Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Microfocus X-ray CT (microCT) Imaging av Actinia equina (Cnidaria), Harmothoe Sp. (Annelida), og Xenoturbella japonica (Xenacoelomorpha)

Published: August 6, 2019 doi: 10.3791/59161
Automatic Translation
1, 2, 3, 3
1Mammalian Genetics Laboratory, National Institute of Genetics, 2Misaki Marine Biological Station, The University of Tokyo, 3Shimoda Marine Research Center, University of Tsukuba

Summary

Her, protokoller for å utføre Microfocus X-ray beregnet tomografi (microCT) Imaging av tre Marine virvelløse dyr er forklart i detalj. Denne studien beskriver trinn som prøve fiksering, farging, montering, skanning, rekonstruksjon av bilder og dataanalyser. Forslag til hvordan protokollen kan justeres for ulike prøver er også gitt.

Abstract

Tradisjonelt har biologer måttet stole på destruktive metoder som snitting for å undersøke de indre strukturene i ugjennomsiktige organismer. Ikke-destruktiv Microfocus X-ray beregnet tomografi (microCT) Imaging har blitt en kraftig og voksende protokoll i biologi, på grunn av teknologiske fremskritt i prøven farging metoder og innovasjoner i microCT maskinvare, prosessering datamaskiner, og data analyseprogramvare. Imidlertid er denne protokollen ikke brukes ofte, som det er i de medisinske og industrielle felt. En av grunnene til denne begrensede bruken er mangelen på en enkel og forståelig Manual som dekker alle de nødvendige trinnene: sample samling, fiksering, farging, montering, skanning, og dataanalyser. En annen grunn er det store mangfoldet av Metazoer, spesielt Marine virvelløse dyr. På grunn av forskjellige størrelser, morfologier og physiologies i marine dyr er det avgjørende å justere eksperimentelle forhold og maskinvarekonfigurasjoner på hvert trinn, avhengig av prøven. Her er microCT Imaging metoder forklart i detalj ved hjelp av tre phylogenetically diverse Marine virvelløse dyr: Actinia equina (Anthozoa, Cnidaria), Harmothoe Sp. (Polychaeta, Annelida), og Xenoturbella japonica ( Xenoturbellida, Xenacoelomorpha). Forslag opp på utføre microCT tenkelig opp på forskjellige dyrene er likeledes forsynt.

Introduction

Biologiske forskere har generelt måttet lage tynne seksjoner og utføre observasjoner av lys eller elektron mikroskopi for å undersøke de indre strukturene i ugjennomsiktige organismer. Disse metodene er imidlertid destruktive og problematiske når de brukes på sjeldne eller verdifulle prøver. Videre er flere trinn i metoden, for eksempel innebygging og snitting, tidkrevende, og det kan ta flere dager å observere en prøve, avhengig av protokollen. Videre, ved håndtering av en rekke seksjoner, er det alltid en mulighet for å skade eller miste noen seksjoner. Vev clearing teknikker er tilgjengelig for noen eksemplarer1,2,3,4,5 men er ennå ikke aktuelt for mange dyrearter.

For å overkomme disse problemene, noen biologer har begynt å bruke Microfocus X-ray beregnet tomografi (microCT) Imaging6,7,8,9,10,11, 12,13,14,15. I røntgen CT er prøven bestrålt med røntgenstråler fra ulike vinkler som genereres fra en røntgen kilde som beveger seg rundt prøven, og de overførte Røntgenbildene overvåkes av en detektor som også beveger seg rundt prøven. Data innhentet for røntgen overføring analyseres for å rekonstruere tverrsnitt bilder av prøven. Denne metoden gjør det mulig observasjon av interne strukturer uten ødeleggelse av prøven. På grunn av sin sikkerhet og letthet, det er ofte brukt i medisinsk og Dental applikasjoner, og CT-systemer kan bli funnet i sykehus og tannlege sentre over hele verden. I tillegg brukes industrielle røntgen CT ofte til å observere ikke-medisinske prøver for inspeksjon og metrologi i det industrielle feltet. I motsetning til medisinsk CT, der røntgen kilde og detektorer er mobile, de to delene er festet i industriell CT, med prøven roterende under skanning. Industriell CT produserer generelt høyere oppløselige bilder enn medisinsk CT og er referert til som microCT (mikrometer-oppløsning) eller nanoCT (nanometer-nivå oppløsning). Nylig forskning bruker microCT har raskt økt i ulike felt av biologi14,15,16,17,18,19, 20 priser og , 21 priser og , 22 av , 23 andre , 24 priser og , 25 priser og , 26 i , 27 andre priser , 28 flere , 29 flere , 30 priser og , 31 andre , 32 for alle , 33 for alle , i 34.

Biologiske studier med CT i utgangspunktet målrettede interne strukturer som i hovedsak består av hardt vev, som bein. Fremskritt i farging teknikker ved hjelp av ulike kjemiske stoffer aktivert visualisering av bløtvev i ulike organismer6,7,8,9,14,15 , 16 flere , 17 i , 18 av år , 19 andre priser , 20 priser og , 21 priser og , 22 av , 23 andre , 24 priser og , 25 priser og , 26 i , 27 andre priser , 28 flere , 29 flere , 30 priser og , 31 andre , 32 for alle , 33 for alle , 34. av disse reagensene, jod-baserte kontrastmidler er relativt trygt, billig, og kan brukes til visualisering av bløtvev i ulike organismer7,14. Om Marine virvelløse dyr, microCT har vært mye brukt på slike dyr sombløtdyr 6,25,32,33,annelids 18,19, 20 priser og , 28, og arthoropods21,23,29,31. Imidlertid, der ha blitt få meddeler opp på annet dyr disse bakteriene, som bryozoans6, xenacoelomorphs26, og Trichoplax24,30. Generelt har det vært færre studier med microCT på Marine virvelløse dyr enn de på virveldyr. En viktig årsak til denne begrensede bruken på Marine virvelløse dyr er det store mangfoldet observert i disse dyrene. På grunn av de ulike størrelsene, morfologier og physiologies, reagerer hver art forskjellig på ulike eksperimentelle prosedyrer. Derfor er det avgjørende under prøve utarbeidelse å velge den mest hensiktsmessige fiksering og farging reagens, og å sette forholdene på hvert trinn, justert for hver art. På samme måte er det også nødvendig å angi skanne konfigurasjoner, for eksempel monteringsmetode, spenning, strøm, mekanisk forstørrelses kurs, og plass oppløsnings strømmen, hensiktsmessig for hver prøve. For å løse dette problemet, en enkel og forståelig Manual som dekker alle de nødvendige skritt, forklarer hvordan hvert trinn kan justeres avhengig av prøven, og viser detaljerte eksempler fra flere prøver er viktig.

I denne studien beskriver vi microCT bilde protokoll trinn for trinn, fra prøve fiksering til dataanalyse, ved bruk av tre Marine virvelløse arter. Eksemplarer av havet Anemone Actinia equina (Anthozoa, Cnidaria) ble samlet i nærheten av Misaki Marine biologiske stasjon, Universitetet i Tokyo. De hadde en sfærisk, myk kropp som var ca 2 cm i diameter (figur 1a-C). Harmothoe Sp. (Polychaeta, Annelida) prøvene ble også samlet inn i nærheten Misaki Marine Biological Station. De var slanke ormer som var ca 1,5 cm i lengde, med tøffe chaetae tilstede langs hele kroppen (figur 1d). En Xenoturbella japonica35 (Xenoturbellida, Xenacoelomorpha) prøven ble samlet inn i nærheten av Shimoda Marine Research Center, Universitetet i TSUKUBA, under 13Th JAMBIO Coastal organisme joint Survey. Det var en myk orm som var ca 0,8 cm i lengde (figur 1e). Justeringer som gjøres for betingelsene og konfigurasjonene i hvert utvalg er forklart i detalj. Vår studie gir flere forslag om hvordan du utfører microCT Imaging på Marine virvelløse dyr, og vi håper at det vil inspirere biologer til å utnytte denne protokollen for sin forskning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. fiksering

  1. For Actinia equina, slappe av dyrene i 10% MgCl2 sjøvann i ca 15 min ved romtemperatur. Overføring til 70% etanol og oppbevares ved romtemperatur.
  2. For Harmothoe Sp., bedøve dyrene ved å plassere dem i iskaldt sjøvann i ca 15 min. Overfør til 10% (v/v) formalin løsning med sjøvann og oppbevar ved romtemperatur.
  3. For Xenoturbella japonica, slappe av dyret ved hjelp av 7% MgCl2 i ferskvann. Fix i 4% paraformaldehyde (PFA) i filtrert sjøvann over natten. Plass i 70% etanol og oppbevares ved 4 ° c.
    FORSIKTIG: PFA er farlig og må håndteres med forsiktighet.

2. farging

  1. Overfør prøvene til 50% etanol og oppbevar ved romtemperatur i 15 timer. Erstatt 50% etanol med 25% etanol og oppbevar ved romtemperatur for 2 t.
    Merk: Dette er ikke nødvendig for Harmothoe Sp.-prøven i 10% (v/v) formalin løsning med sjøvann.
  2. Bytt ut oppløsningen med destillert vann (DW) og oppbevar prøvene i DW ved romtemperatur i 2 timer Gjenta dette trinnet tre ganger.
  3. Forbered 25% Lugol løsning ved å fortynne aksjen løsning (under) til 25% med DW. Stock-løsning (100% Lugol løsning) inneholder 10 g KI og 5 g av I2, justert til 100 ml med DW.
    Merk: Lugol løsningen er lysfølsom, så Oppbevar og håndter løsningen beskyttet mot lys. Følg regelverket til hvert land og institusjon for jod håndtering og avfallshåndtering.
  4. Dekanter DW fra prøvene og hell i 25% Lugol løsning. Stain i 24 timer ved romtemperatur.

3. montering av etappe

  1. Forbered 0,5% agarose ved oppløsning 500 mg agarose i 100 mL av DW i en 250 mL konisk kolbe i en mikrobølgeovn (800 W, ca 1-3 min). Avkjøl til ca 30-40 ° c ved å holde i romtemperatur.
    FORSIKTIG: ikke overopphetes eller helt forsegle kolbe når oppvarming for å hindre at agarose fra kokende over.
  2. Monter store prøver som a. equina ved hjelp av et 50 ml rør.
    Merk: Bruk 50 mL rør for montering av store prøver som ikke får plass i en 1 000 μL micropipette "blå" spiss.
    1. Plasser farget prøve i en 60-mm parabolen med DW å vaske av overdreven farging løsning fra overflaten.
    2. Hell forsiktig 5 mL 0,5% agarose i et 50 mL rør og herde agarose på isen. Vær forsiktig så du ikke lage bobler i agarose.
    3. Legg forsiktig 20 mL 0,5% agarose til 50 mL røret og plasser på isen til agarose begynner å stivne. Plasser prøven innenfor 0,5% agarose ved hjelp av tang. Vær forsiktig så du ikke lage bobler i agarose.
    4. Juster plasseringen og orienteringen av prøven med tang og herde agarose på isen.
    5. Plasser leire på microCT monteringstrinn og sett 50 mL røret på leire (figur 2A).
  3. Monter små prøver som Harmothoe Sp. og X. japonica ved hjelp av en 1 000 μL micropipette "blå" spiss.
    Merk: for mindre prøver kan 200 μL micropipette "gul" spiss brukes. I dette tilfellet, bruk 30 μL av agarose for pluggen og tilsett 200 μL av agarose eller destillert vann.
    1. Tegn opp 100 μL av 0,5% agarose i en 1 000 μL micropipette "blå" spiss og herde agarose ved å holde spissen over isen, noe som gjør en plugg i spissen (figur 2B-a).
    2. Dekanter den fargede prøven inn i en 60-mm rett uten å bruke tang.
    3. Forsiktig overføre prøven ved hjelp av ring pinsett til en annen 60-mm parabolen med DW å vaske av overdreven farging løsning fra overflaten.
    4. Tilsett 1 000 μL av enten 0,5% agarose eller DW inn i plugget spissen (trinn 3.3.1) ved hjelp av en micropipette.
      Merk: bruk av 0,5% agarose anbefales, men bruk DW for skjøre eller dyrebare prøver der agarose bør unngås.
    5. Forsiktig overføre prøven fra 60-mm parabolen inn i agarose eller DW i plugget spissen ved hjelp av ring pinsett.
    6. Juster forsiktig posisjonen og orienteringen til prøven med en petiolate nål eller presisjons pinsett. Vær forsiktig så du ikke lage bobler i monterings mediet. Pass på at prøven er stabil mellom veggene i spissen når DW brukes som montering medium (figur 2D-b). Plasser spissen på isen for å herde agarose hvis den brukes som festemiddel.
    7. Klipp tuppen av en ny 1 000 μL micropipette ' blå ' tupp (figur 2B-b, c) og sett tuppen av den tilkoblede spissen inn i den nye tuppen.
    8. Plasser leire på microCT montering scenen og sette tips med prøven inne på leire (figur 2C, D).
      Merk: farge løsningen vil begynne å vaske av prøven når den er plassert i DW, så Fortsett til neste skanning trinn omgående.

4. MicroCT skanning

  1. Slå på røntgen strålen ved 80 kV, 100 μA.
  2. Mens du observerer X-ray Transmission bildet på midten av skjermen (Figur 3A), Flytt scenen slik at hele prøven kan sees ved å klikke på X og Z akse knappene (Figur 3A), og manuelt justeringsknotten for Y-aksen på monterings trinnet (figur 3b). Angi kontrasten for bildet slik at de interne strukturene kan observeres ved å justere kontrast forholdene (Figur 3A: bilde kontrast).
  3. Juster retningen på prøven ved å endre vinkelen på røret/spissen i leiren (figur 2a). Roter scenen 90 ° ved å sette rotasjons aksen (Figur 3a) til 90 og klikke på knappen for relativ bevegelse (Figur 3a). Utfør samme manøver fire ganger for å fullføre en full rotasjon.
    Merk: du kan manuelt slå av X-ray-strålen hver gang prøve døren åpnes, med mindre systemet slår det av automatisk.
  4. Flytt scenen slik at prøven er i midten av visningen ved å klikke på Z-aksen knappen (Figur 3A) og ved å manuelt justere Y-aksen knotten på monterings trinnet (Figur 3B). Snu scenen med 90 ° og gjøre det samme. Snu scenen 360 ° og kontroller at prøven er i midten av visningen fra alle retninger.
  5. Flytt scenen langs x-aksen mot Røntgenstråle kilden ved å klikke på x-akse -knappen (Figur 3A) for å forstørre prøven og justere etter behov slik at den bare passer i visningen (Figur 3C).
  6. Drei scenen 360 ° og juster etter behov slik at prøven passer i visningen fra alle retninger.
  7. Juster skanne forholdene som vist i tabell 1.
  8. Start skanning; Det tar ca 10 min.

5. rekonstruksjon av bilde

  1. Start opp microCT-systemets tilbehørsprogram vare (se tabell over materialer) og åpne de skannede dataene.
  2. Juster forskjellene i rotasjons aksen for prøven under skanningen ved å klikke knappen for beregning av automatisk Skift verdi (Figur 4A: grønn boks).
  3. Juster bildets retning ved å rotere de oransje pilene (Figur 4B). Hvis retningen ble endret, gjentar du trinn 5,2.
  4. Falle i staver på område Tab (skikkelsen 4C: magenta bokse med) og trimme arealer der hvor eksemplar er ikke gave (skikkelsen 4C: gul bokse med).
  5. Klikk på fanen konfigurering (Figur 4D: magenta boks) og sett filtrene som følger for å fjerne støy. Ring gjenstand redusere filter: median filter-3; Støy eliminerings filter: gjennomsnittlig filter-1.
  6. Utfør konfigurering ved å klikke på knappen for konfigurasjon (Figur 4D: grønn boks).
  7. Juster bildets lysstyrke og kontrast ved å angi svart-hvitt-verdier som svart verdi 0, hvit verdi 250 (Figur 4D: Blue Box).
  8. Lagre rekonstruert TIFF-bildedata sett som en 8-bits TIFF ved å klikke på Lagre-knappen. Endre navn på TIFF-filer som følger: Date_sample_resolution (μm) _number. TIFF.
    Merk: den opprinnelige microCT datasett fra denne studien er tilgjengelig i Figshare depotet, Doi: 10.6084/M9. Figshare. 767083736.

6. data analyser

  1. Start opp dataanalyse programvaren (se tabell over materialer) og Aktiver import av TIFF-filer ved å klikke på database ikonet (figur 5A: magenta boks) og slå av boksen som vises i figur 5B.
  2. Klikk på import -ikonet (figur 5C: magenta boks), Velg datasettet som er lagret i del 5, og klikk på Åpne.
  3. Klikk på Kopier lenker -knappen (figur 5D) for å importere dataene.
  4. Vis 2D-tverrsnitt ved å klikke på 2D- visnings ikonet (figur 5C: Blue Box).
  5. Kalibrer datasettet ved å klikke kategorien 3D-visning (figur 5E: magenta boks) og angi oppløsningsverdien ved skanning (som var 0,018 i denne studien [figur 5F]).
  6. Klikk på lysstyrke/kontrast- ikonet (figur 5E Green Box). Juster lysstyrken og kontrasten ved å flytte markøren inne i det viste 2D-bildet og endre vindus nivået og vindusbredden (figur 5G).
  7. Kontroller andre tverrsnitt bilder ved å flytte rullefeltet (figur 5G: boks).
  8. Endre retningen på tverrsnitt ved å klikke på orienterings ikonet (figur 5E: blå boks) og kontroller bilder i alle retninger (figur 5H).
  9. Klikk på bildet som vises, og Velg Eksporter-fanen for å lagre bilder på tvers av avsnitt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi utførte microCT Imaging på A. equina (Anthozoa, Cnidaria), Harmothoe Sp. (Polychaeta, Annelida), og X. japonica (Xenoturbellida, Xenacoelomorpha) etter farging av prøvene med 25% Lugol løsning. Den farging vellykket forbedret kontrasten av interne strukturer i alle eksemplarer, slik at observasjoner av indre bløtvev (figur 6). Sammen med tidligere rapporter6,7,16,19, 22,23,24,25,26 , 28 flere , 30 priser og , 31 andre , 32 for alle , 33, dette viser at microCT kan brukes på ulike marine virvelløse dyr for å visualisere deres morfologi, inkludert myke indre vev. Klare bilder ble innhentet selv med X. japonica prøven, hvis epidermis var sterkt skadet (figur 6F, G), som viser at denne metoden gjelder for skjøre prøver med ytre skade.

Skanning bare regionen av interesse, i motsetning til et større område, betydelig økt klarhet og oppløsning av bildet (sammenlign figur 6F og figur 6G). Et enkelt datasett med høy oppløsning av en hel prøve ble imidlertid rekonstruert for Harmothoe Sp. (figur 6C) og X. japonica (figur 6F) fra flere skanninger utført på forskjellige (men overlappende) delene av prøven. Sømmene mellom hver skanning var iøynefallende i rekonstruert bildene. Vår studie viser at enkelt høyoppløselige bilder kan fås med membran-bjelke microCT systemer. Ved å skanne et større område med høy oppløsning, er det en mindre risiko for utsikt over små strukturer. En annen fordel er at det er lettere å finne den relative posisjoner av strukturer som ligger langt fra hverandre, for eksempel de fremre og bakre tuppen av en langstrakt ledd.

Figure 1
Figur 1 : Marine virvelløse dyr observert i denne studien. (A-C) Actinia equina (Anthozoa, Cnidaria). (A) ved slutten av et levende dyr avslappet i 10% MgCl2 sjøvann. (B) og proksimale (C) slutter etter fiksering i 70% etanol. (D) live anesthetized Harmothoe Sp. (Polychaeta, Annelida), rygg med fremre til venstre. De fleste av beina var allerede mangler på dette stadiet, med bare fire gjenværende nær bakre enden. (E) Xenoturbella japonica (Xenoturbellida, Xenacoelomorpha) fast i 70% etanol. Høyre utsikt, med fremre til toppen. På grunn av omstendighetene ved samlingen, var dens epidermis begynner å gå av. Skala bars = 3 mm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : Monterings prøver på Microfocus X-ray beregnet tomografi system. (A) monterings prøver i et 50 ml rør ved hjelp av leire. Orienteringen av prøven kan justeres ved hjelp av leire. (B) fremstilling av en 1 000 μL micropipette "blå" tupp for montering av små prøver. a: tipp med enden plugget med 100 μL av 0,5% agarose (diagonale linjer). Prøvene ble plassert i dette tipset. Spissen med prøven ble satt inn i en annen 1 000 μL micropipette "Blue" TIP (b, c) for montering. b ble brukt for Xenoturbella japonica, og c ble brukt til Harmothoe Sp. (c) montert X. japonica sample, oversikt (venstre) og lukke opp (til høyre). X-ray kilde kan sees til høyre for prøven. (D) diagrammer for monterings prøver i en 1 000 μL micropipette "blå" tupp. a: X. japonica prøve i destillert vann. b: prøven var i kontakt med spissen veggen (piler), slik at den ikke beveger seg under skanning. c: Harmothoe Sp. sample i 0,5% agarose. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 : Skanner prøver på Microfocus X-ray beregnet tomografi system. (A) Operating Screen under skanning av Microfocus x-ray beregnet tomografi system som viser et røntgenbilde av en Actinia equina prøve. Juster kontrasten og lysstyrken med ' bilde kontrast ' nederst til venstre. (B) visning av monterings trinnet som viser Y-akse-knotten. (C) røntgenbilde av A. equina prøven etter at monterings trinnet ble flyttet nærmere Røntgenstråle kilden. Legg merke til det er forstørret i forhold til bildet i sentrum av (A). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 : Operating Screen av bildet rekonstruksjon systemet. (A) skjerm for justering av forskjeller i rotasjons aksen i prøven under skanningen, som viser en Actinia equina prøve. Magenta boks: Shift kategorien; grønn boks: automatisk Skift Verdiberegning knapp. (B) skjerm for justering av bildets orientering, med Harmothoe Sp. vist. (C) skjerm under bildet rekonstruksjon av A. equina, trimming området utenfor den gule boksen der ingen prøver er til stede. Magenta boks: område fane. (D) skjerm under rekonstruksjon av bildet, viser rekonstruert bilde av A. equina. Magenta boks: kategorien konfigurering; grønn boks: konfigurere knapp; blå boks: justering av svart-hvitt-verdi. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5 : Betjenings skjermbildet til bildeanalyse systemet. (A) preferanse vindu. Databaseikonet (magenta sirkel) ble klikket for å åpne databasefil behandlings vinduet. (B) vinduet for administrasjon av database filer. I denne programvaren må boksen som vises med en pil være av for å aktivere import av TIFF-filer. (C) meny og verktøylinjer på database skjermen. Magenta boks = import ikon; blå boks = 2D visnings ikon. (D) importvinduet for DataSet. Magenta sirkel = Kopier koblinger-knappen. (E) meny-og verktøylinjer på 2D-visningsskjermen. Magenta boks = 3D-visning kategorien; grønn boks = lysstyrke/kontrast ikon; blå boks = orientering ikon. (F) kalibrerings innstillingsvindu. Angi ønskede oppløsnings verdier i kolonnene i den magenta boksen. (G) tverrsnitt av en Actinia equina prøve som vises i 2D visningsvinduet for justering av lysstyrke og kontrast. Magenta boks: rullefelt for å kontrollere andre tverrsnitt. (H) tverrsnitt av A. equina som vises i 2D-vinduet med en annen orientering til (G). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6 : Skannet og rekonstruert bilder av marin virvelløse dyr. (A) tverrgående og (B) langsgående seksjoner av Actinia equina. Området inne i den prikkete gule boksen i (B) forstørres i innfelt. Forkortelser: DM, par av direktivet mesenteries; m, par perfekte mesenteries; MF, mesenterial filament; p, svelg; si, siphonoglyphs; t, tentakkel; piler, Oral plate; hvite pilspisser, pedal plate; svarte pilspisser, lukkemuskelen. Skala stolper i A, B = 3 mm. (C-E) Harmothoe Sp. (c) sagittal delen av den fremre delen. (D, E) Tverrgående seksjon på de prikkede linjene d og e i (C). Forkortelser: ACI = aciculum; ACIM = acicular muskel; Coe = coelom; DLM = rygg langsgående muskel; ELP = elytrophore; Eye = øyet; int = tarmen; kjeve = kjeve; Mant = median antenne; Mo = munn; MP = musklene i snabel; Palp = Palp; Pha = svelg; prob = snabel; VLM = ventrale langsgående muskel; VNC = ventrale nerve ledningen. Vektstenger: C = 1 mm; D, E = 0,3 mm. (F, G) Xenoturbella japonica. (F) sagittal delen av hele prøven. (G) sagittal delen av den fremre delen. bl = basal lamina; int = tarmen; ml = muskel lag; Mo = munn; nn = intraepidermal nerve nett; hvit pil = statocyst; svart pil = frontal pore; hvit pilspisser = ventrale kjertel nettverk; svarte pilspisser = oocytter. Vektstenger: F = 1 mm, G = 0,5 mm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Table 1
Tabell 1: eksempel på klargjørings-og skanne protokoll for hver prøve.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Fiksativene ved hjelp av formalin, for eksempel 10% (v/v) formalin løsning i sjøvann som brukes i denne studien, er kjent for å bevare morfologi av forskjellige Marine virvelløse dyr og brukes ofte for microCT Imaging18,24,25 ,26,28,30,33. Men restriksjoner på bruk av dette kjemiske har blitt strenge i noen land de siste årene, og erstatninger som paraformaldehyde eller glutaraldehyde kan brukes. Hvis det er planer om å trekke ut DNA etter skanning, er det bedre å unngå å bruke formalin som en bindemiddel, fordi det er kjent for å fragment DNA. I dette tilfellet anbefales bruk av fiksativene som bevarer DNA, for eksempel 70% etanol. I denne studien ble Nesledyr A. equina fast ved hjelp av 70% etanol, og klare microCT bilder ble innhentet fra 70% etanol-faste prøver (figur 6A, B).

I en tidligere studie som utførte microCT skanning av ulike Nesledyr dyr, mange prøvene ble dehydrert i 100% etanol, og noen var kritiske-Point-tørket før skanning24. Selv om myke indre organer som tentakkel klynger, muskler, og gonader ble observert i sin studie, dehydrering og tørking prosesser er kjent for å resultere i store gjenstander som deformasjon og sammentrekning av bløtvev11 , 21. i denne studien, var vi i stand til å observere de interne strukturene i Nesledyr A. equina fast i 70% etanol og beiset med 25% Lugol løsning (figur 6A, B). Vår protokoll, uten dehydrering eller tørking trinn, er å foretrekke, og bør utføres når det er mulig å redusere risikoen for skade på prøver og gjenstander under skanning.

Lugol løsning, jod løsning og phosphotungstic acid (PTA) er farging løsninger som ofte brukes på biologiske prøver i microCT Imaging6,7,9,14,16, 17,20,26,27,38. Fra vår erfaring med å bruke ulike biologiske prøver, Lugol løsning gitt de beste resultatene for mange prøver, med mørke flekker på relativt kort tid. Jod løsning gitt bare svært svake flekker, og PTA kreves lang tid for tilstrekkelig farging og beiset prøvene viste sterke sammentrekninger. Derfor ble alle prøvene farget med Lugol løsning i denne studien. Selv om Lugol-løsningen anbefales, varierer imidlertid den aktuelle farge løsningen mellom prøver, og vi foreslår at forsøk med andre fargeløsninger utføres hvis det er nok prøver. Uavhengig av farging løsningen, prøver gjøre kontrakt under farging37,38, så det er viktig å holde flekker tid kort.

Et kritisk trinn i microCT skanning er å montere prøven slik at den ikke beveger seg. I denne studien ble dette utført i to trinn, først ved hjelp av agarose som direkte montering medium, og deretter bruke leire for å montere røret som inneholdt prøven til scenen. For det første trinnet, har ulike lav tetthet montering Media blitt brukt i tidligere studier, inkludert etanol6,17,20,25,30, agarose9,29 , og floral skum15,22,31. Agarose ble valgt i denne studien da det er en rimelig kjemikalie som er tilgjengelig over hele verden. En ulempe ved agarose er at det kan være vanskelig å hente prøven fra herdet agarose etter skanning, men ved hjelp av lav-smelting-punkt agarose gjør dette henting trinn enklere. For det andre trinnet, kjeve klemmer eller skruer er ofte brukt6,9,17. Clay ble valgt i denne studien som det gir fine justeringer i retning og vinkel på prøven. Forsiktighet er nødvendig for eksperimenter med lang skanning ganger, da muligheten for prøven beveger seg høyere ved bruk av leire i stedet for kjeve klemmer eller skruer.

En tidligere studie gjennomført microCT skanning på syv polychaeten arter med kroppen lengder på 2-8 mm, mindre enn Harmothoe Sp. brukt i denne studien16. De var i stand til å generere bilder med høy oppløsning, og viste organer som vaskulære systemer og individuelle chaeta klarere enn i dagens studie. Den viktigste årsaken til denne forskjellen var ikke protokollen, men spesifikasjonene til microCT-systemene som ble brukt. Systemet som brukes i den forrige studien var utstyrt med en 11-megapiksel lade-kombinert enhets kamera (4000 x 2672 piksler) med en maksimal oppløsning på < 0,8 μm/pixel16. Den aktive bilde Matrix størrelsen på systemet som ble brukt i denne studien var 992 x 992 piksler, med en maksimal oppløsning på > 5 μm/piksel. Derfor var den romlige oppløsningen til microCT-systemet som ble brukt i denne studien, dårligere enn microCT-systemet med høy ytelse som ble brukt i Faulwetter et al.16. Denne forskjellen var spesielt merkbar ved skanning prøver mindre enn 8 mm, der vi opplevde en mangel på oppløsning (data ikke vist). Men fordi færre data ble innhentet under skanning i denne studien, skanningen tid var mye kortere enn i den forrige studien16 (data: 992 x 992 og 4000 x 2672 piksler, henholdsvis; skanning tid: 10 til 26 min og 30 min til flere timer, (henholdsvis). En kort skanning tid reduserer misfarging av jod farging, slik at bruk av Lugol løsning, som er en god farging løsning med høy penetrasjon rate, men lett diffunderer i DW34. En kort skanning tid også reduserer muligheten for prøven beveger seg under skanning, som aktiverte bruken av en enkel montering metode ved hjelp av agarose eller DW (figur 2). Lengre skanning ganger har også ulempen med mulig sample krymping uskarphet i bilder. Flere andre mekaniske og hardware problemer som kan oppstå under lange skanninger har også blitt rapportert39. Derfor, når du bruker microCT systemer, er det viktig å nøyaktig forstå spesifikasjonen av hvert system, og å velge riktig system i form av prøvestørrelse eller forsknings mål. I noen tilfeller kan et microCT-system med lav oppløsning være tilstrekkelig.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Vi vil gjerne takke Toshihiko Shiroishi for hans assistanse og for å gi forskningsmiljøet i løpet av denne studien. Vi er takknemlige for Kensuke Yanagi og Takato Izumi for råd om A. equina, og Masaatsu Tanaka for råd om Harmothoe Sp. prøven. Vi vil gjerne takke de ansatte ved Shimoda Marine Research Center, Universitetet i Tsukuba, og Misaki Marine Biological Station, The University of Tokyo for deres hjelp i utvalget samlinger. Vi vil gjerne takke Editage (www.editage.jp) for engelsk språk redigering. Dette arbeidet ble støttet av JSP Grant-in-Aid for unge forskere (A) (JP26711022) til HN, og JAMBIO, Japanese Association for marinbiologi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
250-ml Erlenmeyer flask Corning CLS430183
5-ml Sampling tube ST-500 BIO-BIK 103010
50-ml Polypropylene tube Greiner Bio One International 227261
60-mm Non-treated Dish IWAKI 1010-060
Agarose Promega V3125
Ecological grade tip (blue) 1000 µl BMBio BIO1000RF
Ethanol Wako Pure Chemical Industries 057-00451
Formalin Wako Pure Chemical Industries 061-00416
Iodine Wako Pure Chemical Industries 094-05421
Magnesium chloride hexahydrate Wako Pure Chemical Industries 135-00165
OsiriX DICOM Viewer Pixmeo SARL OsiriX MD v10.0 https://www.osirix-viewer.com
Paraformaldehyde Wako Pure Chemical Industries 163-25983
Petiolate needle AS ONE 2-013-01
Pipetman P200 Micropipette GILSON F123601
Pipetman P1000 Micropipette GILSON F123602
Potassium iodide Wako Pure Chemical Industries 166-03971
Precision tweezers 5 DUMONT 0302-5-PS
QuickRack MultI fit tip (yellow) 200 ul Sorenson 10660
Razor blades Feather FA-10
Ring tweezers NAPOX A-26
Stereoscopic microscope Leica MZ95
X-ray Micro-CT imaging system Comscantechno ScanXmate-E090S105

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Susaki, E. A., Tainaka, K., Perrin, D., Yukinaga, H., Kuno, A., Ueda, H. R. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10, 1709-1727 (2015).
  2. Susaki, E. A., Ueda, H. R. Whole-body and whole-organ clearing and imaging techniques with single-cell resolution: toward organism-level systems biology in mammals. Cell Chemical Biology. 23, 137-157 (2016).
  3. Silvestri, L., Costantini, I., Sacconi, L., Pavone, F. S. Clearing of fixed tissue: a review from a microscopist's perspective. Journal of Biomedical Optics. 21, 081205 (2016).
  4. Greenbaum, A., et al. Bone CLARITY: clearing, imaging, and computational analysis of osteoprogenitors within intact bone marrow. Science Translational Medicine. 9, (2017).
  5. Konno, A., Okazaki, S. Aqueous-based tissue clearing in crustaceans. Zoological Letters. 4, 13 (2018).
  6. Metscher, B. D. MicroCT for comparative morphology: simple staining methods allow high-contrast 3D imaging of diverse non-mineralized animal tissues. BMC Physiology. 9, 11 (2009).
  7. Metscher, B. D. MicroCT for developmental biology: a versatile tool for high-contrast 3D imaging at histological resolutions. Developmental Dynamics. 238 (3), 632-640 (2009).
  8. Degenhardt, K., Wright, A. C., Horng, D., Padmanabhan, A., Epstein, J. A. Rapid 3D phenotyping of cardiovascular development in mouse embryos by micro-CT with iodine staining. Circulation Cardiovascular Imaging. 3 (3), 314-322 (2010).
  9. Metscher, B. D. X-ray microtomographic imaging of intact vertebrate embryos. Cold Spring Harbor Protocols. 12, 1462-1471 (2011).
  10. Boistel, R., Swoger, J., Kržič, U., Fernandez, V., Gillet, B., Reynaud, E. G. The future of three-dimensional microscopic imaging in marine biology. Marine Ecology. 32, 438-452 (2011).
  11. Mizutani, R., Suzuki, Y. X-ray microtomography in biology. Micron. 43, 104-115 (2012).
  12. Merkle, A. P., Gelb, J. The ascent of 3D X-ray microscopy in the laboratory. Microscopy Today. 21, 10-15 (2013).
  13. Ziegler, A., Menze, B. H. Accelerated acquisition, visualization, and analysis of zooanatomical data. Computation for humanity. Information technology to advance society. Zander, J., Mosterman, P. J. , CRC Press. Boca Raton, USA. 233-260 (2013).
  14. Gignac, P. M., et al. Diffusible iodine-based contrast-enhanced computed tomography (diceCT): an emerging tool for rapid, high-resolution, 3-D imaging of metazoan soft tissues. Journal of Anatomy. 228 (6), 889-909 (2016).
  15. du Plessis, A., Broeckhoven, C., Guelpa, A., le Roux, S. G. Laboratory x-ray micro-computed tomography: a user guideline for biological samples. GigaScience. 6 (6), 1-11 (2017).
  16. Faulwetter, S., Vasileiadou, A., Kouratoras, M., Dailianis, T., Arvanitidis, C. Micro-computed tomography: Introducing new dimensions in taxonomy. ZooKeys. 263, 1-45 (2013).
  17. Staedler, Y. M., Masson, D., Schonenberger, J. Plant tissues in 3D via X-ray tomography: simple contrasting methods allow high resolution imaging. PLoS One. 8 (9), 75295 (2013).
  18. Fernández, R., Kvist, S., Lenihan, J., Giribet, G., Ziegler, A. Sine Systemate Chaos? A Versatile Tool for Earthworm Taxonomy: Non-Destructive Imaging of Freshly Fixed and Museum Specimens Using Micro-Computed Tomography. PLoS One. 9 (5), 96617 (2014).
  19. Paterson, G. L. J., et al. The pros and cons of using micro-computed tomography in gross and microanatomical assessments of polychaetous annelids. Memoirs of Museum Victoria. 71, 237-246 (2014).
  20. Faulwetter, S., Dailianis, T., Vasileiadou, K., Kouratoras, M., Arvanitidis, C. Can micro-CT become an essential tool for the 21st century taxonomist? An evaluation using marine polychaetes. Microscopy and Analysis. 28, 9-11 (2014).
  21. Sombke, A., Lipke, E., Michalik, P., Uhl, G., Harzsch, S. Potential and limitations of X-ray micro-computed tomography in arthropod neuroanatomy: a methodological and comparative survey. Journal of Comparative Neurology. 523, 1281-1295 (2015).
  22. Landschoff, J., Plessis, A., Griffiths, C. L. A dataset describing brooding in three species of South African brittle stars, comprising seven high-resolution, micro X-ray computed tomography scans. GigaScience. 4 (1), 52 (2015).
  23. Keiler, J., Richter, S., Wirkner, C. S. The anatomy of the king crab Hapalogaster mertensii Brandt, 1850 (Anomura: Paguroidea: Hapalogastridae) - new insights into the evolutionary transformation of hermit crabs into king crabs. Contributions to Zoology. 84 (2), 149-165 (2015).
  24. Holst, S., Michalik, P., Noske, M., Krieger, J., Sötje, I. Potential of X-ray micro-computed tomography for soft-bodied and gelatinous cnidarians with emphasis on scyphozoan and cubozoan statoliths. Journal of Plankton Research. 38, 1225-1242 (2016).
  25. Moles, J., Wägele, H., Ballesteros, M., Pujals, Á, Uhl, G., Avila, C. The End of the Cold Loneliness: 3D Comparison between Doto antarctica and a New Sympatric Species of Doto (Heterobranchia: Nudibranchia). PLoS One. 11 (7), 0157941 (2016).
  26. Nakano, H., et al. A new species of Xenoturbella from the western Pacific Ocean and the evolution of Xenoturbella. BMC Evolutionary Biology. 17, 245 (2017).
  27. Tsuda, K., et al. KNOTTED1 Cofactors, BLH12 and BLH14, Regulate Internode Patterning and Vein Anastomosis in Maize. Plant Cell. 29 (5), 1105-1118 (2017).
  28. Parapar, J., Candás, M., Cunha-Veira, X., Moreira, J. Exploring annelid anatomy using micro-computed tomography: A taxonomic approach. Zoologischer Anzeiger. 270, 19-42 (2017).
  29. Akkari, N., Ganske, A. S., Komerički, A., Metscher, B. New avatars for Myriapods: Complete 3D morphology of type specimens transcends conventional species description (Myriapoda, Chilopoda). PLoS One. 13 (7), 0200158 (2018).
  30. Gusmao, L. C., Grajales, A., Rodriguez, E. Sea anemones through X-rays: visualization of two species of Diadumene (Cnidaria, Actiniaria) using micro-CT. American Museum Novitates. 3907, (2018).
  31. Landschoff, J., Komai, T., du Plessis, A., Gouws, G., Griffiths, C. L. MicroCT imaging applied to description of a new species of Pagurus Fabricius, 1775 (Crustacea: Decapoda: Anomura: Paguridae), with selection of three-dimensional type data. PLoS One. 13 (9), 0203107 (2018).
  32. Machado, F. M., Passos, F. D., Giribet, G. The use of micro-computed tomography as a minimally invasive tool for anatomical study of bivalves (Mollusca: Bivalvia). Zoological Journal of the Linnean Society. , (2018).
  33. Sasaki, T., et al. 3D visualization of calcified and non-calcified molluscan tissues using computed tomography. Biomineralization. Endo, K., Kogure, T., Nagasawa, H. , Springer. Singapore. 83-93 (2018).
  34. Maeno, A., Tsuda, K. Micro-computed Tomography to Visualize Vascular Networks in Maize Stems. Bio-protocol. 8 (1), 2682 (2018).
  35. Nakano, H., et al. Correction to: A new species of Xenoturbella from the western Pacific Ocean and the evolution of Xenoturbella. BMC Evolutionary Biology. 18, 83 (2018).
  36. Maeno, A., Kohtsuka, H., Takatani, K., Nakano, H. MicroCT files from 'Microfocus X-ray computed tomography (microCT) imaging of Actinia equina (Cnidaria), Harmothoe sp. (Annelida), and Xenoturbella japonica (Xenacoelomorpha)'. figshare. , (2019).
  37. Vickerton, P., Jarvis, J., Jeffery, N. Concentration-dependent specimen shrinkage in iodine-enhanced microCT. Journal of Anatomy. 223 (2), 185-193 (2013).
  38. Buytaert, J., Goyens, J., De Greef, D., Aerts, P., Dirckx, J. Volume shrinkage of bone, brain and muscle tissue in sample preparation for micro-CT and light sheet fluorescence microscopy (LSFM). Microscopy and Microanalysis. 20 (4), 1208-1217 (2014).
  39. Sasov, A., Liu, X., Salmon, P. L. Compensation of mechanical inaccuracies in micro-CT and nano-CT. Proceedings of SPIE. 7078, 70781 (2008).

Tags

Environmental Sciences microCT Lugol løsning jod Actinia Cnidaria Harmothoe Annelida Xenoturbella Xenacoelomorpha virvelløse dyr
Microfocus X-ray CT (microCT) Imaging av <em>Actinia equina</em> (Cnidaria), <em>Harmothoe</em> Sp. (Annelida), og <em>Xenoturbella japonica</em> (Xenacoelomorpha)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Maeno, A., Kohtsuka, H., Takatani,… More

Maeno, A., Kohtsuka, H., Takatani, K., Nakano, H. Microfocus X-ray CT (microCT) Imaging of Actinia equina (Cnidaria), Harmothoe sp. (Annelida), and Xenoturbella japonica (Xenacoelomorpha). J. Vis. Exp. (150), e59161, doi:10.3791/59161 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter