarda, morfolojiler ve fizyolojik nedeniyle, örnek bağlı olarak, her adımda deneysel koşullar ve donanım yapılandırmaları ayarlamak için çok önemlidir. Burada, microCT görüntüleme yöntemleri üç filogenetik olarak çeşitli deniz omurgasızlar kullanarak ayrıntılı olarak açıklanmıştır: Actinia equina (anthozoa, Cnidaria), harmothoe Sp. (Polychaeta, annelida), ve xenoturbella japonica ( Xenoturbellida, Xenacoelomorpha). Çeşitli hayvanlarda microCT görüntülemenin gerçekleştirilmesi konusunda öneriler de sağlanmaktadır.

Introduction

Biyolojik araştırmacılar genellikle ince bölümler yapmak ve opak organizmaların iç yapılarını araştırmak için ışık veya elektron mikroskobu ile gözlem yapmak zorunda kaldılar. Ancak bu yöntemler nadir veya değerli örneklere uygulandığında yıkıcı ve sorunlu olmaktadır. Ayrıca, katıştırma ve bölümleme gibi yöntemdeki birkaç adım zaman alıcı ve protokole bağlı olarak bir örnek gözlemlemek için birkaç gün sürebilir. Dahası, çok sayıda bölümlerin işlenirken, her zaman zarar veya bazı bölümler kaybetme olasılığı vardır. Doku Temizleme teknikleri bazı numuneler için kullanılabilir1,2,3,4,5 ama henüz birçok hayvan türleri için geçerli değildir.

Bu sorunların üstesinden gelmek için bazı biyologlar microfocus X-Ray bilgisayarlı tomografi (MicroCT) görüntüleme6,7,8,9,10,11, kullanarak başladı 12,13,14,15. X-Ray CT 'de, numunenin etrafında hareket eden bir X-ışını kaynağından oluşturulan çeşitli açılardan X-ışınları ile radyasyon ışınlanmış ve iletilen X-ışınları da örnek etrafında hareket eden bir dedektör tarafından izlenir. Elde edilen X-ışını iletim verisi, numunenin çapraz kesit görüntülerini yeniden inşa etmek için analiz edilir. Bu yöntem, örnek imha olmadan iç yapıları gözlem sağlar. Onun güvenliği ve kolaylığı nedeniyle, yaygın tıbbi ve diş uygulamalarında kullanılır, ve CT sistemleri hastane ve diş merkezlerinde dünya çapında bulunabilir. Ayrıca endüstriyel X-Ray CT, endüstriyel alanda muayene ve Metroloji için tıbbi olmayan numuneleri gözlemlemek için sıklıkla kullanılır. X-Ray kaynağının ve dedektörlerin mobil olduğu tıbbi CT 'nin aksine, iki parça endüstriyel CT 'de sabitlenir, örneğin tarama sırasında döner. Endüstriyel CT genellikle tıbbi CT 'den daha yüksek çözünürlüklü görüntüler üretir ve microCT (mikrometre düzeyinde çözünürlük) veya Naneki (nanometre seviyesi çözünürlüğü) olarak adlandırılır. Son zamanlarda, mikroct kullanarak araştırma hızla biyoloji çeşitli alanlarda arttı14,15,16,17,18,19, 20 tane , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 ' dan fazla , 31 , 32 , 33 , 34.

CT kullanan biyolojik çalışmalar, esas olarak kemik gibi sert dokudan oluşan iç yapıları hedefleyen. Çeşitli kimyasal maddeleri kullanarak boyama tekniklerindeki gelişmeler çeşitli organizmalarda yumuşak dokularda görselleştirmeyi sağladı6,7,8,9,14,15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 tane , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 ' dan fazla , 31 , 32 , 33 , 34. bu reaktiflerin, iyot bazlı kontrast maddeleri nispeten güvenli, ucuz ve çeşitli organizmalarda yumuşak dokularda görselleştirme için kullanılabilir7,14. Deniz omurgasızlar ile ilgili olarak, MicroCT yaygın olarak yumuşakçalar gibi hayvanlar üzerinde kullanılmıştır6,25,32,33, annelids18,19, 20 tane , 28ve arthoropods21,23,29,31. Ancak, diğer hayvan phyla hakkında birkaç rapor olmuştur, bryozoalar6gibi, xenacoelomorphs26, ve cnidarians24,30. Genel olarak, Mikroct kullanarak daha az çalışma olmuştur deniz omurgasızlar üzerinde bu omurgalarından daha. Deniz omurgasızlar bu sınırlı kullanım için büyük bir nedeni bu hayvanların gözlenen büyük çeşitlilik olduğunu. Çeşitli boyutları, morfolojileri ve fizyolojik nedeniyle, her tür farklı deneysel prosedürler için değişik tepki verir. Bu nedenle, en uygun sabitleme ve boyama reakajını seçmek için numune hazırlama sırasında ve her tür için ayarlanan her adımda koşulları ayarlamak için çok önemlidir. Benzer şekilde, her örnek için uygun şekilde montaj yöntemi, voltaj, akım, mekanik Büyüteç hızı ve boşluk çözünürlüğü gücü gibi tarama konfigürasyonlarını ayarlamak da gereklidir. Bu sorunun üstesinden gelmek için, gerekli tüm adımları kapsayan basit ve anlaşılabilir bir manuel, her bir adımın örneğe bağlı olarak nasıl ayarlanacağını açıklıyor ve birden fazla örnekten ayrıntılı örnekler esastır.

Bu çalışmada, üç deniz omurgasız türler kullanarak numune sabitleme veri analizinden, Mikroct görüntüleme Protokolü adım adım açıklanmaktadır. Deniz anemon Actinia equina (anthozoa, Cnidaria) örnekleri Tokyo Üniversitesi Misaki deniz biyolojik İstasyonu yakınında toplandı. Bunlar yaklaşık 2 cm çapında (Şekil 1a-C) küresel, yumuşak bir gövdeye sahipti. Harmothoe Sp. (Polychaeta, annelida) örnekleri de Misaki Marine biyolojik İstasyonu yakınında toplandı. Onlar yaklaşık 1,5 cm uzunluğunda olan ince solucanlar vardı, sert chaetae tüm vücut boyunca mevcut ile (Şekil 1D). A Xenoturbella japonica35 (Xenoturbellida, Xenacoelomorpha) NUMUNESI, 13. Jambıo kıyı organizması ortak araştırması sırasında Tsukuba Üniversitesi Shimoda deniz araştırma merkezi yakınlarında toplandı. Bu yaklaşık 0,8 cm uzunluğunda bir yumuşak gövdeli solucan oldu (Şekil 1E). Her numunenin koşullar ve konfigürasyonları için yapılan ayarlamalar ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Bizim çalışma nasıl deniz omurgasızlar üzerinde microCT görüntüleme gerçekleştirmek için çeşitli öneriler sağlar, ve biz onun araştırma için bu protokol kullanmak için biyologlar ilham olacağını umuyoruz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. sabitleme

  1. Actinia equinaiçin, oda sıcaklığında yaklaşık 15 dakika için% 10 MgCl2 deniz suyu içinde hayvanları rahatlayın. Transfer 70% etanol ve oda sıcaklığında mağaza.
  2. Harmothoe SP için, yaklaşık 15 dakika boyunca buz-soğuk deniz suyuna yerleştirerek hayvanları anestezize. deniz suyuyla% 10 (v/v) formalin çözeltisi ile Oda sıcaklığında saklayın.
  3. Xenoturbella japonicaiçin, tatlısu içinde% 7 MgCl2 kullanarak hayvanı rahatlayın. Filtrelenmiş deniz suyunda% 4 civarında formaldehite (PFA) bir gecede düzeltin. 4 °C% 70 etanol ve mağaza yerleştirin.
    DIKKAT: PFA tehlikelidir ve dikkatle ele alınmalıdır.

2. boyama

  1. Örnekleri transfer% 50 Etanol ve oda sıcaklığında mağaza için 15 h.% 25 etanol ile% 50 Etanol ve oda sıcaklığında 2 h için mağaza değiştirin.
    Not: Bu, Harmothoe Sp. numune için deniz suyu ile% 10 (v/v) formalin çözeltisi için gerekli değildir.
  2. Solüsyonu distile su (DW) ile değiştirin ve DW 'deki numuneleri 2 saat boyunca oda sıcaklığında saklayın. bu adımı üç kez tekrarlayın.
  3. Hazırlama 25% Lugol çözüm (aşağıda)% 25 DW ile stok solüsyonu seyreltilerek. Stok çözümü (100% Lugol solüsyonu), DW ile 100 mL 'ye ayarlanmış 10 g ı ve 5 g ı2içerir.
    Not: Lugol solüsyonu ışığa duyarlıdır, bu nedenle ışıktan korunan çözümü saklayın ve ele alın. İyot elleçleme ve atık imha için her ülke ve kurum yönetmeliklerine uyun.
  4. DW örneklerden decant ve% 25 Lugol çözüm dökün. Oda sıcaklığında 24 saat için leke.

3. aşama montajı

  1. Hazırlamak 0,5% agaroz tarafından çözülerek 500 mg agaroz içinde 100 ml DW bir mikrodalga içinde bir 250 ml konik Flask (800 W, yaklaşık 1-3 dk). Oda sıcaklığında tutarak yaklaşık 30-40 °C ' ye kadar serin.
    Dikkat: agaroz 'nin kaynatılmasına engel olmak için ısıtırken Flask 'ın aşırı ısınması veya tamamen mühürlenmesi gerekmez.
  2. 50 mL tüp kullanarak a. equina gibi büyük örnekleri bağlayın.
    Not: 50 mL tüpler, bir 1.000 μL micropipet ' mavi ' ucu sığmayan büyük örnekleri montaj için kullanın.
    1. Yüzeyden aşırı boyama çözeltisi yıkamak için DW ile bir 60-mm çanak lekeli örnek yerleştirin.
    2. Hafifçe 50 ml tüp içine% 0,5 agaroz 5 ml dökün ve buzda agaroz sertleşmesine. Agarose kabarcıkları yapmak için dikkatli olun.
    3. Yavaşça 50 ml tüp için 0,5% agaroz 20 ml ekleyin ve agaroz sertleşmeye başlar kadar buz üzerine yerleştirin. Numuneyi forseps kullanarak% 0,5 agaroz içine yerleştirin. Agarose kabarcıkları yapmak için dikkatli olun.
    4. Numunenin konumunu ve yönünü forseps ile ayarlayın ve buzda agaroz 'ı sertleştir.
    5. Mikroct montaj aşamasında kil yerleştirin ve kil üzerinde 50 mL tüp ayarlayın (Şekil 2A).
  3. 1.000 μL micropipet ' Blue ' ucu kullanarak Harmothoe Sp. ve X. japonica gibi küçük örnekleri monte edin.
    Not: küçük örnekler Için 200 μL mikropipet ' sarı ' ucu kullanılabilir. Bu durumda, fiş için 30 μL agaroz kullanın ve 200 μL agaroz veya distile su ekleyin.
    1. 1.000 μL micropipet ' Blue ' ucuyla% 0,5 agaroz 100 μL çekin ve ucu buz üzerine tutarak agaroz 'i sertleştir (Şekil 2B-a).
    2. Forseps kullanmadan bir 60-mm çanak içine lekeli numune decant.
    3. Hafifçe yüzey dan aşırı boyama solüsyonu yıkamak için DW ile başka bir 60-mm çanak içine halka Cımbız kullanarak örnek aktarın.
    4. 0,5% agaroz ya da DW 1.000 μL, bir mikropipet kullanarak takılı ucu (adım 3.3.1) içine ekleyin.
      Not:% 0,5 agaroz kullanımı önerilir, ancak agaroz kaçınılmalıdır kırılgan veya değerli örnekler için DW kullanın.
    5. Örnek olarak 60-mm çanak gelen numuneyi, halka Cımbız kullanarak takılı ucunun agaroz veya DW 'ye hafifçe aktarın.
    6. Numunenin konumunu ve yönünü, petiolat iğne veya hassas cımbız ile nazikçe ayarlayın. Montaj ortamında kabarcıklar yapmak için dikkatli olun. DW montaj ortamı olarak kullanıldığında, numunenin ucunun duvarları arasında kararlı olduğundan emin olun (Şekil 2D-b). Montaj ortamı olarak kullanılırsa agaroz 'ı Sertleşmek için ucu buzun üzerine yerleştirin.
    7. Yeni 1.000 μL micropipet ' Blue ' ucu (Şekil 2b-b, c) ve takılı ucunun ucunu yeni ucun içine takın.
    8. Mikroct montaj aşamasında kil yerleştirin ve kil (Şekil 2C, D) içinde numune ile ipuçları ayarlayın.
      Not: boyama çözümü DW yerleştirilir kez örnek yıkamak başlar, bu yüzden hemen bir sonraki tarama adıma geçin.

4. MicroCT tarama

  1. 80 kV, 100 μA cinsinden X-ışını ışını açın.
  2. Ekran merkezinde X-ışını iletim görüntüsünü gözlemlerken (Şekil 3a), tüm numunenin x ve Z ekseni düğmelerini (Şekil 3a) tıklayarak görülebilmesi için sahne alanı hareket ettirin ve el ile montaj aşamasında Y ekseni düğmesini ayarlayın (Şekil 3B). Kontrast koşullarını ayarlayarak iç yapıların izlenebilmek için görüntünün karşıtlığını ayarlayın (Şekil 3A: görüntü kontrastı).
  3. Kil içindeki tüp/uç açısını değiştirerek numunenin yönünü ayarlayın (Şekil 2a). Rotasyon eksenini (Şekil 3a) 90 ve göreli hareket düğmesine tıklayarak aşama 90 ° döndürün (Şekil 3a). Tam rotasyonu tamamlamak için aynı manevrası dört kez gerçekleştirin.
    Not: sistem otomatik olarak kapatmadığı sürece, örnek kapı her açıldığında X ışını ışınını El Ile kapatın.
  4. Örnek, Z ekseni düğmesine (Şekil 3A) tıklayarak ve montaj aşamasında Y ekseni düğmesini elle ayarlayarak (Şekil 3B) görünümün ortasında olması için aşamayı taşıyın. 90 ° tarafından sahne çevirin ve aynı şeyi. Aşama 360 ° çevirin ve örnek tüm yönlerden görünümün merkezinde olup olmadığını kontrol edin.
  5. X ekseninin üzerine doğru x ekseni düğmesine tıklayarak (Şekil 3A), numuneyi büyütmek ve sadece görünüme sığar (Şekil 3C) için gerektiği gibi ayarlamak için sahne alanı 'nı x-ışın ışını kaynağına yöneltir.
  6. Aşama 360 ° çevirin ve örnek tüm yönlerden görünüme sığar böylece gerektiği gibi ayarlayın.
  7. Tablo 1' de gösterildiği gibi tarama koşullarını ayarlayın.
  8. Taramayı Başlat; yaklaşık 10 dakika sürer.

5. görüntü yeniden yapılanma

  1. MicroCT sisteminin aksesuar yazılımını başlatın ( malzeme tablosunabakın) ve taranan verileri açın.
  2. Otomatik vardiya değeri hesaplama düğmesine tıklayarak tarama sırasında numunenin döndürme eksenindeki farklılıkları ayarlayın (Şekil 4A: yeşil kutu).
  3. Turuncu okları çevirerek görüntünün yönünü ayarlayın (Şekil 4B). Oryantasyon değiştirilmişse, 5,2 adımını yineleyin.
  4. Alan sekmesine tıklayın (Şekil 4c: Macenta kutusu) ve numunelerin mevcut olmadığı alanları kırpın (Şekil 4c: sarı kutu).
  5. Yeniden yapılandırma sekmesine tıklayın (Şekil 4D: kırmızı kutu) ve gürültüyü kaldırmak için filtreleri aşağıdaki gibi ayarlayın. Ring artifakı azaltma filtresi: Median filtre-3; Gürültü eliminasyon filtresi: ortalama filtre-1.
  6. Yeniden yapılandırma düğmesine tıklayarak yeniden yapılandırma gerçekleştirin (Şekil 4D: yeşil kutu).
  7. Siyah ve beyaz değerleri siyah değer 0, beyaz değer 250 (Şekil 4D: mavi kutu) olarak ayarlayarak görüntü parlaklığını ve kontrastı ayarlayın.
  8. Yeniden oluşturulan TIFF görüntü veri kümesini, Kaydet düğmesini tıklatarak 8 bit TIFF olarak kaydedin. TIFF dosyalarını aşağıdaki gibi yeniden adlandırın: Date_sample_resolution (μm) _number. TIFF.
    Not: Bu çalışmada orijinal microCT veri kümeleri Figshare deposunda mevcuttur, doi: 10.6084/M9. figshare. 767083736.

6. veri analizleri

  1. Veri çözümleme yazılımını başlatın ( malzeme tablosunabakın) ve VERITABANı simgesine tıklayarak TIFF dosyalarının alınmasını etkinleştirin (Şekil 5A: kırmızı kutu) ve Şekil 5B'de gösterilen kutuyu kapatın.
  2. İçe aktar simgesine tıklayın (Şekil 5C: kırmızı kutu), Bölüm 5 ' te kaydedilmiş veri kümesini seçin ve Aç'ı tıklatın.
  3. Bağlantıları Kopyala düğmesine tıklayın (Şekil 5D) verileri almak için.
  4. 2B Görüntüleyici simgesine tıklayarak 2D kesit görüntüsünü görüntüleyin (Şekil 5C: mavi kutu).
  5. 3B görüntüleyici sekmesine tıklayarak veri kümesini kalibre edin (Şekil 5E: kırmızı kutu) ve tarama sırasında çözünürlük değerini girerek (Bu çalışmada 0,018 oldu [Şekil 5F]).
  6. Parlaklık/kontrast simgesine tıklayın (Şekil 5E yeşil kutu). İmleci görüntülenen 2B görüntünün içine taşıyarak ve pencere seviyesini ve pencere genişliğini değiştirerek parlaklığı ve kontrastı ayarlayın (Şekil 5G).
  7. Kaydırma çubuğunu taşıyarak diğer kesit görüntülerini kontrol edin (Şekil 5G: kutu).
  8. Oryantasyon simgesine tıklayarak kesit yönünü değiştirin (Şekil 5E: mavi kutu) ve tüm oryantasyonlarda görüntüleri kontrol edin (Şekil 5H).
  9. Görüntülenen görüntüyü tıklatın ve çapraz kesit görüntülerini depolamak için dışa aktarma sekmesini seçin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bir. equina (anthozoa, Cnidaria), harmothoe Sp. (Polychaeta, Annelida) ve X. japonica (Xenoturbellida, xenacoelomorpha) üzerinde% 25 Lugol çözeltisi Ile numuneleri boyayan MicroCT görüntüleme gerçekleştirdik. Boyama, dahili yumuşak dokuların gözlemlerini sağlayarak tüm örneklerde iç yapıların kontrastı başarıyla geliştirildi (Şekil 6). Geçmiş raporlarla birlikte6,7,16,19,22,23,24,25,26 , 28 , 30 ' dan fazla , 31 , 32 , 33, bu mikroct çeşitli deniz omurgasızlar üzerinde yumuşak iç dokular da dahil olmak üzere, morfoloji görselleştirilmesi için kullanılabilir olduğunu gösterir. X. japonica numunesi ile bile epidermis kötü hasar gördü (Şekil 6F, G), bu yöntemin dış hasar ile kırılgan numuneler için geçerli olduğunu gösteren net görüntüler elde edildi.

Sadece ilgi alanı tarama, daha geniş bir alanın aksine, büyük ölçüde görüntünün netlik ve çözünürlüğü arttı (karşılaştırmak Şekil 6F ve Şekil 6G). Ancak, tüm numunenin tek bir yüksek çözünürlüklü veri kümesi harmothoe Sp. (Şekil 6C) ve X. japonica (Şekil 6F) için farklı (ancak çakışan) üzerinde gerçekleştirilen birden fazla taramaların yeniden inşa edildi parçalar. Her tarama arasındaki dikişler yeniden oluşturulmuş görüntülerde göze çarpan değildi. Çalışma, tek yüksek çözünürlüklü görüntülerin koni ışınlı microCT sistemleri ile elde edilebilir gösterir. Yüksek çözünürlükte daha büyük bir alanı tarayarak, küçük yapılara bakan daha küçük bir risk vardır. Diğer bir avantaj da, uzamış bir anneliğinin anterior ve posterior uçları gibi çok ayrı bulunan yapıların göreli konumlarını bulmak daha kolay olmasıdır.

Figure 1
Şekil 1 : Bu çalışmada gözlenen deniz omurgasız hayvanlar. (A-C) ( Akköy ) (Antozoa, Cnidaria). (A) canlı bir hayvanın distal ucu% 10 MgCl2 deniz suyu içinde rahat. Distal (B) ve proksimal (C) 70% etanol içinde fiks sonrası biter. (D) canlı anestezize harmothoe Sp. (Polychaeta, annelida), solda anterior ile dorsal görünümü. Elytra çoğu zaten bu aşamada, sadece dört posterior End yakın kalan eksik. (E) xenoturbella japonica (xenoturbellida, Xenacoelomorpha)% 70 etanol içinde düzeltildi. Üst ön ile sağ görünüm. Toplama koşullarında, epidermis gelmeye başladı. Ölçek çubukları = 3 mm. Bu rakam daha büyük bir sürümünü görüntülemek Için lütfen buraya tıklayın .

Figure 2
Şekil 2 : Microfocus X-Ray bilgisayarlı tomografi sisteminde montaj örnekleri. (A) bir 50 ml tüpünde kil kullanılarak montaj örnekleri. Numunenin yönü kil kullanılarak ayarlanabilir. (B) küçük numunelerin montajı Için 1.000 μL mikropipet ' mavi ' ucu hazırlanması. a: uç ile 100 μL% 0,5 agaroz (diyagonal çizgiler) ile takılı ucu. Örnekleri bu ucu yerleştirilir. Numunenin ucu, montaj için başka bir 1.000 μL mikropipet ' Blue ' ucu (b, c) içine yerleştirildi. b Xenoturbella japonicaiçin kullanılmış ve c harmothoe Sp. (c) monte X. japonica örnek, genel bakış (sol) ve yakın (sağ) için kullanılmıştır. X-ışını kaynağı örnek sağında görülebilir. (D) 1.000 μL micropipet ' Blue ' ucunda numune montajı için diyagramlar. a: damıtılmış suda X. japonica örnek. b: örnek, tararken hareket etmediği için ucu duvara (oklar) temas etmiştir. c: 0,5% agarose 'de Harmothoe Sp. örnek. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3 : Microfocus X-Ray bilgisayarlı tomografi sisteminde tarama örnekleri. (A) bir Actinia equina numunesinin x-ışını iletim görüntüsünü gösteren microfocus x-ray bilgisayarlı tomografi sisteminin taranması sırasında çalışma ekranı. Kontrast ve parlaklığı, sol alt tarafta bulunan ' görüntü kontrastı ' ile ayarlayın. (B) Y ekseni düğmesini gösteren montaj aşamasının görünümü. (C) Montaj aşamasından sonra A. equina numunesinin x-ışını iletim görüntüsü x-ışını ışınına daha yakın şekilde taşındıktan sonra. (A) merkezindeki görüntüye kıyasla büyütülür dikkat edin. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4 : Görüntü yeniden yapılanma sisteminin çalışma ekranı. (A) tarama sırasında numunenin döndürme eksenindeki farklılıkları ayarlamak için ekran, bir Actinia equina örneği gösteriliyor. Kırmızı kutu: Shift sekmesi; yeşil kutu: otomatik vardiya değeri hesaplama düğmesi. (B) görüntünün yönünü ayarlamak için ekran, harmothoe Sp. gösterilmiştir. (C) ekran A. equina'nın görüntü rekonstrüksiyonu sırasında, hiçbir numunenin bulunmadığı sarı kutunun dışındaki alanı kırpın. Macenta kutusu: alan sekmesi. (D) ekran görüntü yeniden yapılanma sırasında, A. equina'nın yeniden oluşturulmuş görüntüsünü gösterir. Macenta kutusu: yeniden yapılandırma sekmesi; yeşil kutu: yeniden yapılandırma düğmesi; mavi kutu: siyah ve beyaz değer ayarlaması. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5 : Görüntü analiz sisteminin çalışma ekranı. (A) tercih penceresi. Veritabanı dosyası yönetimi penceresini açmak için veritabanı simgesi (macenta Daire) tıklatıldı. (B) veritabanı dosya yönetimi penceresi. Bu yazılım, bir ok ile gösterilen kutunun TIFF dosyaları alma etkinleştirmek için kapalı olması gerekir. (C) veritabanı ekranının menü ve araç çubukları. Kırmızı kutu = ithalat simgesi; mavi kutu = 2D Görüntüleyici simgesi. (D) DataSet alma penceresi. Magenta Circle = link Kopyala düğmesi. (E) 2D Görüntüleyici ekranının menü ve araç çubukları. Kırmızı kutu = 3D Görüntüleyici sekmesi; yeşil kutu = parlaklık/kontrast simgesi; mavi kutu = oryantasyon simgesi. (F) kalibrasyon ayarı penceresi. Kırmızı kutudaki sütunlar içinde istenen çözünürlük değerlerini girin. (G) parlaklık ve kontrastı ayarlamak için 2B Görüntüleyici penceresinde görüntülenen bir Actinia equina numunesinin çapraz bölümü. Kırmızı kutu: diğer kesitler kontrol etmek için ScrollBar. (H) 2B Görüntüleyici penceresinde (G) farklı bir yönde görüntülenen a. equina kesiti. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 6
Şekil 6 : Denizdeki omurgasızlar tarafından taranan ve yeniden oluşturulmuş görüntüler. (A) Transverse ve (B) Actinia equina'nın uzunlamasına bölümleri. (B) içindeki noktalı sarı kutunun içindeki alan, inset içinde büyütülür. Kısaltmalar: DM, yönergesi mezenterler çifti; m, mükemmel mezenterler çifti; MF, mezenteryal filament; p, farinks; si, siphonoglyphs; t, dokunaç; oklar, oral disk; beyaz ok uçları, pedal diski; siyah ok uçları, sfinkter kas. Ölçek çubukları A, B = 3 mm. (C-E) Harmothoe Sp. (c) ön parçanın sagittal bölümü. (D, E) Noktalı çizgiler d ve e (C) içinde enine bölüm. Kısaltmalar: aci = aciculum; acim = aciküler kas; CoE = koelom; DLM = dorsal uzunlamasına kas; ELP = elytroore; göz = göz; int = bağırsak; çene = çene; mant = Median anten; Mo = ağız; MP = hortum kasları; palp = palp; Pha = farinks; prob = hortum; VLM = ventral uzunlamasına kas; VNC = ventral sinir kablosu. Ölçek çubukları: C = 1 mm; D, E = 0,3 mm. (F, G) xenoturbella japonica. (F) tüm numunenin sagittal bölümü. (G) ön parçanın sagittal bölümü. BL = bazal lamina; int = bağırsak; ml = kas tabakası; Mo = ağız; nn = intraepidermal sinir ağı; beyaz ok = statokist; siyah ok = frontal gözenek; beyaz ok uçları = ventral glandüler ağ; siyah ok uçları = oocytes. Ölçek çubukları: F = 1 mm, G = 0,5 mm. Bu rakam daha büyük bir sürümünü görüntülemek Için lütfen buraya tıklayın .

Table 1
Tablo 1: her numune için örnek hazırlama ve tarama protokolü.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu çalışmada kullanılan deniz suyunda% 10 (v/v) formalin çözeltisi gibi formalin kullanan fixatives, çeşitli deniz omurgasınları morfolojisi korumak için bilinen ve genellikle MicroCT görüntüleme için kullanılan18,24,25 ,26,28,30,33. Ancak, bu kimyasalların kullanımı üzerindeki kısıtlamalar son yıllarda bazı ülkelerde sıkı hale gelmiştir ve paraformaldehit veya glutaraldehit gibi yedek maddeler kullanılabilir. Taramadan sonra DNA ayıklamak için planlar varsa, bu parça DNA bilinmektedir, çünkü bir fikreatif olarak formalin kullanmaktan kaçınmak daha iyidir. Bu durumda,% 70 etanol gibi DNA 'yı koruyan fiksatiflerin kullanımı tavsiye edilir. Bu çalışmada, Genus A. equina 70% etanol kullanılarak düzeltildi ve% 70 etanol-sabit örneklerden net MicroCT görüntüleri elde edildi (Şekil 6A, B).

Çeşitli Genus taxa MicroCT tarama yapılan bir önceki çalışmada, birçok numune 100% etanol içinde susuz edildi, ve bazı kritik nokta-24tarama önce kurutulmuş. Çalışmasında dokunaç kümeleri, kaslar ve gonadlar gibi yumuşak iç organlar başarılı bir şekilde gözlemlense de, dehidrasyon ve kurutma süreçlerinin yumuşak dokuların deformasyon ve kasılma gibi büyük eserler elde edilmesi bilinmektedir11 , 21. Bu çalışmada, 70% etanol içinde sabit Genus A. equina iç yapılarını gözlemlemek başardık ve% 25 Lugol çözeltisi ile lekelenmiş (Şekil 6A, B). Protokollerimiz, herhangi bir dehidrasyon veya kurutma adımları olmadan, tercih edilir ve tarama sırasında numuneler ve eserler zarar riskini azaltmak için mümkün olduğunda yapılmalıdır.

Lugol çözeltisi, iyot çözeltisi ve foshotungstic asit (PTA) genellikle mikroct görüntüleme6,7,9,14,16, biyolojik numunelerde kullanılan boyama çözümleri vardır 17,20,26,27,38. Çeşitli biyolojik numuneler kullanma deneyimlerimizden Lugol solüsyonu, nispeten kısa bir süre içinde koyu renk boyama ile birçok numune için en iyi sonuçları sağladı. İyot çözeltisi sadece çok zayıf lekeleri sağladı, ve PTA yeterli boyama için uzun bir süre gerekli ve lekeli numuneler güçlü kasılmalar gösterdi. Bu nedenle, Tüm numuneler Bu çalışmada Lugol çözeltisi ile lekelendiler. Ancak, Lugol çözeltisi tavsiye edilir olsa da, uygun boyama çözeltisi numuneler arasında farklılık gösterir ve yeterli numune varsa diğer boyama çözümlerini kullanan denemelerin gerçekleştirilmesinin önerilir. Boyama çözeltisi ne olursa olsun, numune boyama sırasında sözleşme yapmak37,38, bu yüzden boyama süresini kısa tutmak önemlidir.

MicroCT tarama kritik bir adım, böylece hareket önlemek için örnek monte etmektir. Bu çalışmada, bu iki adımda yapılmıştır, önce doğrudan montaj ortamı olarak agaroz kullanarak, ve daha sonra sahne örnek içeren tüp monte etmek için kil kullanarak. İlk adım için, etanol6,17,20,25,30, agaroz9,29 dahil olmak üzere önceki çalışmalarda, çeşitli düşük yoğunluklu montaj medya kullanılmıştır ve çiçek köpüğü15,22,31. Bu çalışmada, dünya çapında erişilebilir olan düşük maliyetli bir kimyasal olduğu için agarose seçilmiştir. Agaroz 'nin dezavantajı, taramadan sonra numuneyi sertleştirilmiş agaroz 'den almak zor olabilir, ancak düşük erime noktası agaroz kullanarak bu alma adımını kolaylaştırır. İkinci adımda, çene kelepçeleri veya vidalar genellikle6,9,17kullanılır. Bu çalışmada, numunenin Oryantasyon ve açısında ince ayarlamalar sağlayan kil seçilmiştir. Uzun tarama süreleri ile deneyler için dikkat gereklidir, örnek hareket olasılığı gibi çene kelepçeleri veya vidalar yerine kil kullanırken daha yüksektir.

Bir önceki çalışmada 2-8 mm vücut uzunlukları ile yedi deniz halkalı solucanları türler üzerinde MicroCT tarama yapılan, harmothoe SP daha küçük. Bu çalışmada kullanılan16. Yüksek çözünürlüklü görüntüler üreteceklerdi ve vasküler sistemler ve bireysel chaeta gibi organları bu çalışmada daha net gösterdi. Bu farkın ana nedeni protokol değildi, ancak microCT sistemlerinin özellikleri kullanılmıştır. Önceki çalışmada kullanılan sistem < 0.8 μm/pixel16maksimum çözünürlüğe sahip 11 megapiksel şarj bağlantılı cihaz kamera (4000 x 2672 piksel) ile donatılmıştır. Bu çalışmada kullanılan sistemin etkin görüntü matrisinin boyutu 992 x 992 piksel, maksimum çözünürlük > 5 μm/pikseldir. Bu nedenle, bu çalışmada kullanılan microCT sisteminin uzamsal çözünürlüğü Faulwetter ve al.16' da kullanılan yüksek performanslı MicroCT sistemine altıydı. Bu fark, özellikle 8 mm 'den küçük numuneleri tararken, çözünürlük eksikliği yaşadıysanız (veriler gösterilmez) belirgin olarak belirgindi. Bununla birlikte, bu çalışmada tarama sırasında daha az veri elde edildiğinden, Tarama süresi önceki çalışmada16 ' dan çok daha kısaydı (veri: 992 x 992 ve 4000 x 2672 piksel, sırasıyla; Tarama süresi: 10 ila 26 dakika ve 30 dakika ila birkaç saat, sırasıyla). Kısa bir tarama süresi iyot boyamayı azaltır, yüksek penetrasyon oranı ile iyi bir boyama çözümü olan Lugol solüsyonu kullanımına izin verir, ancak DW34' de kolayca yayılır. Kısa bir tarama süresi Ayrıca, agaroz veya DW (Şekil 2) kullanarak basit bir montaj yönteminin kullanımına olanak sağlayan tarama sırasında hareket eden numunenin olasılığını azaltır. Daha uzun tarama süreleri, görüntülerde olası örnek küçülme bulanıklığı dezavantajı da vardır. Uzun taramalar sırasında oluşabilecek bazı diğer mekanik ve donanım sorunları da39bildirilmiştir. Bu nedenle, microCT sistemleri kullanırken, doğru her sistemin belirtimini anlamak ve numune boyutu veya araştırma amacı açısından doğru sistemi seçmek önemlidir. Bazı durumlarda, düşük çözünürlüklü bir microCT sistemi yeterli olabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

Acknowledgments

Toshihiko Shiroishi 'ye yardım için ve bu çalışmada araştırma ortamının sağlanması için teşekkür etmek istiyoruz. Biz bir. equinatavsiye Için Kensuke Yanagi ve Takato Izumi için minnettar ve harmothoe Sp. numune üzerinde tavsiye için masaatsu Tanaka. Shimoda Marine Research Center, Tsukuba Üniversitesi ve Misaki Marine biyolojik Istasyonu, Tokyo Üniversitesi 'nde, örnek koleksiyonlarında yardım almak için personele teşekkür etmek istiyoruz. Biz Ingilizce dil düzenleme için Editage (www.editage.jp) teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma, genç bilim adamları için JSPS Grant-ın-Aid (A) (JP26711022) ile HN ve JAMBıO, Japon Deniz Biyolojisi Derneği tarafından destekleniyordu.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
250-ml Erlenmeyer flask Corning CLS430183
5-ml Sampling tube ST-500 BIO-BIK 103010
50-ml Polypropylene tube Greiner Bio One International 227261
60-mm Non-treated Dish IWAKI 1010-060
Agarose Promega V3125
Ecological grade tip (blue) 1000 µl BMBio BIO1000RF
Ethanol Wako Pure Chemical Industries 057-00451
Formalin Wako Pure Chemical Industries 061-00416
Iodine Wako Pure Chemical Industries 094-05421
Magnesium chloride hexahydrate Wako Pure Chemical Industries 135-00165
OsiriX DICOM Viewer Pixmeo SARL OsiriX MD v10.0 https://www.osirix-viewer.com
Paraformaldehyde Wako Pure Chemical Industries 163-25983
Petiolate needle AS ONE 2-013-01
Pipetman P200 Micropipette GILSON F123601
Pipetman P1000 Micropipette GILSON F123602
Potassium iodide Wako Pure Chemical Industries 166-03971
Precision tweezers 5 DUMONT 0302-5-PS
QuickRack MultI fit tip (yellow) 200 ul Sorenson 10660
Razor blades Feather FA-10
Ring tweezers NAPOX A-26
Stereoscopic microscope Leica MZ95
X-ray Micro-CT imaging system Comscantechno ScanXmate-E090S105

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Susaki, E. A., Tainaka, K., Perrin, D., Yukinaga, H., Kuno, A., Ueda, H. R. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10, 1709-1727 (2015).
  2. Susaki, E. A., Ueda, H. R. Whole-body and whole-organ clearing and imaging techniques with single-cell resolution: toward organism-level systems biology in mammals. Cell Chemical Biology. 23, 137-157 (2016).
  3. Silvestri, L., Costantini, I., Sacconi, L., Pavone, F. S. Clearing of fixed tissue: a review from a microscopist's perspective. Journal of Biomedical Optics. 21, 081205 (2016).
  4. Greenbaum, A., et al. Bone CLARITY: clearing, imaging, and computational analysis of osteoprogenitors within intact bone marrow. Science Translational Medicine. 9, (2017).
  5. Konno, A., Okazaki, S. Aqueous-based tissue clearing in crustaceans. Zoological Letters. 4, 13 (2018).
  6. Metscher, B. D. MicroCT for comparative morphology: simple staining methods allow high-contrast 3D imaging of diverse non-mineralized animal tissues. BMC Physiology. 9, 11 (2009).
  7. Metscher, B. D. MicroCT for developmental biology: a versatile tool for high-contrast 3D imaging at histological resolutions. Developmental Dynamics. 238 (3), 632-640 (2009).
  8. Degenhardt, K., Wright, A. C., Horng, D., Padmanabhan, A., Epstein, J. A. Rapid 3D phenotyping of cardiovascular development in mouse embryos by micro-CT with iodine staining. Circulation Cardiovascular Imaging. 3 (3), 314-322 (2010).
  9. Metscher, B. D. X-ray microtomographic imaging of intact vertebrate embryos. Cold Spring Harbor Protocols. 12, 1462-1471 (2011).
  10. Boistel, R., Swoger, J., Kržič, U., Fernandez, V., Gillet, B., Reynaud, E. G. The future of three-dimensional microscopic imaging in marine biology. Marine Ecology. 32, 438-452 (2011).
  11. Mizutani, R., Suzuki, Y. X-ray microtomography in biology. Micron. 43, 104-115 (2012).
  12. Merkle, A. P., Gelb, J. The ascent of 3D X-ray microscopy in the laboratory. Microscopy Today. 21, 10-15 (2013).
  13. Ziegler, A., Menze, B. H. Accelerated acquisition, visualization, and analysis of zooanatomical data. Computation for humanity. Information technology to advance society. Zander, J., Mosterman, P. J. , CRC Press. Boca Raton, USA. 233-260 (2013).
  14. Gignac, P. M., et al. Diffusible iodine-based contrast-enhanced computed tomography (diceCT): an emerging tool for rapid, high-resolution, 3-D imaging of metazoan soft tissues. Journal of Anatomy. 228 (6), 889-909 (2016).
  15. du Plessis, A., Broeckhoven, C., Guelpa, A., le Roux, S. G. Laboratory x-ray micro-computed tomography: a user guideline for biological samples. GigaScience. 6 (6), 1-11 (2017).
  16. Faulwetter, S., Vasileiadou, A., Kouratoras, M., Dailianis, T., Arvanitidis, C. Micro-computed tomography: Introducing new dimensions in taxonomy. ZooKeys. 263, 1-45 (2013).
  17. Staedler, Y. M., Masson, D., Schonenberger, J. Plant tissues in 3D via X-ray tomography: simple contrasting methods allow high resolution imaging. PLoS One. 8 (9), 75295 (2013).
  18. Fernández, R., Kvist, S., Lenihan, J., Giribet, G., Ziegler, A. Sine Systemate Chaos? A Versatile Tool for Earthworm Taxonomy: Non-Destructive Imaging of Freshly Fixed and Museum Specimens Using Micro-Computed Tomography. PLoS One. 9 (5), 96617 (2014).
  19. Paterson, G. L. J., et al. The pros and cons of using micro-computed tomography in gross and microanatomical assessments of polychaetous annelids. Memoirs of Museum Victoria. 71, 237-246 (2014).
  20. Faulwetter, S., Dailianis, T., Vasileiadou, K., Kouratoras, M., Arvanitidis, C. Can micro-CT become an essential tool for the 21st century taxonomist? An evaluation using marine polychaetes. Microscopy and Analysis. 28, 9-11 (2014).
  21. Sombke, A., Lipke, E., Michalik, P., Uhl, G., Harzsch, S. Potential and limitations of X-ray micro-computed tomography in arthropod neuroanatomy: a methodological and comparative survey. Journal of Comparative Neurology. 523, 1281-1295 (2015).
  22. Landschoff, J., Plessis, A., Griffiths, C. L. A dataset describing brooding in three species of South African brittle stars, comprising seven high-resolution, micro X-ray computed tomography scans. GigaScience. 4 (1), 52 (2015).
  23. Keiler, J., Richter, S., Wirkner, C. S. The anatomy of the king crab Hapalogaster mertensii Brandt, 1850 (Anomura: Paguroidea: Hapalogastridae) - new insights into the evolutionary transformation of hermit crabs into king crabs. Contributions to Zoology. 84 (2), 149-165 (2015).
  24. Holst, S., Michalik, P., Noske, M., Krieger, J., Sötje, I. Potential of X-ray micro-computed tomography for soft-bodied and gelatinous cnidarians with emphasis on scyphozoan and cubozoan statoliths. Journal of Plankton Research. 38, 1225-1242 (2016).
  25. Moles, J., Wägele, H., Ballesteros, M., Pujals, Á, Uhl, G., Avila, C. The End of the Cold Loneliness: 3D Comparison between Doto antarctica and a New Sympatric Species of Doto (Heterobranchia: Nudibranchia). PLoS One. 11 (7), 0157941 (2016).
  26. Nakano, H., et al. A new species of Xenoturbella from the western Pacific Ocean and the evolution of Xenoturbella. BMC Evolutionary Biology. 17, 245 (2017).
  27. Tsuda, K., et al. KNOTTED1 Cofactors, BLH12 and BLH14, Regulate Internode Patterning and Vein Anastomosis in Maize. Plant Cell. 29 (5), 1105-1118 (2017).
  28. Parapar, J., Candás, M., Cunha-Veira, X., Moreira, J. Exploring annelid anatomy using micro-computed tomography: A taxonomic approach. Zoologischer Anzeiger. 270, 19-42 (2017).
  29. Akkari, N., Ganske, A. S., Komerički, A., Metscher, B. New avatars for Myriapods: Complete 3D morphology of type specimens transcends conventional species description (Myriapoda, Chilopoda). PLoS One. 13 (7), 0200158 (2018).
  30. Gusmao, L. C., Grajales, A., Rodriguez, E. Sea anemones through X-rays: visualization of two species of Diadumene (Cnidaria, Actiniaria) using micro-CT. American Museum Novitates. 3907, (2018).
  31. Landschoff, J., Komai, T., du Plessis, A., Gouws, G., Griffiths, C. L. MicroCT imaging applied to description of a new species of Pagurus Fabricius, 1775 (Crustacea: Decapoda: Anomura: Paguridae), with selection of three-dimensional type data. PLoS One. 13 (9), 0203107 (2018).
  32. Machado, F. M., Passos, F. D., Giribet, G. The use of micro-computed tomography as a minimally invasive tool for anatomical study of bivalves (Mollusca: Bivalvia). Zoological Journal of the Linnean Society. , (2018).
  33. Sasaki, T., et al. 3D visualization of calcified and non-calcified molluscan tissues using computed tomography. Biomineralization. Endo, K., Kogure, T., Nagasawa, H. , Springer. Singapore. 83-93 (2018).
  34. Maeno, A., Tsuda, K. Micro-computed Tomography to Visualize Vascular Networks in Maize Stems. Bio-protocol. 8 (1), 2682 (2018).
  35. Nakano, H., et al. Correction to: A new species of Xenoturbella from the western Pacific Ocean and the evolution of Xenoturbella. BMC Evolutionary Biology. 18, 83 (2018).
  36. Maeno, A., Kohtsuka, H., Takatani, K., Nakano, H. MicroCT files from 'Microfocus X-ray computed tomography (microCT) imaging of Actinia equina (Cnidaria), Harmothoe sp. (Annelida), and Xenoturbella japonica (Xenacoelomorpha)'. figshare. , (2019).
  37. Vickerton, P., Jarvis, J., Jeffery, N. Concentration-dependent specimen shrinkage in iodine-enhanced microCT. Journal of Anatomy. 223 (2), 185-193 (2013).
  38. Buytaert, J., Goyens, J., De Greef, D., Aerts, P., Dirckx, J. Volume shrinkage of bone, brain and muscle tissue in sample preparation for micro-CT and light sheet fluorescence microscopy (LSFM). Microscopy and Microanalysis. 20 (4), 1208-1217 (2014).
  39. Sasov, A., Liu, X., Salmon, P. L. Compensation of mechanical inaccuracies in micro-CT and nano-CT. Proceedings of SPIE. 7078, 70781 (2008).

Tags

Çevre Bilimleri sayı 150 Mikroct Lugol solüsyonu iyot Actinia Cnidaria harmothoe Annelida xenoturbella xenacoelomorpha omurgasızlar
<em>Actinia equina</em> (cnidaria), <em>harmothoe</em> Sp. (Annelida) ve <em>xenoturbella japonica</em> (xenacoelomorpha) Microfocus X-Ray CT (MicroCT) görüntüleme
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Maeno, A., Kohtsuka, H., Takatani,… More

Maeno, A., Kohtsuka, H., Takatani, K., Nakano, H. Microfocus X-ray CT (microCT) Imaging of Actinia equina (Cnidaria), Harmothoe sp. (Annelida), and Xenoturbella japonica (Xenacoelomorpha). J. Vis. Exp. (150), e59161, doi:10.3791/59161 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter