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Microfoco CT de rayos X (microCT) Imagen de Actinia equina (Cnidaria), Harmothoe sp. (Annelida) y Xenoturbella japonica (Xenacoelomorpha)

Published: August 6, 2019 doi: 10.3791/59161
Automatic Translation
1, 2, 3, 3
1Mammalian Genetics Laboratory, National Institute of Genetics, 2Misaki Marine Biological Station, The University of Tokyo, 3Shimoda Marine Research Center, University of Tsukuba

Summary

Aquí, los protocolos para realizar imágenes de tomografía computarizada de rayos X de microfoco (microCT) de tres animales invertebrados marinos se explican en detalle. Este estudio describe los pasos tales como la fijación de muestras, la tinción, el montaje, el escaneo, la reconstrucción de imágenes y los análisis de datos. También se proporcionan sugerencias sobre cómo se puede ajustar el protocolo para diferentes muestras.

Abstract

Tradicionalmente, los biólogos han tenido que depender de métodos destructivos como la sección para investigar las estructuras internas de los organismos opacos. La tomografía computarizada por rayos X de microfoco no destructivo (microCT) se ha convertido en un protocolo potente y emergente en biología, debido a los avances tecnológicos en los métodos de tinción de muestras e innovaciones en hardware de microCT, computadoras de procesamiento y datos software de análisis. Sin embargo, este protocolo no se utiliza comúnmente, como lo es en los campos médico e industrial. Una de las razones de este uso limitado es la falta de un manual sencillo y comprensible que cubra todos los pasos necesarios: recolección de muestras, fijación, tinción, montaje, escaneo y análisis de datos. Otra razón es la gran diversidad de metazoos, particularmente invertebrados marinos. Debido a los diversos tamaños, morfologías y fisiologías de los invertebrados marinos, es crucial ajustar las condiciones experimentales y las configuraciones de hardware en cada paso, dependiendo de la muestra. Aquí, los métodos de imágenes microCT se explican en detalle utilizando tres invertebrados marinos filogenéticamente diversos: Actinia equina (Anthozoa, Cnidaria), Harmothoe sp. (Polychaeta, Annelida) y Xenoturbella japonica ( Xenoturbellida, Xenacoelomorpha). También se proporcionan sugerencias sobre la realización de imágenes microCT en varios animales.

Introduction

Los investigadores biológicos generalmente han tenido que hacer secciones delgadas y realizar observaciones por microscopía ligera o electrónica con el fin de investigar las estructuras internas de los organismos opacos. Sin embargo, estos métodos son destructivos y problemáticos cuando se aplican a especímenes raros o valiosos. Además, varios pasos en el método, como la incrustación y la sección, consumen mucho tiempo, y pueden tardar varios días en observar una muestra, dependiendo del protocolo. Además, al manipular numerosas secciones, siempre existe la posibilidad de dañar o perder algunas secciones. Las técnicas de limpieza de tejidos están disponibles para algunos especímenes1,2,3,4,5, pero todavía no son aplicables para muchas especies animales.

Para superar estos problemas, algunos biólogos han comenzado a utilizar la tomografía computarizada de rayos X de microfoco (microCT) imágenes6,7,8,9,10,11, 12,13,14,15. En la TC de rayos X, la muestra es irradiada con rayos X desde varios ángulos que se generan a partir de una fuente de rayos X que se mueve alrededor de la muestra, y los rayos X transmitidos son monitoreados por un detector que también se mueve alrededor de la muestra. Los datos de transmisión de rayos X obtenidos se analizan para reconstruir imágenes transversales de la muestra. Este método permite la observación de estructuras internas sin destrucción de la muestra. Debido a su seguridad y facilidad, se utiliza comúnmente en aplicaciones médicas y dentales, y los sistemas de TC se pueden encontrar en hospitales y centros dentales de todo el mundo. Además, la TC de rayos X industrial se utiliza con frecuencia para observar muestras no médicas para inspección y metrología en el campo industrial. A diferencia de la TC médica, en la que la fuente de rayos X y los detectores son móviles, las dos partes se fijan en TC industrial, con la muestra girando durante el escaneo. La TC industrial generalmente produce imágenes de mayor resolución que la TC médica y se conoce como microCT (resolución a nivel de micrométrico) o nanoCT (resolución a nivel de nanómetro). Recientemente, la investigación con microCT ha aumentado rápidamente en diversos campos de la biología14,15,16,17,18,19, 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34.

Los estudios biológicos que utilizan CT inicialmente se dirigió a estructuras internas que consisten principalmente en tejido duro, como el hueso. Los avances en las técnicas de tinción utilizando diversos agentes químicos permitieron la visualización de tejidos blandos en diversos organismos6,7,8,9,14,15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34. De estos reactivos, los agentes de contraste a base de yodo son relativamente seguros, baratos y se pueden utilizar para la visualización de tejidos blandos en diversos organismos7,14. En cuanto a los invertebrados marinos, la microCT hasido ampliamente utilizada en animales como los moluscos 6,25,32,33, anélidos18,19, 20 , 28, y arthorópodos21,23,29,31. Sin embargo, ha habido pocos informes sobre otrasphyla animales, como bryozoans 6, xenacoelomorphs26,y cnidarios24,30. En general, se han realizado menos estudios con microCT en invertebrados marinos que en los vertebrados. Una de las principales razones de este uso limitado de los invertebrados marinos es la gran diversidad observada en estos animales. Debido a sus diversos tamaños, morfologías y fisiologías, cada especie reacciona de manera diferente a diferentes procedimientos experimentales. Por lo tanto, es crucial durante la preparación de la muestra elegir el reactivo de fijación y tinción más adecuado, y establecer las condiciones en cada paso, ajustado para cada especie. Del mismo modo, también es necesario establecer las configuraciones de escaneo, como el método de montaje, voltaje, corriente, velocidad de aumento mecánica y la potencia de resolución de espacio, adecuadamente para cada muestra. Para superar este problema, es esencial un manual sencillo y comprensible que cubra todos los pasos necesarios, explica cómo se puede ajustar cada paso dependiendo de la muestra, y muestra ejemplos detallados de múltiples muestras.

En el presente estudio, describimos el protocolo de imágenes microCT paso a paso, desde la fijación de muestras hasta el análisis de datos, utilizando tres especies de invertebrados marinos. Los especímenes de la anémona de mar Actinia equina (Anthozoa, Cnidaria) fueron recogidos cerca de la Estación Biológica Marina misaki, Universidad de Tokio. Tenían un cuerpo esférico y suave de unos 2 cm de diámetro (Figura1A-C). También se recogieron muestras de Harmothoe sp. (Polychaeta, Annelida) cerca de la Estación Biológica Marina de Misaki. Eran gusanos delgados de unos 1,5 cm de longitud, con chaetas duras presentes a lo largo de todo el cuerpo (Figura1D). Un espécimen Xenoturbella japonica35 (Xenoturbellida, Xenacoelomorpha) fue recolectado cerca del Centro de Investigación Marina Shimoda, Universidad de Tsukuba, durante el 13o Estudio Conjunto de Organismos Costeros de JAMBIO. Era un gusano de cuerpo suave que tenía aproximadamente 0,8 cm de longitud (Figura1E). Los ajustes realizados para las condiciones y configuraciones de cada muestra se explican en detalle. Nuestro estudio proporciona varias sugerencias sobre cómo realizar imágenes microCT en invertebrados marinos, y esperamos que inspire a los biólogos a utilizar este protocolo para su investigación.

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Protocol

1. Fijación

  1. Para Actinia equina,relajar a los animales en 10% MgCl2 agua de mar durante unos 15 minutos a temperatura ambiente. Transfiera al 70% de etanol y almacene a temperatura ambiente.
  2. Para Harmothoe sp., anestesiar a los animales colocándolos en agua de mar helada durante unos 15 minutos. Traslado a una solución de formalina del 10% (v/v) con agua de mar y almacenar a temperatura ambiente.
  3. Para Xenoturbella japonica,relaja al animal usando 7% MgCl2 en agua dulce. Fijar en 4% paraformaldehído (PFA) en agua de mar filtrada durante la noche. Colocar en 70% etanol y almacenar a 4oC.
    ADVERTENCIA: La PFA es peligrosa y debe manipularse con cuidado.

2. Tinción

  1. Transfiera las muestras al 50% de etanol y guárdelas a temperatura ambiente durante 15 h. Reemplace el 50% de etanol por etanol al 25% y guárdelas a temperatura ambiente durante 2 h.
    NOTA: Esto no es necesario para la muestra Harmothoe sp. en solución de formalina del 10% (v/v) con agua de mar.
  2. Sustituya la solución por agua destilada (DW) y guarde las muestras en DW a temperatura ambiente durante 2 h. Repita este paso tres veces.
  3. Prepare un 25% de la solución de Lugol diluyendo la solución en stock (abajo) al 25% con DW. La solución de stock (solución 100% Lugol)contiene 10 g de KI y 5 g de I 2, ajustada a 100 ml con DW.
    NOTA: La solución Lugol es sensible a la luz, por lo que debe almacenar y manipular la solución protegida de la luz. Siga las regulaciones de cada país e institución para la manipulación de yodo y la eliminación de residuos.
  4. Decantar el DW de las muestras y verter en la solución de Lugol 25%. Mancha durante 24 h a temperatura ambiente.

3. Montaje en etapa

  1. Preparar el 0,5% de agarosa disolviendo 500 mg de agarosa en 100 ml de DW en un matraz cónico de 250 ml en microondas (800 W, aproximadamente 1-3 min). Enfriar a unos 30-40 oC manteniendo a temperatura ambiente.
    ADVERTENCIA: No sobrecaliente ni selle completamente el matraz al calentar para evitar que la agarosa hierva.
  2. Monte muestras grandes como A. equina utilizando un tubo de 50 ml.
    NOTA: Utilice tubos de 50 ml para montar muestras grandes que no encajen en una punta azul de micropipeta de 1.000 ml.
    1. Coloque la muestra teñida en un plato de 60 mm con DW para lavar la solución de tinción excesiva de la superficie.
    2. Vierta suavemente 5 ml de agarosa al 0,5% en un tubo de 50 ml y endurezca la agarosa sobre hielo. Tenga cuidado de no hacer burbujas en la agarosa.
    3. Añadir suavemente 20 ml de agarosa al tubo de 50 ml y colocar sobre hielo hasta que la agarosa comience a endurecerse. Coloque el espécimen dentro de la agarosa del 0,5% usando fórceps. Tenga cuidado de no hacer burbujas en la agarosa.
    4. Ajuste la posición y la orientación de la muestra con fórceps y endurezcan la agarosa sobre hielo.
    5. Coloque la arcilla en la etapa de montaje de microCT y coloque el tubo de 50 ml en la arcilla (Figura2A).
  3. Monte muestras pequeñas como Harmothoe sp. y X. japonica usando una punta de micropipeta 'azul' de 1.000 l.
    NOTA: Para muestras más pequeñas, se puede utilizar una punta 'amarilla' de micropipeta de 200 l. En este caso, utilice 30 s de agarosa para el tapón y agregue 200 l de agarosa o agua destilada.
    1. Dibuje 100 sl de agarosa al 0,5% en una punta 'azul' de micropipeta de 1.000 ml y endurezca la agarosa sosteniendo la punta sobre el hielo, haciendo un tapón en la punta (Figura2B-a).
    2. Decantar la muestra manchada en un plato de 60 mm sin usar fórceps.
    3. Transfiera suavemente la muestra utilizando pinzas de anillo en otro plato de 60 mm con DW para lavar la solución de tinción excesiva de la superficie.
    4. Añadir 1.000 l de agarosa o DW al 0,5% de agarosa o DW en la punta enchufada (paso 3.3.1) con un micropipeta.
      NOTA: Se recomienda el uso de agarosa al 0,5%, pero utilice DW para muestras frágiles o preciosas en las que se debe evitar la agarosa.
    5. Transfiera suavemente la muestra de la placa de 60 mm a la agarosa o DW en la punta enchufada utilizando pinzas de anillo.
    6. Ajuste suavemente la posición y la orientación de la muestra con una aguja peciolada o pinzas de precisión. Tenga cuidado de no hacer burbujas en el medio de montaje. Asegúrese de que la muestra es estable entre las paredes de la punta cuando DW se utiliza como medio de montaje (Figura2D-b). Coloque la punta sobre hielo para endurecer la agarosa si se utiliza como medio de montaje.
    7. Corte la punta de una nueva punta 'azul' de micropipeta de 1.000 l (Figura2B-b,c)e inserte la punta de la punta enchufada en la nueva punta.
    8. Coloque la arcilla en la etapa de montaje de microCT y coloque las puntas con la muestra en el interior de la arcilla (Figura2C,D).
      NOTA: La solución de tinción comenzará a lavar la muestra una vez que se coloca en DW, así que continúe con el siguiente paso de escaneo con prontitud.

4. Escaneo de MicroCT

  1. Encienda el haz de rayos X a 80 kV, 100 oA.
  2. Mientras observa la imagen de transmisión de rayos X en el centro de la pantalla (Figura3A), mueva el escenario para que se pueda ver toda la muestra haciendo clic en los botones de los ejes X y Z (Figura3A)y manualmente ajustando la perilla del eje Y en la etapa de montaje (Figura3B). Establezca el contraste de la imagen para que las estructuras internas puedan observarse ajustando las condiciones de contraste (Figura3A: Contraste de imagen).
  3. Ajuste la orientación de la muestra cambiando el ángulo del tubo/punta en la arcilla (Figura 2A). Gire la etapa 90o estableciendo el eje de rotación (Figura3A) en 90 y haciendo clic en el botón de movimiento relativo (Figura3A). Realiza la misma maniobra cuatro veces para completar una rotación completa.
    NOTA: Apague manualmente el haz de rayos X cada vez que se abra la puerta de muestra, a menos que el sistema lo apague automáticamente.
  4. Mueva el escenario para que la muestra esté en el centro de la vista haciendo clic en el botón del eje Z (Figura3A) y ajustando manualmente la perilla del eje Y en la etapa de montaje (Figura3B). Gire el escenario 90o y haga lo mismo. Gire el escenario 360o y compruebe que la muestra está en el centro de la vista desde todas las direcciones.
  5. Mueva el escenario a lo largo del eje X hacia la fuente del haz de rayos X haciendo clic en el botón Eje X (Figura3A) para ampliar la muestra y ajustarla según sea necesario para que solo encaje en la vista (Figura3C).
  6. Gire el escenario 360o y ajuste según sea necesario para que la muestra se ajuste a la vista desde todas las direcciones.
  7. Ajuste las condiciones de escaneado como se muestra en la Tabla1.
  8. Comience a escanear; toma unos 10 minutos.

5. Reconstrucción de la imagen

  1. Inicie el software de accesorios del sistema microCT (consulte la Tabla de materiales)y abra los datos escaneados.
  2. Ajuste las diferencias en el eje de rotación de la muestra durante el escaneo haciendo clic en el botón de cálculo del valor de desplazamiento automático (Figura4A: cuadro verde).
  3. Ajuste la orientación de la imagen girando las flechas naranjas (Figura4B). Si se ha cambiado la orientación, repita el paso 5.2.
  4. Haga clic en la pestaña de área (Figura4C: caja magenta) y recorte las áreas donde las muestras no están presentes (Figura4C: caja amarilla).
  5. Haga clic en la pestaña de reconfiguración (Figura4D:cuadro magenta) y establezca los filtros de la siguiente manera para eliminar el ruido. Filtro de reducción de artefacto de anillo: Filtro mediano -3; Filtro de eliminación de ruido: Filtro promedio-1.
  6. Realice la reconfiguración haciendo clic en el botón de reconfiguración (Figura4D: cuadro verde).
  7. Ajuste el brillo y el contraste de la imagen estableciendo los valores en blanco y negro como valor negro 0, valor blanco 250 (Figura4D:cuadro azul).
  8. Guarde el dataset de imagen TIFF reconstruido como un TIFF de 8 bits haciendo clic en el botón Guardar. Cambie el nombre de los archivos TIFF de la siguiente manera: Date_sample_resolution (m)_number.tiff.
    NOTA: Los conjuntos de datos microCT originales de este estudio están disponibles en el repositorio de Figshare, doi:10.6084/m9.figshare.767083736.

6. Análisis de datos

  1. Inicie el software de análisis de datos (consulte la Tabla de materiales)y habilite la importación de archivos TIFF haciendo clic en el icono Base de datos (Figura5A:cuadro magenta) y desactivando el cuadro que se muestra en la Figura 5B.
  2. Haga clic en el icono de importación (Figura5C:cuadro magenta), seleccione el conjunto de datos guardado en la sección 5 y haga clic en Abrir.
  3. Haga clic en el botón Copiar vínculos (Figura5D) para importar los datos.
  4. Muestre la sección transversal 2D haciendo clic en el icono del visor 2D (Figura5C:cuadro azul).
  5. Calibre el conjunto de datos haciendo clic en la pestaña Visor 3D (Figura5E: cuadro magenta) e introduciendo el valor de resolución en el escaneo (que era 0.018 en este estudio [Figura 5F]).
  6. Haga clic en el icono de brillo/contraste (cuadro verdede la figura 5E). Ajuste el brillo y el contraste moviendo el cursor dentro de la imagen 2D mostrada y cambiando el nivel de la ventana y el ancho de la ventana (Figura5G).
  7. Compruebe otras imágenes transversales moviendo la barra de desplazamiento (figura5G: caja).
  8. Cambie la orientación de la sección transversal haciendo clic en el icono de orientación (Figura5E: cuadro azul) y compruebe las imágenes en todas las orientaciones (Figura5H).
  9. Haga clic en la imagen mostrada y elija la pestaña de exportación para almacenar imágenes de sección transversal.

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Representative Results

Realizamos imágenes microCT en A. equina (Anthozoa, Cnidaria), Harmothoe sp. (Polychaeta, Annelida) y X. japonica (Xenoturbellida, Xenacoelomorpha) después de manchar las muestras con 25% de solución lugol. La tinción mejoró con éxito el contraste de las estructuras internas en todos los especímenes, permitiendo observaciones de los tejidos blandos internos (Figura6). Junto con informes anteriores6,7,16,19,22,23,24,25,26 , 28 , 30 , 31 , 32 , 33, esto muestra que la microCT se puede utilizar en varios invertebrados marinos para visualizar su morfología, incluyendo tejidos internos blandos. Se obtuvieron imágenes claras incluso con el espécimen X. japonica, cuya epidermis fue gravemente dañada (Figura6F,G),mostrando que este método es aplicable a especímenes frágiles con daños externos.

El escaneo de sólo la región de interés, a diferencia de un área más amplia, aumentó en gran medida la claridad y la resolución de la imagen (comparar la Figura 6F y la Figura 6G). Sin embargo, se reconstruyó un único conjunto de datos de alta resolución de un espécimen entero para Harmothoe sp. (Figura6C) y X. japonica (Figura6F) a partir de múltiples escaneos realizados en escaneos diferentes (pero superpuestos) partes del espécimen. Las costuras entre cada escaneo eran discretas en las imágenes reconstruidas. Nuestro estudio muestra que se pueden obtener imágenes únicas de alta resolución con sistemas microCT de haz de cono. Al escanear un área más grande a alta resolución, existe un menor riesgo de pasar por alto las estructuras pequeñas. Otra ventaja es que es más fácil localizar las posiciones relativas de las estructuras que están situadas muy separadas, como las puntas anterior y posterior de un anélido alargado.

Figure 1
Figura 1 : Animales invertebrados marinos observados en este estudio. (A-C) Actinia equina (Antozoo, Cnidaria). (A) Extremo distal de un animal vivo relajado en 10% MgCl2 agua de mar. Distal (B) y proximal (C) termina después de la fijación en 70% etanol. (D) Armothoe anestesiado vivo sp. (Polichaeta, Annelida), vista dorsal con anterior a la izquierda. La mayoría de los elytra ya faltaban en esta etapa, y sólo cuatro quedaban cerca del extremo posterior. (E) Xenoturbella japonica (Xenoturbellida, Xenacoelomorpha) fijada en 70% de etanol. Vista derecha, con anterior a la parte superior. Debido a las circunstancias de la colección, su epidermis empezaba a desprenderse. Barras de escala de 3 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2 : Montaje de muestras en el sistemade tomografía computarizada de rayos X de microfoco. (A) Montaje de muestras en un tubo de 50 ml utilizando arcilla. La orientación de la muestra se puede ajustar utilizando la arcilla. (B) Preparación de una punta 'azul' de micropipeta de 1.000 ml para el montaje de muestras pequeñas. a: Punta con el extremo enchufado con 100 ml de agarosa al 0,5% (líneas diagonales). Las muestras fueron colocadas en esta punta. La punta con la muestra se insertó en otra punta 'azul' de micropipeta de 1.000 ml (b, c) para el montaje. b se utilizó para Xenoturbella japonica,y c se utilizó para Harmothoe sp. (C) Mounted X. japonica sample, overview (izquierda) y close up (derecha). La fuente de rayos X se puede ver a la derecha de la muestra. (D) Diagramas para el montaje de muestras en una punta 'azul' de micropipeta de 1.000 ml. a: Muestra X. japonica en agua destilada. b: la muestra estaba en contacto con la pared de la punta (flechas), para que no se mueva durante el escaneo. c: Muestra de Harmothoe sp. en agarosa al 0,5%. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3 : Escaneado de muestras en el sistemade tomografía computarizada de rayos X de microfoco. (A) Pantalla de funcionamiento durante el escaneo del sistema de tomografía computarizada de rayos X de microfoco que muestra una imagen de transmisión de rayos X de una muestra de Actinia equina. Ajuste el contraste y el brillo con el 'Contraste de imagen' en la parte inferior izquierda. (B) Vista del escenario de montaje que muestra la perilla del eje Y. (C) Imagen de transmisión de rayos X de la muestra A. equina después de que la etapa de montaje se haya acercado a la fuente del haz de rayos X. Observe que se agranda en comparación con la imagen en el centro de (A). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4 : Pantalla de funcionamiento del sistema de reconstrucción de imágenes. (A) Pantalla para ajustar las diferencias en el eje de rotación de la muestra durante el escaneo, mostrando una muestra actinia equina. Caja Magenta: pestaña de desplazamiento; caja verde: botón de cálculo automático del valor de desplazamiento. (B) Pantalla para ajustar la orientación de la imagen, con Harmothoe sp. mostrado. (C) Pantalla durante la reconstrucción de la imagen de A. equina,recortando el área fuera de la caja amarilla donde no hay muestras presentes. Caja Magenta: pestaña de área. (D) Pantalla durante la reconstrucción de la imagen, mostrando la imagen reconstruida de A. equina. Caja Magenta: pestaña de reconfiguración; Caja verde: botón de reconfiguración; caja azul: ajuste del valor blanco y negro. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5 : Pantalla de funcionamiento del sistema de análisis de imágenes. (A) Ventana de preferencias. Se ha clickeado en el icono Base de datos (círculo magenta) para abrir la ventana de administración de archivos de base de datos. (B) Ventana de administración de archivos de base de datos. En este software, el cuadro que se muestra con una flecha debe estar desactivado para permitir la importación de archivos TIFF. (C) Menú y barras de herramientas de la pantalla Base de datos. Caja Magenta : icono de importación; cuadro azul: icono del visor 2D. (D) Ventana de importación del conjunto de datos. Círculo Magenta - botón copiar enlaces. (E) Menú y barras de herramientas de la pantalla del visor 2D. Caja Magenta : pestaña Visor 3D; caja verde : icono de brillo/contraste; cuadro azul : icono de orientación. (F) Ventana de configuración de calibración. Introduzca los valores de resolución deseados dentro de las columnas en el cuadro magenta. (G) Sección transversal de una muestra actinia equina que se muestra en la ventana del visor 2D para ajustar el brillo y el contraste. Cuadro Magenta: barra de desplazamiento para comprobar otras secciones transversales. (H) Sección transversal de A. equina que se muestra en la ventana del visor 2D con una orientación diferente a (G). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6 : Imágenes escaneadas y reconstruidas de invertebrados marinos. (A) Secciones transversales y (B) longitudinales de Actinia equina. El área dentro de la caja amarilla punteada en (B) se agranda en el recuadro. Abreviaturas: dm, par de mesenteries directivas; m, par de mesenterios perfectos; mf, filamento mesenterial; p, faringe; si, sifonoglifos; t, tentáculo; flechas, disco oral; puntas de flecha blancas, disco de pedal; puntas de flecha negras, músculo del esfínter. Escamas de barras en A, B a 3 mm. (C-E) Harmothoe sp. (C) Sección sagital de la parte anterior. (D, E) Sección transversal en las líneas punteadas d y e en (C). Abreviaturas: aci - aciculum; acim - músculo acicular; coe - coelom; dlm - músculo longitudinal dorsal; elp - elytrophore; ojo- ojo; int - intestino; mandíbula; mant - antena mediana; boca; mp - músculos de la probóscsí; palp á palp; pha - faringe; prob - probóscis; vlm - músculo longitudinal ventral; vnc - cordón del nervio ventral. Barras de escala: C a 1 mm; D, E a 0,3 mm. (F, G) Xenoturbella japonica. (F) Sección sagital de toda la muestra. (G) Sección sagital de la parte anterior. lamina basal; int - intestino; ml - capa muscular; boca; nn - red nerviosa intraepidérmica; flecha blanca - estatoquista; flecha negra - poro frontal; puntas de flecha blancas - red glandular ventral; puntas de flecha negras - ovocitos. Barras de escala: F a 1 mm, G a 0,5 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Table 1
Tabla 1: Preparación de muestras y protocolo de escaneo para cada espécimen.

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Discussion

Se sabe que los fijadores que utilizan formalina, como la solución de formalina del 10% (v/v) en el agua de mar utilizada en este estudio, preservan la morfología de diversos invertebrados marinos y se utilizan a menudo para imágenes microCT18,24,25 ,26,28,30,33. Sin embargo, las restricciones en el uso de este producto químico se han vuelto estrictas en algunos países en los últimos años, y se pueden utilizar sustitutos como paraformaldehído o glutaraldehído. Si hay planes para extraer ADN después de escanear, es mejor evitar el uso de formalina como un fijador, porque se sabe que fragmenta el ADN. En este caso, se recomienda el uso de fijadores que preservan el ADN, como el 70% de etanol. En este estudio, el cnidario A. equina se fijó utilizando 70% de etanol, y se obtuvieron imágenes microCT claras de las muestras fijas de etanol del 70% (Figura6A,B).

En un estudio anterior que realizó la exploración microCT de varios taxones cnidarios, muchas muestras se deshidrataron en etanol 100%, y algunas fueron secadas a puntocrítico antes de escanear24. Aunque los órganos internos blandos como racimos de tentáculos, músculos y gónadas se observaron con éxito en su estudio, se sabe que los procesos de deshidratación y secado dan lugar a importantes artefactos como la deformación y contracción de los tejidos blandos11 , 21. En el presente estudio, pudimos observar las estructuras internas del cnidario A. equina fijadas en etanol al 70% y teñidas con 25% de solución de Lugol (Figura6A,B). Nuestro protocolo, sin ningún paso de deshidratación o secado, es preferible, y debe realizarse siempre que sea posible para reducir el riesgo de daños a las muestras y artefactos durante el escaneo.

La solución de Lugol, la solución de yodo y el ácido fosfotúrtico (PTA) son soluciones de tinción que se utilizan a menudo en muestras biológicas en imágenes microCT6,7,9,14,16, 17,20,26,27,38. A partir de nuestra experiencia en el uso de varias muestras biológicas, la solución Lugol proporcionó los mejores resultados para muchas muestras, con manchas oscuras en un período relativamente corto de tiempo. La solución de yodo sólo produjo manchas muy débiles, y la PTA requirió mucho tiempo para una tinción suficiente y los especímenes manchados mostraron fuertes contracciones. Por lo tanto, todos los especímenes fueron manchados con solución Lugol en este estudio. Sin embargo, aunque se recomienda la solución de Lugol, la solución de tinción adecuada difiere entre los especímenes, y sugerimos que se realicen ensayos con otras soluciones de tinción si hay suficientes muestras. Independientemente de la solución de tinción, las muestras se contraen durante la tinción37,38, por lo que es importante mantener el tiempo de tinción corto.

Un paso crítico en el escaneo de microCT es montar la muestra para evitar que se mueva. En este estudio, esto se realizó en dos pasos, primero usando agarosa como medio de montaje directo, y luego usando arcilla para montar el tubo que contenía la muestra en el escenario. Para el primer paso, se han utilizado varios medios de montaje de baja densidad en estudios anteriores, incluyendo etanol6,17,20,25,30, agarosa9,29 , y espuma floral15,22,31. Agarose fue seleccionada en este estudio, ya que es un producto químico de bajo costo que es accesible en todo el mundo. Una desventaja de la agarosa es que puede ser difícil recuperar la muestra de la agarosa endurecida después de escanear, pero el uso de agarosa de punto de fusión baja hace que este paso de recuperación sea más fácil. Para el segundo paso, las abrazaderas de mandíbula o tornillos se utilizan a menudo6,9,17. Clay fue seleccionado en este estudio, ya que permite ajustes finos en la orientación y el ángulo de la muestra. Se necesita precaución para los experimentos con tiempos de escaneo largos, ya que la posibilidad de que la muestra se mueva es mayor cuando se utiliza arcilla en lugar de abrazaderas de mandíbula o tornillos.

Un estudio anterior llevó a cabo la exploración microCT en siete especies de poliquetos con longitudes corporales de 2-8 mm, más pequeñas que la sp de Harmothoe utilizada en este estudio16. Fueron capaces de generar imágenes de alta resolución, y mostraron órganos como los sistemas vasculares y la chaeta individual más claro que en el presente estudio. La causa principal de esta diferencia no fue el protocolo, sino las especificaciones de los sistemas microCT utilizados. El sistema utilizado en el estudio anterior estaba equipado con una cámara de dispositivo acoplado a carga de 11 megapíxeles (4000 x 2672 píxeles) con una resolución máxima de <0,8 m/píxel16. El tamaño de matriz de imagen activa del sistema utilizado en este estudio fue de 992 x 992 píxeles, con una resolución máxima de >5 m/píxel. Por lo tanto, la resolución espacial del sistema microCT utilizado en este estudio fue inferior al sistema microCT de alto rendimiento utilizado en Faulwetter et al.16. Esta diferencia era particularmente notable cuando se escaneaban muestras de menos de 8 mm, en la que experimentamos una falta de resolución (datos no mostrados). Sin embargo, debido a que se obtuvieron menos datos durante el escaneo en este estudio, el tiempo de escaneo fue mucho más corto que en el estudio anterior16 (datos: 992 x 992 y 4000 x 2672 píxeles, respectivamente; tiempo de escaneo: 10 a 26 min y 30 min a varias horas, respectivamente). Un corto tiempo de escaneo reduce la decoloración de la tinción de yodo, permitiendo el uso de la solución Lugol, que es una buena solución de tinción con una alta tasa de penetración, pero se difunde fácilmente en DW34. Un tiempo de escaneo corto también reduce la posibilidad de que la muestra se mueva durante el escaneo, lo que permitió el uso de un método de montaje simple utilizando agarosa o DW (Figura2). Los tiempos de escaneo más largos también tienen la desventaja de un posible desenfoque de contracción de muestras en las imágenes. Varios otros problemas mecánicos y de hardware que pueden ocurrir durante escaneos largos también se han reportado39. Por lo tanto, cuando se utilizan sistemas microCT, es importante comprender con precisión la especificación de cada sistema, y elegir el sistema adecuado en términos de tamaño de la muestra o objetivo de investigación. En algunos casos, un sistema microCT con baja resolución puede ser suficiente.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Nos gustaría agradecer a Toshihiko Shiroishi por su ayuda y por proporcionar el entorno de investigación durante este estudio. Agradecemos a Kensuke Yanagi y Takato Izumi por el asesoramiento sobre A. equina,y Masaatsu Tanaka por consejos sobre el espécimen Harmothoe sp. Nos gustaría agradecer al personal del Centro de Investigación Marina de Shimoda, universidad de Tsukuba, y de la Estación Biológica Marina misaki, la Universidad de Tokio, por su ayuda en colecciones de muestras. Nos gustaría agradecer a Editage (www.editage.jp) por la edición en inglés. Este trabajo fue apoyado por la JSPS Grant-in-Aid for Young Scientists (A) (JP26711022) a HN, y JAMBIO, Asociación Japonesa de Biología Marina.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
250-ml Erlenmeyer flask Corning CLS430183
5-ml Sampling tube ST-500 BIO-BIK 103010
50-ml Polypropylene tube Greiner Bio One International 227261
60-mm Non-treated Dish IWAKI 1010-060
Agarose Promega V3125
Ecological grade tip (blue) 1000 µl BMBio BIO1000RF
Ethanol Wako Pure Chemical Industries 057-00451
Formalin Wako Pure Chemical Industries 061-00416
Iodine Wako Pure Chemical Industries 094-05421
Magnesium chloride hexahydrate Wako Pure Chemical Industries 135-00165
OsiriX DICOM Viewer Pixmeo SARL OsiriX MD v10.0 https://www.osirix-viewer.com
Paraformaldehyde Wako Pure Chemical Industries 163-25983
Petiolate needle AS ONE 2-013-01
Pipetman P200 Micropipette GILSON F123601
Pipetman P1000 Micropipette GILSON F123602
Potassium iodide Wako Pure Chemical Industries 166-03971
Precision tweezers 5 DUMONT 0302-5-PS
QuickRack MultI fit tip (yellow) 200 ul Sorenson 10660
Razor blades Feather FA-10
Ring tweezers NAPOX A-26
Stereoscopic microscope Leica MZ95
X-ray Micro-CT imaging system Comscantechno ScanXmate-E090S105

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Ciencias Ambientales Número 150 microCT Solución Lugol yodo Actinia,Cnidaria Harmothoe,Annelida Xenoturbella,Xenacoelomorpha invertebrados
Microfoco CT de rayos X (microCT) Imagen de <em>Actinia equina</em> (Cnidaria), <em>Harmothoe</em> sp. (Annelida) y <em>Xenoturbella japonica</em> (Xenacoelomorpha)
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Maeno, A., Kohtsuka, H., Takatani,… More

Maeno, A., Kohtsuka, H., Takatani, K., Nakano, H. Microfocus X-ray CT (microCT) Imaging of Actinia equina (Cnidaria), Harmothoe sp. (Annelida), and Xenoturbella japonica (Xenacoelomorpha). J. Vis. Exp. (150), e59161, doi:10.3791/59161 (2019).

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