Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

ميكروفوكس الأشعة السينية CT (microCT) التصوير من أكتينيا إكوينا (Cnidaria)، Harmothoe sp. (Annelida)، وXenoturbella japonica (Xenacoelomorpha)

Published: August 6, 2019 doi: 10.3791/59161
Automatic Translation
1, 2, 3, 3
1Mammalian Genetics Laboratory, National Institute of Genetics, 2Misaki Marine Biological Station, The University of Tokyo, 3Shimoda Marine Research Center, University of Tsukuba

Summary

هنا، يتم شرح بروتوكولات إجراء التصوير المقطعي المحوسب بالأشعة السينية (microCT) لثلاثة من الحيوانات اللافقارية البحرية بالتفصيل. تصف هذه الدراسة خطوات مثل تثبيت العينة، وتلطيخ العينة، والتركيب، والمسح الضوئي، وإعادة بناء الصورة، وتحليل البيانات. كما تقدم اقتراحات بشأن كيفية تعديل البروتوكول لعينات مختلفة.

Abstract

وتقليديا، كان على علماء الأحياء أن يعتمدوا على أساليب تدميرية مثل التشعب من أجل التحقيق في الهياكل الداخلية للكائنات الحية غير الشفافة. أصبح التصوير المقطعي المحوسب بالأشعة السينية (microCT) غير المدمرة بروتوكولًا قويًا وناشئًا في علم الأحياء، وذلك بسبب التقدم التكنولوجي في أساليب تلطيخ العينات والابتكارات في أجهزة microCT وأجهزة المعالجة والبيانات تحليل البرمجيات. ومع ذلك، فإن هذا البروتوكول غير شائع الاستخدام، كما هو الحال في المجالين الطبي والصناعي. أحد أسباب هذا الاستخدام المحدود هو عدم وجود دليل بسيط ومفهوم يغطي جميع الخطوات الضرورية: جمع العينات، والتثبيت، وتلطيخ، وتركيب، والمسح الضوئي، وتحليل البيانات. وثمة سبب آخر هو التنوع الواسع للميتازوان، ولا سيما اللافقاريات البحرية. وبسبب الأحجام المتنوعة لللافقاريات البحرية، والمورفولوجيا، والفيزيولوجيا، من الأهمية بمكان ضبط الظروف التجريبية وتكوينات الأجهزة في كل خطوة، حسب العينة. هنا، يتم شرح أساليب التصوير المجهري بالتفصيل باستخدام ثلاثة لافقاريات بحرية متنوعة وراثيا: أكتينيا إكوينا (أنثوزوا، كانيداريا)، هارموتهو سب(بوليشيتا، أنيليدا)، وXenoturbella japonica ( Xenoturbellida, Xenacoelomorpha). كما تقدم اقتراحات بشأن إجراء التصوير المجهري على مختلف الحيوانات.

Introduction

وكان على الباحثين البيولوجيين عموما أن يقوموا بأقسام رفيعة وأن يقوموا بالمراقبة عن طريق المجهر الضوئي أو الإلكتروني من أجل التحقيق في الهياكل الداخلية للكائنات الحية غير الشفافة. ومع ذلك، فإن هذه الأساليب مدمرة وإشكالية عند تطبيقها على عينات نادرة أو قيمة. وعلاوة على ذلك، عدة خطوات في الأسلوب، مثل التضمين والمقطع، تستغرق وقتاً طويلاً، ويمكن أن يستغرق عدة أيام لمراقبة عينة، اعتماداً على البروتوكول. وعلاوة على ذلك، عند التعامل مع العديد من الأقسام، هناك دائما إمكانية إلحاق الضرر أو فقدان بعض الأقسام. تقنيات إزالة الأنسجة متاحةلبعض العينات 1،2،3،4،5 ولكن لا تنطبق حتى الآن على العديد من الأنواع الحيوانية.

للتغلب على هذه المشاكل، بدأ بعض علماء الأحياء باستخدام التصوير المقطعي المحوسب بالأشعة السينية(microCT)6و7و8 و9 و10و11، 12،13،14،15. في الأشعة السينية المقطعية، يتم تشعيع العينة بأشعة سينية من زوايا مختلفة يتم إنشاؤها من مصدر الأشعة السينية التي تتحرك حول العينة، ويتم رصد الأشعة السينية المرسلة بواسطة كاشف يتحرك أيضا حول العينة. يتم تحليل بيانات الإرسال بالأشعة السينية التي تم الحصول عليها لإعادة بناء الصور المقطعية للعينة. تمكن هذه الطريقة من مراقبة الهياكل الداخلية دون تدمير العينة. بسبب سلامتها وسهولة، ويستخدم عادة في التطبيقات الطبية وطب الأسنان، ويمكن العثور على أنظمة التصوير المقطعي المحوسب في المستشفيات ومراكز طب الأسنان في جميع أنحاء العالم. وعلاوة على ذلك، كثيرا ما تستخدم الأشعة السينية الصناعية للأشعة المقطعية لمراقبة العينات غير الطبية للتفتيش والقياس في المجال الصناعي. وعلى النقيض من التصوير المقطعي المحوسب الطبي، الذي يكون فيه مصدر الأشعة السينية وأجهزة الكشف متنقلة، يتم إصلاح الجزأين في التصوير المقطعي المحوسب الصناعي، مع تدوير العينة أثناء المسح الضوئي. تنتج CT الصناعية بشكل عام صورًا ذات دقة أعلى من التصوير المقطعي المحوسب الطبي ويشار إليها باسم microCT (دقة على مستوى الميكرومتر) أو nanoCT (دقة على مستوى النانومتر). في الآونة الأخيرة، وقد زادت البحوث باستخدام microCT بسرعة في مختلف مجالات البيولوجيا14،15،16،17،18،19، 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34.

استهدفت الدراسات البيولوجية باستخدام التصوير المقطعي المحوسب في البداية الهياكل الداخلية التي تتكون أساسا من الأنسجة الصلبة، مثل العظام. التقدم في تقنيات تلطيخ باستخدام مختلف العوامل الكيميائية تمكينالتصور من الأنسجة الرخوة في مختلف الكائنات الحية 6،7،8،9،14،15 , 16 سنة , 17 سنة , 18 سنة , 19 سنة , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34- ومن بين هذه الكواشف، تكون عوامل التباين القائمة على اليود مأمونة نسبيا وغير مكلفة، ويمكن استخدامها في تصور الأنسجة الرخوة في مختلف الكائنات الحية7و14. وفيما يتعلق باللافقاريات البحرية، تم استخدام microCTعلى نطاق واسع على الحيوانات مثل الرخويات 6،25،32،33،الأنليدات18،19، 20 , 28، وarthoropods21،23،29،31. ومع ذلك، كانت هناك تقارير قليلة عن فيلا الحيوانات الأخرى، مثل bryozoans6، xenacoelomorphs26، وcnidarians24،30. وبوجه عام، كانت هناك دراسات أقل استخداماً للميكروكت على اللافقاريات البحرية من الدراسات المتعلقة بالفقاريات. وأحد الأسباب الرئيسية لهذا الاستخدام المحدود لللافقاريات البحرية هو التنوع الواسع الذي لوحظ في هذه الحيوانات. بسبب أحجامها المتنوعة، والمورفولوجيا، والفيزيولوجيا، كل نوع يتفاعل بشكل مختلف مع الإجراءات التجريبية المختلفة. ولذلك، فمن الأهمية بمكان أثناء إعداد العينة لاختيار التثبيت الأنسب وتلطيخ الكاشف، ووضع الظروف في كل خطوة، وتعديلها لكل نوع. وبالمثل، فمن الضروري أيضا لتعيين تكوينات المسح الضوئي، مثل طريقة التركيب، والجهد، والحالية، ومعدل المكبرة الميكانيكية، ومساحة القرار السلطة، بشكل مناسب لكل عينة. للتغلب على هذه المشكلة، دليل بسيط ومفهوم يغطي جميع الخطوات الضرورية، ويوضح كيف يمكن تعديل كل خطوة اعتمادا على العينة، ويظهر أمثلة مفصلة من عينات متعددة أمر ضروري.

وفي هذه الدراسة، نوصف بروتوكول التصوير المجهري خطوة بخطوة، من تثبيت العينات إلى تحليل البيانات، باستخدام ثلاثة أنواع من اللافقاريات البحرية. وقد جُمعت عينات من النعمان البحرية أكتينيا إكوينا (أنثوزوا، كانداريا) بالقرب من محطة ميساكي البيولوجية البحرية، جامعة طوكيو. كان لديهم كروية، والجسم لينة التي كانت حوالي 2 سم في القطر (الشكل1A-C). كما جُمعت عينات من مادة هارموتهو (بوليشايتا، أنيليدا) بالقرب من محطة ميساكي البيولوجية البحرية. كانت الديدان النحيلة التي كانت حوالي 1.5 سم في الطول، مع chaetae صعبة موجودة على طول الجسم كله (الشكل1D). تم جمع عينة Xenoturbella japonica35 (Xenoturbellida, Xenacoelomorpha) بالقرب من مركز بحوث شيمودا البحرية، جامعة تسوكوبا، خلال المسح المشترك الثالث عشر للكائن الحي الساحلي جامبيو. كانت دودة لينة الجسم الذي كان حوالي 0.8 سم في الطول (الشكل1E). يتم شرح التعديلات التي أجريت لشروط وتكوينات كل عينة بالتفصيل. تقدم دراستنا العديد من الاقتراحات حول كيفية إجراء التصوير المجهري على اللافقاريات البحرية، ونأمل أن يلهم علماء الأحياء لاستخدام هذا البروتوكول لأبحاثهم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. التثبيت

  1. لActinia equina،والاسترخاء الحيوانات في 10٪ MgCl2 مياه البحر لمدة 15 دقيقة تقريبا في درجة حرارة الغرفة. نقل إلى 70٪ الإيثانول وتخزينها في درجة حرارة الغرفة.
  2. لHarmothoe sp.، التخدير الحيوانات عن طريق وضعها في مياه البحر الباردة الجليد لمدة 15 دقيقة تقريبا نقل إلى 10٪ (V / v) حل رسمي مع مياه البحر وتخزينها في درجة حرارة الغرفة.
  3. لXenoturbella جابونيكا،والاسترخاء الحيوان باستخدام 7٪ MgCl2 في المياه العذبة. إصلاح في 4٪ بارافورمالدهايد (PFA) في مياه البحر المصفاة بين عشية وضحاها. مكان في الإيثانول 70٪ وتخزينها في 4 درجة مئوية.
    تحذير: PFA خطرة ويجب التعامل معها بعناية.

2. تلطيخ

  1. نقل العينات إلى 50٪ الإيثانول وتخزينها في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 ح. استبدال الإيثانول 50٪ مع 25٪ الإيثانول وتخزينها في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة.
    ملاحظة: هذا ليس ضروريا ً لعينة Harmothoe sp. في 10% (v/v) حل رسمي مع مياه البحر.
  2. استبدال الحل بالماء المقطر (DW) وتخزين العينات في DW في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ح. كرر هذه الخطوة ثلاث مرات.
  3. إعداد 25٪ حل Lugol عن طريق تخفيف حل الأسهم (أدناه) إلى 25٪ مع DW. حل الأوراق المالية (100٪ محلول Lugol) يحتوي على10 غرام من KI و 5 غرام من I 2، وتعديلها إلى 100 مل مع DW.
    ملاحظة: حل Lugol حساس للضوء، لذلك تخزين والتعامل مع الحل المحمية من الضوء. اتباع لوائح كل بلد ومؤسسة لمعالجة اليود والتخلص من النفايات.
  4. Decant DW من العينات وتصب في محلول Lugol 25٪. وصمة عار لمدة 24 ساعة في درجة حرارة الغرفة.

3. مرحلة التركيب

  1. إعداد 0.5٪ أغاروز عن طريق حل 500 ملغ أغاروز في 100 مل من DW في قارورة مخروطية 250 مل في الميكروويف (800 W، حوالي 1-3 دقيقة). بارد إلى حوالي 30-40 درجة مئوية عن طريق الحفاظ على درجة حرارة الغرفة.
    تحذير: لا تسخن أو تغلق القارورة بالكامل عند التدفئة لمنع الأجروز من الغليان.
  2. جبل عينات كبيرة مثل A. equina باستخدام أنبوب 50 مل.
    ملاحظة: استخدام أنابيب 50 مل لتركيب عينات كبيرة لا تناسب في 1000 ميكرومازيت 'الأزرق' تلميح.
    1. ضع العينة الملطخة في طبق من عيار 60 مم مع DW لغسل محلول التلطيخ المفرط من السطح.
    2. صب بلطف 5 مل من 0.5٪ أغاروز في أنبوب 50 مل وتصلب أغاروز على الجليد. يجب الحرص على عدم جعل فقاعات في أغاروز.
    3. إضافة بلطف 20 مل من 0.5٪ agarose إلى أنبوب 50 مل ووضعها على الجليد حتى يبدأ أجاروز تصلب. ضع العينة داخل الأجاروز 0.5٪ باستخدام ملقط. يجب الحرص على عدم جعل فقاعات في أغاروز.
    4. ضبط موقف واتجاه العينة مع ملقط وتصلب أجاروز على الجليد.
    5. وضع الطين على مرحلة التركيب microCT وتعيين أنبوب 50 مل على الطين (الشكل2A).
  3. جبل عينات صغيرة مثل Harmothoe sp. و X. جابونيكا باستخدام 1000 ميكرومازيت 'الأزرق' تلميح.
    ملاحظة: بالنسبة للعينات الأصغر حجماً، يمكن استخدام طرف "أصفر" بـ 200 ميكرومازيت. في هذه الحالة، استخدم 30 ميكرولتر من الأجاروز للسداد وإضافة 200 ميكرولتر من الأجاروز أو الماء المقطر.
    1. رسم 100 درجة مئوية من 0.5٪ أغاروز في 1000 ميكرومازيت 'الأزرق' غيض وتصلب أجاروز عن طريق عقد غيض على الجليد، مما يجعل المكونات في غيض (الشكل2B-A).
    2. Decant العينة الملونة في طبق 60 ملم دون استخدام ملقط.
    3. نقل بلطف العينة باستخدام ملاقط حلقة في طبق آخر 60 ملم مع DW لغسل محلول تلطيخ المفرط من السطح.
    4. أضف 1000 لتر إما من الآغاروز بنسبة 0.5% أو DW إلى الطرف الموصول (الخطوة 3.3.1) باستخدام الميكرومازيت.
      ملاحظة: ينصح باستخدام 0.5٪ أغاروز، ولكن استخدام DW لعينات هشة أو ثمينة التي ينبغي تجنب الأجاروز.
    5. نقل بلطف العينة من طبق 60 ملم إلى أغاروز أو DW في طرف موصول باستخدام ملاقط حلقة.
    6. ضبط بلطف موقف واتجاه العينة مع إبرة petiolate أو ملاقط الدقة. يجب الحرص على عدم جعل فقاعات في المتوسط تصاعد. تأكد من أن العينة مستقرة بين جدران الطرف عند استخدام DW كوسيلة تصاعد (الشكل2D-b). ضع الطرف على الجليد لتصلب الأجاروز إذا تم استخدامه كوسيلة تصاعد.
    7. قطع غيض من جديد 1000 ميكرومازيت 'الأزرق' تلميح (الشكل2B-b,c) وإدراج غيض من طرف موصول في طرف جديد.
    8. وضع الطين على مرحلة التركيب microCT وتعيين نصائح مع عينة داخل على الطين (الشكل2C،D).
      ملاحظة: سوف يبدأ الحل تلطيخ لغسل العينة بمجرد وضعها في DW، حتى انتقل إلى خطوة المسح الضوئي التالية على الفور.

4. ميكروت المسح الضوئي

  1. تشغيل شعاع الأشعة السينية في 80 كيلوفولت، 100 درجة مئوية.
  2. أثناء مراقبة صورة إرسال الأشعة السينية في وسط الشاشة (الشكل3A)، حرك المرحلة بحيث يمكن رؤية العينة بأكملها بالنقر على أزرار المحور X وZ (الشكل3A)، ويدوياً ضبط مقبض محور Y على مرحلة التركيب (الشكل3B). تعيين تباين الصورة بحيث يمكن ملاحظة الهياكل الداخلية عن طريق ضبط ظروف التباين (الشكل 3A: تباين الصورة).
  3. ضبط اتجاه العينة عن طريق تغيير زاوية أنبوب / طرف في الطين (الشكل2A). تدوير المرحلة 90 درجة عن طريق تعيين محور دوران (الشكل3A) إلى 90 والنقر على زر الحركة النسبية (الشكل3A). أداء نفس المناورة أربع مرات لإكمال دوران كامل.
    ملاحظة: يدوياً إيقاف شعاع الأشعة السينية في كل مرة يتم فتح باب العينة، إلا إذا كان النظام إيقاف تشغيله تلقائياً.
  4. نقل المرحلة بحيث تكون العينة في مركز العرض عن طريق النقر على زر محور Z (الشكل3A) وعن طريق ضبط يدويا مقبض محور ص على مرحلة التركيب (الشكل3B). بدوره المرحلة من قبل 90 درجة وتفعل الشيء نفسه. بدوره المرحلة 360 درجة وتحقق من أن العينة في وسط العرض من جميع الاتجاهات.
  5. تحريك المرحلة على طول المحور س نحو مصدر شعاع الأشعة السينية عن طريق النقر على زر محور X (الشكل3A) لتكبير العينة وضبط حسب الحاجة بحيث تناسبها فقط في طريقة العرض (الشكل3C).
  6. بدوره المرحلة 360 درجة وضبط حسب الحاجة بحيث تناسب العينة داخل العرض من جميع الاتجاهات.
  7. ضبط ظروف المسح الضوئي كما هو موضح في الجدول 1.
  8. بدء المسح الضوئي; يستغرق حوالي 10 دقائق.

5. إعادة بناء الصورة

  1. بدء تشغيل برنامج ملحق نظام microCT (راجع جدولالمواد) وفتح البيانات الممسوحة ضوئيًا.
  2. ضبط الاختلافات في محور دوران العينة أثناء المسح الضوئي عن طريق النقر على زر حساب قيمة التحول التلقائي (الشكل4A: المربع الأخضر).
  3. ضبط اتجاه الصورة عن طريق تدوير الأسهم البرتقالية (الشكل4B). إذا تم تغيير الاتجاه كرر الخطوة 5.2.
  4. انقر على علامة التبويب المنطقة (الشكل4C: مربع أرجواني) ومناطق تقليم حيث العينات غير موجودة (الشكل4C: مربع أصفر).
  5. انقر على علامة التبويب إعادة التكوين (الشكل4D: مربع أرجواني) وتعيين المرشحات على النحو التالي لإزالة الضوضاء. حلقة قطعة أثرية تقليل فلتر: متوسط مرشح -3; مرشح إزالة الضوضاء: متوسط عامل التصفية-1.
  6. إجراء إعادة تشكيل عن طريق النقر على زر إعادة التكوين (الشكل4D: المربع الأخضر).
  7. ضبط سطوع الصورة والتباين عن طريق تعيين القيم الأسود والأبيض كقيمة سوداء 0، قيمة بيضاء 250 (الشكل4D:المربع الأزرق).
  8. حفظ مجموعة بيانات صورة TIFF التي أعيد بناؤها كـ TIFF 8 بت بالنقر فوق الزر حفظ. إعادة تسمية ملفات TIFF كما يلي: Date_sample_resolution (μm)_number.tiff.
    ملاحظة: تتوفر مجموعات البيانات الأصلية من هذه الدراسة في مستودع Figshare، doi:10.6084/m9.figshare.767083736.

6 - تحليلات البيانات

  1. بدء تشغيل برنامج تحليل البيانات (راجع جدولالمواد) وتمكين استيراد ملفات TIFF بالنقر على رمز قاعدة البيانات (الشكل5A: مربع أرجواني) وإيقاف تشغيل المربع الموضح في الشكل 5B.
  2. انقر على رمز الاستيراد (الشكل 5C: مربع أرجواني)، حدد مجموعة البيانات المحفوظة في القسم 5، وانقر فوق فتح.
  3. انقر على زر روابط النسخ (الشكل5D)لاستيراد البيانات.
  4. عرض المقطع العرضي 2D عن طريق النقر على رمز عارض 2D (الشكل5C: المربع الأزرق).
  5. معايرة مجموعة البيانات عن طريق النقر على علامة التبويب المشاهد 3D (الشكل5E: مربع أرجواني) وإدخال قيمة الدقة في المسح الضوئي (الذي كان 0.018 في هذه الدراسة [ الشكل5F]).
  6. انقر على أيقونة السطوع / التباين (الشكل5E مربع أخضر). ضبط السطوع والتباين عن طريق تحريك المؤشر داخل الصورة 2D المعروضة وتغيير مستوى النافذة وعرض النافذة (الشكل5G).
  7. تحقق من الصور المقطع العرضي الأخرى عن طريق تحريك شريط التمرير (الشكل5G: مربع).
  8. تغيير اتجاه المقطع العرضي عن طريق النقر على رمز الاتجاه (الشكل5E: المربع الأزرق) والتحقق من الصور في جميع الاتجاهات (الشكل5H).
  9. انقر على الصورة المعروضة، واختر علامة التبويب تصدير لتخزين الصور المقطع العرضي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

قمنا بتصوير ميكروCT على A. equina (Anthozoa, Cnidaria), Harmothoe sp. (Polychaeta, Annelida), and X. japonica (Xenoturbellida, Xenacoelomorpha) بعد تلطيخ العينات بمحلول لوغول بنسبة 25%. وأدى تلطيخ الأنسجة بنجاح إلى تعزيز تباين الهياكل الداخلية في جميع العينات،مما مكّن من رصد الأنسجة الرخوة الداخلية (الشكل 6). جنبا إلى جنب مع التقارير السابقة6،7،16،19،22،23،24،25،26 , 28 , 30 , 31 , 32 , 33، وهذا يدل على أن microCT يمكن استخدامها على مختلف اللافقاريات البحرية لتصور مورفولوجيا، بما في ذلك الأنسجة الداخلية الناعمة. تم الحصول على صور واضحة حتى مع عينة X. جابونيكا، التي تضررت البشرة بشدة (الشكل6F،G)، مما يدل على أن هذه الطريقة تنطبق على العينات الهشة مع الضرر الخارجي.

المسح الضوئي فقط المنطقة ذات الأهمية، على النقيض من منطقة أوسع، أدى إلى زيادة كبيرة في وضوح ودقة الصورة (مقارنة الشكل 6واو والشكل 6زاي). ومع ذلك، تم إعادة بناء مجموعة بيانات واحدة عالية الدقة من عينة كاملة لHarmothoe sp. (الشكل6C) و X. japonica (الشكل6F) من عمليات مسح متعددة أجريت على مختلف (ولكن متداخلة) أجزاء من العينة. وكانت طبقات بين كل مسح غير واضحة في الصور التي أعيد بناؤها. وتبين دراستنا أنه يمكن الحصول على صور واحدة عالية الدقة مع أنظمة microCT مخروطي الحزمة. من خلال مسح مساحة أكبر في دقة عالية، هناك خطر أصغر من تطل على الهياكل الصغيرة. ميزة أخرى هي أنه من الأسهل لتحديد المواقع النسبية للهياكل التي تقع بعيدا عن بعضها البعض، مثل النصائح الأمامية والخلفية من أنليد ممدود.

Figure 1
الشكل 1 الحيوانات اللافقارية البحرية التي لوحظت في هذه الدراسة. (ألف-جيم) أكتينيا إكوينا (Anthozoa, Cnidaria). (أ) نهاية القاصية من الحيوان الحي استرخاء في 10٪ MgCl2 مياه البحر. القاصي (B) والقريب (C) ينتهي بعد التثبيت في 70 ٪ الإيثانول. (د) يعيش التخدير Harmothoe sp. (Polychaeta, Annelida), وجهة نظر الظهرية مع الأمامي إلى اليسار. وكان معظم الإليترا مفقودا بالفعل في هذه المرحلة، مع بقاء أربعة فقط بالقرب من النهاية الخلفية. (E) Xenoturbella japonica (Xenoturbellida, Xenacoelomorpha) ثابتة في 70٪ الإيثانول. المنظر الأيمن، مع الأمامي إلى الأعلى. بسبب الظروف في جمع، بدأت البشرة في الخروج. قضبان مقياس = 3 ملم.

Figure 2
الشكل 2 تركيب عينات على نظام التصوير المقطعي المحوسب بالأشعة السينية microfocus. (أ) تركيب عينات في أنبوب 50 مل باستخدام الطين. ويمكن تعديل اتجاه العينة باستخدام الطين. (ب) إعداد 1000 ميكرومازيت 'الأزرق' طرف لتركيب عينات صغيرة. أ: نصيحة مع نهايتهم موصول مع 100 ميكرولتر من 0.5٪ agarose (خطوط قطري). تم وضع العينات في هذا الطرف. تم إدراج الطرف مع العينة في آخر 1000 ميكرومازيت 'الأزرق' تلميح (ب، ج) لتركيب. تم استخدام ب لXenoturbella japonica، وكان يستخدم ج لHarmothoe sp. (C) شنت X. japonica عينة، نظرة عامة (يسار) وعن قرب (يمين). ويمكن رؤية مصدر الأشعة السينية على يمين العينة. (D) الرسوم البيانية لتركيب العينات في 1000 ميكرومازيت 'الأزرق' تلميح. أ: X. عينة جابونيكا في الماء المقطر. ب: كانت العينة على اتصال مع جدار طرف (الأسهم)، بحيث لا تتحرك أثناء المسح الضوئي. ج: Harmothoe sp. عينة في 0.5٪ agarose. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3 مسح العينات على نظام التصوير المقطعي المحوسب بالأشعة السينيةالدقيقة: (أ) شاشة التشغيل أثناء المسح الضوئي لنظام التصوير المقطعي المحوسب بالأشعة السينية الدقيقة الذي يظهر صورة إرسال بالأشعة السينية لعينة من أكتينيا إكوينا. اضبط التباين والسطوع باستخدام "تباين الصورة" في أسفل اليسار. (B) عرض المرحلة المتصاعدة التي تظهر مقبض محور Y. (C) صورة إرسال الأشعة السينية للعينة A. equina بعد أن تم نقل مرحلة التركيب أقرب إلى مصدر شعاع الأشعة السينية. لاحظ أنه يتم تكبيره عند مقارنته بالصورة في وسط (A). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4 شاشة التشغيل لنظام إعادة بناءالصورة. (أ) شاشة لضبط الاختلافات في محور دوران العينة أثناء المسح الضوئي، وتظهر عينة Equina Actinia. مربع أرجواني: علامة التبويب التحول; المربع الأخضر: التلقائي زر حساب قيمة التحول. (B) شاشة لضبط اتجاه الصورة، مع Harmothoe sp. هو مبين. (C) الشاشة أثناء إعادة بناء صورة A. equina،وتقليم المنطقة خارج المربع الأصفر حيث لا توجد عينات. مربع أرجواني: علامة التبويبالمنطقة. (D) شاشة أثناء إعادة بناء الصورة، وتظهر الصورة التي أعيد بناؤها من A. equina. مربع أرجواني: علامة التبويب إعادة التشكيل; مربع أخضر: زر إعادة تشكيل; مربع أزرق: أسود وأبيض تعديل القيمة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5 شاشة التشغيل لنظام تحليلالصور. (أ) نافذة التفضيل. تم النقر فوق رمز قاعدة البيانات (دائرة أرجواني) لفتح إطار إدارة ملفات قاعدة البيانات. (B) إطار إدارة ملفات قاعدة البيانات. في هذا البرنامج، يجب إيقاف تشغيل المربع المعروض بسهم لتمكين استيراد ملفات TIFF. (C) القائمة وأشرطة الأدوات من شاشة قاعدة البيانات. مربع أرجواني = رمز الاستيراد; المربع الأزرق = رمز عارض 2D. (D) إطار استيراد مجموعة البيانات. دائرة أرجوانية = زر روابط النسخ. (E) القائمة وأشرطة الأدوات من شاشة المشاهد 2D. مربع أرجواني = علامة التبويب عارض 3D; مربع أخضر = رمز السطوع / التباين؛ المربع الأزرق = رمز الاتجاه. (F) نافذة إعداد المعايرة. أدخل قيم الدقة المطلوبة داخل الأعمدة في المربع الأرجواني. (G) مقطع عرضي من عينة actinia equina المعروضة في نافذة المشاهد 2D لضبط السطوع والتباين. مربع أرجواني: شريط تمرير للتحقق من المقاطع العرضية الأخرى. (H) المقطع العرضي من A. equina المعروضة في نافذة المشاهد 2D مع اتجاه مختلف إلى (G). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6 الصور الممسوحة والمعاد بناؤها لللافقاريات البحرية. (أ) عرضية و (ب) المقاطع الطولية من Actinia equina. يتم توسيع المنطقة داخل المربع الأصفر المنقط في (B) في الداخل. المختصرات: [دم], زوج من توجيه [ميسّينتيرس]; م ، زوج من mesenteries الكمال ؛ MF ، خيوط mesenterial ؛ ع، البلعوم. si، سيفونوغليفيت. ر، اللامسة؛ الأسهم ، والقرص عن طريق الفم ؛ رؤوس الأسهم البيضاء ، دواسة القرص ؛ رؤوس الأسهم السوداء، عضلة العضلة العاصرة. قضبان مقياس في A، B = 3 ملم (C-E) Harmothoe sp. (C) قسم Sagittal من الجزء الأمامي. (دال، هاء) المقطع العرضي في الخطوط المنقطة d و e في (C). المختصرات: aci = aciculum; أسيم = عضلة الكسي. coe = coelom; دلم = العضلات الطولية الدجورية. [إلب] = [إلتروبهور]; العين = العين. int = الأمعاء. الفك = الفك. مانت = هوائي متوسط؛ مو = الفم. النائب = عضلات البروبوسسيس. بالب = بالب. فا = البلعوم. مشكله = بروبوسسيس. VLM = العضلات الطولية البطنية. vnc = الحبل العصبي البطني. قضبان المقياس: C = 1 مم؛ D, E = 0.3مم. (F) قسم Sagittal من العينة بأكملها. (ز) قسم Sagittal من الجزء الأمامي. bl = لامينا القاعدية؛ int = الأمعاء. مل = طبقة العضلات. مو = الفم. nn = صافي العصب داخل البشرة. السهم الأبيض = statocyst. السهم الأسود = المسام الأمامية. رؤوس الأسهم البيضاء = الشبكة الغدية البطنية; رؤوس الأسهم السوداء = البويضات. أشرطة المقياس: F = 1 مم، G = 0.5 مم.

Table 1
الجدول 1: بروتوكول إعداد العينات والمسح الضوئي لكل عينة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

المثبتات باستخدام الفورماين، مثل 10٪ (v / v) حل الفورمالين في مياه البحر المستخدمة في هذه الدراسة، ومن المعروف للحفاظ على مورفولوجيا اللافقاريات البحرية المتنوعة وغالبا ما تستخدم لتصوير microCT18،24،25 ،26،28،30،33. ومع ذلك، أصبحت القيود المفروضة على استخدام هذه المادة الكيميائية صارمة في بعض البلدان في السنوات الأخيرة، ويمكن استخدام بدائل مثل البارافورمالهايد أو الجلوتالارهايد. إذا كانت هناك خطط لاستخراج الحمض النووي بعد المسح الضوئي، فمن الأفضل تجنب استخدام الفورمالين كمصلح، لأنه من المعروف أن تجزئة الحمض النووي. في هذه الحالة، ينصح باستخدام المثبتات التي تحافظ على الحمض النووي، مثل الإيثانول 70٪. في هذه الدراسة، تم إصلاح cnidarian A. equina باستخدام الإيثانول 70٪، وتم الحصول على صور microCT واضحة من عينات 70٪ الإيثانول ثابتة (الشكل6ألف،باء).

في دراسة سابقة أجريت مسح microCT من مختلف cnidarian taxa، تم تجفيف العديد من العينات في الإيثانول 100٪، وبعضها كانت الحرجة نقطة المجففة قبل المسحالضوئي 24. على الرغم من أن الأعضاء الداخلية الناعمة مثل مجموعات اللامسة والعضلات والغدد التناسلية لوحظت بنجاح في دراستها، ومن المعروف أن عمليات الجفاف والتجفيف تؤدي إلى قطع أثرية رئيسية مثل تشوه وتقلص الأنسجة الرخوة11 , 21.في هذه الدراسة، تمكنا من مراقبة الهياكل الداخلية للcnidarian A. equina ثابتة في 70٪ الإيثانول وملطخة 25٪ محلول لوغول (الشكل6A،B). بروتوكولنا، دون أي جفاف أو خطوات التجفيف، هو الأفضل، وينبغي أن تنفذ كلما كان ذلك ممكنا للحد من خطر الأضرار التي لحقت العينات والمصنوعات اليدوية أثناء المسح الضوئي.

حل لوغول، محلول اليود، وحمض فوسفيوالتنغستن (PTA) هي حلول تلطيخالتي غالبا ما تستخدم على العينات البيولوجية في التصوير microCT 6،7،9،14،16، 17،20،26،27،38. من تجربتنا في استخدام مختلف العينات البيولوجية، قدم حل Lugol أفضل النتائج للعديد من العينات، مع تلطيخ الظلام في فترة قصيرة نسبيا من الزمن. لم ينتج عن محلول اليود سوى بقع ضعيفة جدا، وPTA يتطلب وقتا طويلا لتلطيخ كافية والعينات الملونة أظهرت تقلصات قوية. لذلك، كانت جميع العينات ملطخة محلول لوغول في هذه الدراسة. ومع ذلك، على الرغم من أن الحل Lugol ينصح، الحل المناسب تلطيخ يختلف بين العينات، ونحن نقترح أن يتم إجراء التجارب باستخدام حلول تلطيخ أخرى إذا كان هناك ما يكفي من العينات. بغض النظر عن حل تلطيخ، عينات لا عقد خلال تلطيخ37،38،لذلك من المهم للحفاظ على الوقت تلطيخ قصيرة.

خطوة حاسمة في المسح المجهري هو تحميل العينة وذلك لمنعها من التحرك. في هذه الدراسة، تم تنفيذ هذا في خطوتين، أولا باستخدام agarose كوسيلة تصاعد مباشرة، ومن ثم استخدام الطين لتركيب الأنبوب الذي يحتوي على العينة إلى المرحلة. للخطوة الأولى، وقد استخدمت مختلف وسائل الإعلام المتصاعدة منخفضةالكثافة في الدراسات السابقة، بما في ذلك الإيثانول 6،17،20،25،30،أغاروز9،29 ، ورغوة الأزهار15،22،31. وقد تم اختيار أغاروز في هذه الدراسة لأنها مادة كيميائية منخفضة التكلفة يمكن الوصول إليها في جميع أنحاء العالم. عيب من أجاروز هو أنه قد يكون من الصعب استرداد العينة من أجاروز تصلب بعد المسح الضوئي ولكن باستخدام نقطة اغروس منخفضة ذوبان يجعل هذه الخطوة استرجاع أسهل. للخطوة الثانية، وغالبا ما تستخدمالمشابك الفك أو مسامير 6،9،17. تم اختيار كلاي في هذه الدراسة لأنها تمكن من التعديلات الدقيقة في اتجاه وزاوية العينة. هناك حاجة إلى الحذر للتجارب مع أوقات المسح الضوئي طويلة، كما أن إمكانية نقل العينة أعلى عند استخدام الطين بدلا من المشابك الفك أو مسامير.

أجرت دراسة سابقة المسح المجهري على سبعة أنواع polychaete مع أطوال الجسم من 2-8 ملم، أصغر من sp. Harmothoe المستخدمة في هذه الدراسة16. وقد تمكنوا من توليد صور عالية الاستبانة، وأظهروا أعضاء مثل أنظمة الأوعية الدموية وchaeta الفردية أكثر وضوحا مما كانت عليه في هذه الدراسة. ولم يكن السبب الرئيسي لهذا الاختلاف هو البروتوكول، بل مواصفات نظم الميكروسيتي المستخدمة. تم تجهيز النظام المستخدم في الدراسة السابقة مع كاميرا جهاز 11 ميجابيكسل تهمة المقترنة (4000 × 2672 بكسل) مع الحد الأقصى للدقة من <0.8 ميكروغرام / بكسل16. وكان حجم مصفوفة الصورة النشطة للنظام المستخدم في هذه الدراسة 992 × 992 بكسل، مع دقة قصوى من > 5 ميكرومتر / بكسل. ولذلك، فإن الاستبانة المكانية لنظام الميكروسيت المستخدم في هذه الدراسة كانت أدنى من نظام الميكروسيت عالي الأداء المستخدم في شركة فولويتر وآخرون16. وكان هذا الاختلاف ملحوظا بشكل خاص عند مسح العينات أصغر من 8 ملم، والتي شهدنا فيها عدم وجود دقة (البيانات لم تظهر). ومع ذلك، ونظراً لقلة البيانات التي تم الحصول عليها أثناء المسح الضوئي في هذه الدراسة، كان وقت المسح أقصر بكثير مما كان عليه في الدراسة السابقة16 (البيانات: 992 × 992 و4000 × 2672 بكسل، على التوالي؛ وقت المسح الضوئي: 10 إلى 26 دقيقة و30 دقيقة إلى عدة ساعات، على التوالي). وقت المسح الضوئي القصير يقلل من تلون تلطيخ اليود، مما يسمح باستخدام محلول لوغول، وهو حل تلطيخ جيد مع معدل اختراق عالية، ولكن ينتشر بسهولة في DW34. كما يقلل وقت المسح الضوئي القصير من إمكانية انتقال العينة أثناء المسح الضوئي، مما مكن مناستخدام طريقة تركيب بسيطة باستخدام أغاروز أو DW (الشكل 2). أوقات المسح الضوئي أطول أيضا عيب من طمس العينة المحتملة انكماش في الصور. كما تم الإبلاغ عن العديد من المشاكل الميكانيكية والأجهزة الأخرى التي يمكن أن تحدث أثناء عمليات المسح الطويلة39. لذلك، عند استخدام أنظمة microCT، من المهم أن نفهم بدقة مواصفات كل نظام، واختيار النظام الصحيح من حيث حجم العينة أو هدف البحث. وفي بعض الحالات، قد يكون نظام الميكروسيتي ذو الاستبانة المنخفضة كافياً.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

ونود أن نشكر توشيهيكو شيرويشي على مساعدته وعلى توفير البيئة البحثية خلال هذه الدراسة. ونحن ممتنون لكينسوكي ياناغي وتاكاتو إيزومي للحصول على المشورة بشأن A. equina، وMasaatsu تاناكا للحصول على المشورة بشأن عينة Harmothoe sp. نود أن نشكر الموظفين في مركز شيمودا للبحوث البحرية، جامعة تسوكوبا، ومحطة ميساكي البيولوجية البحرية، جامعة طوكيو لمساعدتهم في مجموعات العينات. نود أن نشكر Editage (www.editage.jp) لتحرير اللغة الإنجليزية. وقد تم دعم هذا العمل من خلال منحة المساعدة المقدمة للعلماء الشباب (A) (JP26711022) إلى HN، وJAMBIO، الرابطة اليابانية للبيولوجيا البحرية.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
250-ml Erlenmeyer flask Corning CLS430183
5-ml Sampling tube ST-500 BIO-BIK 103010
50-ml Polypropylene tube Greiner Bio One International 227261
60-mm Non-treated Dish IWAKI 1010-060
Agarose Promega V3125
Ecological grade tip (blue) 1000 µl BMBio BIO1000RF
Ethanol Wako Pure Chemical Industries 057-00451
Formalin Wako Pure Chemical Industries 061-00416
Iodine Wako Pure Chemical Industries 094-05421
Magnesium chloride hexahydrate Wako Pure Chemical Industries 135-00165
OsiriX DICOM Viewer Pixmeo SARL OsiriX MD v10.0 https://www.osirix-viewer.com
Paraformaldehyde Wako Pure Chemical Industries 163-25983
Petiolate needle AS ONE 2-013-01
Pipetman P200 Micropipette GILSON F123601
Pipetman P1000 Micropipette GILSON F123602
Potassium iodide Wako Pure Chemical Industries 166-03971
Precision tweezers 5 DUMONT 0302-5-PS
QuickRack MultI fit tip (yellow) 200 ul Sorenson 10660
Razor blades Feather FA-10
Ring tweezers NAPOX A-26
Stereoscopic microscope Leica MZ95
X-ray Micro-CT imaging system Comscantechno ScanXmate-E090S105

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Susaki, E. A., Tainaka, K., Perrin, D., Yukinaga, H., Kuno, A., Ueda, H. R. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10, 1709-1727 (2015).
  2. Susaki, E. A., Ueda, H. R. Whole-body and whole-organ clearing and imaging techniques with single-cell resolution: toward organism-level systems biology in mammals. Cell Chemical Biology. 23, 137-157 (2016).
  3. Silvestri, L., Costantini, I., Sacconi, L., Pavone, F. S. Clearing of fixed tissue: a review from a microscopist's perspective. Journal of Biomedical Optics. 21, 081205 (2016).
  4. Greenbaum, A., et al. Bone CLARITY: clearing, imaging, and computational analysis of osteoprogenitors within intact bone marrow. Science Translational Medicine. 9, (2017).
  5. Konno, A., Okazaki, S. Aqueous-based tissue clearing in crustaceans. Zoological Letters. 4, 13 (2018).
  6. Metscher, B. D. MicroCT for comparative morphology: simple staining methods allow high-contrast 3D imaging of diverse non-mineralized animal tissues. BMC Physiology. 9, 11 (2009).
  7. Metscher, B. D. MicroCT for developmental biology: a versatile tool for high-contrast 3D imaging at histological resolutions. Developmental Dynamics. 238 (3), 632-640 (2009).
  8. Degenhardt, K., Wright, A. C., Horng, D., Padmanabhan, A., Epstein, J. A. Rapid 3D phenotyping of cardiovascular development in mouse embryos by micro-CT with iodine staining. Circulation Cardiovascular Imaging. 3 (3), 314-322 (2010).
  9. Metscher, B. D. X-ray microtomographic imaging of intact vertebrate embryos. Cold Spring Harbor Protocols. 12, 1462-1471 (2011).
  10. Boistel, R., Swoger, J., Kržič, U., Fernandez, V., Gillet, B., Reynaud, E. G. The future of three-dimensional microscopic imaging in marine biology. Marine Ecology. 32, 438-452 (2011).
  11. Mizutani, R., Suzuki, Y. X-ray microtomography in biology. Micron. 43, 104-115 (2012).
  12. Merkle, A. P., Gelb, J. The ascent of 3D X-ray microscopy in the laboratory. Microscopy Today. 21, 10-15 (2013).
  13. Ziegler, A., Menze, B. H. Accelerated acquisition, visualization, and analysis of zooanatomical data. Computation for humanity. Information technology to advance society. Zander, J., Mosterman, P. J. , CRC Press. Boca Raton, USA. 233-260 (2013).
  14. Gignac, P. M., et al. Diffusible iodine-based contrast-enhanced computed tomography (diceCT): an emerging tool for rapid, high-resolution, 3-D imaging of metazoan soft tissues. Journal of Anatomy. 228 (6), 889-909 (2016).
  15. du Plessis, A., Broeckhoven, C., Guelpa, A., le Roux, S. G. Laboratory x-ray micro-computed tomography: a user guideline for biological samples. GigaScience. 6 (6), 1-11 (2017).
  16. Faulwetter, S., Vasileiadou, A., Kouratoras, M., Dailianis, T., Arvanitidis, C. Micro-computed tomography: Introducing new dimensions in taxonomy. ZooKeys. 263, 1-45 (2013).
  17. Staedler, Y. M., Masson, D., Schonenberger, J. Plant tissues in 3D via X-ray tomography: simple contrasting methods allow high resolution imaging. PLoS One. 8 (9), 75295 (2013).
  18. Fernández, R., Kvist, S., Lenihan, J., Giribet, G., Ziegler, A. Sine Systemate Chaos? A Versatile Tool for Earthworm Taxonomy: Non-Destructive Imaging of Freshly Fixed and Museum Specimens Using Micro-Computed Tomography. PLoS One. 9 (5), 96617 (2014).
  19. Paterson, G. L. J., et al. The pros and cons of using micro-computed tomography in gross and microanatomical assessments of polychaetous annelids. Memoirs of Museum Victoria. 71, 237-246 (2014).
  20. Faulwetter, S., Dailianis, T., Vasileiadou, K., Kouratoras, M., Arvanitidis, C. Can micro-CT become an essential tool for the 21st century taxonomist? An evaluation using marine polychaetes. Microscopy and Analysis. 28, 9-11 (2014).
  21. Sombke, A., Lipke, E., Michalik, P., Uhl, G., Harzsch, S. Potential and limitations of X-ray micro-computed tomography in arthropod neuroanatomy: a methodological and comparative survey. Journal of Comparative Neurology. 523, 1281-1295 (2015).
  22. Landschoff, J., Plessis, A., Griffiths, C. L. A dataset describing brooding in three species of South African brittle stars, comprising seven high-resolution, micro X-ray computed tomography scans. GigaScience. 4 (1), 52 (2015).
  23. Keiler, J., Richter, S., Wirkner, C. S. The anatomy of the king crab Hapalogaster mertensii Brandt, 1850 (Anomura: Paguroidea: Hapalogastridae) - new insights into the evolutionary transformation of hermit crabs into king crabs. Contributions to Zoology. 84 (2), 149-165 (2015).
  24. Holst, S., Michalik, P., Noske, M., Krieger, J., Sötje, I. Potential of X-ray micro-computed tomography for soft-bodied and gelatinous cnidarians with emphasis on scyphozoan and cubozoan statoliths. Journal of Plankton Research. 38, 1225-1242 (2016).
  25. Moles, J., Wägele, H., Ballesteros, M., Pujals, Á, Uhl, G., Avila, C. The End of the Cold Loneliness: 3D Comparison between Doto antarctica and a New Sympatric Species of Doto (Heterobranchia: Nudibranchia). PLoS One. 11 (7), 0157941 (2016).
  26. Nakano, H., et al. A new species of Xenoturbella from the western Pacific Ocean and the evolution of Xenoturbella. BMC Evolutionary Biology. 17, 245 (2017).
  27. Tsuda, K., et al. KNOTTED1 Cofactors, BLH12 and BLH14, Regulate Internode Patterning and Vein Anastomosis in Maize. Plant Cell. 29 (5), 1105-1118 (2017).
  28. Parapar, J., Candás, M., Cunha-Veira, X., Moreira, J. Exploring annelid anatomy using micro-computed tomography: A taxonomic approach. Zoologischer Anzeiger. 270, 19-42 (2017).
  29. Akkari, N., Ganske, A. S., Komerički, A., Metscher, B. New avatars for Myriapods: Complete 3D morphology of type specimens transcends conventional species description (Myriapoda, Chilopoda). PLoS One. 13 (7), 0200158 (2018).
  30. Gusmao, L. C., Grajales, A., Rodriguez, E. Sea anemones through X-rays: visualization of two species of Diadumene (Cnidaria, Actiniaria) using micro-CT. American Museum Novitates. 3907, (2018).
  31. Landschoff, J., Komai, T., du Plessis, A., Gouws, G., Griffiths, C. L. MicroCT imaging applied to description of a new species of Pagurus Fabricius, 1775 (Crustacea: Decapoda: Anomura: Paguridae), with selection of three-dimensional type data. PLoS One. 13 (9), 0203107 (2018).
  32. Machado, F. M., Passos, F. D., Giribet, G. The use of micro-computed tomography as a minimally invasive tool for anatomical study of bivalves (Mollusca: Bivalvia). Zoological Journal of the Linnean Society. , (2018).
  33. Sasaki, T., et al. 3D visualization of calcified and non-calcified molluscan tissues using computed tomography. Biomineralization. Endo, K., Kogure, T., Nagasawa, H. , Springer. Singapore. 83-93 (2018).
  34. Maeno, A., Tsuda, K. Micro-computed Tomography to Visualize Vascular Networks in Maize Stems. Bio-protocol. 8 (1), 2682 (2018).
  35. Nakano, H., et al. Correction to: A new species of Xenoturbella from the western Pacific Ocean and the evolution of Xenoturbella. BMC Evolutionary Biology. 18, 83 (2018).
  36. Maeno, A., Kohtsuka, H., Takatani, K., Nakano, H. MicroCT files from 'Microfocus X-ray computed tomography (microCT) imaging of Actinia equina (Cnidaria), Harmothoe sp. (Annelida), and Xenoturbella japonica (Xenacoelomorpha)'. figshare. , (2019).
  37. Vickerton, P., Jarvis, J., Jeffery, N. Concentration-dependent specimen shrinkage in iodine-enhanced microCT. Journal of Anatomy. 223 (2), 185-193 (2013).
  38. Buytaert, J., Goyens, J., De Greef, D., Aerts, P., Dirckx, J. Volume shrinkage of bone, brain and muscle tissue in sample preparation for micro-CT and light sheet fluorescence microscopy (LSFM). Microscopy and Microanalysis. 20 (4), 1208-1217 (2014).
  39. Sasov, A., Liu, X., Salmon, P. L. Compensation of mechanical inaccuracies in micro-CT and nano-CT. Proceedings of SPIE. 7078, 70781 (2008).

Tags

العلوم البيئية، العدد 150، microCT، محلول لوغول، اليود، أكتينيا،Cnidaria، Harmothoe،Annelida، Xenoturbella، Xenacoelomorpha، اللافقاريات
ميكروفوكس الأشعة السينية CT (microCT) التصوير من <em>أكتينيا إكوينا</em> (Cnidaria)، <em>Harmothoe</em> sp. (Annelida)، وXenoturbella <em>japonica</em> (Xenacoelomorpha)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Maeno, A., Kohtsuka, H., Takatani,… More

Maeno, A., Kohtsuka, H., Takatani, K., Nakano, H. Microfocus X-ray CT (microCT) Imaging of Actinia equina (Cnidaria), Harmothoe sp. (Annelida), and Xenoturbella japonica (Xenacoelomorpha). J. Vis. Exp. (150), e59161, doi:10.3791/59161 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter