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Mikrofokus-Röntgen-CT (microCT) Bildgebung von Actinia equina (Cnidaria), Harmothoe sp. (Annelida) und Xenoturbella japonica (Xenacoelomorpha)

Published: August 6, 2019 doi: 10.3791/59161
Automatic Translation
1, 2, 3, 3
1Mammalian Genetics Laboratory, National Institute of Genetics, 2Misaki Marine Biological Station, The University of Tokyo, 3Shimoda Marine Research Center, University of Tsukuba

Summary

Hier werden Protokolle zur Durchführung von Mikrofokus-Röntgentomographie (MicroCT) von drei marinen Wirbellosen-Tieren ausführlich erläutert. In dieser Studie werden Schritte wie Probenfixierung, Färbung, Montage, Scannen, Bildrekonstruktion und Datenanalysen beschrieben. Vorschläge, wie das Protokoll für verschiedene Samples angepasst werden kann, werden ebenfalls bereitgestellt.

Abstract

Traditionell mussten sich Biologen auf destruktive Methoden wie Dassektionen verlassen, um die inneren Strukturen undurchsichtiger Organismen zu untersuchen. Die zerstörungsfreie Mikrofokus-Röntgentomographie (MicroCT) ist aufgrund technologischer Fortschritte bei Probenfärbemethoden und Innovationen in MikroCT-Hardware, Verarbeitungscomputern und Daten zu einem leistungsfähigen und sich abzeichnenden Protokoll in der Biologie geworden. Analysesoftware. Dieses Protokoll wird jedoch nicht häufig verwendet, da es im medizinischen und industriellen Bereich ist. Einer der Gründe für diese eingeschränkte Nutzung ist das Fehlen eines einfachen und verständlichen Handbuchs, das alle notwendigen Schritte abdeckt: Probenentnahme, Fixierung, Färbung, Montage, Scannen und Datenanalysen. Ein weiterer Grund ist die große Vielfalt von Metazoen, insbesondere wirbellosen Meerestieren. Aufgrund der unterschiedlichen Größen, Morphologien und Physiologien von Marinewirbellosen ist es entscheidend, die experimentellen Bedingungen und Hardwarekonfigurationen bei jedem Schritt je nach Probe anzupassen. Hier werden mikroCT-Bildgebungsverfahren anhand von drei phylogenetisch unterschiedlichen wirbellosen Meereswirbeltieren ausführlich erklärt: Actinia equina (Anthozoa, Cnidaria), Harmothoe sp. (Polychaeta, Annelida) und Xenoturbella japonica ( Xenoturbellida, Xenacoelomorpha). Vorschläge zur Durchführung von MikroCT-Aufnahmen an verschiedenen Tieren werden ebenfalls bereitgestellt.

Introduction

Biologische Forscher mussten in der Regel dünne Abschnitte machen und Beobachtungen mittels Licht- oder Elektronenmikroskopie durchführen, um die inneren Strukturen undurchsichtiger Organismen zu untersuchen. Diese Methoden sind jedoch destruktiv und problematisch, wenn sie auf seltene oder wertvolle Exemplare angewendet werden. Darüber hinaus sind mehrere Schritte in der Methode, wie das Einbetten und Teilen, zeitaufwändig, und es kann mehrere Tage dauern, bis eine Probe beobachtet wird, je nach Protokoll. Darüber hinaus besteht bei der Handhabung zahlreicher Abschnitte immer die Möglichkeit, Teile zu beschädigen oder zu verlieren. Geweberäumtechniken sind für einige Exemplare1,2,3,4,5 verfügbar, aber noch nicht für viele Tierarten anwendbar.

Um diese Probleme zu überwinden, haben einige Biologen begonnen, Mikrofokus-Röntgen-Computertomographie (microCT) Bildgebung6,7,8,9,10,11, 12,13,14,15. In Der Röntgen-CT wird die Probe mit Röntgenstrahlen aus verschiedenen Winkeln bestrahlt, die aus einer Röntgenquelle erzeugt werden, die sich um die Probe bewegt, und die übertragenen Röntgenstrahlen werden von einem Detektor überwacht, der sich ebenfalls um die Probe bewegt. Die erhaltenen Röntgenübertragungsdaten werden analysiert, um Querschnittsbilder der Probe zu rekonstruieren. Diese Methode ermöglicht die Beobachtung von internen Strukturen ohne Zerstörung der Probe. Aufgrund seiner Sicherheit und Leichtigkeit, Es wird häufig in medizinischen und zahnmedizinischen Anwendungen verwendet, und CT-Systeme können in Krankenhäusern und Zahnzentren weltweit gefunden werden. Darüber hinaus wird industrielle Röntgen-CT häufig zur Beobachtung nichtmedizinischer Proben zur Inspektion und Messtechnik im industriellen Bereich eingesetzt. Im Gegensatz zur medizinischen CT, bei der die Röntgenquelle und die Detektoren mobil sind, werden die beiden Teile in industriellem CT fixiert, wobei sich die Probe beim Scannen dreht. Industrielle CT produziert in der Regel Bilder mit höherer Auflösung als medizinische CT und wird als microCT (Micrometer-Level Resolution) oder nanoCT (Nanometer-Level-Auflösung) bezeichnet. In letzter Zeit hat die Forschung mit microCT in verschiedenen Bereichen der Biologie schnell zugenommen14,15,16,17,18,19, 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34.

Biologische Studien mit CT zielten zunächst auf interne Strukturen ab, die hauptsächlich aus Hartem Gewebe bestehen, wie Knochen. Fortschritte in der Färbetechnik mit verschiedenen chemischen Mitteln ermöglicht die Visualisierung von Weichteilen in verschiedenen Organismen6,7,8,9,14,15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34. Von diesen Reagenzien sind Jod-basierte Kontrastmittel relativ sicher, kostengünstig und können zur Visualisierung von Weichgeweben in verschiedenenOrganismen7,14verwendet werden. In Bezug auf marine Wirbellose, microCT wurde weit verbreitet auf solche Tiere wie Weichtiere6,25,32,33, Annelids18,19, 20 , 28und Arthoropoden21,23,29,31. Es gab jedoch nur wenige Berichte über andere Tierphyla, wie bryozoans6, xenacoelomorphs26, und cnidarians24,30. Im Allgemeinen gab es weniger Studien mit MicroCT an wirbellosen Meerestieren als an Wirbeltieren. Ein Hauptgrund für diesen begrenzten Einsatz bei wirbellosen Meerestieren ist die große Vielfalt, die bei diesen Tieren beobachtet wird. Aufgrund ihrer unterschiedlichen Größen, Morphologien und Physiologien reagiert jede Spezies unterschiedlich auf unterschiedliche experimentelle Verfahren. Daher ist es bei der Probenvorbereitung von entscheidender Bedeutung, das am besten geeignete Fixierungs- und Färbereagenz zu wählen und bei jedem Schritt die Bedingungen festzulegen, die für jede Art angepasst sind. Ebenso ist es notwendig, die Scankonfigurationen, wie z. B. Montagemethode, Spannung, Strom, mechanische Vergrößerungsrate und die Raumauflösungsleistung, für jede Probe entsprechend einzustellen. Um dieses Problem zu lösen, ist ein einfaches und verständliches Handbuch, das alle notwendigen Schritte abdeckt, erklärt, wie jeder Schritt je nach Probe angepasst werden kann, und detaillierte Beispiele aus mehreren Proben zeigt, ist unerlässlich.

In der vorliegenden Studie beschreiben wir Schritt für Schritt das mikroCT-Bildgebungsprotokoll, von der Probenfixierung bis zur Datenanalyse unter Verwendung von drei marinen Wirbellosenarten. Exemplare der Seeanemone Actinia equina (Anthozoa, Cnidaria) wurden in der Nähe der Misaki Marine Biological Station, University of Tokyo, gesammelt. Sie hatten einen kugelförmigen, weichen Körper mit einem Durchmesser von etwa 2 cm (Abbildung1A-C). Harmothoe sp. (Polychaeta, Annelida) Proben wurden auch in der Nähe der Misaki Marine Biological Station gesammelt. Es handelte sich um schlanke Würmer, die etwa 1,5 cm lang waren, mit zähen Chaetae am ganzen Körper (Abbildung1D). Ein Xenoturbella japonica35 (Xenoturbellida, Xenacoelomorpha) Wurde in der Nähe des Shimoda Marine Research Center, Universität Tsukuba, während der 13. JAMBIO Coastal Organism Joint Survey gesammelt. Es war ein weichköpfiger Wurm, der etwa 0,8 cm lang war (Abbildung 1E). Die Anpassungen für die Bedingungen und Konfigurationen der einzelnen Stichproben werden ausführlich erläutert. Unsere Studie enthält mehrere Vorschläge zur Durchführung von MikroCT-Aufnahmen an wirbellosen Meerestieren, und wir hoffen, dass sie Biologen dazu inspirieren wird, dieses Protokoll für ihre Forschung zu nutzen.

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Protocol

1. Fixierung

  1. Für Actinia equina,entspannen Sie die Tiere in 10% MgCl2 Meerwasser für ca. 15 min bei Raumtemperatur. Auf 70% Ethanol übertragen und bei Raumtemperatur lagern.
  2. Für Harmothoe sp. beanten Sie die Tiere, indem Sie sie ca. 15 min in eiskaltes Meerwasser geben. Übertragen Sie sie auf 10% (v/v) formalin Lösung mit Meerwasser und lagern Sie bei Raumtemperatur.
  3. Für Xenoturbella japonica,entspannen Sie das Tier mit 7% MgCl2 in Süßwasser. Fix in 4% Paraformaldehyd (PFA) in gefiltertem Meerwasser über Nacht. 70% Ethanol einlagern und bei 4 °C lagern.
    VORSICHT: PFA ist gefährlich und muss mit Vorsicht behandelt werden.

2. Färbung

  1. Die Proben auf 50% Ethanol übertragen und bei Raumtemperatur 15 h lagern. 50% Ethanol mit 25% Ethanol ersetzen und bei Raumtemperatur für 2 h lagern.
    HINWEIS: Dies ist für die Harmothoe sp. Probe in 10% (v/v) formalin Lösung mit Meerwasser nicht erforderlich.
  2. Ersetzen Sie die Lösung durch destilliertes Wasser (DW) und lagern Sie die Proben in DW bei Raumtemperatur für 2 h. Wiederholen Sie diesen Schritt dreimal.
  3. Bereiten Sie 25% Lugol Lösung durch Verdünnen der Lagerlösung (unten) bis 25% mit DW. Lagerlösung (100% Lugol Lösung) enthält 10 g KI und 5 g I2, angepasst auf 100 ml mit DW.
    HINWEIS: Lugol Lösung ist lichtempfindlich, so speichern und behandeln Sie die Lösung vor Licht geschützt. Befolgen Sie die Vorschriften der einzelnen Länder und Institutionen für die Jodbehandlung und Abfallentsorgung.
  4. Dekantiert die DW aus den Proben und gießt die 25% Lugol-Lösung ein. Fleck für 24 h bei Raumtemperatur.

3. Bühnenmontage

  1. Bereiten Sie 0,5% Agarose vor, indem Sie 500 mg Agarose in 100 ml DW in einem 250 ml konischen Kolben in einer Mikrowelle (800 W, ca. 1-3 min) auflösen. Auf ca. 30-40 °C abkühlen, indem man bei Raumtemperatur hält.
    VORSICHT: Überhitzen oder versiegeln Sie den Kolben beim Erhitzen nicht vollständig, um ein Überkochen der Agrose zu verhindern.
  2. Montieren Sie große Proben wie A. equina mit einem 50 ml Rohr.
    HINWEIS: Verwenden Sie 50 ml-Rohre für die Montage großer Proben, die nicht in eine "blaue" Spitze der Mikropipette mit 1.000 l passen.
    1. Die gebeizte Probe in eine 60-mm-Schale mit DW geben, um übermäßige Färbelösung von der Oberfläche abzuwaschen.
    2. 5 ml 0,5% Agarose vorsichtig in ein 50 ml Rohr gießen und die Agarose auf Eis aushärten. Achten Sie darauf, keine Blasen in der Agarose zu machen.
    3. 20 ml 0,5% Agarose vorsichtig in die 50 ml-Röhre geben und auf Eis legen, bis die Agarose zu verhärten beginnt. Platzieren Sie die Probe mit Zangen innerhalb der 0,5%-Agarose. Achten Sie darauf, keine Blasen in der Agarose zu machen.
    4. Stellen Sie die Position und Ausrichtung der Probe mit Zangen ein und härten Sie die Agarose auf Eis aus.
    5. Legen Sie Ton auf die microCT-Montagebühne und stellen Sie das 50 ml-Rohr auf den Ton (Abbildung 2A).
  3. Montieren Sie kleine Proben wie Harmothoe sp. und X. japonica mit einer 1.000 L Mikropipette 'blauen' Spitze.
    HINWEIS: Für kleinere Proben kann eine "gelbe" Spitze der Mikropipette mit 200 L verwendet werden. Verwenden Sie in diesem Fall 30 l Agarose für den Stecker und fügen Sie 200 l Agarose oder destilliertes Wasser hinzu.
    1. Ziehen Sie 100 l von 0,5% Agarose in eine 1.000 l Mikropipette 'blaue' Spitze und härten Sie die Agarose, indem Sie die Spitze über Eis halten, so dass ein Stecker in der Spitze (Abbildung2B-a).
    2. Dekantieren Sie die gebeizte Probe in eine 60-mm-Schale ohne Zange.
    3. Die Probe vorsichtig mit einer Ringpinzette in eine weitere 60-mm-Schale mit DW geben, um übermäßige Färbelösungen von der Oberfläche abzuwaschen.
    4. Fügen Sie mit einer Mikropipette 1.000 l entweder 0,5% Agarose oder DW in die gesteckte Spitze (Schritt 3.3.1) ein.
      HINWEIS: Die Verwendung von 0,5% Agarose wird empfohlen, aber verwenden Sie DW für zerbrechliche oder wertvolle Proben, in denen Agarose vermieden werden sollte.
    5. Die Probe von der 60-mm-Schale vorsichtig mit einer Ringpinzette in die Agarose oder DW in die atopfende Spitze geben.
    6. Passen Sie die Position und Ausrichtung der Probe vorsichtig mit einer Petiolatenadel oder einer Präzisionspinzette an. Achten Sie darauf, keine Blasen im Montagemedium zu machen. Stellen Sie sicher, dass die Probe zwischen den Wänden der Spitze stabil ist, wenn DW als Montagemedium verwendet wird (Abbildung 2D-b). Legen Sie die Spitze auf Eis, um die Agarose zu härten, wenn sie als Montagemedium verwendet wird.
    7. Schneiden Sie die Spitze von einer neuen 1.000 l Mikropipette 'blaue' Spitze (Abbildung 2B-b,c) und legen Sie die Spitze der gesteckten Spitze in die neue Spitze.
    8. Legen Sie Ton auf die microCT-Montagebühne und stellen Sie die Spitzen mit der Probe innen auf den Ton (Abbildung 2C,D).
      HINWEIS: Die Färbelösung beginnt, die Probe abzuwaschen, sobald sie in DW platziert wurde, also fahren Sie mit dem nächsten Scanschritt fort.

4. MicroCT-Scannen

  1. Schalten Sie den Röntgenstrahl bei 80 kV, 100 A ein.
  2. Bewegen Sie beim Betrachten des Röntgenübertragungsbildes in der Mitte des Bildschirms (Abbildung 3A) die Bühne so, dass das gesamte Beispiel durch Anklicken der X- und Z-Achsentasten ( Abbildung3A) und manuell gesehen werden kann. Einstellung des Y-Achsenknopfes auf der Montagebühne (Abbildung 3B). Stellen Sie den Kontrast des Bildes so ein, dass die internen Strukturen durch Anpassen der Kontrastbedingungen beobachtet werden können (Abbildung 3A: Bildkontrast).
  3. Passen Sie die Ausrichtung der Probe an, indem Sie den Winkel des Rohres/der Spitze im Ton ändern (Abbildung 2A). Drehen Sie die Stufe um 90°, indem Sie die Rotationsachse (Abbildung 3A) auf 90 stellen und auf die relative Bewegungsschaltfläche klicken (Abbildung 3A). Führen Sie das gleiche Manöver viermal durch, um eine vollständige Drehung durchzuführen.
    HINWEIS: Schalten Sie den Röntgenstrahl bei jedem Öffnen der Probentür manuell aus, es sei denn, das System schaltet ihn automatisch aus.
  4. Verschieben Sie die Bühne so, dass sich die Probe in der Mitte der Ansicht befindet, indem Sie auf die Taste Z-Achse klicken (Abbildung 3A) und indem Sie den Y-Achsenknopf auf der Montagestufe manuell einstellen (Abbildung 3B). Drehen Sie die Bühne um 90° und tun Sie das gleiche. Drehen Sie die Stufe 360° und überprüfen Sie, ob sich die Probe aus allen Richtungen in der Mitte der Ansicht befindet.
  5. Bewegen Sie die Bühne entlang der x-Achse in Richtung der Röntgenstrahlquelle, indem Sie auf die X-Achsen-Schaltfläche (Abbildung 3A) klicken, um das Beispiel zu vergrößern und nach Bedarf so anzupassen, dass es nur in die Ansicht passt (Abbildung 3C).
  6. Drehen Sie die Stufe um 360° und stellen Sie sie nach Bedarf so ein, dass die Probe aus allen Richtungen in die Sicht passt.
  7. Passen Sie die Scanbedingungen an, wie in Tabelle 1dargestellt.
  8. Starten Sie das Scannen; es dauert ca. 10 min.

5. Bildrekonstruktion

  1. Starten Sie die Zubehörsoftware des microCT-Systems (siehe Materialtabelle) und öffnen Sie die gescannten Daten.
  2. Passen Sie die Unterschiede in der Rotationsachse der Probe während des Scannens an, indem Sie auf die Schaltfläche für die Berechnung des automatischen Schaltwerts klicken (Abbildung4A:grünes Kästchen).
  3. Passen Sie die Ausrichtung des Bildes an, indem Sie die orangen Pfeile drehen (Abbildung 4B). Wenn die Ausrichtung geändert wurde, wiederholen Sie Schritt 5.2.
  4. Klicken Sie auf die Registerkarte Bereich (Abbildung4C: Magenta-Box) und Trimmbereiche, in denen keine Proben vorhanden sind (Abbildung4C:gelbe box).
  5. Klicken Sie auf die Registerkarte Neukonfiguration (Abbildung4D: Magenta-Box) und stellen Sie die Filter wie folgt ein, um Rauschen zu entfernen. RingArtefakt reduzieren Filter: Medianfilter -3; Rauschelfilter: Durchschnittlicher Filter-1.
  6. Führen Sie eine Neukonfiguration durch, indem Sie auf die Schaltfläche "Neukonfiguration" klicken (Abbildung4D: grünes Kästchen).
  7. Passen Sie die Bildhelligkeit und den Kontrast an, indem Sie die Schwarzweißwerte als Schwarzwert 0, Weißwert 250 (Abbildung4D:blaues Feld) einstellen.
  8. Speichern Sie das rekonstruierte TIFF-Bild-Dataset als 8-Bit-TIFF, indem Sie auf die Schaltfläche Speichern klicken. Benennen Sie TIFF-Dateien wie folgt um: Date_sample_resolution ('m)_number.tiff'.
    HINWEIS: Die ursprünglichen microCT-Datensätze aus dieser Studie sind im Figshare-Repository verfügbar, doi:10.6084/m9.figshare.767083736.

6. Datenanalysen

  1. Starten Sie die Datenanalysesoftware (siehe Materialtabelle) und aktivieren Sie den Import von TIFF-Dateien, indem Sie auf das Datenbanksymbol klicken (Abbildung 5A: Magenta-Feld) und das in Abbildung 5Bdargestellte Feld deaktivieren.
  2. Klicken Sie auf das Importsymbol (Abbildung 5C: Magenta-Feld), wählen Sie das in Abschnitt 5 gespeicherte Dataset aus, und klicken Sie auf Öffnen.
  3. Klicken Sie auf die Schaltfläche Kopierlinks (Abbildung 5D), um die Daten zu importieren.
  4. Zeigen Sie den 2D-Querschnitt an, indem Sie auf das 2D-Viewer-Symbol klicken (Abbildung5C:blaues Feld).
  5. Kalibrieren Sie den Datensatz, indem Sie auf die Registerkarte 3D-Viewer klicken (Abbildung 5E: Magenta-Box) und den Auflösungswert beim Scannen eingeben (der in dieser Studie 0,018 betrug [Abbildung 5F]).
  6. Klicken Sie auf das Helligkeits-/Kontrastsymbol (Abbildung5E-Grünfeld). Passen Sie die Helligkeit und den Kontrast an, indem Sie den Cursor innerhalb des angezeigten 2D-Bildes bewegen und die Fensterebene und Fensterbreite ändern (Abbildung 5G).
  7. Überprüfen Sie andere Querschnittsbilder, indem Sie die Bildlaufleiste bewegen (Abbildung5G: Feld).
  8. Ändern Sie die Ausrichtung des Querschnitts, indem Sie auf das Orientierungssymbol klicken (Abbildung 5E: blaues Kästchen) und überprüfen Sie Bilder in allen Ausrichtungen (Abbildung 5H).
  9. Klicken Sie auf das angezeigte Bild, und wählen Sie die Registerkarte Export aus, um Querschnittsbilder zu speichern.

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Representative Results

Wir führten MikroCT-Bildgebung auf A. equina (Anthozoa, Cnidaria), Harmothoe sp. (Polychaeta, Annelida) und X. japonica (Xenoturbellida, Xenacoelomorpha) nach der Färbung der Proben mit 25% Lugol-Lösung durch. Die Färbung verbesserte erfolgreich den Kontrast der inneren Strukturen in allen Proben und ermöglichte Beobachtungen von inneren Weichteilen (Abbildung 6). Zusammen mit früheren Berichten6,7,16,19,22,23,24,25,26 , 28 , 30 , 31 , 32 , 33, dies zeigt, dass microCT an verschiedenen marinen Wirbellosen zur Visualisierung ihrer Morphologie, einschließlich weicher Binnengewebe, verwendet werden kann. Auch bei der X. japonica-Probe, deren Epidermis stark beschädigt war (Abbildung 6F,G), wurden klare Bilder gewonnen, die zeigen, dass diese Methode auf empfindliche Proben mit äußeren Schäden anwendbar ist.

Das Scannen nur des Interessenbereichs hat im Gegensatz zu einem größeren Bereich die Klarheit und Auflösung des Bildes erheblich erhöht (vergleiche Abbildung 6F und Abbildung 6G). Für Harmothoe sp. (Abbildung 6C) und X. japonica (Abbildung 6F) wurde jedoch ein einziger hochauflösender Datensatz einer ganzen Probe rekonstruiert, der auf verschiedenen (aber überlappenden) Scans durchgeführt wurde. Teile der Probe. Die Nähte zwischen den einzelnen Scans waren in den rekonstruierten Bildern unauffällig. Unsere Studie zeigt, dass einzelne hochauflösende Bilder mit Kegelstrahl-MikroCT-Systemen gewonnen werden können. Durch das Scannen einer größeren Fläche mit hoher Auflösung besteht ein geringeres Risiko, kleine Strukturen zu übersehen. Ein weiterer Vorteil ist, dass es einfacher ist, die relativen Positionen von Strukturen zu lokalisieren, die weit voneinander entfernt liegen, wie die vorderen und hinteren Spitzen eines länglichen Annelids.

Figure 1
Abbildung 1 : In dieser Studie beobachtete Marinewirbellose Tiere. (A-C) Actinia equina (Anthozoa, Cnidaria). (A) Distales Ende eines lebenden Tieres entspannt in 10% MgCl2 Meerwasser. Distal (B) und proximal (C) endet nach Fixierung in 70% Ethanol. (D) Live anesthetized Harmothoe sp. (Polychaeta, Annelida), dorsale Ansicht mit vorderem nach links. Die meisten elytra fehlten bereits zu diesem Zeitpunkt, mit nur vier in der Nähe des hinteren Endes. (E) Xenoturbella japonica (Xenoturbellida, Xenacoelomorpha) fixiert in 70% Ethanol. Rechte Ansicht, mit vorderem Nachoben. Aufgrund der Umstände bei der Sammlung begann seine Epidermis zu kommen. Skalenbalken = 3 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2 : Montage von Proben auf dem Mikrofokus-Röntgentomographiesystem. (A) Montage von Proben in einem 50 ml Rohr mit Ton. Die Ausrichtung der Probe konnte mit dem Ton angepasst werden. (B) Vorbereitung einer 1.000 l L Mikropipette 'blauen' Spitze für die Montage kleiner Proben. a: Spitze mit einem Ende, das mit 100 l mit 0,5% Agarose (diagonale Linien) verstopft ist. Die Proben wurden in diese Spitze gelegt. Die Spitze mit der Probe wurde zur Montage in eine weitere 1.000 l Mikropipette 'blaue' Spitze (b, c) eingesetzt. b wurde für Xenoturbella japonicaverwendet, und c wurde für Harmothoe sp. (C) Mounted X. japonica Probe, Übersicht (links) und Nahaufnahme (rechts) verwendet. Die Röntgenquelle ist rechts neben der Probe zu sehen. (D) Diagramme für die Montage von Proben in einer 'blauen' Spitze der Mikropipette mit 1.000 l. L. a: X. japonica Probe in destilliertem Wasser. b: Die Probe stand in Kontakt mit der SpitzeWand (Pfeile), so dass sie sich beim Scannen nicht bewegt. c: Harmothoe sp. Probe in 0,5% Agarose. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3 : Scannen von Proben auf dem Mikrofokus-Röntgentomographiesystem. (A) Betriebsbildschirm beim Scannen des Mikrofokus-Röntgentomographiesystems, das ein Röntgenübertragungsbild einer Actinia equina Probe zeigt. Passen Sie den Kontrast und die Helligkeit mit dem "Bildkontrast" unten links an. (B) Ansicht der Montagestufe mit dem Y-Achsenknopf. (C) Röntgenübertragungsbild der A. equina-Probe nach der Montagestufe wurde näher an die Röntgenstrahlquelle verschoben. Beachten Sie, dass es im Vergleich zum Bild in der Mitte von (A) vergrößert wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4 : Betriebsbildschirm des Bildrekonstruktionssystems. (A) Bildschirm zum Anpassen von Unterschieden in der Rotationsachse der Probe während des Scannens, auf dem eine Actinia equina Probe angezeigt wird. Magenta-Box: Schiebelader; green box: automatische Shift-Wert-Berechnungstaste. (B) Bildschirm zum Anpassen der Ausrichtung des Bildes, mit Harmothoe sp. angezeigt. (C) Bildschirm während der Bildrekonstruktion von A. equina, Trimmen des Bereichs außerhalb der gelben Box, wo keine Proben vorhanden sind. Magenta-Box: Bereich Tab. (D) Bildschirm während der Bildrekonstruktion, zeigt das rekonstruierte Bild von A. equina. Magenta-Box: Registerkarte "Neukonfiguration" ; grüne Box: Rekonfigurationstaste; blaue Box: Schwarz-Weiß-Wertanpassung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5 : Betriebsbildschirm des Bildanalysesystems. (A) Voreinstellungsfenster. Das Datenbanksymbol (Magenta-Kreis) wurde angeklickt, um das Datenbankdateiverwaltungsfenster zu öffnen. (B) Datenbankdateiverwaltungsfenster. In dieser Software muss das mit einem Pfeil angezeigte Feld ausgeschaltet sein, um den Import von TIFF-Dateien zu ermöglichen. (C) Menü- und Symbolleisten des Datenbankbildschirms. Magenta-Box = Importsymbol; blue box = 2D-Viewer-Symbol. (D) Dataset-Importfenster. Magenta-Kreis = Schaltfläche Links kopieren. (E) Menü- und Symbolleisten des 2D-Viewer-Bildschirms. Magenta-Box = 3D-Viewer-Registerkarte; grüne Box = Helligkeit/Kontrast-Symbol; blaues Feld = Orientierungssymbol. (F) Kalibrier-Einstellungsfenster. Geben Sie die gewünschten Auflösungswerte in die Spalten im Magenta-Feld ein. (G) Querschnitt eines Actinia equina-Exemplars, das im 2D-Viewer-Fenster zur Einstellung von Helligkeit und Kontrast angezeigt wird. Magenta-Box: Scrollbar zum Überprüfen anderer Querschnitte. (H) Querschnitt von A. equina im 2D-Viewer-Fenster mit einer anderen Ausrichtung als (G) angezeigt Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 6
Abbildung 6 : Gescannte und rekonstruierte Bilder von wirbellosen Meerestieren. (A) Quer- und (B) Längsabschnitte von Actinia equina. Der Bereich innerhalb des gepunkteten gelben Feldes in (B) wird im Einset vergrößert. Abkürzungen: dm, Paar von Direktive Mesenteries; m, Paar perfekte Mesenteries; mf, mesenterialfilament; p, Rachen; si, siphonoglyphen; t, Tentakel; Pfeile, mundliche Scheibe; weiße Pfeilspitzen, Pedalscheibe; schwarze Pfeilspitzen, Schließmuskel. Skalenstäbe in A, B = 3 mm. (C-E) Harmothoe sp. (C) Sagittalabschnitt des vorderen Teils. (D, E) Querschnitt an den gepunkteten Linien d und e in (C). Abkürzungen: aci = aciculum; acim = acicular Muskel; coe = coelom; dlm = dorsaler Längsmuskel; elp = Elytrophor; Auge = Auge; int = Darm; Kiefer = Kiefer; mant = Medianantenne; mo = Mund; mp = Muskeln des Proboscis; palp = palp; pha = Pharynx; prob = proboscis; vlm = ventraler Längsmuskel; vnc = ventrale Nervenschnur. Skalenstäbe: C = 1 mm; D, E = 0,3 mm. (F, G) Xenoturbella japonica. (F) Schütze Abschnitt der gesamten Probe. (G) Schütze des vorderen Teils. bl = basallamina; int = Darm; ml = Muskelschicht; mo = Mund; nn = intraepidermales Nervennetz; weißer Pfeil = Statozyste; schwarzer Pfeil = Frontalpore; weiße Pfeilspitzen = ventrales Drüsennetz; schwarze Pfeilspitzen = Oozyten. Skalenbalken: F = 1 mm, G = 0,5 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Table 1
Tabelle 1: Probenvorbereitungs- und Scanprotokoll für jede Probe.

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Discussion

Fixative, die Formalin verwenden, wie die 10% (v/v) Formalinlösung in Meerwasser, die in dieser Studie verwendet wird, sind dafür bekannt, die Morphologie verschiedener mariner Wirbellose zu erhalten und werden häufig für MikroCT-Bildgebung verwendet18,24,25 ,26,28,30,33. Allerdings sind die Beschränkungen für die Verwendung dieser Chemikalie in einigen Ländern in den letzten Jahren streng geworden, und Ersatzstoffe wie Paraformaldehyd oder Glutaraldehyd können verwendet werden. Wenn es Pläne gibt, DNA nach dem Scannen zu extrahieren, ist es besser, formalin als Fixierung zu vermeiden, weil es bekannt ist, DNA zu fragmentieren. In diesem Fall wird die Verwendung von Fixativen empfohlen, die DNA-Konservierungsstoffe, wie z. B. 70% Ethanol, erhalten. In dieser Studie wurde die cnidarian A. equina mit 70% Ethanol fixiert, und aus den 70% Ethanol-fixierten Proben wurden klare MikroCT-Bilder gewonnen (Abbildung 6A, B).

In einer früheren Studie, die MikroCT-Scans von verschiedenen cnidarian Taxa durchgeführt, viele Proben wurden in 100% Ethanol dehydriert, und einige wurden kritisch-punktgetrocknet vor dem Scannen24. Obwohl weiche innere Organe wie Tentakelhaufen, Muskeln und Gonaden in ihrer Studie erfolgreich beobachtet wurden, sind Dehydrierungs- und Trocknungsprozesse dafür bekannt, dass sie zu wichtigen Artefakten wie der Verformung und Kontraktion von Weichgeweben führen11 , 21. In der vorliegenden Studie konnten wir die inneren Strukturen der cnidarian A. equina in 70% Ethanol fixiert und mit 25% Lugol-Lösung gefärbt beobachten (Abbildung 6A,B). Unser Protokoll, ohne Austrocknung sende oder Trocknungsschritte, ist vorzuziehen und sollte nach Möglichkeit durchgeführt werden, um das Risiko von Schäden an den Proben und Artefakten während des Scannens zu reduzieren.

Lugol-Lösung, Jodlösung und Phosphotungstiksäure (PTA) sind Färbelösungen, diehäufig auf biologischen Proben in der MikroCT-Bildgebung 6,7,9,14,16, 17,20,26,27,38. Aus unserer Erfahrung mit verschiedenen biologischen Proben lieferte die Lugol-Lösung die besten Ergebnisse für viele Proben, mit dunkler Färbung in relativ kurzer Zeit. Jodlösung ergab nur sehr schwache Flecken, und PTA benötigte eine lange Zeit für eine ausreichende Färbung und die gefärbten Proben zeigten starke Kontraktionen. Daher wurden alle Proben in dieser Studie mit Lugol-Lösung befleckt. Obwohl jedoch die Lugol-Lösung empfohlen wird, unterscheidet sich die geeignete Färbelösung zwischen den Proben, und wir schlagen vor, dass Versuche mit anderen Färbelösungen durchgeführt werden, wenn genügend Proben vorhanden sind. Unabhängig von der Färbelösung ziehen sich Proben während der Färbung37,38zusammen, daher ist es wichtig, die Färbezeit kurz zu halten.

Ein wichtiger Schritt beim MicroCT-Scannen besteht darin, die Probe so zu montieren, dass sie sich nicht bewegt. In dieser Studie wurde dies in zwei Schritten durchgeführt, zuerst mit Agarose als direktem Montagemedium und dann mit Ton, um das Rohr, das die Probe enthielt, auf die Bühne zu montieren. Für den ersten Schritt wurden in früheren Studien verschiedene Montagemedien mit geringer Dichte verwendet, darunter Ethanol6,17,20,25,30, Agarose9,29 , und Blumenschaum15,22,31. Agarose wurde in dieser Studie ausgewählt, da es sich um eine kostengünstige Chemikalie handelt, die weltweit zugänglich ist. Ein Nachteil von Agarose ist, dass es schwierig sein kann, die Probe nach dem Scannen aus der gehärteten Agarose zu holen, aber die Verwendung von Niedrigschmelzpunkt-Agarose erleichtert diesen Abrufschritt. Für den zweiten Schritt werden oft Kieferklemmen oder Schrauben verwendet6,9,17. Ton wurde in dieser Studie ausgewählt, da er feine Anpassungen in der Ausrichtung und im Winkel der Probe ermöglicht. Bei Experimenten mit langen Scanzeiten ist Vorsicht geboten, da die Möglichkeit, dass sich die Probe bewegt, bei Verwendung von Ton anstelle von Kieferklemmen oder Schrauben höher ist.

Eine frühere Studie führte MikroCT-Scans an sieben polychaete Arten mit Körperlängen von 2-8 mm durch, kleiner als die in dieser Studie verwendete Harmothoe sp.16. Sie waren in der Lage, hochauflösende Bilder zu erzeugen, und zeigten Organe wie Gefäßsysteme und einzelne Chaeta klarer als in der vorliegenden Studie. Die Hauptursache für diesen Unterschied war nicht das Protokoll, sondern die Spezifikationen der verwendeten microCT-Systeme. Das in der vorherigen Studie verwendete System war mit einer 11-Megapixel-Ladekamera (4000 x 2672 Pixel) mit einer maximalen Auflösung von <0,8 m/Pixel16ausgestattet. Die aktive Bildmatrixgröße des in dieser Studie verwendeten Systems betrug 992 x 992 Pixel mit einer maximalen Auflösung von >5 m/Pixel. Daher war die räumliche Auflösung des in dieser Studie verwendeten mikroCT-Systems schlechter als das in Faulwetter et al.16verwendete Hochleistungs-MikroCT-System. Dieser Unterschied war besonders deutlich, wenn Proben kleiner als 8 mm gescannt wurden, bei denen es an Auflösung fehlte (Daten nicht dargestellt). Da jedoch während des Scannens in dieser Studie weniger Daten gewonnen wurden, war die Scanzeit viel kürzer als in der vorherigen Studie16 (Daten: 992 x 992 bzw. 4000 x 2672 Pixel; Scanzeit: 10 bis 26 min und 30 min bis mehrere Stunden, bzw.). Eine kurze Scanzeit reduziert die Verfärbung der Jodfärbung und ermöglicht die Verwendung der Lugol-Lösung, die eine gute Färbelösung mit einer hohen Penetrationsrate ist, aber leicht in DW34diffundiert. Eine kurze Scanzeit verringert auch die Möglichkeit, dass sich die Probe während des Scannens bewegt, was die Verwendung einer einfachen Montagemethode mit Agarose oder DW ermöglichte (Abbildung 2). Längere Scanzeiten haben auch den Nachteil einer möglichen Schwischung der Probe in Bildern. Mehrere andere mechanische und Hardware-Probleme, die bei langen Scans auftreten können, wurden ebenfalls gemeldet39. Daher ist es bei der Verwendung von microCT-Systemen wichtig, die Spezifikation jedes Systems genau zu verstehen und das richtige System in Bezug auf Probengröße oder Forschungsziel zu wählen. In einigen Fällen kann ein MicroCT-System mit geringer Auflösung ausreichen.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Wir danken Toshihiko Shiroishi für seine Unterstützung und für die Bereitstellung des Forschungsumfelds während dieser Studie. Wir danken Kensuke Yanagi und Takato Izumi für Ihre Beratung zu A. equinaund Masaatsu Tanaka für Ihre Beratung zum Harmothoe sp. Exemplar. Wir danken den Mitarbeitern des Shimoda Marine Research Center, der Universität Tsukuba und der Misaki Marine Biological Station, The University of Tokyo für ihre Hilfe bei den Probensammlungen. Wir danken Editage (www.editage.jp) für die Englischsprachige Bearbeitung. Diese Arbeit wurde vom JSPS Grant-in-Aid for Young Scientists (A) (JP26711022) an HN und JAMBIO, Japanese Association for Marine Biology, unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
250-ml Erlenmeyer flask Corning CLS430183
5-ml Sampling tube ST-500 BIO-BIK 103010
50-ml Polypropylene tube Greiner Bio One International 227261
60-mm Non-treated Dish IWAKI 1010-060
Agarose Promega V3125
Ecological grade tip (blue) 1000 µl BMBio BIO1000RF
Ethanol Wako Pure Chemical Industries 057-00451
Formalin Wako Pure Chemical Industries 061-00416
Iodine Wako Pure Chemical Industries 094-05421
Magnesium chloride hexahydrate Wako Pure Chemical Industries 135-00165
OsiriX DICOM Viewer Pixmeo SARL OsiriX MD v10.0 https://www.osirix-viewer.com
Paraformaldehyde Wako Pure Chemical Industries 163-25983
Petiolate needle AS ONE 2-013-01
Pipetman P200 Micropipette GILSON F123601
Pipetman P1000 Micropipette GILSON F123602
Potassium iodide Wako Pure Chemical Industries 166-03971
Precision tweezers 5 DUMONT 0302-5-PS
QuickRack MultI fit tip (yellow) 200 ul Sorenson 10660
Razor blades Feather FA-10
Ring tweezers NAPOX A-26
Stereoscopic microscope Leica MZ95
X-ray Micro-CT imaging system Comscantechno ScanXmate-E090S105

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References

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Umweltwissenschaften Ausgabe 150 microCT Lugol-Lösung Jod Actinia Cnidaria Harmothoe Annelida Xenoturbella Xenacoelomorpha Wirbellose
Mikrofokus-Röntgen-CT (microCT) Bildgebung von <em>Actinia equina</em> (Cnidaria), <em>Harmothoe</em> sp. (Annelida) und <em>Xenoturbella japonica</em> (Xenacoelomorpha)
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Maeno, A., Kohtsuka, H., Takatani,… More

Maeno, A., Kohtsuka, H., Takatani, K., Nakano, H. Microfocus X-ray CT (microCT) Imaging of Actinia equina (Cnidaria), Harmothoe sp. (Annelida), and Xenoturbella japonica (Xenacoelomorpha). J. Vis. Exp. (150), e59161, doi:10.3791/59161 (2019).

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