Summary
Hier worden protocollen voor het uitvoeren van micro focus X-Ray computertomografie (microCT) Imaging van drie mariene ongewervelde dieren gedetailleerd uitgelegd. Deze studie beschrijft stappen zoals monster fixatie, kleuring, montage, Scanning, beeld reconstructie en data-analyses. Suggesties over hoe het protocol kan worden aangepast voor verschillende monsters worden ook verstrekt.
Abstract
Traditioneel hebben biologen moeten vertrouwen op destructieve methodes zoals snijden om de interne structuren van ondoorzichtige organismen te onderzoeken. Niet-destructieve micro focus X-Ray computertomografie (microCT) Imaging is uitgegroeid tot een krachtig en opkomende protocol in de biologie, als gevolg van technologische vooruitgang in monster kleurings methoden en innovaties in microCT hardware, processing computers, en data analyse software. Dit protocol wordt echter niet vaak gebruikt, zoals het is in de medische en industriële gebieden. Een van de redenen voor dit beperkte gebruik is het ontbreken van een eenvoudige en begrijpelijke handleiding die alle noodzakelijke stappen omvat: monsterverzameling, fixatie, kleuring, montage, Scanning en gegevensanalyses. Een andere reden is de enorme diversiteit van metazoanen, met name mariene ongewervelde dieren. Door de uiteenlopende afmetingen, morfologieën en fysiologieën van mariene ongewervelde dieren is het van cruciaal belang om de experimentele omstandigheden en hardwareconfiguraties bij elke stap aan te passen, afhankelijk van het monster. Hier worden microCT-beeldvormingsmethoden gedetailleerd toegelicht met behulp van drie phylogenetisch diverse mariene ongewervelde dieren: Actinia equina (anthozoa, Cnidaria), Harmothoe SP. (Polychaeta, Annelida) en xenoturbella japonica ( Xenoturbellida, Xenacoelomorpha). Er worden ook suggesties gegeven voor het uitvoeren van microCT-beeldvorming op verschillende dieren.
Introduction
Biologische onderzoekers hebben over het algemeen dunne secties moeten maken en waarnemingen moeten verrichten door licht of elektronenmicroscopie om de inwendige structuren van ondoorzichtige organismen te onderzoeken. Deze methoden zijn echter destructief en problematisch wanneer ze worden toegepast op zeldzame of waardevolle specimens. Bovendien zijn verschillende stappen in de methode, zoals insluiten en snijden, tijdrovend en kan het enkele dagen duren voordat een voorbeeld wordt nageleefd, afhankelijk van het protocol. Bovendien, bij het hanteren van tal van secties, is er altijd een mogelijkheid van beschadiging of verlies van sommige secties. Weefsel clearing technieken zijn beschikbaar voor sommige specimens1,2,3,4,5 maar zijn nog niet van toepassing op veel diersoorten.
Om deze problemen te overwinnen, zijn sommige biologen begonnen met het gebruik van micro focus röntgenfoto computertomografie (microct) beeldvorming6,7,8,9,10,11, 12,13,14,15. In X-Ray CT wordt het preparaat bestraald met röntgenstralen vanuit verschillende hoeken die worden gegenereerd uit een röntgenbron die rond het monster beweegt, en worden de verzonden röntgenstralen bewaakt door een detector die ook rond het monster beweegt. De verkregen X-Ray transmissiegegevens worden geanalyseerd om transversale beelden van het preparaat te reconstrueren. Deze methode maakt de observatie van interne structuren mogelijk zonder vernietiging van het monster. Vanwege de veiligheid en het gemak, het wordt vaak gebruikt in medische en tandheelkundige toepassingen, en CT-systemen kunnen worden gevonden in ziekenhuizen en tandheelkundige centra wereldwijd. Bovendien wordt industriële X-Ray CT vaak gebruikt voor het observeren van niet-medische monsters voor inspectie en metrologie in het industriële gebied. In tegenstelling tot de medische CT, waarin de röntgenbron en de detectoren mobiel zijn, zijn de twee onderdelen bevestigd in industriële CT, waarbij het monster wordt gedraaid tijdens het scannen. Industriële CT produceert over het algemeen hogere resolutie beelden dan medische CT en wordt aangeduid als microCT (micrometer-niveau resolutie) of nanoCT (nanometer-niveau resolutie). Onlangs is onderzoek met behulp van microct snel toegenomen in verschillende gebieden van de biologie14,15,16,17,18,19, 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34.
Biologische studies met behulp van CT aanvankelijk gerichte interne structuren die voornamelijk bestaan uit harde weefsel, zoals bot. Vooruitgang in kleurings technieken met behulp van verschillende chemische agentia stelde de visualisatie van zachte weefsels in verschillende organismen6,7,8,9,14,15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34. van deze reagentia zijn op jodium gebaseerde contrastmiddelen relatief veilig, goedkoop en kunnen worden gebruikt voor de visualisatie van zachte weefsels in verschillende organismen7,14. Wat mariene ongewervelde dieren betreft, is microct op grote schaal gebruikt voor dergelijke diersoorten, zoals weekdieren6,25,32,33, tot18,19, 20 , 28, en arthoropods21,23,29,31. Er zijn echter weinig rapporten over andere dier fyla, zoals bryozoërs6, xenacoelomorphs26en cnidariërs24,30. Over het algemeen zijn er minder studies met behulp van microCT op mariene ongewervelde dieren dan die op gewervelde dieren. Een belangrijke reden voor dit beperkte gebruik op mariene ongewervelde dieren is de enorme diversiteit die in deze diersoorten wordt waargenomen. Door hun uiteenlopende afmetingen, morfologieën en fysiologieën reageert elke soort verschillend op verschillende experimentele procedures. Daarom is het van cruciaal belang tijdens de monstervoorbereiding om de meest geschikte fixatie-en kleurings reagens te kiezen en voorwaarden vast te stellen bij elke stap, aangepast voor elke soort. Evenzo is het ook noodzakelijk om de scan configuraties in te stellen, zoals de montagemethode, spanning, stroom, mechanische vergrotings snelheid en het ruimte resolutievermogen, op passende wijze voor elk monster. Om dit probleem te overwinnen, een eenvoudige en begrijpelijke handleiding die alle van de nodige stappen dekt, legt uit hoe elke stap kan worden aangepast afhankelijk van het specimen, en toont gedetailleerde voorbeelden uit meerdere monsters is essentieel.
In de huidige studie beschrijven we het microCT Imaging protocol stap voor stap, van monster fixatie tot gegevensanalyse, met behulp van drie ongewervelde mariene soorten. Specimens van de zeeanemonen Actinia equina (anthozoa, Cnidaria) werden verzameld in de buurt van het Misaki Marine Biological station, de Universiteit van Tokio. Ze hadden een sferische, zachte Body die ongeveer 2 cm in diameter was (Figuur 1a-C). Harmothoe SP. (Polychaeta, Annelida) monsters werden ook verzameld in de buurt van Misaki Marine Biological station. Het waren slanke wormen die ongeveer 1,5 cm lang waren, met stoere chaetae aanwezig langs het hele lichaam (figuur 1d). Een Xenoturbella japonica35 (Xenoturbellida, Xenacoelomorpha) specimen werd verzameld in de buurt van Shimoda Marine Research Center, University of Tsukuba, tijdens het 13e JAMBIO Coastal organisme joint Survey. Het was een zacht-bodied worm die ongeveer 0,8 cm lang was (Figuur 1e). Aanpassingen voor de voorwaarden en configuraties van elk monster worden gedetailleerd toegelicht. Onze studie biedt verschillende suggesties voor het uitvoeren van microCT-beeldvorming op mariene ongewervelde dieren, en we hopen dat het biologen zal inspireren om dit protocol voor hun onderzoek te gebruiken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. fixatie
- Voor Actinia equina, ontspan de dieren in 10% MgCl2 zeewater voor ongeveer 15 min bij kamertemperatuur. Transfer naar 70% ethanol en bewaren bij kamertemperatuur.
- Voor Harmothoe SP., anesthetiseer de dieren door ze te plaatsen in ijskoud zeewater voor ongeveer 15 min. Transfer naar 10% (v/v) formaline oplossing met zeewater en bewaren bij kamertemperatuur.
- Voor Xenoturbella japonica, ontspan het dier met behulp van 7% MgCl2 in zoet water. Fix in 4% Paraformaldehyde (PFA) in gefilterd zeewater 's nachts. Plaats in 70% ethanol en bewaar bij 4 °C.
Let op: PFA is gevaarlijk en moet voorzichtig behandeld worden.
2. vlekken
- Breng de monsters over naar 50% ethanol en bewaar bij kamertemperatuur gedurende 15 uur. Vervang de 50% ethanol met 25% ethanol en bewaar bij kamertemperatuur gedurende 2 uur.
Opmerking: dit is niet nodig voor de Harmothoe SP. monster in 10% (v/v) formaline oplossing met zeewater. - Vervang de oplossing door gedistilleerd water (DW) en bewaar de monsters in DW bij kamertemperatuur 2 uur. Herhaal deze stap drie keer.
- Bereid 25% Lugol oplossing voor door de stockoplossing (onder) tot 25% te verdunen met DW. Stock oplossing (100% Lugol oplossing) bevat 10 g KI en 5 g I2, aangepast tot 100 ml met DW.
Opmerking: Lugol-oplossing is lichtgevoelig, dus Bewaar en behandel de oplossing beschermd tegen licht. Volg de voorschriften van elk land en elke instelling voor de verwerking van jodium en afvalverwijdering. - Decaner de DW uit de monsters en giet de 25% Lugol oplossing. Vlek gedurende 24 uur bij kamertemperatuur.
3. stage montage
- Bereid 0,5% agarose door het oplossen van 500 mg agarose in 100 mL DW in een erlenmeyer van 250 mL in een magnetron (800 W, ongeveer 1-3 min). Koel tot ongeveer 30-40 °C door op kamertemperatuur te houden.
Let op: niet oververhit raken of de erlenmeyer niet volledig afdichten bij het verwarmen om te voorkomen dat de agarose overkookt. - Monteer grote monsters zoals a. equina met behulp van een 50 ml buis.
Opmerking: gebruik 50 mL buizen voor het monteren van grote monsters die niet in een 1.000 μL micro pipet ' blauwe ' Tip passen.- Plaats het gebeitst monster in een schaal van 60 mm met DW om overmatige kleurings oplossing van het oppervlak af te spoelen.
- Giet zachtjes 5 mL 0,5% agarose in een buis van 50 mL en verharden de agarose op ijs. Let op dat u geen bubbels in de agarose maakt.
- Voeg zachtjes 20 mL 0,5% agarose toe aan de buis van 50 mL en plaats op ijs totdat de agarose begint te harden. Plaats het preparaat binnen de 0,5% agarose met behulp van een tang. Let op dat u geen bubbels in de agarose maakt.
- Pas de positie en oriëntatie van het monster met de Tang en verharden de agarose op ijs.
- Plaats klei op de microCT montage fase en stel de 50 mL buis op de klei (Figuur 2A).
- Monteer kleine monsters zoals Harmothoe SP. en X. japonica met behulp van een 1.000 μL micro pipet ' Blue ' tip.
Opmerking: voor kleinere monsters kan 200 μL micro pipet ' gele ' tip worden gebruikt. Gebruik in dit geval 30 μL agarose voor de stekker en voeg 200 μL agarose of gedistilleerd water toe.- Trek 100 μL van 0,5% agarose op in een micro pipet ' Blue ' van 1.000 μL en verharden de agarose door de punt over ijs te houden, waardoor er een stekker in de punt zit (Figuur 2B-a).
- Decante het gebeitst monster in een 60-mm schaal zonder gebruik van een tang.
- Breng het monster voorzichtig over met ring pincet in een andere 60-mm schaal met DW om overmatige kleurings oplossing van het oppervlak af te spoelen.
- Voeg met behulp van een micro pipet 1.000 μL van 0,5% agarose of DW toe aan de aangesloten punt (stap 3.3.1).
Opmerking: gebruik van 0,5% agarose wordt aanbevolen, maar gebruik DW voor fragiele of kostbare monsters waarin agarose moet worden vermeden. - Breng het monster voorzichtig over van de 60-mm schaal in de agarose of DW in de ingeplugde tip met ring pincet.
- Stel de positie en de oriëntatie van het monster voorzichtig in met een petiolaat naald of precisie pincet. Let op dat u geen bubbels in het afdekmedium maakt. Zorg ervoor dat het monster stabiel is tussen de wanden van de tip wanneer DW als montage medium wordt gebruikt (figuur 2D-b). Plaats de punt op ijs om de agarose te verharden als het wordt gebruikt als afdekmedium.
- Snijd de tip van een nieuwe 1.000 μL micro pipet ' blauwe ' Tip (Figuur 2B-b, c) en steek de punt van de aangesloten punt in de nieuwe tip.
- Plaats klei op de microCT montage fase en stel de uiteinden in met het monster binnenin op de klei (Figuur 2C, D).
Opmerking: de kleurings oplossing begint het monster af te spoelen zodra het in DW is geplaatst, dus ga snel naar de volgende scan stap.
4. MicroCT Scanning
- Schakel de X-Ray Beam in op 80 kV, 100 μA.
- Terwijl u de X-Ray transmissie afbeelding in het midden van het scherm (Figuur 3a) observeert, verplaatst u het werkgebied zodanig dat het hele monster zichtbaar is door op de X -en Z-as -knoppen (Figuur 3a) te klikken en handmatig aanpassen van de Y-as-knop op de montage fase (Figuur 3b). Stel het contrast van de afbeelding zo in dat de inwendige structuren kunnen worden geobserveerd door de contrast omstandigheden aan te passen (Figuur 3A: beeldcontrast).
- Pas de oriëntatie van het monster aan door de hoek van de buis/punt in de klei te veranderen (Figuur 2a). Draai het werkgebied 90 ° door de rotatie-as (Figuur 3a) in te stellen op 90 en te klikken op de relatieve bewegingsknop (Figuur 3a). Voer dezelfde manoeuvre vier keer uit om een volledige rotatie te voltooien.
Opmerking: Schakel de X-Ray Beam handmatig uit telkens wanneer de voorbeeld deur wordt geopend, tenzij het systeem automatisch wordt uitgeschakeld. - Verplaats het werkgebied zodat het monster zich in het midden van de weergave bevindt door op de knop Z-as (Figuur 3A) te klikken en door de Y-as-knop op de montage fase handmatig aan te passen (Figuur 3B). Draai het werkgebied met 90 ° en doe hetzelfde. Draai de stage 360 ° en controleer of het monster vanuit alle richtingen in het midden van de weergave staat.
- Verplaats het werkgebied langs de x-as naar de X-Ray Beam-bron door op de x-as -knop (afbeelding 3A) te klikken om het monster te vergroten en zo nodig aan te passen, zodat het gewoon in de weergave past (Figuur 3C).
- Draai de stage 360 ° en pas deze zo nodig aan zodat het monster vanuit alle richtingen in het zicht past.
- Pas de scan condities aan zoals weergegeven in tabel 1.
- Beginnen met scannen; het duurt ongeveer 10 minuten.
5. beeld reconstructie
- Start de accessoiresoftware van het microCT-systeem (Zie de tabel met materialen) en open de gescande gegevens.
- Pas tijdens het scannen de verschillen in de rotatie-as van het monster aan door te klikken op de knop automatische verschuiving waarde berekenen (afbeelding 4A: groen kader).
- Pas de oriëntatie van de afbeelding aan door de oranje pijlen te roteren (Figuur 4B). Als de afdrukstand is gewijzigd, herhaalt u stap 5,2.
- Klik op het tabbladgebied (Figuur 4c: magenta doos) en snijd gebieden waar geen monsters aanwezig zijn (Figuur 4c: gele doos).
- Klik op het tabblad opnieuw configureren (afbeelding 4D: magenta vak) en stel de filters als volgt in om ruis te verwijderen. Ring artefact Verminder filter: mediaan filter-3; Noise eliminatie filter: gemiddelde filter-1.
- Voer een herconfiguratie uit door op de knop opnieuw configureren te klikken (afbeelding 4D: groene doos).
- Pas de helderheid en het contrast van de afbeelding aan door de zwart-witwaarden in te stellen als zwarte waarde 0, witte waarde 250 (afbeelding 4D: blauw kader).
- Sla de gereconstrueerde TIFF-afbeeldingsgegevensset op als een 8-bits TIFF door op de knop Opslaan te klikken. Wijzig de naam van TIFF-bestanden als volgt: Date_sample_resolution (μm) _number. TIFF.
Opmerking: de oorspronkelijke microCT-gegevenssets uit deze studie zijn beschikbaar in de Figshare repository, DOI: 10.6084/M9. figshare. 767083736.
6. gegevensanalyses
- Start de data-analyse software (Zie de tabel met materialen) en schakel het importeren van TIFF-bestanden in door op het database pictogram te klikken (afbeelding 5A: magenta) en het vakje uit te schakelen dat wordt weergegeven in afbeelding 5B.
- Klik op het pictogram importeren (afbeelding 5C: magenta-vak), selecteer de gegevensset die is opgeslagen in sectie 5 en klik op openen.
- Klik op de knop koppelingen kopiëren (afbeelding 5D) om de gegevens te importeren.
- Geef de 2D-dwarsdoorsnede weer door op het pictogram van de 2D-Viewer te klikken (afbeelding 5C: blauw kader).
- Kalibreer de gegevensset door te klikken op het tabblad 3D-viewer (afbeelding 5E: magenta) en de resolutie waarde op te geven bij het scannen (0,018 in deze studie [Figuur 5F]).
- Klik op het pictogram helderheid/contrast (afbeelding 5E groene doos). Pas de helderheid en het contrast aan door de cursor in de weergegeven 2D-afbeelding te verplaatsen en het venster niveau en de vensterbreedte te wijzigen (Figuur 5G).
- Controleer andere doorsnede afbeeldingen door de schuifbalk te verplaatsen (afbeelding 5G: doos).
- Verander de oriëntatie van de dwarsdoorsnede door op het oriëntatie pictogram te klikken (afbeelding 5E: blauw kader) en controleer de beelden op alle oriëntaties (Figuur 5H).
- Klik op de weergegeven afbeelding en kies het tabblad exporteren om doorsnede afbeeldingen op te slaan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
We voerden microCT Imaging op A. equina (Anthozoa, Cnidaria), Harmothoe SP. (Polychaeta, Annelida), en X. japonica (Xenoturbellida, xenacoelomorpha) na kleuring van de monsters met 25% Lugol oplossing. De kleuring heeft het contrast van de inwendige structuren in alle specimens met succes verbeterd, waardoor waarnemingen van interne zachte weefsels mogelijk zijn (Figuur 6). Samen met verslagen uit het verleden6,7,16,19,22,23,24,25,26 , 28 , 30 , 31 , 32 , 33, dit toont aan dat microct kan worden gebruikt op verschillende mariene ongewervelde dieren voor het visualiseren van hun morfologie, met inbegrip van zachte interne weefsels. Duidelijke beelden werden verkregen, zelfs met de X. japonica specimen, waarvan de epidermis was zwaar beschadigd (Figuur 6F, G), waaruit blijkt dat deze methode van toepassing is op fragiele specimens met externe schade.
Het scannen van alleen het interessegebied, in tegenstelling tot een breder gebied, verhoogde de helderheid en resolutie van het beeld aanzienlijk (Vergelijk Figuur 6F en Figuur 6G). Echter, een enkele high-resolution gegevensset van een heel specimen werd gereconstrueerd voor harmothoe SP. (Figuur 6C) en X. japonica (Figuur 6F) van meerdere scans uitgevoerd op verschillende (maar overlappende) delen van het preparaat. De naden tussen elke scan waren onopvallend in de gereconstrueerde beelden. Onze studie toont aan dat enkelvoudige hoge-resolutie beelden kunnen worden verkregen met kegelvormige microCT-systemen. Door een groter gebied te scannen met hoge resolutie, is er een kleiner risico van het uitkijkend op kleine structuren. Een ander voordeel is dat het gemakkelijker is om de relatieve posities te lokaliseren van structuren die ver uit elkaar liggen, zoals de voorste en achterste uiteinden van een langwerpig annelid.
Figuur 1 : Ongewervelde mariene dieren die in dit onderzoek zijn waargenomen. (a-C) Actinia equina (Anthozoa, Cnidaria). A)distale uiteinde van een levend dier ontspannen in 10% MgCl2 zeewater. Distale (B) en proximale (C) eindigt na fixatie in 70% ethanol. (D) levende verdoofd harmothoe SP. (Polychaeta, Annelida), rugzicht met voorste naar links. Het merendeel van de Elytra ontbrak al in dit stadium, met slechts vier overgebleven in de buurt van het achterste uiteinde. E) xenoturbella japonica (Xenoturbellida, Xenacoelomorpha), vastgesteld op 70% ethanol. Rechter aanzicht, met voorste naar de top. Vanwege de omstandigheden bij de inzameling begon de epidermis af te komen. Schaal staven = 3 mm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2 : Montage monsters op het micro focus X-Ray computertomografie systeem. A) montagemonsters in een buis van 50 ml met behulp van klei. De oriëntatie van het monster kan worden aangepast met behulp van de klei. B) bereiding van een 1.000 μL micro pipet ' Blue ' Tip voor de montage van kleine monsters. a: Tip met het uiteinde aangesloten met 100 μL van 0,5% agarose (diagonale lijnen). De monsters werden in deze tip geplaatst. De punt met het monster werd ingebracht in een andere 1.000 μL micro pipet ' blauwe ' Tip (b, c) voor montage. b werd gebruikt voor Xenoturbella japonica, en c werd gebruikt voor Harmothoe SP. (c) gemonteerd X. japonica sample, overzicht (links) en close up (rechts). X-Ray bron kan worden gezien rechts van het monster. D) schema's voor de montage van monsters in een micro pipet ' Blue ' van 1.000 μL. a: X. japonica monster in gedistilleerd water. b: het monster was in contact met de tipmuur (pijlen), zodat het niet beweegt tijdens het scannen. c: Harmothoe SP. monster in 0,5% agarose. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3 : Het scannen van samples op het micro focus X-Ray computertomografie systeem. (A) bedieningsscherm tijdens het scannen van het MicroFocus X-Ray computertomografie systeem met een Röntgen transmissie afbeelding van een Actinia equina -specimen. Pas het contrast en de helderheid aan met het ' afbeeldingscontrast ' linksonder. B) weergave van de montage fase die de Y-as-knop weergeeft. C) X-Ray transmissie afbeelding van het A. equina -preparaat nadat de montage fase dichter bij de bron van de röntgenstraal is geplaatst. Merk op dat het wordt vergroot in vergelijking met de afbeelding in het midden van (A). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4 : Bedieningsscherm van het beeld reconstructie systeem. (A) scherm voor het aanpassen van verschillen in de rotatie-as van het monster tijdens het scannen, met een Actinia equina -specimen. Magenta vak: tabblad verschuiving; groene doos: automatische verschuiving waarde berekening knop. (B) scherm voor het aanpassen van de oriëntatie van de afbeelding, met Harmothoe SP. afgebeeld. (C) scherm tijdens het beeld reconstructie van A. equina, trimmen van het gebied buiten het gele vak waar geen monsters aanwezig zijn. Magenta vak: tabbladgebied. (D) scherm tijdens de reconstructie van het beeld, met het gereconstrueerde beeld van A. equina. Magenta vak: tabblad opnieuw configureren; groene doos: knop opnieuw configureren; blauwe doos: zwart-witwaarde aanpassing. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5 : Bedieningsscherm van het beeldanalyse systeem. (A) voorkeurs venster. Op het database pictogram (magenta cirkel) is geklikt om het venster database-bestandsbeheer te openen. (B) venster database bestandsbeheer. In deze software moet het vak dat wordt weergegeven met een pijl uitgeschakeld zijn om TIFF-bestanden te kunnen importeren. (C) menu-en gereedschaps balken van het database scherm. Magenta vak = pictogram importeren; Blue Box = 2D-Viewer pictogram. (D) venster voor importeren van gegevensset. Magenta cirkel = knop koppelingen kopiëren. (E) menu-en gereedschaps balken van het 2D-Viewer scherm. Magenta Box = tabblad 3D-viewer; groen kader = pictogram helderheid/contrast; blauw vak = oriëntatie pictogram. (F) venster voor kalibratie-instellingen. Geef de gewenste resolutiewaarden op in de kolommen in het vak magenta. G) doorsnede van een Actinia equina -specimen dat in het 2D-viewer venster wordt weergegeven voor het aanpassen van de helderheid en het contrast. Magenta doos: schuifbalk voor het controleren van andere dwarsdoorsneden. H) doorsnede van A. equina , weergegeven in het 2D-viewer venster met een andere oriëntatie dan (G). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6 : Gescande en gereconstrueerde beelden van ongewervelde waterdieren. A) dwarse en (B) longitudinale delen van Actinia equina. Het gebied binnen de gestippelde gele doos in (B) wordt vergroot in de inzet. Afkortingen: DM, paar richtlijn mesenteries; m, paar perfecte mesenteries; MF, mesenteriaal filament; p, farynx; si, siphonoglyphs; t, tentakel; pijlen, orale schijf; witte pijlpunten, pedaal schijf; zwarte pijlpunten, sfincter spier. Schaal staven in A, B = 3 mm. (C-E) Harmothoe SP.c) Sagittaal gedeelte van het voorste deel. (D, E) Dwarsdoorsnede op de gestippelde lijnen d en e in (C). Afkortingen: ACI = aciculum; Acim = acicular spier; Coe = coelom; DLM = dorsale longitudinale spier; Elp = elytrophore; oog = oog; int = darm; kaak = kaak; Mant = mediane antenne; mo = mond; MP = spieren van Proboscis; palp = palp; Pha = farynx; prob = Proboscis; VLM = ventrale longitudinale spier; VNC = ventrale zenuw streng. Schaal staven: C = 1 mm; D, E = 0,3 mm. (F, G) xenoturbella japonica. F) Sagittaal gedeelte van het hele monster. G) Sagittaal gedeelte van het voorste deel. BL = basale lamina; int = darm; ml = spierlaag; mo = mond; nn = intraepidermale zenuw net; witte pijl = statocyst; zwarte pijl = frontale porie; witte pijlpunten = ventrale klier netwerk; zwarte pijlpunten = eicellen. Schaal staven: F = 1 mm, G = 0,5 mm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Tabel 1: monstervoorbereiding en scanning protocol voor elk specimen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fixatieven die formaline gebruiken, zoals de 10% (v/v) formaline oplossing in zeewater die in deze studie wordt gebruikt, zijn gekend om de morfologie van diverse mariene ongewervelde dieren te behouden en worden vaak gebruikt voor microct-beeldvorming18,24,25 ,26,28,30,33. Beperkingen op het gebruik van deze chemische stof zijn echter in sommige landen in de afgelopen jaren streng geworden, en substituten zoals Paraformaldehyde of Glutaaraldehyde kunnen worden gebruikt. Als er plannen zijn om DNA te extraheren na het scannen, is het beter om te voorkomen dat formaline als fixatief wordt gebruikt, omdat het bekend is dat het DNA fragmenteren. In dit geval wordt het gebruik van fixeermiddelen die het DNA bewaren, zoals 70% ethanol, aanbevolen. In deze studie, de cnidarian A. equina werd vastgesteld met behulp van 70% ethanol, en duidelijke microct beelden werden verkregen uit de 70% ethanol-vaste monsters (Figuur 6A, B).
In een eerdere studie die microCT scannen van verschillende cnidarian taxa uitgevoerd, veel monsters werden gedehydrateerd in 100% ethanol, en sommige waren kritische-punt-gedroogd voorafgaand aan het scannen24. Hoewel zachte inwendige organen zoals tentakel clusters, spieren en geslachtsklieren met succes werden waargenomen in hun studie, zijn uitdroging en droogprocessen bekend om te resulteren in belangrijke artefacten zoals de vervorming en contractie van zachte weefsels11 , 21. in de huidige studie waren we in staat om de interne structuren van de cnidarian A. equina vast te stellen in 70% ethanol en gekleurd met 25% Lugol oplossing (Figuur 6A, B). Ons protocol, zonder uitdroging of droog stappen, verdient de voorkeur en moet zoveel mogelijk worden uitgevoerd om het risico op beschadiging van de specimens en artefacten tijdens het scannen te verkleinen.
Lugol oplossing, jodiumoplossing, en phosphotungstic acid (PTA) zijn kleurings oplossingen die vaak worden gebruikt op biologische monsters in microct beeldvorming6,7,9,14,16, 17,20,26,27,38. Uit onze ervaring met het gebruik van verschillende biologische monsters, Lugol oplossing verstrekt de beste resultaten voor vele monsters, met donkere kleuring in een relatief korte hoeveelheid tijd. Jodiumoplossing leverde alleen zeer zwakke vlekken, en PTA vereist een lange tijd voor voldoende kleuring en de bevlekte specimens toonde sterke contracties. Daarom werden alle specimens in deze studie met Lugol-oplossing bevlekt. Echter, hoewel Lugol oplossing wordt aanbevolen, verschilt de juiste kleurings oplossing tussen de specimens en wij stellen voor dat proeven met andere kleurings oplossingen worden uitgevoerd als er voldoende specimens zijn. Ongeacht de kleuring oplossing, monsters doen contract tijdens kleuring37,38, dus het is belangrijk om de kleuring tijd kort te houden.
Een kritieke stap bij het scannen van micro CT is om het monster te monteren om te voorkomen dat het beweegt. In deze studie, dit werd uitgevoerd in twee stappen, eerst met behulp van agarose als de directe montage medium, en vervolgens met behulp van klei te monteren van de buis die het monster bevatte op het podium. Voor de eerste stap zijn verschillende bevestigings media met lage dichtheid gebruikt in eerdere studies, waaronder ethanol6,17,20,25,30, agarose9,29 , en Floral Foam15,22,31. Agarose werd geselecteerd in deze studie omdat het een goedkope chemische stof is die wereldwijd toegankelijk is. Een nadeel van agarose is dat het moeilijk kan zijn om het monster uit de verharde agarose te halen na het scannen, maar het gebruik van laag smeltende punt agarose maakt deze ophaal stap gemakkelijker. Voor de tweede stap worden kaak klemmen of schroeven vaak gebruikt6,9,17. Clay werd geselecteerd in deze studie omdat het fijne aanpassingen in de oriëntatie en hoek van het monster mogelijk maakt. Voorzichtigheid is geboden voor experimenten met lange scantijden, omdat de mogelijkheid van het verplaatsen van het monster hoger is bij het gebruik van klei in plaats van kaak klemmen of schroeven.
Een eerdere studie voerde microct Scanning uit op zeven borstel soorten met een lichaamslengte van 2-8 mm, kleiner dan de harmothoe SP. gebruikt in deze studie16. Ze waren in staat om hoge-resolutie beelden te genereren, en toonde organen zoals vasculaire systemen en individuele Chaeta duidelijker dan in de huidige studie. De belangrijkste oorzaak van dit verschil was niet het Protocol, maar de specificaties van de gebruikte microCT-systemen. Het systeem dat in de vorige studie werd gebruikt, was uitgerust met een 11-megapixel oplaad camera (4000 x 2672 pixels) met een maximale resolutie van < 0,8 μm/pixel16. De actieve afbeeldings matrixgrootte van het systeem dat in deze studie werd gebruikt was 992 x 992 pixels, met een maximale resolutie van > 5 μm/pixel. Daarom was de ruimtelijke resolutie van het microCT-systeem dat in deze studie werd gebruikt inferieur aan het High-Performance microCT-systeem dat wordt gebruikt in Faulwetter et al.16. Dit verschil was vooral merkbaar bij het scannen van specimens kleiner dan 8 mm, waarin we een gebrek aan resolutie ondervonden (gegevens niet weergegeven). Echter, omdat er minder gegevens werden verkregen tijdens het scannen in deze studie, de scantijd was veel korter dan in de vorige studie16 (data: 992 x 992 en 4000 x 2672 pixels, respectievelijk; scantijd: 10 tot 26 minuten en 30 minuten tot enkele uren, respectievelijk). Een korte scantijd vermindert de verkleuring van de jodium kleuring, waardoor het gebruik van Lugol oplossing, dat is een goede kleurings oplossing met een hoge penetratie snelheid, maar gemakkelijk verspreidt in DW34. Een korte scantijd vermindert ook de mogelijkheid van het monster bewegen tijdens het scannen, waardoor het gebruik van een eenvoudige montagemethode met behulp van agarose of DW (Figuur 2). Langere scantijden hebben ook het nadeel van mogelijke monster krimp vervaging in afbeeldingen. Verschillende andere mechanische en hardwareproblemen die kunnen optreden tijdens lange scans zijn ook gerapporteerd39. Daarom is het bij het gebruik van microCT-systemen belangrijk om de specificatie van elk systeem nauwkeurig te begrijpen en het juiste systeem te kiezen in termen van specimen grootte of onderzoeksdoel. In sommige gevallen kan een microCT-systeem met een lage resolutie voldoende zijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We willen Toshihiko Shiroishi graag bedanken voor zijn hulp en voor het verstrekken van de onderzoeksomgeving tijdens deze studie. We zijn Kensuke Yanagi en Takato Izumi dankbaar voor advies over A. equinaen Masaatsu Tanaka voor advies over het Harmothoe SP. specimen. We willen de medewerkers van het Shimoda Marine Research Center, de Universiteit van Tsukuba en het Misaki Marine Biological station, de Universiteit van Tokio, bedanken voor hun hulp in sample collecties. We willen graag Editage (www.editage.jp) bedanken voor de Engelse taal bewerking. Dit werk werd gesteund door de JSPS-subsidie-in-Aid voor jonge wetenschappers (A) (JP26711022) aan HN en JAMBIO, Japanse Vereniging voor mariene biologie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 250-ml Erlenmeyer flask | Corning | CLS430183 | |
| 5-ml Sampling tube ST-500 | BIO-BIK | 103010 | |
| 50-ml Polypropylene tube | Greiner Bio One International | 227261 | |
| 60-mm Non-treated Dish | IWAKI | 1010-060 | |
| Agarose | Promega | V3125 | |
| Ecological grade tip (blue) 1000 µl | BMBio | BIO1000RF | |
| Ethanol | Wako Pure Chemical Industries | 057-00451 | |
| Formalin | Wako Pure Chemical Industries | 061-00416 | |
| Iodine | Wako Pure Chemical Industries | 094-05421 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Wako Pure Chemical Industries | 135-00165 | |
| OsiriX DICOM Viewer | Pixmeo SARL | OsiriX MD v10.0 | https://www.osirix-viewer.com |
| Paraformaldehyde | Wako Pure Chemical Industries | 163-25983 | |
| Petiolate needle | AS ONE | 2-013-01 | |
| Pipetman P200 Micropipette | GILSON | F123601 | |
| Pipetman P1000 Micropipette | GILSON | F123602 | |
| Potassium iodide | Wako Pure Chemical Industries | 166-03971 | |
| Precision tweezers 5 | DUMONT | 0302-5-PS | |
| QuickRack MultI fit tip (yellow) 200 ul | Sorenson | 10660 | |
| Razor blades | Feather | FA-10 | |
| Ring tweezers | NAPOX | A-26 | |
| Stereoscopic microscope | Leica | MZ95 | |
| X-ray Micro-CT imaging system | Comscantechno | ScanXmate-E090S105 |
References
- Susaki, E. A., Tainaka, K., Perrin, D., Yukinaga, H., Kuno, A., Ueda, H. R. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10, 1709-1727 (2015).
- Susaki, E. A., Ueda, H. R. Whole-body and whole-organ clearing and imaging techniques with single-cell resolution: toward organism-level systems biology in mammals. Cell Chemical Biology. 23, 137-157 (2016).
- Silvestri, L., Costantini, I., Sacconi, L., Pavone, F. S. Clearing of fixed tissue: a review from a microscopist's perspective. Journal of Biomedical Optics. 21, 081205 (2016).
- Greenbaum, A., et al. Bone CLARITY: clearing, imaging, and computational analysis of osteoprogenitors within intact bone marrow. Science Translational Medicine. 9, (2017).
- Konno, A., Okazaki, S. Aqueous-based tissue clearing in crustaceans. Zoological Letters. 4, 13 (2018).
- Metscher, B. D. MicroCT for comparative morphology: simple staining methods allow high-contrast 3D imaging of diverse non-mineralized animal tissues. BMC Physiology. 9, 11 (2009).
- Metscher, B. D. MicroCT for developmental biology: a versatile tool for high-contrast 3D imaging at histological resolutions. Developmental Dynamics. 238 (3), 632-640 (2009).
- Degenhardt, K., Wright, A. C., Horng, D., Padmanabhan, A., Epstein, J. A. Rapid 3D phenotyping of cardiovascular development in mouse embryos by micro-CT with iodine staining. Circulation Cardiovascular Imaging. 3 (3), 314-322 (2010).
- Metscher, B. D. X-ray microtomographic imaging of intact vertebrate embryos. Cold Spring Harbor Protocols. 12, 1462-1471 (2011).
- Boistel, R., Swoger, J., Kržič, U., Fernandez, V., Gillet, B., Reynaud, E. G. The future of three-dimensional microscopic imaging in marine biology. Marine Ecology. 32, 438-452 (2011).
- Mizutani, R., Suzuki, Y. X-ray microtomography in biology. Micron. 43, 104-115 (2012).
- Merkle, A. P., Gelb, J. The ascent of 3D X-ray microscopy in the laboratory. Microscopy Today. 21, 10-15 (2013).
- Ziegler, A., Menze, B. H. Accelerated acquisition, visualization, and analysis of zooanatomical data. Computation for humanity. Information technology to advance society. Zander, J., Mosterman, P. J. , CRC Press. Boca Raton, USA. 233-260 (2013).
- Gignac, P. M., et al. Diffusible iodine-based contrast-enhanced computed tomography (diceCT): an emerging tool for rapid, high-resolution, 3-D imaging of metazoan soft tissues. Journal of Anatomy. 228 (6), 889-909 (2016).
- du Plessis, A., Broeckhoven, C., Guelpa, A., le Roux, S. G. Laboratory x-ray micro-computed tomography: a user guideline for biological samples. GigaScience. 6 (6), 1-11 (2017).
- Faulwetter, S., Vasileiadou, A., Kouratoras, M., Dailianis, T., Arvanitidis, C. Micro-computed tomography: Introducing new dimensions in taxonomy. ZooKeys. 263, 1-45 (2013).
- Staedler, Y. M., Masson, D., Schonenberger, J. Plant tissues in 3D via X-ray tomography: simple contrasting methods allow high resolution imaging. PLoS One. 8 (9), 75295 (2013).
- Fernández, R., Kvist, S., Lenihan, J., Giribet, G., Ziegler, A. Sine Systemate Chaos? A Versatile Tool for Earthworm Taxonomy: Non-Destructive Imaging of Freshly Fixed and Museum Specimens Using Micro-Computed Tomography. PLoS One. 9 (5), 96617 (2014).
- Paterson, G. L. J., et al. The pros and cons of using micro-computed tomography in gross and microanatomical assessments of polychaetous annelids. Memoirs of Museum Victoria. 71, 237-246 (2014).
- Faulwetter, S., Dailianis, T., Vasileiadou, K., Kouratoras, M., Arvanitidis, C. Can micro-CT become an essential tool for the 21st century taxonomist? An evaluation using marine polychaetes. Microscopy and Analysis. 28, 9-11 (2014).
- Sombke, A., Lipke, E., Michalik, P., Uhl, G., Harzsch, S. Potential and limitations of X-ray micro-computed tomography in arthropod neuroanatomy: a methodological and comparative survey. Journal of Comparative Neurology. 523, 1281-1295 (2015).
- Landschoff, J., Plessis, A., Griffiths, C. L. A dataset describing brooding in three species of South African brittle stars, comprising seven high-resolution, micro X-ray computed tomography scans. GigaScience. 4 (1), 52 (2015).
- Keiler, J., Richter, S., Wirkner, C. S. The anatomy of the king crab Hapalogaster mertensii Brandt, 1850 (Anomura: Paguroidea: Hapalogastridae) - new insights into the evolutionary transformation of hermit crabs into king crabs. Contributions to Zoology. 84 (2), 149-165 (2015).
- Holst, S., Michalik, P., Noske, M., Krieger, J., Sötje, I. Potential of X-ray micro-computed tomography for soft-bodied and gelatinous cnidarians with emphasis on scyphozoan and cubozoan statoliths. Journal of Plankton Research. 38, 1225-1242 (2016).
- Moles, J., Wägele, H., Ballesteros, M., Pujals, Á, Uhl, G., Avila, C. The End of the Cold Loneliness: 3D Comparison between Doto antarctica and a New Sympatric Species of Doto (Heterobranchia: Nudibranchia). PLoS One. 11 (7), 0157941 (2016).
- Nakano, H., et al. A new species of Xenoturbella from the western Pacific Ocean and the evolution of Xenoturbella. BMC Evolutionary Biology. 17, 245 (2017).
- Tsuda, K., et al. KNOTTED1 Cofactors, BLH12 and BLH14, Regulate Internode Patterning and Vein Anastomosis in Maize. Plant Cell. 29 (5), 1105-1118 (2017).
- Parapar, J., Candás, M., Cunha-Veira, X., Moreira, J. Exploring annelid anatomy using micro-computed tomography: A taxonomic approach. Zoologischer Anzeiger. 270, 19-42 (2017).
- Akkari, N., Ganske, A. S., Komerički, A., Metscher, B. New avatars for Myriapods: Complete 3D morphology of type specimens transcends conventional species description (Myriapoda, Chilopoda). PLoS One. 13 (7), 0200158 (2018).
- Gusmao, L. C., Grajales, A., Rodriguez, E. Sea anemones through X-rays: visualization of two species of Diadumene (Cnidaria, Actiniaria) using micro-CT. American Museum Novitates. 3907, (2018).
- Landschoff, J., Komai, T., du Plessis, A., Gouws, G., Griffiths, C. L. MicroCT imaging applied to description of a new species of Pagurus Fabricius, 1775 (Crustacea: Decapoda: Anomura: Paguridae), with selection of three-dimensional type data. PLoS One. 13 (9), 0203107 (2018).
- Machado, F. M., Passos, F. D., Giribet, G. The use of micro-computed tomography as a minimally invasive tool for anatomical study of bivalves (Mollusca: Bivalvia). Zoological Journal of the Linnean Society. , (2018).
- Sasaki, T., et al. 3D visualization of calcified and non-calcified molluscan tissues using computed tomography. Biomineralization. Endo, K., Kogure, T., Nagasawa, H. , Springer. Singapore. 83-93 (2018).
- Maeno, A., Tsuda, K. Micro-computed Tomography to Visualize Vascular Networks in Maize Stems. Bio-protocol. 8 (1), 2682 (2018).
- Nakano, H., et al. Correction to: A new species of Xenoturbella from the western Pacific Ocean and the evolution of Xenoturbella. BMC Evolutionary Biology. 18, 83 (2018).
- Maeno, A., Kohtsuka, H., Takatani, K., Nakano, H. MicroCT files from 'Microfocus X-ray computed tomography (microCT) imaging of Actinia equina (Cnidaria), Harmothoe sp. (Annelida), and Xenoturbella japonica (Xenacoelomorpha)'. figshare. , (2019).
- Vickerton, P., Jarvis, J., Jeffery, N. Concentration-dependent specimen shrinkage in iodine-enhanced microCT. Journal of Anatomy. 223 (2), 185-193 (2013).
- Buytaert, J., Goyens, J., De Greef, D., Aerts, P., Dirckx, J. Volume shrinkage of bone, brain and muscle tissue in sample preparation for micro-CT and light sheet fluorescence microscopy (LSFM). Microscopy and Microanalysis. 20 (4), 1208-1217 (2014).
- Sasov, A., Liu, X., Salmon, P. L. Compensation of mechanical inaccuracies in micro-CT and nano-CT. Proceedings of SPIE. 7078, 70781 (2008).
