Summary
Qui, i protocolli per l'esecuzione di immagini di tomografia computerizzata a raggi X (microCT) microfocus di tre animali invertebrati marini sono spiegati in dettaglio. Questo studio descrive passaggi quali la fissazione dei campioni, la colorazione, il montaggio, la scansione, la ricostruzione delle immagini e l'analisi dei dati. Vengono inoltre forniti suggerimenti su come il protocollo può essere regolato per diversi campioni.
Abstract
Tradizionalmente, i biologi hanno dovuto fare affidamento su metodi distruttivi come il sezionamento per studiare le strutture interne degli organismi opachi. L'imaging di tomografia computerizzata a raggi X (microCT) non distruttivo è diventato un protocollo potente ed emergente in biologia, grazie ai progressi tecnologici nei metodi di colorazione dei campioni e nelle innovazioni nell'hardware microCT, nei computer di elaborazione e nei dati software di analisi. Tuttavia, questo protocollo non è comunemente usato, come è nei campi medico e industriale. Uno dei motivi di questo uso limitato è la mancanza di un manuale semplice e comprensibile che copra tutti i passaggi necessari: raccolta dei campioni, fissazione, colorazione, montaggio, scansione e analisi dei dati. Un'altra ragione è la grande diversità dei metazoi, in particolare degli invertebrati marini. A causa delle diverse dimensioni, morfologie e fisiologie degli invertebrati marini, è fondamentale regolare le condizioni sperimentali e le configurazioni hardware ad ogni fase, a seconda del campione. Qui, i metodi di imaging microCT sono spiegati in dettaglio utilizzando tre invertebrati marini filogeneticamente diversi: Actinia equina (Anthozoa, Cnidaria), Harmothoe sp. (Polychaeta, Annelida) e Xenoturbella japonica ( Xenoturbellida, Xenacoelomorpha). Vengono inoltre forniti suggerimenti sull'esecuzione di immagini microCT su vari animali.
Introduction
I ricercatori biologici hanno generalmente dovuto fare sezioni sottili ed eseguire osservazioni con microscopia leggera o elettronica al fine di studiare le strutture interne degli organismi opachi. Tuttavia, questi metodi sono distruttivi e problematici se applicati a esemplari rari o preziosi. Inoltre, diversi passaggi del metodo, ad esempio l'incorporamento e il sezionamento, richiedono molto tempo e possono essere necessari diversi giorni per osservare un campione, a seconda del protocollo. Inoltre, quando si maneggiano numerose sezioni, c'è sempre la possibilità di danneggiare o perdere alcune sezioni. Tecniche di sgombero dei tessuti sono disponibili per alcuni esemplari1,2,3,4,5 ma non sono ancora applicabili a molte specie animali.
Per superare questi problemi, alcuni biologi hanno iniziato a utilizzare la tomografia computerizzata a raggi X microfocus (microCT)6,7,8,9,10,11, 12,13,14,15. Nella TC a raggi X, il campione viene irradiato con raggi X da varie angolazioni generate da una sorgente di raggi X che si muove intorno al campione e i raggi X trasmessi vengono monitorati da un rilevatore che si muove anche intorno al campione. I dati di trasmissione a raggi X ottenuti vengono analizzati per ricostruire le immagini trasversali del campione. Questo metodo consente l'osservazione di strutture interne senza distruzione del campione. A causa della sua sicurezza e facilità, è comunemente usato in applicazioni mediche e dentali, e sistemi CT possono essere trovati in ospedali e centri dentali in tutto il mondo. Inoltre, la TAC industriale a raggi X viene spesso utilizzata per l'osservazione di campioni non medici per l'ispezione e la metrologia nel campo industriale. A differenza della Tac medica, in cui la sorgente di raggi X e i rilevatori sono mobili, le due parti sono fissate nella TC industriale, con il campione che ruota durante la scansione. La TC industriale produce generalmente immagini ad alta risoluzione rispetto alla TC medica ed è indicata come microCT (risoluzione a livello di micrometro) o nanoCT (risoluzione a livello di nanometri). Recentemente, la ricerca con microCT è rapidamente aumentata in vari campi della biologia14,15,16,17,18,19, 20 anni , 21 Mieto , 22 Milia , 23 del 23 o , 24 Mi lasa' di , 25 mi lato , 26 del sistema di , 27 mi lapiùdel , 28 mi la più del 24 , 29 del 22 221 , 30 milio , 31 Milia , 32 Milia risse , 33 Mi lasa , 34.
Studi biologici che utilizzano TC inizialmente miravano a strutture interne che consistono principalmente di tessuto duro, come l'osso. I progressi nelle tecniche di colorazione utilizzando vari agenti chimici hanno permesso la visualizzazione dei tessuti molli in vari organismi6,7,8,9,14,15 , 16 , 17 mi lato , 18 mi lato , 19 del 12 , 20 anni , 21 Mieto , 22 Milia , 23 del 23 o , 24 Mi lasa' di , 25 mi lato , 26 del sistema di , 27 mi lapiùdel , 28 mi la più del 24 , 29 del 22 221 , 30 milio , 31 Milia , 32 Milia risse , 33 Mi lasa , 34. Di questi reagenti, gli agenti di contrasto a base di iodio sono relativamente sicuri, economici e possono essere utilizzati per la visualizzazione dei tessuti molli in vari organismi7,14. Per quanto riguarda gli invertebrati marini, la microCT è stata ampiamente utilizzata su animali come molluschi6,25,32,33, annelidi18,19, 20 anni , 28e arboridi21,23,29,31. Tuttavia, ci sono state poche segnalazioni su altri phyla animale, come bryozoans6, xenacoelomorfi26, e cnidarians24,30. In generale, ci sono stati meno studi che utilizzano microCT sugli invertebrati marini rispetto a quelli sui vertebrati. Uno dei motivi principali di questo uso limitato sugli invertebrati marini è la grande diversità osservata in questi animali. A causa delle loro diverse dimensioni, morfologie e fisiologie, ogni specie reagisce in modo diverso alle diverse procedure sperimentali. Pertanto, durante la preparazione del campione è fondamentale scegliere la fissazione e il reagente di colorazione più appropriati e impostare le condizioni ad ogni fase, regolate per ogni specie. Allo stesso modo, è anche necessario impostare le configurazioni di scansione, come il metodo di montaggio, la tensione, la corrente, la velocità di ingrandimento meccanica e la potenza di risoluzione dello spazio, in modo appropriato per ogni campione. Per superare questo problema, è essenziale un manuale semplice e comprensibile che copra tutti i passaggi necessari, spiega come ogni passaggio può essere regolato a seconda del campione e mostra esempi dettagliati tratti da più campioni.
Nel presente studio, descriviamo il protocollo di microCT, passo dopo passo, dalla fissazione dei campioni all'analisi dei dati, utilizzando tre specie di invertebrati marini. Gli esemplari dell'anemone marino Actinia equina (Anthozoa, Cnidaria) sono stati raccolti nei pressi della Stazione Biologica Marina di Misaki, dell'Università di Tokyo. Avevano un corpo sferico e morbido di circa 2 cm di diametro (Figura 1A-C). Sono stati raccolti anche campioni di Harmothoe sp. (Polychaeta, Annelida) nei pressi della stazione biologica marina di Misaki. Erano vermi sottili che erano di circa 1,5 cm di lunghezza, con chaetae duri presenti lungo tutto il corpo (Figura 1D). Un xenoturbella japonica35 (Xenoturbellida, Xenacoelomorpha) esemplare è stato raccolto vicino a Shimoda Marine Research Center, Università di Tsukuba, durante il 13th COASTAL Organism Joint Survey. Era un verme dal corpo morbido che era di circa 0,8 cm di lunghezza (Figura 1E). Le regolazioni effettuate per le condizioni e le configurazioni di ciascun campione sono spiegate in dettaglio. Il nostro studio fornisce diversi suggerimenti su come eseguire l'imaging microCT sugli invertebrati marini, e speriamo che ispirerà i biologi a utilizzare questo protocollo per la loro ricerca.
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Protocol
1. Fissazione
- Per Actinia equina,rilassare gli animali in 10% MgCl2 acqua di mare per circa 15 min a temperatura ambiente. Trasferire al 70% di etanolo e conservarlo a temperatura ambiente.
- Per Harmothoe sp., anestesizzare gli animali mettendoli in acqua di mare ghiacciata per circa 15 min. Trasferire al 10% (v/v) soluzione formalina con acqua di mare e conservarli a temperatura ambiente.
- Per Xenoturbella japonica,rilassare l'animale utilizzando il 7% MgCl2 in acqua dolce. Fissare in 4% paraformaldeide (PFA) in acqua di mare filtrata durante la notte. Mettere in 70% etanolo e conservare a 4 gradi centigradi.
AVVISO: il PFA è pericoloso e deve essere maneggiato con cura.
2. Colorazione
- Trasferire i campioni al 50% di etanolo e conservarli a temperatura ambiente per 15 h. Sostituire il 50% di etanolo con il 25% di etanolo e conservarli a temperatura ambiente per 2 h.
NOTA: Questo non è necessario per il campione Harmothoe sp. in soluzione formalina 10% (v/v) con acqua di mare. - Sostituire la soluzione con acqua distillata (DW) e conservare i campioni in DW a temperatura ambiente per 2 h. Ripetere questo passaggio tre volte.
- Preparare la soluzione 25% Lugol diluindo la soluzione stock (sotto) al 25% con DW. Soluzione di riserva (100% soluzione Lugol) contiene 10 g di KI e 5 g di I2, regolato a 100 mL con DW.
NOTA: la soluzione Lugol è sensibile alla luce, quindi conserva e gestisci la soluzione protetta dalla luce. Seguire le normative di ogni paese e istituzione per la movimentazione dello iodio e lo smaltimento dei rifiuti. - Decant il DW dai campioni e versare nella soluzione 25% Lugol. Macchie per 24 h a temperatura ambiente.
3. Montaggio a tappe
- Preparare lo 0,5% di agarose sciogliendo 500 mg di agarose in 100 mL di DW in una fiaschetta conica da 250 ml in un forno a microonde (800 W, circa 1-3 min). Raffreddare fino a circa 30-40 gradi centigradi mantenendo a temperatura ambiente.
AVVISO: Non surriscaldare o sigillare completamente il pallone durante il riscaldamento per evitare che l'agarose ebollisca. - Montare campioni di grandi dimensioni come A. equina utilizzando un tubo da 50 mL.
NOTA: Utilizzare tubi da 50 mL per il montaggio di campioni di grandi dimensioni che non si adattano a una punta 'blu' di micropipette da 1.000 l.l.- Mettere il campione colorato in un piatto da 60 mm con DW per lavare via un'eccessiva soluzione di colorazione dalla superficie.
- Versare delicatamente 5 mL dello 0,5% di agarose in un tubo da 50 mL e indurire l'agarose sul ghiaccio. Fare attenzione a non fare bolle nell'agarose.
- Aggiungere delicatamente 20 mL di 0,5% di agarose al tubo da 50 mL e mettere sul ghiaccio fino a quando l'agarose inizia a indurirsi. Posizionare il campione all'interno dello 0,5% di agarose usando le pinze. Fare attenzione a non fare bolle nell'agarose.
- Regolare la posizione e l'orientamento del campione con pinze e indurire l'agarose sul ghiaccio.
- Posizionare l'argilla sullo stadio di montaggio microCT e impostare il tubo da 50 mL sull'argilla (Figura 2A).
- Montare piccoli campioni come Harmothoe sp. e X. japonica utilizzando una punta 'blu' di micropipette da 1.000 .L.
NOTA: Per i campioni più piccoli, è possibile utilizzare la punta "giallo" di micropipette a 200 . In questo caso, utilizzare 30 l di agarose per la spina e aggiungere 200 lofd di acqua agarose o distillata.- Prelevare 100 L dello 0,5% di agarose in una punta 'blu' di micropipette da 1.000 ,L e indurire l'agarose tenendo la punta sul ghiaccio, facendo una spina nella punta (Figura 2B-a).
- Decant il campione macchiato in un piatto di 60 mm senza usare pinze.
- Trasferire delicatamente il campione utilizzando pinzette ad anello in un altro piatto da 60 mm con DW per lavare via un'eccessiva soluzione di colorazione dalla superficie.
- Aggiungere 1.000 L di 0,5% di agarose o DW nella punta collegata (passaggio 3.3.1) utilizzando una micropipetta.
NOTA: si raccomanda l'uso di agarose dello 0,5%, ma utilizzare DW per campioni fragili o preziosi in cui agarose dovrebbe essere evitato. - Trasferire delicatamente il campione dal piatto da 60 mm nell'agarose o dW nella punta collegata utilizzando una pinzetta ad anello.
- Regolare delicatamente la posizione e l'orientamento del campione con un ago petiolato o una pinzetta di precisione. Fare attenzione a non fare bolle nel supporto di montaggio. Assicurarsi che il campione sia stabile tra le pareti della punta quando DW viene utilizzato come supporto di montaggio (Figura 2D-b). Posizionare la punta sul ghiaccio per indurire l'agarose se viene utilizzata come mezzo di montaggio.
- Tagliare la punta di una nuova punta 'blu' di micropipette da 1.000 (Figura2B-b,c) e inserire la punta della punta collegata nella nuova punta.
- Posizionare l'argilla sulla fase di montaggio microCT e impostare le punte con il campione all'interno sull'argilla (Figura 2C,D).
NOTA: La soluzione di colorazione inizierà a lavare via il campione una volta inserito in DW, quindi procedere al passaggio successivo della scansione.
4. Scansione MicroCT
- Accendere il fascio di raggi X a 80 kV, 100 A.
- Osservando l'immagine di trasmissione a raggi X al centro dello schermo (Figura 3A), spostare lo stage in modo che l'intero campione possa essere visualizzato facendo clic sui pulsanti dell'asse X e z (Figura 3A) e manualmente regolazione della manopola dell'asse Y sulla fase di montaggio (Figura 3B). Impostare il contrasto dell'immagine in modo che le strutture interne possano essere osservate regolando le condizioni di contrasto (Figura 3A: Contrasto dell'immagine).
- Regolare l'orientamento del campione modificando l'angolo del tubo/punta nell'argilla (Figura 2A). Ruotare lo stage di 90 gradi impostando l'asse di rotazione (Figura 3A) su 90 e facendo clic sul pulsante di movimento relativo (Figura 3A). Esegui la stessa manovra quattro volte per completare una rotazione completa.
NOTA: Spegnere manualmente il raggio a raggi X ogni volta che viene aperta la porta campione, a meno che il sistema non lo spenghi automaticamente. - Spostare la fase in modo che il campione si trovi al centro della vista facendo clic sul pulsante dell'asse z (Figura 3A) e regolando manualmente la manopola dell'asse Y sulla fase di montaggio (Figura 3B). Girare il palco di 90 gradi e fare lo stesso. Ruotare la fase a 360 gradi e verificare che il campione si trova al centro della vista da tutte le direzioni.
- Spostare lo stage lungo l'asse x verso la sorgente del fascio di raggi X facendo clic sul pulsante dell'asse X (Figura 3A) per ingrandire il campione e regolarlo in base alle esigenze in modo che si adatti alla vista (Figura 3C).
- Ruotare lo stage a 360 gradi e regolare in base alle esigenze in modo che il campione si adatti alla vista da tutte le direzioni.
- Regolare le condizioni di scansione come mostrato nella Tabella 1.
- Avviare la scansione; ci vogliono circa 10 min.
5. Ricostruzione dell'immagine
- Avviare il software accessorio del sistema microCT (vedere la tabella deimateriali) e aprire i dati scansionati.
- Regolare le differenze nell'asse di rotazione del campione durante la scansione facendo clic sul pulsante di calcolo automatico del valore di spostamento (Figura4A: casella verde).
- Regolare l'orientamento dell'immagine ruotando le frecce arancioni (Figura 4B). Se l'orientamento è stato modificato, ripetere il passaggio 5.2.
- Fare clic sulla scheda area (Figura4C: casella magenta) e tagliare le aree in cui i campioni non sono presenti (Figura4C: casella gialla).
- Fare clic sulla scheda di riconfigurazione (Figura4D: scatola magenta) e impostare i filtri come segue per rimuovere il rumore. Artefatto ad anello ridurre il filtro: filtro mediano -3; Filtro di eliminazione del rumore: filtro medio-1.
- Eseguire la riconfigurazione facendo clic sul pulsante di riconfigurazione (Figura4D: casella verde).
- Regolare la luminosità e il contrasto dell'immagine impostando i valori in bianco e nero come valore nero 0, valore bianco 250 (Figura4D: casella blu).
- Salvare il set di dati dell'immagine TIFF ricostruito come TIFF a 8 bit facendo clic sul pulsante Salva. Rinominare i file TIFF come segue: Date_sample_resolution (m)_number.tiff.
NOTA: i set di dati microCT originali di questo studio sono disponibili nel repository Figshare, doi:10.6084/m9.figshare.767083736.
6. Analisi dei dati
- Avviare il software di analisi dei dati (vedere la tabella dei materiali) e consentire l'importazione di file TIFF facendo clic sull'icona Database (Figura 5A: scatola magenta) e spegnendo la casella mostrata in Figura 5B.
- Fare clic sull'icona di importazione (Figura5C: magenta box), selezionare il set di dati salvato nella sezione 5 e fare clic su Apri.
- Fare clic sul pulsante Copia collegamenti (Figura 5D) per importare i dati.
- Visualizzare la sezione trasversale 2D facendo clic sull'icona del visualizzatore 2D (Figura5C: casella blu).
- Calibrare il set di dati facendo clic sulla scheda del visualizzatore 3D (Figura5E: scatola magenta) e immettendo il valore di risoluzione al momento della scansione (che era 0.018 in questo studio [ Figura5F]).
- Fare clic sull'icona luminosità/contrasto (Figura5E casella verde). Regolare la luminosità e il contrasto spostando il cursore all'interno dell'immagine 2D visualizzata e modificando il livello della finestra e la larghezza della finestra (Figura 5G).
- Controllare altre immagini di sezione spostando la barra di scorrimento (Figura 5G: casella).
- Modificare l'orientamento della sezione trasversale facendo clic sull'icona di orientamento (Figura 5E: casella blu) e controllare le immagini a tutti gli orientamenti (Figura 5H).
- Fare clic sull'immagine visualizzata e scegliere la scheda Esporta per memorizzare le immagini di sezione trasversale.
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Representative Results
Abbiamo eseguito immagini microCT su A. equina (Anthozoa, Cnidaria), Harmothoe sp. (Polychaeta, Annelida) e X. japonica (Xenoturbellida, Xenacoelomorpha) dopo aver colorato i campioni con soluzione 25% Lugol. La colorazione ha migliorato con successo il contrasto delle strutture interne in tutti i campioni, consentendo osservazioni di tessuti molli interni (Figura 6). Insieme alle relazioni passate6,7,16,19,22,23,24,25,26 , 28 mi la più del 24 , 30 milio , 31 Milia , 32 Milia risse , 33, questo dimostra che la microTC può essere utilizzata su vari invertebrati marini per visualizzare la loro morfologia, compresi i tessuti interni molli. Immagini chiare sono state ottenute anche con l'esemplare X. japonica, la cui epidermide è stata gravemente danneggiata (Figura 6F,G), dimostrando che questo metodo è applicabile a campioni fragili con danni esterni.
La scansione solo della regione di interesse, a differenza di un'area più ampia, ha notevolmente aumentato la chiarezza e la risoluzione dell'immagine (confrontare la figura 6F e la Figura 6G). Tuttavia, un singolo set di dati ad alta risoluzione di un intero esemplare è stato ricostruito per Harmothoe sp. (Figura 6C) e X. japonica (Figura 6F) da scansioni multiple eseguite su scansioni diverse (ma sovrapposte) parti del campione. Le cuciture tra ogni scansione erano poco appariscenti nelle immagini ricostruite. Il nostro studio dimostra che è possibile ottenere singole immagini ad alta risoluzione con sistemi microCT a fascio di cono. Scansionando un'area più ampia ad alta risoluzione, c'è un rischio minore di trascurare piccole strutture. Un altro vantaggio è che è più facile individuare le posizioni relative delle strutture che si trovano distanti tra loro, come le punte anteriori e posteriori di un annelide allungato.
Figura 1 : Animali invertebrati marini osservati in questo studio. (A-C) Actinia equina (Anthozoa, Cnidaria). (A) Fine distale di un animale vivo rilassato in 10% MgCl2 acqua di mare. Dispari (B) e prossimale (C) termina dopo la fissazione in 70% etanolo. (D) Anestesizzata Adurathoe sp. (Polychaeta, Annelida), vista dorsale con anteriore a sinistra. La maggior parte dell'elis mancava già in questa fase, con solo quattro rimasti vicino alla fine posteriore. (E) Xenoturbella japonica (Xenoturbellida, Xenacoelomorpha) fissato nel 70% di etanolo. Vista destra, con anteriore verso l'alto. A causa delle circostanze della raccolta, la sua epidermide stava cominciando a staccarsi. Barre di scala - 3 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Montaggio di campioni sul sistema di tomografia computerizzataa raggi X microfocalizzato. (A) Montare campioni in un tubo da 50 mL utilizzando l'argilla. L'orientamento del campione potrebbe essere regolato utilizzando l'argilla. (B) Preparazione di una punta "blu" di 1.000 micropipette per il montaggio di piccoli campioni. a: Punta con l'estremità collegata con 100 - L di 0,5% di agarose (linee diagonali). I campioni sono stati inseriti in questa punta. La punta con il campione è stata inserita in un'altra punta 'blu' di micropipetta da 1.000 (b, c) per il montaggio. b è stato utilizzato per Xenoturbella japonica, e c è stato utilizzato per Harmothoe sp. (C) Montato X. campione di japonica, panoramica (a sinistra) e da vicino (a destra). La sorgente a raggi X può essere vista a destra del campione. (D) Diagrammi per il montaggio di campioni in una punta 'blu' di micropipette da 1.000 . a: X. campione di japonica in acqua distillata. b: il campione era in contatto con il muro di punta (frecce), in modo che non si muova durante la scansione. c: Campione Harmothoe sp. in 0,5% agarose. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : scansione di campioni sul sistema di tomografia computerizzata a raggi X microfocalizzato. (A) Schermo operativo durante la scansione del sistema di tomografia computerizzata a raggi X microfocale che mostra un'immagine di trasmissione a raggi X di un campione di Actinia equina. Regola il contrasto e la luminosità con il "Contrasto immagine" in basso a sinistra. (B) Vista della fase di montaggio che mostra la manopola dell'asse Y. (C) Immagine di trasmissione a raggi X del campione A. equina dopo che la fase di montaggio è stata spostata più vicino alla sorgente del fascio di raggi X. Si noti che viene ingrandito rispetto all'immagine al centro di (A). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : schermata di funzionamento del sistema di ricostruzione delle immagini. (A) Schermata per regolare le differenze nell'asse di rotazione del campione durante la scansione, mostrando un campione di Actinia equina. Scatola Magenta: scheda turno; casella verde: pulsante di calcolo automatico del valore dello spostamento. (B) Schermata per regolare l'orientamento dell'immagine, con l'Harmothoe sp. (C) Schermo durante la ricostruzione dell'immagine di A. equina, tagliando l'area al di fuori della scatola gialla dove non sono presenti campioni. Scatola Magenta: scheda area. (D) Schermo durante la ricostruzione dell'immagine, che mostra l'immagine ricostruita di A. equina. Scatola Magenta: scheda di riconfigurazione; scatola verde: pulsante di riconfigurazione; casella blu: regolazione del valore in bianco e nero. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5 : schermata di funzionamento del sistema di analisi delle immagini. (A) finestra delle preferenze. È stato fatto clic sull'icona Database (magenta circle) per aprire la finestra di gestione dei file di database. (B) Finestra di gestione dei file di database. In questo software, la casella visualizzata con una freccia deve essere disattivata per consentire l'importazione di file TIFF. (C) Menu e barre degli strumenti della schermata Database. Magenta box: icona di importazione; scatola blu - Icona del visualizzatore 2D. (D) Finestra di importazione del set di dati. Magenta circle: pulsante Copia collegamenti. (E) Menu e barre degli strumenti della schermata del visualizzatore 2D. Scatola Magenta - scheda visualizzatore 3D; casella verde: icona di luminosità/contrasto; casella blu - icona di orientamento. (F) Finestra di impostazione della calibrazione. Immettere i valori di risoluzione desiderati all'interno delle colonne nella casella magenta. (G) Sezione trasversale di un campione Actinia equina visualizzato nella finestra del visualizzatore 2D per regolare la luminosità e il contrasto. Magenta box: barra di scorrimento per il controllo di altre sezioni trasversali. (H) Sezione trasversale di A. equina visualizzata nella finestra del visualizzatore 2D con un orientamento diverso rispetto a (G). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6 : immagini scansionate e ricostruite di invertebrati marini. (A) Sezioni longitudinali trasversali e (B) di Actinia equina. L'area all'interno della casella gialla tratteggiata in (B) viene ingrandita nel tratto. Abbreviazioni: dm, coppia di mesenteries direttiva; m, paio di mesenterie perfette; mf, filamento mesenteriale; p, pharynx; si, siphonoglyphs; t, tentacolo; frecce, disco orale; frecce bianche, disco del pedale; punte di freccia nere, muscolo dello sfintere. Barre di scala in A, B - 3 mm. (C-E) Harmothoe sp. (C) Sezione Sagittal della parte anteriore. (D, E) Sezione trasversale in corrispondenza delle linee tratteggiate d ed e in (C). Abbreviazioni: aci - aciculum; acim - muscolo acicolare; coe - coelom; dlm - muscolo longitudinale dorsale; elp - elofoma; occhio - occhio; int - intestino; mascella - mascella; mant - antenna mediana; mo - bocca; mp - muscoli della proboscide; palp - palp; pha - pharynx; prob - proboscide; vlm - muscolo longitudinale ventrale; vnc - cordone nervoso ventrale. Barre della scala: C - 1 mm; D, E - 0,3 mm. (F, G) Xenoturbella japonica. (F) Sezione sagittale dell'intero campione. (G) Sezione sagittale della parte anteriore. bl - lamina basale; int - intestino; ml - strato muscolare; mo - bocca; nn - rete nervosa intraepidermica; freccia bianca - statocisti; freccia nera - poro frontale; frecce bianche - rete ghiandolare ventrale; punte di freccia nere - oociti. Barre di scala: F : 1 mm, G - 0,5 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Tabella 1: Protocollo di preparazione e scansione del campione per ogni campione.
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Discussion
Fissativi che utilizzano formalina, come la soluzione formalina 10% (v/v) in acqua di mare utilizzata in questo studio, sono noti per preservare la morfologia di diversi invertebrati marini e sono spesso utilizzati per l'imaging microCT18,24,25 ,26,28,30,33. Tuttavia, restrizioni sull'uso di questa sostanza chimica sono diventati rigorosi in alcuni paesi negli ultimi anni, e sostituti come la paraformaldeide o glutaraldeide possono essere utilizzati. Se ci sono piani per estrarre il DNA dopo la scansione, è meglio evitare di utilizzare la formalina come fissativo, perché è noto per frammentare il DNA. In questo caso, si raccomanda l'uso di fissativi che conservano il DNA, come il 70% di etanolo. In questo studio, il cnidarian A. equina è stato fissato utilizzando 70% etanolo, e immagini microCT chiare sono state ottenute dai campioni fissi 70% etanolo (Figura 6A, B).
In uno studio precedente che ha eseguito la scansione microCT di vari taxa cnidarian, molti campioni sono stati disidratati nel 100% di etanolo, e alcuni sono stati essiccati a punti critici prima della scansione24. Anche se gli organi interni morbidi come gli ammassi tentacoli, i muscoli e le gonadi sono stati osservati con successo nel loro studio, i processi di disidratazione e essiccazione sono noti per provocare importanti artefatti come la deformazione e la contrazione dei tessuti molli11 , 21.Nel presente studio, abbiamo potuto osservare le strutture interne del cnidarian A. equina fissato nel 70% di etanolo e macchiato con soluzione Lugol 25% (Figura6A,B). Il nostro protocollo, senza alcuna disidratazione o di essiccazione, è preferibile e deve essere eseguito quando possibile per ridurre il rischio di danni ai campioni e ai manufatti durante la scansione.
Soluzione Lugol, soluzione di iodio e acido fosfocaggetico (PTA) sono soluzioni di colorazione che vengono spesso utilizzate su campioni biologici nell'imaging microCT6,7,9,14,16, 17,20,26,27,38. Dalla nostra esperienza nell'utilizzo di vari campioni biologici, la soluzione Lugol ha fornito i migliori risultati per molti campioni, con colorazione scura in un periodo di tempo relativamente breve. La soluzione di iodio produceva solo macchie molto deboli, e la PTA richiedeva molto tempo per una colorazione sufficiente e gli esemplari macchiati mostravano forti contrazioni. Pertanto, tutti gli esemplari sono stati macchiati con soluzione Lugol in questo studio. Tuttavia, anche se la soluzione Lugol è consigliata, la soluzione di colorazione appropriata differisce tra i campioni e suggeriamo di eseguire prove che utilizzano altre soluzioni di colorazione se ci sono abbastanza campioni. Indipendentemente dalla soluzione di colorazione, i campioni si contraggono durante la colorazione37,38, quindi è importante mantenere il tempo di colorazione breve.
Un passaggio critico nella scansione microCT consiste nel montare il campione in modo da evitare che si muova. In questo studio, questo è stato eseguito in due fasi, prima utilizzando l'agarose come mezzo di montaggio diretto, e poi utilizzando l'argilla per montare il tubo che conteneva il campione allo stadio. Per la prima fase, diversi supporti di montaggio a bassa densità sono stati utilizzati in studi precedenti, tra cui etanolo6,17,20,25,30, agarose9,29 e schiuma floreale15,22,31. Agarose è stato selezionato in questo studio in quanto è una sostanza chimica a basso costo che è accessibile in tutto il mondo. Uno svantaggio di agarose è che può essere difficile recuperare il campione dall'agarose indurito dopo la scansione, ma l'utilizzo di agarose a basso punto di fusione rende più facile questo passaggio di recupero. Per il secondo passo, morsetti a mascella o viti sono spesso utilizzati6,9,17. L'argilla è stata selezionata in questo studio in quanto consente regolazioni fini nell'orientamento e nell'angolo del campione. È necessaria cautela per gli esperimenti con lunghi tempi di scansione, poiché la possibilità che il campione si muova è maggiore quando si utilizza argilla piuttosto che morsetti o viti della mascella.
Uno studio precedente ha condotto la scansione microCT su sette specie di polichaete con lunghezze corporee di 2-8 mm, più piccole dell'Harmothoe sp. utilizzato in questo studio16. Sono stati in grado di generare immagini ad alta risoluzione e hanno mostrato organi come sistemi vascolari e chaeta individuali più chiari rispetto al presente studio. La causa principale di questa differenza non era il protocollo, ma le specifiche dei sistemi microCT utilizzati. Il sistema utilizzato nello studio precedente è stato dotato di una fotocamera per dispositivi accoppiata con carica da 11 megapixel (4000 x 2672 pixel) con una risoluzione massima di <0,8 m/pixel16. Le dimensioni della matrice dell'immagine attiva del sistema utilizzato in questo studio erano 992 x 992 pixel, con una risoluzione massima di >5 m/pixel. Pertanto, la risoluzione spaziale del sistema microCT utilizzato in questo studio era inferiore al sistema microCT ad alte prestazioni utilizzato in Faulwetter et al.16. Questa differenza è stata particolarmente evidente quando si scansionavano campioni di dimensioni inferiori a 8 mm, in cui si è riscontrata una mancanza di risoluzione (dati non mostrati). Tuttavia, poiché durante la scansione sono stati ottenuti meno dati, il tempo di scansione è stato molto più breve rispetto allo studio precedente16 (dati: 992 x 992 e 4000 x 2672 pixel, rispettivamente; tempo di scansione: da 10 a 26 min e da 30 minuti a diverse ore, rispettivamente). Un breve tempo di scansione riduce lo scolorimento della colorazione dello iodio, consentendo l'uso della soluzione Lugol, che è una buona soluzione di colorazione con un alto tasso di penetrazione, ma si diffonde facilmente in DW34. Un breve tempo di scansione riduce anche la possibilità che il campione si sposti durante la scansione, che ha permesso l'uso di un metodo di montaggio semplice utilizzando agarose o DW (Figura 2). I tempi di scansione più lunghi hanno anche lo svantaggio di una possibile sfocatura di riduzione dei campioni nelle immagini. Diversi altri problemi meccanici e hardware che possono verificarsi durante lunghe scansioni sono stati segnalati anche39. Pertanto, quando si utilizzano sistemi microCT, è importante comprendere con precisione le specifiche di ogni sistema e scegliere il sistema giusto in termini di dimensioni del campione o obiettivo di ricerca. In alcuni casi, un sistema microCT a bassa risoluzione può essere sufficiente.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo Toshihiko Shiroishi per la sua assistenza e per aver fornito l'ambiente di ricerca durante questo studio. Siamo grati a Kensuke Yanagi e Takato Izumi per consigli su A. equina, e Masaatsu Tanaka per consigli sul esemplare Harmothoe sp. Vorremmo ringraziare il personale del Shimoda Marine Research Center, dell'Università di Tsukuba, e della Misaki Marine Biological Station, l'Università di Tokyo per il loro aiuto nelle collezioni di campioni. Ringraziamo Editage (www.editage.jp) per l'editing in lingua inglese. Questo lavoro è stato supportato dal JSPS Grant-in-Aid for Young Scientists (A) (JP2671022) all'HN, e dalla JAMBIO, Associazione Giapponese per la Biologia Marina.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 250-ml Erlenmeyer flask | Corning | CLS430183 | |
| 5-ml Sampling tube ST-500 | BIO-BIK | 103010 | |
| 50-ml Polypropylene tube | Greiner Bio One International | 227261 | |
| 60-mm Non-treated Dish | IWAKI | 1010-060 | |
| Agarose | Promega | V3125 | |
| Ecological grade tip (blue) 1000 µl | BMBio | BIO1000RF | |
| Ethanol | Wako Pure Chemical Industries | 057-00451 | |
| Formalin | Wako Pure Chemical Industries | 061-00416 | |
| Iodine | Wako Pure Chemical Industries | 094-05421 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Wako Pure Chemical Industries | 135-00165 | |
| OsiriX DICOM Viewer | Pixmeo SARL | OsiriX MD v10.0 | https://www.osirix-viewer.com |
| Paraformaldehyde | Wako Pure Chemical Industries | 163-25983 | |
| Petiolate needle | AS ONE | 2-013-01 | |
| Pipetman P200 Micropipette | GILSON | F123601 | |
| Pipetman P1000 Micropipette | GILSON | F123602 | |
| Potassium iodide | Wako Pure Chemical Industries | 166-03971 | |
| Precision tweezers 5 | DUMONT | 0302-5-PS | |
| QuickRack MultI fit tip (yellow) 200 ul | Sorenson | 10660 | |
| Razor blades | Feather | FA-10 | |
| Ring tweezers | NAPOX | A-26 | |
| Stereoscopic microscope | Leica | MZ95 | |
| X-ray Micro-CT imaging system | Comscantechno | ScanXmate-E090S105 |
References
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