Summary
Transgene lck:eGFP zebrafisk udtrykke normal god landbrugspraksis højt i T-lymfocytter, og har været brugt til at studere T-celle udvikling og akut lymfoblastær leukæmi. Denne linje kan bruges til undersøgelse B celler, der udtrykker lck på lavere niveauer. Denne protokol beskriver rensning af maligne og ikke-maligne B celler fra lck:eGFP zebrafisk.
Abstract
Zebrafisk (Danio rerio) er en kraftfuld model til at studere lymfocyt udvikling. Ligesom pattedyr besidder D. rerio en adaptive immunsystem, der omfatter B og T lymfocytter. Undersøgelser af zebrafisk lymphopoiesis er vanskeligt, fordi antistoffer anerkende D. rerio celle overflade markører ikke er generelt tilgængelige, komplicerende isolering og karakterisering af forskellige lymfocyt befolkning, herunder B-afstamning celler. Transgene linjer med afstamning-specifikke fluorophore udtryk bruges ofte til at omgå denne udfordring. Transgene lck:eGFP linje er blevet brugt til at studere D. rerio T-celle udvikling, og er også blevet udnyttet til model T-celle udvikling og akut lymfoblastær leukæmi (T-ALL). Selvom lck:eGFP fisk har været meget anvendt til at analysere T-afstamning, har de ikke været brugt til at studere B-celler. For nylig, opdagede vi, at mange zebrafisk B celler også udtrykke lck, omend på et lavere niveau. Lck:eGFP B celler udtrykker derfor ligeledes lave niveauer af normal god landbrugspraksis. Baseret på dette resultat, udviklede vi en protokol til at rense B-slægt celler fra lck:eGFP zebrafisk, som vi rapporten her. Vores metode beskriver, hvordan du udnytter et fluorescerende-aktiveret celle sidesorteringen (FACS) til at rense B celler fra lck:eGFP fisk eller relaterede linjer, som dobbelt-transgene rag2:hMYC; lck:eGFP fisk. I disse linjer, B-celler, så især umodne B-celler, udtrykkelig normal god landbrugspraksis på lavt men påviselige niveauer, de kan skelnes fra T-celler, der giver stærkt udtryk for normal god landbrugspraksis. B-celler kan isoleres fra marv, thymus, milt, blod eller andre væv. Denne protokol indeholder en ny metode til at rense D. rerio B-celler, muliggør undersøgelser fokuseret på emner som B celle udvikling og B-lymfocytter maligniteter.
Introduction
Zebrafisk tilbyder kraftfulde attributter, såsom genetisk manipulability, høj frugtbarhed, optisk gennemskinnelighed og hurtige udvikling, lette at studere hvirveldyr udvikling ved hjælp af genetiske metoder. Disse fordele, kombineret med de delte funktioner af teleost og pattedyr bloddannelsen, gør D. rerio ideel til in vivo analyser af lymphopoiesis og lymfocyt funktion, fra deres tidligste udseende i larver i hele voksenlivet. Blod udvikling i zebrafisk er afhængig af godt bevarede genetiske processer, der er delt med pattedyr, og disse omfatte den adaptive immunsystem. Molekylære mekanismer for lymfoide udvikling bevares desuden bemærkelsesværdigt mellem zebrafisk og pattedyr1.
I de sidste 2 årtier, transgene D. rerio linjer at etiketten specifikke blod lineages og mutant linjer mangelfuld i disse slægter har oprettet2,3,4,5. En af disse, linjen lck:eGFP transgene bruger zebrafisk lymfocyt protein tyrosin kinase (lck) initiativtageren til at drive normal god landbrugspraksis udtryk6. Dette gen, som er stærkt udtrykt af både T-lineage prækursorer og modne T-lymfocytter, tillader in vivo, sporing af thymic T-celle udvikling og ex vivo rensning af T-slægt celler af FACS7. Tidligere brugte vi denne linje i en frem-genetiske ENU mutagenese skærm til at identificere kønscelleoverførsel mutanter tilbøjelige til T-alle og studere somatically erhvervet genetisk begivenheder i forbindelse med T-celle oncogenesis8,9.
For nylig forlænget vores laboratorium yderligere nytte af lck:eGFP zebrafisk. I dobbelt-transgene rag2:hMYC (human MYC), lck:eGFP D. rerio der er kendt for at udvikle T-alle 10, vi opdagede, at B-afstamning alle også forekomme11. I modsætning til T-alle i denne model, der fluorescerer smukt på grund af høj normal god landbrugspraksis udtryk, B-alle er svagt-fluorescerende på grund af lavt normal god landbrugspraksis tillader fisk med B-alle kan skelnes klart fra dem med T-alle af fluorescerende mikroskopi. Denne differentierede normal god landbrugspraksis udtryk tillader også adskillelsen af normal god landbrugspraksislo B-alle celler fra normal god landbrugspraksisHej T-alle celler ved hjælp af FACS11. Endvidere er lav lck udtryk ikke enestående for zebrafisk B-alle, som menneskelige B-alle også udtrykke lave niveauer af LCK11,12. Ligeledes, normale B-slægt celler af D. rerio, mus og mennesker også udtrykke lave niveauer af lck/Lck/LCK, med umodne B-celler har den højeste udtryk11,13. På grundlag af per celle express B-slægt celler i lckeGFP zebrafisk eller afledte linjer 1-10% så meget normal god landbrugspraksis som T-lymfocytter. Disse normal god landbrugspraksislo celler udtrykkelige karakteristisk B celle mRNAs såsom pax5, cd79b, blnk, btk, ighm, ighzog andre, og kan blive renset fra marv, thymus, milt eller perifere blod11. Derfor isoleret både B - og T-slægt celler kan være fra lckeGFP zebrafisk og rag2hMYC, lckeGFP dyr, B - og T-alle celler samt11.
Her præsenterer vi vores protokol til effektivt FACS-rense ikke-maligne B celler fra lck:eGFP zebrafisk og ikke-maligne eller maligne B celler i rag2hMYC; lck:eGFP fisk, ved hjælp af forskellige kilde væv. Sådanne celler kan ligeledes kvantificeres ved flowcytometri uden FACS isolation, hvis det ønskes. Opdagelsen af lav lck udtryk- og dermed lav normal god landbrugspraksis udtryk-af B celler åbner nye døre for eksperimenterende muligheder for lckeGFP zebrafisk, som in vivo B celle udviklingsmæssige undersøgelser. Således, denne transgene linje, første gang rapporteret i 2004, har nye liv som vi søger at udnytte det til at opsnuse frisk indsigt vedrørende zebrafisk adaptive immunitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer, der involverer zebrafisk blev godkendt af institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC) på University of Oklahoma Health Sciences Center.
1. isolere Non-maligne B og T lymfocytter fra transgene lck:eGFP fisk
- Bedøver fisk ved hjælp af 0,02% tricaine (MS-222) i systemet fiskevand.
- Undersøge 2 – 6 måned gammel fisk for fluorescerende thymi, der er placeret på dorsomedial aspekt af den branchial hulrum i zebrafisk og andre teleosts14. Bruge et epifluorescensmikroskop (470/40 excitation bølgelængde og 525/50 emission filter) til at registrere normal god landbrugspraksis.
- Forberede sig på forhånd 50 mL af filter-steriliseret 1 x Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI) indeholdende 1% føtal bovin serum og 1% penicillin-streptomycin (sortering media). Ubrugte sortering medier kan opbevares ved 4 ° C i op til 2 måneder.
- Aflive fisken ved at placere det i et bægerglas, indeholdende 0,2% Tricaine for ca. 5 min., efterfulgt af is bad fordybelse. Bekræft død ved ophør af opercular (gill) bevægelse.
- Placer de aflivede fisk i en petriskål og dissekere lymfoide organer af interesse, ved hjælp af de fluorescerende mikroskop til at dissekere normal god landbrugspraksis+ thymi14, og lysfelt mikroskopi indstillinger til dissekere nyre marv og milt15. Resultaterne præsenteres her blev opnået ved hjælp af 3 måneder gamle fisk. Lymfocyt proportioner og absolutte tal varierer afhængigt af alder og genotype (Se diskussion for yderligere detaljer).
- Placer hver dissekeret orgel i 1,5 mL rør indeholdende 500 µL af kolde sortering medier.
- Homogeniseres væv på isen med en pistil mikro-tube homogeniseringsapparat.
- Passere en 35 µm mesh-filter til at generere en enkelt cellesuspension homogeniseret væv. Holde celler på is, indtil analysen.
2. isolering af maligne lymfocytter fra dobbelt-transgene rag2:hMYC; lck:eGFP zebrafisk
-
Begynder ved 2-4 måneder, mikroskopisk skærm rag2:hMYC; lck:eGFP fisk for unormal normal god landbrugspraksis mønstre.
Bemærk: B-celler er normal god landbrugspraksislo i lck:eGFP baggrund, så B-alle kræver praksis at genkende; T-alt er indlysende, fordi T-celler er normal god landbrugspraksisHej. Derfor, rag2:hMYC, lck:eGFP dual-transgene linje har to fænotyper: lyst-fluorescerende T-alle, der normalt opstår som følge af thymus og udvide ind i kroppen og dunkelt-fluorescerende B-alle.- Ved hjælp af en fluorescerende mikroskop, skærm fisk ved hjælp af "lav eksponering" indstillinger (200 ms, 2,4 x gevinst) at identificere lyse T-ALL (figur 1A) og "høj eksponering" (1,5 s, 3,4 x gevinst) at identificere dim B-ALL (figur 1A). WT kontrol og pre leukemic fisk har normal god landbrugspraksis lokaliseret kun i thymus (figur 1B).
- Bedøver og undersøge fisk som beskrevet i trin 1.1-1.2.
- Kategorisere fisk baseret på omfanget af normal god landbrugspraksis fluorescens, ved hjælp af en simpel tre kategori system:
Bemærk: Niveau 1: Fluorescens vises som en thymic tumor med kun begrænset lokal spredning.
Niveau 2: Fluorescens vises ud over thymus, der involverer < 50% af kroppen.
Niveau 3: Fluorescens strækker sig ud over 50% af kroppen. - Adskille fisken med alle fra dem uden kræft. Overvåge pre leukemic fisk (dvs. fisk uden normal god landbrugspraksis+ tumorer) én gang månedligt for udviklingen af nye ALL. Af ~ 9 måneder, alle rag2:hMYC, lck:eGFP fisk udvikle T-ALL, B-ALL, eller begge dele.
- For T - eller B-alle celle isolation, skal du vælge niveau 3 fisk (alt der involverer > 50% af kroppen), som giver mere end 2 x 106 alle celler, og typisk mange flere.
- Aflive fisk som i trin 1.4.
Bemærk: Der er to metoder til at få alle celler: hele kroppen homogenisering og en peritoneal vask teknik16. Metoderne varierer i det absolutte antal celler indsamlet til sortering, og dermed, mængder af FACS tid kræves og omkostninger (Se diskussion for yderligere detaljer). - For begge metoder, først placere de aflivede fisk i en petriskål og bruger et barberblad, fjerne hovedet med thymic regionen. Dette kan blive behandlet separat, hvis ønsket, eller anvendes til histologisk farvning.
-
Peritoneal vask metode
- Bruger en P1000 pipette, vask fisk bughulen med 500 µL af kolde sortering medier, indsamling af celler og medier i en 5 mL tube.
- Ved hjælp af en frisk pipette tip, indsprøjte en yderligere 200 – 300 µL koldt sortering medier i kroppen hulrum. Derefter, ved hjælp af spidsen af en pipette, anvende blide tryk på selve fisk at presse celler fra kroppen hulrum. Indsamle dette medie og tilføje til 5 mL tube.
- Gentag trin 2.8.2 2 – 3 gange. Holde de indsamlede celler i sortering medier på is.
- Filtrere cellesuspension, selvom en 35 µm mesh filtrere før flow flowcytometri/FACS og holde celler på is, indtil analysen.
-
Hele kroppen homogenisering
- Efter fjernelse af placere fisk hoved, kroppen i 1,5 mL rør indeholdende 200 µL af sortering medier.
- Homogeniseres kroppen bruger en pistil mikro-tube homogeniseringsapparat.
- Tilføje en yderligere 300 µL af kolde sortering medier. Filtrere cellesuspension, selvom en 35 µm mesh-filter. Tilføj sortering medier efter behov at vaske alle celler gennem filteret, indtil kun væv snavs forbliver på filteret. Holde celler på is, indtil analysen.
3. Cytometric analyse af Normal eller maligne B-lymfocytter
- Angiv flow cytometric analyse og/eller FACS parametre efter fabrikantens vejledning.
-
Erhverve ønskede antal hændelser i første omgang kendetegner prøven. Analysere 1 x 104 til 5 x 104 begivenheder før sortering til fastlæggelse af specifikke porte til efterfølgende sortering trin.
- Bestemme gates: definere lymfocyt og stamfader celle porte ved hjælp af forward scatter (FSC) og side scatter (SSC) parametre, bortset fra celleaffald (figur 2A-C)17. FSC og SSC svarer til celle størrelse/diameter og granulering, henholdsvis.
Bemærk: Normal god landbrugspraksis-, normal god landbrugspraksislo, og normal god landbrugspraksisHej celler afvige 10-til-100-fold i deres normal god landbrugspraksis fluorescens støtteintensitet, at adskillelsen af disse befolkninger ligetil (tal 2-5). Live-døde forskelsbehandling kan vurderes på dette punkt ved hjælp af propidium jod (PI) eller 7-aminoactinomycin D (7-AAAD) levedygtighed farvning. Tidligere eksperimenter med PI typisk vise > 95% levedygtighed af normal god landbrugspraksis+ celler efter FACS. - Udelukke celle dubletter, ifølge parametrene for FACS maskinen bliver brugt.
- Inden for de lymfoide og/eller prækursor gates, bestemme antallet og procentdelen af normal god landbrugspraksis+ celler.
- Bestemme gates: definere lymfocyt og stamfader celle porte ved hjælp af forward scatter (FSC) og side scatter (SSC) parametre, bortset fra celleaffald (figur 2A-C)17. FSC og SSC svarer til celle størrelse/diameter og granulering, henholdsvis.
- Bruge phycoerythrin (PE) og normal god landbrugspraksis intensiteter, definere gate for normal god landbrugspraksis- vs normal god landbrugspraksislo vs normal god landbrugspraksisHej celler.
Bemærk: B-celler udstille dim normal god landbrugspraksis fluorescens og T-celler Vis lyse normal god landbrugspraksis i lck:eGFP linjer. Mange lymfoide organer eller tumor prøver indeholder både normal god landbrugspraksis+ populationer. B-slægt celler/B-alle er normal god landbrugspraksislo og T-slægt celler/T-alle er normal god landbrugspraksisHej. Definer gates til at skelne mellem normal god landbrugspraksis-, normal god landbrugspraksislo, og normal god landbrugspraksisHej celler, og indsamle disse populationer separat (figur 2A-C, figur 3A-C, figur 4A og figur 5a). - Sortere hver celle befolkning i forskellige 15 mL polypropylen rør indeholdende 2 mL af sortering media, eller direkte i forskellige 1,5 mL rør indeholdende en passende buffer for yderligere analyser (fx, RNA, DNA eller protein udvinding, allo-transplantation, osv.).
- Holde oprensede celler på is før yderligere analyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi brugte flowcytometri til at analysere og FACS at isolere normal god landbrugspraksislo og normal god landbrugspraksisHej celler fra thymus, nyre marv og milten af lck:eGFP transgene zebrafisk. Analyse af 3-måned-forhenværende fisk viste thymus indeholdt oftest normal god landbrugspraksis+ lymfocytter. Normal god landbrugspraksis+ celler blev stort set begrænset til lymfoid porten tidligere beskrevet af Traver et al.17. To særskilte normal god landbrugspraksis+ populationer, normal god landbrugspraksisloog normal god landbrugspraksisHej,kan observeres i thymus. Normal god landbrugspraksisHej lymfocytter repræsenteret en højere procentdel, ~ 60%, mens normal god landbrugspraksislo celler var mindre rigelige, der repræsenterer ~ 40% af samlede thymic lymfocytter (tabel 1). I modsætning til pattedyr, er fisk hæmatopoietisk marv lokaliseret i nyrerne, snarere end i knoglen. Vi bestemt B celler bosat i nyre marv også udtrykke lave niveauer af normal god landbrugspraksis (figur 2B og figur 3B). Normal god landbrugspraksislo celler i marv var rigelige, mens normal god landbrugspraksisHej celler var knappe (figur 2B og figur 3B)), der angiver, at kun en lille procentdel af T-lymfocytter var til stede i marv på 3 måneder. Milt prøver ligeledes viste højere procentsatser af normal god landbrugspraksislo end normal god landbrugspraksisHej celler (figur 2 c og figur 3 c). Vi har også analyseret ikke-maligne lymfocytter fra thymus, marv, og milt af dobbelt-transgene lck:eGFP; rag2:hMYC zebrafisk, som er udsat for både B - og T-alle11. I fisk, der ikke havde endnu udviklet alle, var resultaterne fra thymus, marv og milten svarende til single-transgene lck:eGFP fisk. Men antallet af lymfocytter pr. orgel blev øget (figur 3), formentlig på grund af MYC-drevne ekspansion af umodne B og T-celle populationer hvor rag2 promotor er aktiv.
Vi har også analyseret dobbelt-transgene fisk med B - og/eller T-alle, der havde udviklet fluorescerende kræftformer af 6 måneder. Forudsigeligt, B-alle fisk med svagt-fluorescerende kræftformer indeholdt oftest normal god landbrugspraksislo celler (figur 4A). Derimod lyst-fluorescerende fisk kan havnen enten isolerede T-ALL eller blandede befolkninger i både normal god landbrugspraksislo B-alle og normal god landbrugspraksisHej T-alle celler (figur 5). Et eksempel på blandet alle, som indeholder forskellige B - og T-alle, er vist her (figur 5). For at bekræfte identiteten af normal god landbrugspraksislo og normal god landbrugspraksisHej celler som B - og T-afstamning, henholdsvis, analyserede vi B - og T-celle-specifikke udskrifter af kvantitative real-time PCR (qRT-PCR). Vores resultater viser normal god landbrugspraksislo celler express højere niveauer af B-celle udskrifter og normal god landbrugspraksisHej celler express højere niveauer af T celle gener (figur 2D, figur3D, figur4B og figur 5B). Endvidere udtryk for lck og normal god landbrugspraksis i normal god landbrugspraksislo alle svarer til dim i vivo normal god landbrugspraksis fluorescens af B-ALL (figur 2D, figur3D, figur4B og figur5B; qRT-PCR betingelser og primere sekvenser tidligere beskrevet af Borga et al.) 11.
Figur 1: Særskilt fluorescens mønstre i lck:eGFP transgene fisk. (A) fluorescerende mikroskopi billeder rag2:hMYC; lck:eGFP fisk med smukt fluorescerende T-ALL (venstre) eller svagt-fluorescerende B-ALL (til højre). T-alt er synligt med lav eksponeringsindstillinger; B-alle kan kun ses ved hjælp af store engagementer. (B) høj eksponeringsindstillinger viser svag thymic fluorescens (gule cirkler) i wild-type lck:eGFP (venstre) og rag2:hMYC; lck:eGFP dobbelt-transgene fisk uden alle (højre). Skalere barer = 20 mm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Lymfocyt populationer i lck:eGFP zebrafisk. Billeder øverst viser en 3 måneder gammel WT, lck:eGFP fisk med høj eksponeringsindstillinger eller computer-ekstraudstyr (til at lette visualisering). Skalere barer = 20 mm. Flow cytometric analyser af thymus (A), knoglemarv (B), og milt (C). Venstre paneler viser FSC (x-aksen) og SSC (y-aksen), med sort ovaler angiver lymfocyt gates. Midterste paneler skildrer fluorescens-baserede gating med normal god landbrugspraksis (x-aksen) og PE (y-aksen). Normal god landbrugspraksisHej (blå rektangel), normal god landbrugspraksislo (grøn rektangel) og normal god landbrugspraksis- (sort ovaler) populationer er vist. Rigtige paneler vises histogrammer af normal god landbrugspraksisHej og normal god landbrugspraksislo celler. Stiplede linjer angiver gating kriterier i midterste paneler. (D) WT lck:eGFP thymi sorteret for normal god landbrugspraksisHej (blå) og normal god landbrugspraksislo (grøn). Udtryk for B-celle gen (pax5), T (cd4) celle-specifikke gener)lck og normal god landbrugspraksis. Resultaterne er normaliseret til husholdning gener (β-actin og eef1a1l1) og vist som fold-change ± standardafvigelse (Anja). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Lymfocyt befolkning i pre leukemic rag2:hMYC; lck:eGFP zebrafisk. Billeder øverst viser en 3-måneders -gamle rag2:hMYC; lck:eGFP fisk med højt og computer-forstærket engagementer. Skalalinjen = 20 mm. paneler af dele A-D er afbildet i samme format til figur 2. (D) udtryk for pax5, cd4, lckog normal god landbrugspraksis i FACS-renset thymic normal god landbrugspraksislo (grøn) NGLHej (blå) cellepopulationer af lck:eGFP fisk. qRT-PCR resultater er vist som fold-change ± S.E. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Analyse af B-alle rag2:hMYC; lck:eGFP transgene fisk. (A) Top: 6-måned-forhenværende rag2:hMYC; lck:eGFP fisk med B-alle med høj eksponeringsindstilling. Flow cytometric analyser af tumorceller isoleret fra fisk legeme er identiske format til figur 2. (B) Gen-ekspression i B-alle NGLlo celler (grønne gate i figur 4A), rag2:hMYC; lck:eGFP normal god landbrugspraksisHej thymocytter (blå gate i figur 3A) og T-alle NGLHej celler (blå gate i figur 5A ). Udtryk for B (pax5, cd79a) og Thomsen (cd4) celle-specifikke gener, lckog normal god landbrugspraksis. Resultaterne er normaliseret til husholdning gener (β-actin og eef1a1l1) og vist som fold-change ± S.E. skala bar = 20 mm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Analyse af blandet alle rag2:hMYC; lck:eGFP transgene fisk. (A) Top: 6 måneder gammel rag2:hMYC; lck:eGFP fisk med blandet-alle med høj eksponeringsindstilling. Flow cytometric analyser af tumorceller isoleret fra fisk legeme er identiske format til figur 2. (B) NGLHej (blå) og normal god landbrugspraksislo (grøn) FACS gates. Udtryk for B (pax5, cd79a) og Thomsen (cd4) celle-specifikke gener, lckog normal god landbrugspraksis. Resultaterne er normaliseret til husholdning gener (β-actin og eef1a1l1) og vist som fold-change ± S.E. skala bar = 20 mm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi udviklede og give en protokol for at isolere B celler fra lck:eGFP transgene zebrafisk, tilføjer indeværende hen til andre D. rerio modeller med B-afstamning etiketter3,4. Noget overraskende, gik identifikation af normal god landbrugspraksislo B celler i denne linje ubemærket siden dens beskrivelse i 2004. Generelt, lck anses for T-celle-specifikke6, men nylige undersøgelser fandt uventet lck udtryk af natural killer og myeloide celler, så godt som i B-celler som vist her18,19. I samarbejde med vores opdagelse at zebrafisk B celler er normal god landbrugspraksislo, præ-B, naiv, og modne B udtrykke celler i mennesker også lave niveauer af LCK11,13.
På grund af de forskellige niveauer for normal god landbrugspraksis i B og T celler af disse fisk, kan celler af begge slægter nu isoleres fra denne linje. Selv om disse dyr har klassisk blevet brugt til at studere thymic T-lymfocytter udvikling og sporing, vise vi, at lignende undersøgelser er også muligt med B-celler. Med henblik herpå identificere vi B-celler i thymus, nyre marv og milt her, og i perifert blod og andetsteds i forudgående arbejde11.
Anerkende B-alle i rag2:hMYC; lck:eGFP fisk kræver et vågent øje, men med praksis, er ligetil. Næste, vælge, hvilken metode du bruger til at rense alle celler er kritisk. Her præsenterer vi to metoder: peritoneal vask og hele kroppen homogenisering. Peritoneal vask giver et langt lavere antal samlede celler, men en meget høj procentdel af normal god landbrugspraksis+ celler. Lille FACS tid er derfor påkrævet, minimere omkostningerne. Til downstream applikationer, hvor samlede udbytte er mindre vigtigt (f.eks. qRT-PCR), dette er mere effektivt. Alternativt, hele kroppen homogenisering resulterer i større enkelt celle opslæmninger indeholdende mange flere celler, men en lavere procentdel af celler vil være normal god landbrugspraksis+. Mere FACS tid er således forpligtet til at indsamle det samme antal NGL+ celler som med peritoneal vask, men millioner flere celler kan renses. For undersøgelser, nedstrøms, hvor høj ydelse er vigtig (f.eks., vestlige skamplet), dette kan opveje de ekstra omkostninger. Derudover for alle undersøgelser indfanger kroppens samlede homogenisering mangfoldigheden af kræftceller til stede, mere præcist repræsenterer tumor heterogenitet. Skønt ikke listet i vores protokol, er det også muligt at dissekere kun normal god landbrugspraksis+ kroppen regioner/organer fra fisk med alle til homogenisering af hakning i en petriskål, dermed faldende samlede FACS tid og omkostninger, beslægtet med peritoneal vask.
Thymic normal god landbrugspraksis udtryk i lck:eGFP fisk viste, at normal god landbrugspraksis er påviselige så tidligt som 5 dpf6. Vores undersøgelser her blev udført i voksne fisk 3 måneder i alder eller ældre, og vise, at i denne alder, B-celler er rigelige i nyre marv og milt, men T-celler er sjældne. Efterfølgende undersøgelser med fisk i forskellige aldre vil være forpligtet til at afgøre, om T-celler er mere udbredt på forskellige tidspunkter. Ligeledes på 3 måneder, T-celler er beriget i thymus, men et betydeligt antal af thymic B-celler er også til stede. Hvis disse lymfocyt befolkning varierer på forskellige alderstrin er i øjeblikket ukendt, men overordnet, thymic fluorescens svinder i lck:eGFP fisk begynder på seksuel modenhed (~ 3 måneder), så det er sandsynligt, at T-celle tal formindskes med stigende alder, og B-celler kan også. Ligeledes, når normal god landbrugspraksislo B celler kolonisere zebrafisk thymus er i øjeblikket ukendt. Ved hjælp af lck:eGFP fisk, er det nu muligt at overvåge thymic B og T-celle udvikling, tilstrømningen, efflux og den specifikke kinetik af disse begivenheder. Derudover er sådanne spørgsmål også relevante for andre anatomiske steder, hvor B-celler er placeret, f.eks nyre marv, spleen, blod og tarmen (data ikke vist).
Udover B celle udviklingsmæssige undersøgelser fundet vi for nylig B-alle i lck:eGFP; rag2:hMYC dobbelt-transgene fisk11. Transgene rag2:hMYC var kendt for at inducere T-alle10 men B-alle var gået blev ikke genkendt. På grund af den høje penetrans af denne onkogen, begge typer af alle er fremherskende i disse fisk, og mange fisk faktisk udvikle både alle typer samtidig11. Da B-alle er normal god landbrugspraksislo, mens T-alle er normal god landbrugspraksisHej, tillader varierende normal god landbrugspraksis udtryk disse to enheder at være isoleret af FACS, selv når forekommer i de samme dyr (figur 5A). Afgørende, i både normale og maligne lymfocytter viser qRT-PCRresults, at normal god landbrugspraksislo og normal god landbrugspraksisHej celler konsekvent svarer til B - og T-slægter, henholdsvis (figur 2 og figur 3).
Det uudnyttede potentiale i lck:eGFP fisk var centrale for dette arbejde, fremhæve, at mange allerede eksisterende transgene linjer sandsynligvis har nytte ud over deres formål. Vi præsenterer her, en roman protokol for at isolere B og T celler fra D. rerio med transgene lck:eGFP, åbne døren for nye testpræparat veje om normale, og ondartet B-lymfocytter. Resultaterne af disse undersøgelser vil utvivlsomt re-vitalisere hvad har allerede været en værdifuld ressource til bloddannelsen, lymphopoiesis og kræft biologi felter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer nogen interessekonflikt.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Megan Malone-Perez for zebrafisk pleje og OUHSC flow flowcytometri kerne. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Hyundai Hope på hjul, Oklahoma Center for avancement of Science og Technology (HRP-067), en NIH/NIGMS INBRE pilotprojekt award (P20 GM103447). JKF holder E.L. & Thelma Gaylord begavet stol i pædiatrisk hæmatologi-onkologi af children's Hospital Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 µm mesh | Sefar Filter technology | 7050-1220-000-13 | |
| 5 mL Polystyrene round-Bottom tube with cell-strainer cap | Falcon Corning Brand | 352235 | |
| 50 mL conical tube | VWR international | 525-0448 | |
| AZ APO 100 Fluorescent microscope | Nikon | ||
| Cytoflex | Beckman Coulter | ||
| DS-Qi1MC camara | Nikon | ||
| Ethyl 3-aminobenzoate methansesulfonate; MS-222 | Sigma | E-10521 | |
| FACSJazz | BD Biosciences | ||
| Fetal bovine Serum | Thermo Fisher | 10437028 | |
| FlowJo v10.2 | FlowJo, LLC | ||
| lck:eGFP | See Langeneu et al., 2004 | ||
| NIS Elements software | Nikon | Version 4.13 | |
| Penicilin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Pestle micro-tube homogenizers | Electron Microscopy Sciences | 64788-20 | |
| Plastic Transfer pippetes | |||
| rag2:hMYC-ER | See Gutierrez et al., 2011 | ||
| RPMI Media 1640 1x | Life Technologies | 11835-030 |
References
- Paik, E. J., Zon, L. I.
- Kasheta, M., et al. Identification and characterization of T reg-like cells in zebrafish. Journal of Experimental Medicine. 214 (12), 3519-3530 (2017).
- Liu, X., et al. Zebrafish B Cell Development without a Pre-B Cell Stage, Revealed by CD79 Fluorescence Reporter Transgenes. Journal of Immunology. 199 (5), 1706-1715 (2017).
- Page, D. M., et al. An evolutionarily conserved program of B-cell development and activation in zebrafish. Blood. 122 (8), e1-e11 (2013).
- Schorpp, M., et al. Conserved functions of Ikaros in vertebrate lymphocyte development: genetic evidence for distinct larval and adult phases of T cell development and two lineages of B cells in zebrafish. Journal of Immunology. 177 (4), 2463-2476 (2006).
- Langenau, D. M., et al. In vivo tracking of T cell development, ablation, and engraftment in transgenic zebrafish. Proceedings of National Academy of Sciences U S A. 101 (19), 7369-7374 (2004).
- Trede, N. S., Langenau, D. M., Traver, D., Look, A. T., Zon, L. I. The use of zebrafish to understand immunity. Immunity. 20 (4), 367-379 (2004).
- Frazer, J. K., et al. Heritable T-cell malignancy models established in a zebrafish phenotypic screen. Leukemia. 23 (10), 1825-1835 (2009).
- Rudner, L. A., et al. Shared acquired genomic changes in zebrafish and human T-ALL. Oncogene. 30 (41), 4289-4296 (2011).
- Gutierrez, A., et al. Pten mediates Myc oncogene dependence in a conditional zebrafish model of T cell acute lymphoblastic leukemia. Journal of Experimental Medicine. 208 (8), 1595-1603 (2011).
- Borga, C., et al. Simultaneous B and T cell acute lymphoblastic leukemias in zebrafish driven by transgenic MYC: implications for oncogenesis and lymphopoiesis. Leukemia. , (2018).
- Haferlach, T., et al. Clinical utility of microarray-based gene expression profiling in the diagnosis and subclassification of leukemia: report from the International Microarray Innovations in Leukemia Study Group. Journal of Clinical Oncology. 28 (15), 2529-2537 (2010).
- Novershtern, N., et al. Densely interconnected transcriptional circuits control cell states in human hematopoiesis. Cell. 144 (2), 296-309 (2011).
- Menke, A. L., Spitsbergen, J. M., Wolterbeek, A. P., Woutersen, R. A. Normal anatomy and histology of the adult zebrafish. Toxicology Pathology. 39 (5), 759-775 (2011).
- Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of organs from the adult zebrafish. Journal of Visualized Experiments. , (2010).
- Pruitt, M. M., Marin, W., Waarts, M. R., de Jong, J. L. O. Isolation of the Side Population in Myc-induced T-cell Acute Lymphoblastic Leukemia in Zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (37), (2017).
- Traver, D., et al. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants. Nature Immunology. 4 (12), 1238-1246 (2003).
- Carmona, S. J., et al. Single-cell transcriptome analysis of fish immune cells provides insight into the evolution of vertebrate immune cell types. Genome Research. 27 (3), 451-461 (2017).
- Tang, Q., et al. Dissecting hematopoietic and renal cell heterogeneity in adult zebrafish at single-cell resolution using RNA sequencing. Journal of Experimental Medicine. 214 (10), 2875-2887 (2017).
