Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

MicroFocus X-ray CT (microCT) Imaging af Actinia equina (CNIDARIA), Harmothoe Sp. (Annelida), og xenoturbella japonica (xenacoelomorpha)

Published: August 6, 2019 doi: 10.3791/59161
Automatic Translation
1, 2, 3, 3
1Mammalian Genetics Laboratory, National Institute of Genetics, 2Misaki Marine Biological Station, The University of Tokyo, 3Shimoda Marine Research Center, University of Tsukuba

Summary

Her forklares i detaljer protokoller til udførelse af MicroFocus X-ray computertomografi (microCT) Imaging af tre Marine hvirvelløse dyr. Denne undersøgelse beskriver trin som prøve fiksering, farvning, montage, scanning, billed rekonstruktion og dataanalyser. Der gives også forslag til, hvordan protokollen kan justeres for forskellige prøver.

Abstract

Traditionelt har biologer måttet forlade sig på destruktive metoder såsom skæring for at undersøge de interne strukturer af uigennemsigtige organismer. Ikke-destruktiv MicroFocus X-ray computertomografi (microCT) Imaging er blevet en kraftfuld og fremspirende protokol i biologi, på grund af teknologiske fremskridt i prøve farvning metoder og innovationer i microCT hardware, behandling af computere, og data Analysis software. Men denne protokol er ikke almindeligt anvendt, som det er på det medicinske og industrielle områder. En af årsagerne til denne begrænsede brug er manglen på en enkel og forståelig manual, der dækker alle de nødvendige skridt: prøveindsamling, fiksering, farvning, monteringen, scanning, og dataanalyser. En anden grund er den store mangfoldighed af metazoanere, især Marine hvirvelløse dyr. På grund af hvirvelløse vanddyr ' forskelligartede størrelser, morfologier og fysiologier er det afgørende at justere eksperimentelle forhold og hardwarekonfigurationer på hvert trin, afhængigt af prøven. Her forklares Mikroct-billedbehandlings metoder i detaljer ved hjælp af tre Fylogenetisk mangfoldige Marine hvirvelløse dyr: Actinia equina (anthozoa, CNIDARIA), Harmothoe Sp. (polychaeta, Annelida) og xenoturbella japonica ( Xenoturbellida, Xenacoelomorpha). Forslag til udførelse microCT Imaging på forskellige dyr er også forudsat.

Introduction

Biologiske forskere generelt har måttet gøre tynde sektioner og udføre observationer af lys eller elektronmikroskopi for at undersøge de interne strukturer af uigennemsigtige organismer. Disse metoder er imidlertid destruktive og problematiske, når de anvendes på sjældne eller værdifulde prøver. Desuden er flere trin i metoden, såsom indlejring og skæring, tidskrævende, og det kan tage flere dage at observere en prøve, afhængigt af protokollen. Desuden, ved håndtering af talrige sektioner, er der altid en mulighed for at beskadige eller miste nogle sektioner. Vævs clearing teknikker er tilgængelige for nogle enheder1,2,3,4,5 , men er endnu ikke gældende for mange dyrearter.

For at overvinde disse problemer, nogle biologer er begyndt at bruge MicroFocus X-ray computertomografi (microct) billeddannelse6,7,8,9,10,11, 12,13,14,15. I røntgen CT er præparatet bestrålet med røntgenstråler fra forskellige vinkler, der genereres fra en røntgenstråle kilde, som bevæger sig rundt i prøven, og de transmitterede røntgenstråler overvåges af en detektor, der også bevæger sig rundt i prøven. De opnåede røntgen transmissions data analyseres for at rekonstruere tværsnitsbilleder af præparatet. Denne metode gør det muligt at observere interne strukturer uden at ødelægge prøven. På grund af sin sikkerhed og lethed, det er almindeligt anvendt i medicinsk og dental applikationer, og CT-systemer kan findes i hospitaler og dental centre i hele verden. Desuden anvendes industrielt røntgen-CT hyppigt til observation af ikke-medicinske prøver til inspektion og metrologi på industriområdet. I modsætning til medicinsk CT, hvor røntgen kilden og detektorerne er mobile, er de to dele fastgjort i industriel CT, hvor prøven roterer under scanningen. Industriel CT generelt producerer højere opløsning billeder end medicinsk CT og omtales som microCT (micrometer-level resolution) eller nanoCT (nanometer-niveau opløsning). For nylig, forskning ved hjælp af microct er hurtigt steget inden for forskellige områder af biologi14,15,16,17,18,19, 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34.

Biologiske undersøgelser ved hjælp af CT oprindeligt målrettede interne strukturer, der hovedsagelig består af hårdt væv, såsom knogle. Fremskridt i farvningsteknikker ved hjælp af forskellige kemiske agenser muliggjorde visualisering af blødt væv i forskellige organismer6,7,8,9,14,15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34. af disse reagenser er jod-baserede kontrastmidler relativt sikre, billige og kan anvendes til visualisering af blødt væv i forskellige organismer7,14. Med hensyn til hvirvelløse Marine dyr er microct i vid udstrækning blevet anvendt på sådanne dyr som bløddyr6,25,32,33, Ledorme18,19, 20 , 28, og arthoropods21,23,29,31. Der har dog været få rapporter om andre animalske phyla, såsom bryozoans6, xenacoelomorphs26, og cnidarians24,30. Generelt har der været færre studier med Mikroct på hvirvelløse havdyr end på hvirveldyr. En væsentlig årsag til denne begrænsede brug af hvirvelløse havdyr er den store diversitet, der observeres i disse dyr. På grund af deres forskelligartede størrelser, morfologier og fysiologier, reagerer hver art forskelligt på forskellige eksperimentelle procedurer. Det er derfor afgørende under prøveforberedelsen at vælge det mest hensigtsmæssige fikserings-og farvnings reagens og at fastsætte betingelser for hvert trin, justeret for hver art. På samme måde er det også nødvendigt at indstille scannings konfigurationerne, såsom monteringsmetode, spænding, aktuel, mekanisk forstørrelsesgrad og rumopløsnings kraften, passende for hver prøve. For at løse dette problem, en enkel og forståelig manual, der dækker alle de nødvendige skridt, forklarer, hvordan hvert trin kan justeres afhængigt af prøven, og viser detaljerede eksempler fra flere prøver er afgørende.

I denne undersøgelse beskriver vi Mikroct Imaging Protocol trin-for-trin, fra prøve fiksering til dataanalyse, ved hjælp af tre Marine hvirvelløse arter. Prøver af havanemone Actinia equina (anthozoa, CNIDARIA) blev indsamlet i nærheden af Misaki Marine Biological Station, University of Tokyo. De havde en sfærisk, blød krop, der var omkring 2 cm i diameter (figur 1a-C). Harmothoe Sp. (polychaeta, Annelida) prøver blev også indsamlet i nærheden af Misaki Marine Biological Station. De var slanke orme, der var omkring 1,5 cm i længden, med hårde chaetae til stede langs hele kroppen (figur 1d). En Xenoturbella japonica35 (xenoturbellida, Xenacoelomorpha) prøveeksemplar blev samlet i nærheden af Shimoda Marine Research Center, University of Tsukuba, under den 13. Det var en soft-bodied orm, der var omkring 0,8 cm i længden (figur 1E). Justeringer for de enkelte prøvens betingelser og konfigurationer forklares i detaljer. Vores undersøgelse giver flere forslag til, hvordan man udfører microCT Imaging på marine invertebrater, og vi håber, at det vil inspirere biologer til at udnytte denne protokol til deres forskning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. fiksering

  1. For Actinia equina, slap dyrene i 10% mgcl2 havvand i ca. 15 min ved stuetemperatur. Overfør til 70% ethanol og opbevar ved stuetemperatur.
  2. For Harmothoe Sp., bedøve dyrene ved at placere dem i iskold havvand i ca. 15 min. overførsel til 10% (v/v) formalin opløsning med havvand og opbevares ved stuetemperatur.
  3. For Xenoturbella japonica, slappe dyret ved hjælp af 7% mgcl2 i ferskvand. Fix i 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) i filtreret havvand natten over. Sted i 70% ethanol og opbevares ved 4 °C.
    Forsigtig: PFA er farlig og skal håndteres forsigtigt.

2. farvning

  1. Prøverne overføres til 50% ethanol og opbevares ved stuetemperatur i 15 h. Erstat 50% ethanol med 25% ethanol og opbevar ved stuetemperatur i 2 timer.
    Bemærk: Dette er ikke nødvendigt for Harmothoe Sp.-prøven i 10% (v/v) formalin-opløsning med havvand.
  2. Opløsningen udskiftes med destilleret vand (DW), og prøverne opbevares i DW ved stuetemperatur i 2 timer. Gentag dette trin tre gange.
  3. Forbered 25% Lugol opløsning ved at fortynde stamopløsningen (nedenfor) til 25% med DW. Stamopløsning (100% Lugol-opløsning) indeholder 10 g KI og 5 g af I2, justeret til 100 ml med DW.
    Bemærk: Lugol-opløsningen er lysfølsom, så Opbevar og Håndtér opløsningen beskyttet mod lys. Følg reglerne i hvert land og institution for jod håndtering og bortskaffelse af affald.
  4. DW fra prøverne og hældes i 25% Lugol-opløsningen. Pletter i 24 timer ved stuetemperatur.

3. montering af Stage

  1. Forbered 0,5% agopstået ved opløsning 500 mg agopstod i 100 mL DW i en 250 mL konisk kolbe i en mikrobølgeovn (800 W, ca. 1-3 min). Afkøles til ca. 30-40 °C ved at holde ved stuetemperatur.
    Forsigtig: Undlad at overophede eller helt forsegle kolben ved opvarmning for at forhindre, at ageren koges over.
  2. Monter store prøver som a. equina ved hjælp af et 50 ml rør.
    Bemærk: Brug 50 mL rør til montering af store prøver, der ikke passer i en 1.000 μL mikropipette ' blå ' spids.
    1. Placer den farvede prøve i en 60-mm skål med DW for at vaske overdreven farvningsopløsning fra overfladen.
    2. Hæld forsigtigt 5 mL 0,5% agopstået i et 50 mL rør og hærde agopstod på is. Vær omhyggelig med ikke at lave bobler i agopstået.
    3. Tilsæt forsigtigt 20 mL 0,5% agopstået til 50 mL røret og Placer på isen, indtil agrose begynder at hærde. Placer prøven inden for 0,5% agopstået ved hjælp af pincet. Vær omhyggelig med ikke at lave bobler i agopstået.
    4. Justér placeringen og retningen af prøven med pincet og forhærde agopstået på is.
    5. Placer ler på Mikroct monterings stadiet og sæt 50 mL røret på leret (figur 2A).
  3. Monter små prøver såsom Harmothoe Sp. og X. japonica ved hjælp af en 1.000 μl mikropipette ' blå ' spids.
    Bemærk: ved mindre prøver kan der anvendes 200 μL mikropipette ' gul ' spids. I dette tilfælde skal du bruge 30 μL agopstået for proppen og tilsæt 200 μL agopstået eller destilleret vand.
    1. Udsæt 100 μL 0,5% agopstået i en 1.000 μL mikropipette ' blå ' spids og hærde agopstået ved at holde spidsen over isen, hvilket gør et stik i spidsen (figur 2B-a).
    2. Decant den farvede prøve i en 60-mm skål uden brug af pincet.
    3. Overfør forsigtigt prøven ved hjælp af ring pincet til en anden 60-mm skål med DW for at vaske overdreven farvningsopløsning fra overfladen.
    4. Der tilsættes 1.000 μL af enten 0,5% agopstået eller DW i den tilsluttede spids (trin 3.3.1) ved hjælp af en mikropipette.
      Bemærk: brug af 0,5% agopstået anbefales, men brug DW til skrøbelige eller dyrebare prøver, hvor agopstået bør undgås.
    5. Overfør forsigtigt prøven fra 60-mm skålen til agrose eller DW i den tilsluttede spids ved hjælp af ringe pincet.
    6. Juster forsigtigt placeringen og retningen af prøven med en bladstilke nål eller præcisions pincet. Vær omhyggelig med ikke at lave bobler i monterings mediet. Sørg for, at prøven er stabil mellem tiens vægge, når DW bruges som monterings medium (figur 2D-b). Placer spidsen på isen for at forhærde agopstod, hvis den bruges som monterings medium.
    7. Skær spidsen af en ny 1.000 μL mikropipette ' blå ' spids (figur 2b-b, c) og Indsæt spidsen af den tilsluttede spids i det nye tip.
    8. Placer ler på Mikroct monterings stadiet og sæt spidserne med prøven inde på leret (figur 2C, D).
      Bemærk: Farvningsopløsningen vil begynde at vaske prøven, når den er placeret i DW, så fortsæt til næste scannings trin med det samme.

4. Mikroct-scanning

  1. Tænd for Røntgenstrålen ved 80 kV, 100 μA.
  2. Mens du observerer røntgen transmissions billedet i midten af skærmen (figur 3a), skal du flytte scenen, så hele prøven kan ses ved at klikke på knapperne x og Z-aksen (figur 3a) og manuelt justering af Y-akse knappen på monterings stadiet (figur 3b). Indstil billedets kontrast, så de indvendige strukturer kan observeres ved at justere kontrast forholdene (figur 3A: billedkontrast).
  3. Juster prøvens retning ved at ændre vinklen på røret/spidsen i leret (figur 2a). Drej scenen 90 ° ved at indstille rotationsaksen (figur 3a) til 90 og klikke på den relative bevægelses knap (figur 3a). Udfør den samme manøvre fire gange for at fuldføre en fuld rotation.
    Bemærk: Sluk for Røntgenstrålen manuelt, hver gang prøve lågen åbnes, medmindre systemet slukker automatisk.
  4. Flyt scenen, så prøven er midt i visningen ved at klikke på knappen Z-akse (figur 3A) og ved manuelt at justere Y-akse-knappen på monterings stadiet (figur 3B). Drej scenen med 90 ° og gør det samme. Drej scenen 360 ° og kontroller, at prøven er i midten af visningen fra alle retninger.
  5. Flyt scenen langs x-aksen mod røntgenstråle kilden ved at klikke på knappen x-akse (figur 3A) for at forstørre prøven og justere efter behov, så den bare passer i visningen (figur 3C).
  6. Drej scenen 360 ° og Juster efter behov, så prøven passer ind i visningen fra alle retninger.
  7. Juster scannings betingelserne som vist i tabel 1.
  8. Start scanning; det tager ca. 10 min.

5. genopbygning af billedet

  1. Start Mikroct-systemets tilbehørs software (Se tabellen over materialer), og Åbn de scannede data.
  2. Juster forskellene i prøve rotationens rotationsakse under scanningen ved at klikke på knappen automatisk beregning af Skift værdi (figur 4A: grøn boks).
  3. Juster billedets retning ved at rotere de orange pile (figur 4B). Hvis retningen er ændret, skal du gentage trin 5,2.
  4. Klik på fanen område (figur 4c: magenta boks) og trim områder, hvor prøverne ikke er til stede (figur 4c: gul boks).
  5. Klik på omkonfiguration fanebladet (figur 4D: magenta boks) og Indstil filtrene som følger for at fjerne støj. Ring artefakt Reducer filter: median filter-3; Støjeliminering filter: gennemsnitlig filter-1.
  6. Udfør omkonfiguration ved at klikke på knappen omkonfiguration (figur 4D: grøn boks).
  7. Juster billedets lysstyrke og kontrast ved at indstille de sorte og hvide værdier som sort værdi 0, hvid værdi 250 (figur 4D: blå boks).
  8. Gem det rekonstruerede TIFF-billed datasæt som en 8-bit TIFF ved at klikke på knappen Gem. Omdøb TIFF-filer som følger: Date_sample_resolution (μm) _number. TIFF.
    Bemærk: de oprindelige Mikroct datasæt fra denne undersøgelse er tilgængelige i Figshare repository, Doi: 10.6084/M9. figshare. 767083736.

6. data analyser

  1. Start dataanalyse softwaren (Se tabellen over materialer) og Aktivér import af TIFF-filer ved at klikke på database ikonet (figur 5A: magenta boks) og slukke for boksen vist i figur 5B.
  2. Klik på ikonet Importer (figur 5C: magenta boks), Vælg det datasæt, som er gemt i afsnit 5, og klik på Åbn.
  3. Klik på knappen Kopiér links (figur 5D) for at importere dataene.
  4. Vis 2D-tværsnit ved at klikke på 2D-fremviser ikonet (figur 5C: blå boks).
  5. Kalibrer datasættet ved at klikke på fanen 3D-frem viser (figur 5E: magenta boks) og indtaste opløsnings værdien ved scanning (som var 0,018 i dette studie [figur 5F]).
  6. Klik på ikonet lysstyrke/kontrast (figur 5E grøn boks). Juster lysstyrken og kontrasten ved at flytte markøren ind i det viste 2D-billede og ændre vindues niveauet og vindues bredden (figur 5G).
  7. Kontroller andre tværsnitsbilleder ved at flytte rullebjælken (figur 5G: boks).
  8. Skift retningen af tværsnit ved at klikke på orienterings ikonet (figur 5E: blå boks) og kontrollere billeder i alle retninger (figur 5H).
  9. Klik på det viste billede, og vælg fanen Eksporter for at gemme tværsnit billeder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi udførte microCT Imaging på A. equina (anthozoa, CNIDARIA), Harmothoe Sp. (polychaeta, Annelida) og X. japonica (Xenoturbellida, xenacoelomorpha) efter farvning af prøverne med 25% Lugol opløsning. Farvningen har med held forbedret kontrasten mellem de indvendige strukturer i alle enheder, hvilket muliggør observationer af interne bløde væv (figur 6). Sammen med tidligere beretninger6,7,16,19,22,23,24,25,26 , 28 , 30 , 31 , 32 , 33, dette viser, at microct kan bruges på forskellige Marine hvirvelløse dyr til at visualisere deres morfologi, herunder bløde indre væv. Klare billeder blev opnået selv med X. japonica -prøven, hvis epidermis var alvorligt beskadiget (figur 6F, G), hvilket viser, at denne metode gælder for skrøbelige prøver med ydre skader.

Scanning kun den region af interesse, i modsætning til et bredere område, i høj grad øget klarhed og opløsning af billedet (Sammenlign figur 6F og figur 6G). Et enkelt højopløsnings datasæt for et helt eksemplar blev imidlertid rekonstrueret for harmothoe Sp. (figur 6C) og X. japonica (figur 6F) fra flere scanninger udført på forskellige (men overlappende) dele af prøven. Sømmene mellem hver scanning var diskret i de rekonstruerede billeder. Vores undersøgelse viser, at enkeltbilleder i høj opløsning kan fås med kegle-Beam microCT-systemer. Ved at scanne et større område ved høj opløsning, er der en mindre risiko for at have udsigt til små strukturer. En anden fordel er, at det er lettere at finde de relative positioner af strukturer, der er placeret langt fra hinanden, såsom de forreste og bageste spidser af en aflang annelid.

Figure 1
Figur 1 : Hvirvelløse Marine dyr observeret i dette studie. (A-C) Actinia equina (Anthozoa, CNIDARIA). A) den distale ende af et levende dyr, der er afslappet i 10% mgcl2 havvand. Distal (B) og proksimale (C) slutter efter fiksering i 70% ethanol. D) levende bedøvet harmothoe Sp. (polychaeta, Annelida), dorsale udsigt med forreste til venstre. De fleste af elytra var allerede savnet på dette tidspunkt, med kun fire tilbage i nærheden af den bageste ende. E) xenoturbella japonica (xenoturbellida, Xenacoelomorpha) fastgjort i 70% ethanol. Højre visning, med forreste til toppen. På grund af omstændighederne ved indsamlingen, var dens epidermis begyndt at komme ud. Skala stænger = 3 mm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : Montering af prøver på MicroFocus X-ray computertomografi systemet. A) montering af prøver i et 50 ml rør med ler. Stikprøvens retning kan justeres ved hjælp af leret. B) fremstilling af en 1.000 μl mikropipette "blå" spids til montering af små prøver. a: Tip med enden sat med 100 μL 0,5% agopstået (Diagonale linjer). Prøverne blev anbragt i dette tip. Spidsen med prøven blev indsat i en anden 1.000 μL mikropipette ' blå ' spids (b, c) til montering. b blev brugt til Xenoturbella japonica, og c blev brugt til Harmothoe Sp. (c) monteret X. japonica -prøve, oversigt (venstre) og Luk op (højre). Røntgenstråle kilde kan ses til højre for prøven. (D) diagrammer til montering af prøver i en 1.000 μl mikropipette "blå" spids. a: X. japonica prøve i destilleret vand. b: prøven var i kontakt med spidsen væggen (pile), så den ikke bevæger sig under scanningen. c: Harmothoe Sp. sample i 0,5% agopstået. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : Scanning af prøver på MicroFocus X-ray computertomografi systemet. A) betjenings skærm under scanning af Micro Focus x-ray computertomografi systemet, der viser et røntgenbillede af et Actinia equina -præparat. Juster kontrasten og lysstyrken med ' billedets kontrast ' nederst til venstre. B) visning af monterings stadiet, der viser Y-akse knappen. C) x-ray-transmissions billede af a. equina -prøven, efter at monterings stadiet er flyttet tættere på røntgenstråle kilden. Bemærk det er forstørret i forhold til billedet i midten af (A). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 : Betjenings skærmbillede af billed genopbygnings systemet. A) skærm til justering af forskelle i prøvens rotationsakse under scanningen,derviser et Actinia equina -præparat. Magenta boks: Skift tab; grøn boks: automatisk skift værdiberegning knap. (B) skærm til justering af billedets retning med Harmothoe Sp. vist. (C) skærm under billedet rekonstruktion af A. equina, trimning området uden for den gule boks, hvor der ikke er nogen prøver er til stede. Magenta boks: område fane. (D) skærm under billed rekonstruktion, der viser det rekonstruerede billede af A. equina. Magenta boks: omkonfiguration tab; grøn boks: omkonfiguration knap; blå boks: justering af sort og hvid værdi. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5 : Betjenings skærmbillede af billedanalyse systemet. (A) præference vindue. Databaseikonet (magenta cirkel) blev klikket for at åbne vinduet administration af database filer. (B) vinduet administration af database filer. I denne software skal den boks, der vises med en pil, være slukket for at kunne importere TIFF-filer. (C) menu og værktøjslinjer på database skærmen. Magenta box = Importer ikon; blå boks = 2D-fremviser ikon. (D) vinduet datasæt import. Magenta cirkel = Kopiér links-knap. (E) menu-og værktøjslinjer på 2D-fremviser skærmen. Magenta box = 3D Viewer tab; grøn boks = lysstyrke/kontrast ikon; blå boks = orienterings ikon. F) kalibrerings indstillingsvindue. Indtast de ønskede opløsningsværdier i kolonnerne i boksen magenta. G) tværsnit af et Actinia equina -præparat, som vises i 2D-fremviservinduet til justering af lysstyrke og kontrast. Magenta boks: rullepanel til kontrol af andre tværsnit. H) tværsnit af a. equina , der vises i 2D-fremviservinduet med en anden retning til (G). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6 : Skannede og rekonstruerede billeder af hvirvelløse Marine dyr. A) tværgående og (B) sektioner i længderetningen af Actinia equina. Området inde i den stiplede gule boks i (B) er forstørret i indsættet. Forkortelser: DM, direktiv mesenterier; m, par perfekte mesenteries; MF, mesenterial filament; p, pharynx; si, siphonoglyphs; t, Tentacle; pile, oral skive; hvide pilespidser, pedal skiver; sorte pilespidser, sphincter muskel. Skala stænger i A, B = 3 mm. (C-E) Harmothoe Sp. (c) sagittal del af den forreste del. (D, E) Tværsnit ved de stiplede linjer d og e i (C). Forkortelser: ACI = aciculum; ACIM = acicular muskel; Coe = coelom; DLM = dorsale langsgående muskel; ELP = elytrophore; Eye = øje; int = tarm; kæbe = kæbe; mant = median antenne; mo = mund; MP = muskler af proboscis; palp = palp; Pha = pharynx; sandsynlighed = proboscis; VLM = ventrale langsgående muskel; VNC = ventrale nerveledning. Skala stænger: C = 1 mm; D, E = 0,3 mm. (F, G) xenoturbella japonica. F) sagittal-delen af hele prøven. (G) sagittal del af den forreste del. bl = basal lamina; int = tarm; ml = muskellag; mo = mund; NN = intraepidermal nerve net; Hvid pil = statocyst; sort pil = frontal pore; hvid pilespidser = ventrale glandulær netværk; sorte pilespidser = oocytter. Skala stænger: F = 1 mm, G = 0,5 mm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Table 1
Tabel 1: prøveforberedelse og scannings protokol for hver prøve.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Fikater, der anvender formalin, såsom 10% (v/v) formalin-opløsningen i havvand, som anvendes i dette studie, er kendt for at bevare morfologien af forskellige Marine hvirvelløse dyr og anvendes ofte til mikroct-billeddannelse18,24,25 ,26,28,30,33. Begrænsningerne i anvendelsen af dette kemikalie er imidlertid blevet strenge i nogle lande i de senere år, og der kan anvendes erstatninger såsom PARAFORMALDEHYD eller glutaraldehyd. Hvis der er planer om at udtrække DNA efter scanning, er det bedre at undgå at bruge formalin som en fikativ, fordi det er kendt for at fragmentere DNA. I dette tilfælde anbefales brugen af fikater, der bevarer DNA, såsom 70% ethanol. I denne undersøgelse blev cnidarian A. equina fastgjort med 70% ethanol, og der blev opnået klare mikroct-billeder fra 70% ethanol-faste prøver (figur 6A, B).

I en tidligere undersøgelse, der udførte microCT scanning af forskellige cnidarian taxa, mange prøver var dehydreret i 100% ethanol, og nogle var kritisk-punkt-tørret før scanning24. Selv om bløde indre organer såsom Tentacle klynger, muskler og gonader blev observeret med succes i deres undersøgelse, er dehydrering og tørring processer kendt for at resultere i store artefakter såsom deformation og sammentrækning af bløde væv11 , 21. i denne undersøgelse var vi i stand til at observere de interne strukturer i cnidarian A. equina fastsat i 70% ethanol og farvet med 25% Lugol opløsning (figur 6A, B). Vores protokol, uden nogen dehydrering eller tørring trin, er at foretrække, og bør udføres så vidt muligt for at reducere risikoen for beskadigelse af prøverne og artefakter under scanningen.

Lugol opløsning, jod opløsning, og wolframphosphorsyre syre (PTA) er farvnings opløsninger, der ofte anvendes på biologiske prøver i microct Imaging6,7,9,14,16, 17,20,26,27,38. Fra vores erfaring med at bruge forskellige biologiske prøver, Lugol løsning gav de bedste resultater for mange prøver, med mørkfarvning i en relativt kort tid. Jod opløsning gav kun meget svage pletter, og PTA krævede lang tid for tilstrækkelig farvning og de farvede prøver viste stærke sammentrækninger. Derfor blev alle prøver plettet med Lugol opløsning i dette studie. Selv om Lugol-opløsningen anbefales, er den rette farvningsopløsning dog forskellig mellem prøverne, og vi foreslår, at der udføres forsøg med andre farvnings opløsninger, hvis prøverne er tilstrækkeligt. Uanset Farvningsopløsningen, prøver prøverne kontrakt under farvning37,38, så det er vigtigt at holde farvnings tiden kort.

Et kritisk skridt i Mikroct scanning er at montere prøven for at forhindre den i at bevæge sig. I denne undersøgelse blev dette udført i to trin, først ved hjælp af agopstået som den direkte monterings medium, og derefter bruge ler til at montere røret, der indeholdt prøven til scenen. For det første trin er der anvendt forskellige monterings medier med lav densitet i tidligere undersøgelser, herunder ethanol6,17,20,25,30, agopstået9,29 og blomstret skum15,22,31. Agrose blev valgt i denne undersøgelse, da det er en billig kemikalie, der er tilgængelig på verdensplan. En ulempe ved agopstået er, at det kan være vanskeligt at hente prøven fra den hærdede agopstod efter scanning, men ved hjælp af lav-smeltepunkt agopstået gør dette hentning skridt lettere. For det andet trin, kæbe klemmer eller skruer bruges ofte6,9,17. Clay blev valgt i denne undersøgelse, da det muliggør finjusteringer i orienteringen og vinklen af prøven. Der skal udvises forsigtighed ved forsøg med lange scanningstider, da muligheden for, at prøven bevæger sig, er højere, når der anvendes ler i stedet for kæbe klemmer eller skruer.

En tidligere undersøgelse foretaget microCT scanning på syv polychaete arter med krops længder på 2-8 mm, mindre end Harmothoe Sp. anvendes i dette studie16. De var i stand til at generere billeder i høj opløsning, og viste organer såsom vaskulære systemer og individuelle chaeta klarere end i den nuværende undersøgelse. Den væsentligste årsag til denne forskel var ikke protokollen, men specifikationerne for de anvendte Mikroct-systemer. Det system, der blev brugt i den tidligere undersøgelse, var udstyret med et 11-megapixel opladnings koblet enheds kamera (4000 x 2672 pixels) med en maksimal opløsning på < 0,8 μm/pixel16. Det aktive billede matrix størrelse af systemet, der anvendes i denne undersøgelse var 992 x 992 pixels, med en maksimal opløsning på > 5 μm/pixel. Derfor var den rumlige opløsning af Mikroct-systemet, der anvendes i denne undersøgelse, ringere end det højtydende Mikroct-system, der anvendes i Faulwetter et al.16. Denne forskel var især mærkbar ved scanning af enheder mindre end 8 mm, hvor vi oplevede en manglende opløsning (data ikke vist). Da der imidlertid blev indhentet færre data under scanningen i dette studie, var scanningstiden meget kortere end i det foregående studie16 (data: henholdsvis 992 x 992 og 4000 x 2672 pixels; scanningstid: 10 til 26 min og 30 min til flere timer, henholdsvis). En kort scanningstid reducerer Misfarvningen af jod-farvning, hvilket gør det muligt at bruge Lugol-opløsningen, som er en god farvningsopløsning med en høj dækningsgrad, men let spreder sig i DW34. En kort scanningstid mindsker også muligheden for, at prøven bevægede sig under scanningen, hvilket gjorde det muligt at anvende en simpel monteringsmetode ved hjælp af agrose eller DW (figur 2). Længere scanningstider har også den ulempe, at mulige prøve svind slør i billeder. Flere andre mekaniske og hardwareproblemer, der kan opstå under lange scanninger er også blevet rapporteret39. Derfor, når du bruger microCT-systemer, er det vigtigt at præcist at forstå specifikationen af hvert system, og at vælge det rigtige system i form af prøvestørrelse eller forskning mål. I nogle tilfælde kan et Mikroct-system med lav opløsning være tilstrækkeligt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Vi vil gerne takke Toshihiko Shiroishi for hans hjælp og for at tilvejebringe forskningsmiljøet under denne undersøgelse. Vi er taknemmelige for Kensuke Yanagi og Takato Izumi for rådgivning om a. equinaog Masaatsu Tanaka til rådgivning om Harmothoe Sp.-prøven. Vi vil gerne takke personalet på Shimoda Marine Research Center, University of Tsukuba og Misaki Marine Biological Station, University of Tokyo for deres hjælp i prøve samlinger. Vi vil gerne takke Editage (www.editage.jp) for engelsk sprog redigering. Dette arbejde blev støttet af JSPS-støtten til unge videnskabsmænd (A) (JP26711022) til HN og JAMBIO, den japanske forening for havbiologi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
250-ml Erlenmeyer flask Corning CLS430183
5-ml Sampling tube ST-500 BIO-BIK 103010
50-ml Polypropylene tube Greiner Bio One International 227261
60-mm Non-treated Dish IWAKI 1010-060
Agarose Promega V3125
Ecological grade tip (blue) 1000 µl BMBio BIO1000RF
Ethanol Wako Pure Chemical Industries 057-00451
Formalin Wako Pure Chemical Industries 061-00416
Iodine Wako Pure Chemical Industries 094-05421
Magnesium chloride hexahydrate Wako Pure Chemical Industries 135-00165
OsiriX DICOM Viewer Pixmeo SARL OsiriX MD v10.0 https://www.osirix-viewer.com
Paraformaldehyde Wako Pure Chemical Industries 163-25983
Petiolate needle AS ONE 2-013-01
Pipetman P200 Micropipette GILSON F123601
Pipetman P1000 Micropipette GILSON F123602
Potassium iodide Wako Pure Chemical Industries 166-03971
Precision tweezers 5 DUMONT 0302-5-PS
QuickRack MultI fit tip (yellow) 200 ul Sorenson 10660
Razor blades Feather FA-10
Ring tweezers NAPOX A-26
Stereoscopic microscope Leica MZ95
X-ray Micro-CT imaging system Comscantechno ScanXmate-E090S105

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Susaki, E. A., Tainaka, K., Perrin, D., Yukinaga, H., Kuno, A., Ueda, H. R. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10, 1709-1727 (2015).
  2. Susaki, E. A., Ueda, H. R. Whole-body and whole-organ clearing and imaging techniques with single-cell resolution: toward organism-level systems biology in mammals. Cell Chemical Biology. 23, 137-157 (2016).
  3. Silvestri, L., Costantini, I., Sacconi, L., Pavone, F. S. Clearing of fixed tissue: a review from a microscopist's perspective. Journal of Biomedical Optics. 21, 081205 (2016).
  4. Greenbaum, A., et al. Bone CLARITY: clearing, imaging, and computational analysis of osteoprogenitors within intact bone marrow. Science Translational Medicine. 9, (2017).
  5. Konno, A., Okazaki, S. Aqueous-based tissue clearing in crustaceans. Zoological Letters. 4, 13 (2018).
  6. Metscher, B. D. MicroCT for comparative morphology: simple staining methods allow high-contrast 3D imaging of diverse non-mineralized animal tissues. BMC Physiology. 9, 11 (2009).
  7. Metscher, B. D. MicroCT for developmental biology: a versatile tool for high-contrast 3D imaging at histological resolutions. Developmental Dynamics. 238 (3), 632-640 (2009).
  8. Degenhardt, K., Wright, A. C., Horng, D., Padmanabhan, A., Epstein, J. A. Rapid 3D phenotyping of cardiovascular development in mouse embryos by micro-CT with iodine staining. Circulation Cardiovascular Imaging. 3 (3), 314-322 (2010).
  9. Metscher, B. D. X-ray microtomographic imaging of intact vertebrate embryos. Cold Spring Harbor Protocols. 12, 1462-1471 (2011).
  10. Boistel, R., Swoger, J., Kržič, U., Fernandez, V., Gillet, B., Reynaud, E. G. The future of three-dimensional microscopic imaging in marine biology. Marine Ecology. 32, 438-452 (2011).
  11. Mizutani, R., Suzuki, Y. X-ray microtomography in biology. Micron. 43, 104-115 (2012).
  12. Merkle, A. P., Gelb, J. The ascent of 3D X-ray microscopy in the laboratory. Microscopy Today. 21, 10-15 (2013).
  13. Ziegler, A., Menze, B. H. Accelerated acquisition, visualization, and analysis of zooanatomical data. Computation for humanity. Information technology to advance society. Zander, J., Mosterman, P. J. , CRC Press. Boca Raton, USA. 233-260 (2013).
  14. Gignac, P. M., et al. Diffusible iodine-based contrast-enhanced computed tomography (diceCT): an emerging tool for rapid, high-resolution, 3-D imaging of metazoan soft tissues. Journal of Anatomy. 228 (6), 889-909 (2016).
  15. du Plessis, A., Broeckhoven, C., Guelpa, A., le Roux, S. G. Laboratory x-ray micro-computed tomography: a user guideline for biological samples. GigaScience. 6 (6), 1-11 (2017).
  16. Faulwetter, S., Vasileiadou, A., Kouratoras, M., Dailianis, T., Arvanitidis, C. Micro-computed tomography: Introducing new dimensions in taxonomy. ZooKeys. 263, 1-45 (2013).
  17. Staedler, Y. M., Masson, D., Schonenberger, J. Plant tissues in 3D via X-ray tomography: simple contrasting methods allow high resolution imaging. PLoS One. 8 (9), 75295 (2013).
  18. Fernández, R., Kvist, S., Lenihan, J., Giribet, G., Ziegler, A. Sine Systemate Chaos? A Versatile Tool for Earthworm Taxonomy: Non-Destructive Imaging of Freshly Fixed and Museum Specimens Using Micro-Computed Tomography. PLoS One. 9 (5), 96617 (2014).
  19. Paterson, G. L. J., et al. The pros and cons of using micro-computed tomography in gross and microanatomical assessments of polychaetous annelids. Memoirs of Museum Victoria. 71, 237-246 (2014).
  20. Faulwetter, S., Dailianis, T., Vasileiadou, K., Kouratoras, M., Arvanitidis, C. Can micro-CT become an essential tool for the 21st century taxonomist? An evaluation using marine polychaetes. Microscopy and Analysis. 28, 9-11 (2014).
  21. Sombke, A., Lipke, E., Michalik, P., Uhl, G., Harzsch, S. Potential and limitations of X-ray micro-computed tomography in arthropod neuroanatomy: a methodological and comparative survey. Journal of Comparative Neurology. 523, 1281-1295 (2015).
  22. Landschoff, J., Plessis, A., Griffiths, C. L. A dataset describing brooding in three species of South African brittle stars, comprising seven high-resolution, micro X-ray computed tomography scans. GigaScience. 4 (1), 52 (2015).
  23. Keiler, J., Richter, S., Wirkner, C. S. The anatomy of the king crab Hapalogaster mertensii Brandt, 1850 (Anomura: Paguroidea: Hapalogastridae) - new insights into the evolutionary transformation of hermit crabs into king crabs. Contributions to Zoology. 84 (2), 149-165 (2015).
  24. Holst, S., Michalik, P., Noske, M., Krieger, J., Sötje, I. Potential of X-ray micro-computed tomography for soft-bodied and gelatinous cnidarians with emphasis on scyphozoan and cubozoan statoliths. Journal of Plankton Research. 38, 1225-1242 (2016).
  25. Moles, J., Wägele, H., Ballesteros, M., Pujals, Á, Uhl, G., Avila, C. The End of the Cold Loneliness: 3D Comparison between Doto antarctica and a New Sympatric Species of Doto (Heterobranchia: Nudibranchia). PLoS One. 11 (7), 0157941 (2016).
  26. Nakano, H., et al. A new species of Xenoturbella from the western Pacific Ocean and the evolution of Xenoturbella. BMC Evolutionary Biology. 17, 245 (2017).
  27. Tsuda, K., et al. KNOTTED1 Cofactors, BLH12 and BLH14, Regulate Internode Patterning and Vein Anastomosis in Maize. Plant Cell. 29 (5), 1105-1118 (2017).
  28. Parapar, J., Candás, M., Cunha-Veira, X., Moreira, J. Exploring annelid anatomy using micro-computed tomography: A taxonomic approach. Zoologischer Anzeiger. 270, 19-42 (2017).
  29. Akkari, N., Ganske, A. S., Komerički, A., Metscher, B. New avatars for Myriapods: Complete 3D morphology of type specimens transcends conventional species description (Myriapoda, Chilopoda). PLoS One. 13 (7), 0200158 (2018).
  30. Gusmao, L. C., Grajales, A., Rodriguez, E. Sea anemones through X-rays: visualization of two species of Diadumene (Cnidaria, Actiniaria) using micro-CT. American Museum Novitates. 3907, (2018).
  31. Landschoff, J., Komai, T., du Plessis, A., Gouws, G., Griffiths, C. L. MicroCT imaging applied to description of a new species of Pagurus Fabricius, 1775 (Crustacea: Decapoda: Anomura: Paguridae), with selection of three-dimensional type data. PLoS One. 13 (9), 0203107 (2018).
  32. Machado, F. M., Passos, F. D., Giribet, G. The use of micro-computed tomography as a minimally invasive tool for anatomical study of bivalves (Mollusca: Bivalvia). Zoological Journal of the Linnean Society. , (2018).
  33. Sasaki, T., et al. 3D visualization of calcified and non-calcified molluscan tissues using computed tomography. Biomineralization. Endo, K., Kogure, T., Nagasawa, H. , Springer. Singapore. 83-93 (2018).
  34. Maeno, A., Tsuda, K. Micro-computed Tomography to Visualize Vascular Networks in Maize Stems. Bio-protocol. 8 (1), 2682 (2018).
  35. Nakano, H., et al. Correction to: A new species of Xenoturbella from the western Pacific Ocean and the evolution of Xenoturbella. BMC Evolutionary Biology. 18, 83 (2018).
  36. Maeno, A., Kohtsuka, H., Takatani, K., Nakano, H. MicroCT files from 'Microfocus X-ray computed tomography (microCT) imaging of Actinia equina (Cnidaria), Harmothoe sp. (Annelida), and Xenoturbella japonica (Xenacoelomorpha)'. figshare. , (2019).
  37. Vickerton, P., Jarvis, J., Jeffery, N. Concentration-dependent specimen shrinkage in iodine-enhanced microCT. Journal of Anatomy. 223 (2), 185-193 (2013).
  38. Buytaert, J., Goyens, J., De Greef, D., Aerts, P., Dirckx, J. Volume shrinkage of bone, brain and muscle tissue in sample preparation for micro-CT and light sheet fluorescence microscopy (LSFM). Microscopy and Microanalysis. 20 (4), 1208-1217 (2014).
  39. Sasov, A., Liu, X., Salmon, P. L. Compensation of mechanical inaccuracies in micro-CT and nano-CT. Proceedings of SPIE. 7078, 70781 (2008).

Tags

Miljøvidenskaber microCT Lugol opløsning jod Actinia CNIDARIA Harmothoe Annelida xenoturbella xenacoelomorpha hvirvelløse dyr
MicroFocus X-ray CT (microCT) Imaging af <em>Actinia equina</em> (CNIDARIA), <em>Harmothoe</em> Sp. (Annelida), og <em>xenoturbella japonica</em> (xenacoelomorpha)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Maeno, A., Kohtsuka, H., Takatani,… More

Maeno, A., Kohtsuka, H., Takatani, K., Nakano, H. Microfocus X-ray CT (microCT) Imaging of Actinia equina (Cnidaria), Harmothoe sp. (Annelida), and Xenoturbella japonica (Xenacoelomorpha). J. Vis. Exp. (150), e59161, doi:10.3791/59161 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter