Zebrafish transgenici lck:eGFP esprimono GFP altamente nei linfociti T e sono stati usati per studiare lo sviluppo delle cellule T e la leucemia linfoblastica acuta. Questa linea può essere utilizzato per Studio B cellule, che esprimono lck a livelli inferiori. Questo protocollo descrive la purificazione delle cellule di B maligne e benigne da lck:eGFP zebrafish.
Zebrafish (Danio rerio) sono un potente modello per studiare lo sviluppo del linfocita. Come mammiferi, d. rerio possiedono un sistema immunitario adattativo che include i linfociti B e T. Gli studi di zebrafish linfopoiesi sono difficili perché anticorpi che riconoscono i marcatori di superficie delle cellule di d. rerio non sono generalmente disponibili, isolamento e caratterizzazione di popolazioni linfocitarie diverse, tra cui B-stirpe di complicazione cellule. Linee transgeniche con espressione fluoroforo lineage-specifici sono spesso utilizzati per aggirare questa sfida. La linea transgenica lck:eGFP è stata utilizzata per studiare lo sviluppo delle cellule di T di d. rerio e inoltre è stata utilizzata per lo sviluppo delle cellule di T di modello e leucemia linfoblastica acuta (LAL-T). Anche se lck:eGFP pesce sono stati ampiamente usati per analizzare il T-stirpe, essi non sono stati utilizzati per studiare le cellule B. Recentemente, abbiamo scoperto che molte cellule di zebrafish B esprimono anche lck, seppur a livelli inferiori. Di conseguenza, le cellule lck:eGFP B similarmente esprimono bassi livelli di GFP. Sulla base di questa individuazione, abbiamo sviluppato un protocollo per purificare le cellule di B-stirpe da lck:eGFP zebrafish, che segnaliamo qui. Il nostro metodo viene descritto come utilizzare un sorter fluorescente-attivata delle cellule (FACS) per purificare le cellule B da lck:eGFP pesce o righe correlate, ad esempio transgenici doppio rag2:hMYC; pesce LCK:EGFP . In queste righe, cellule B, cellule B particolarmente immature, GFP espressa a livelli bassi ma rilevabili, consentendo loro di essere distinto dalle cellule T, che esprimono GFP altamente. B cellule possono essere isolate da midollo osseo, timo, milza, sangue o altri tessuti. Questo protocollo fornisce un nuovo metodo per purificare le cellule di B di d. rerio , abilitazione studi incentrati su temi come lo sviluppo delle cellule B e le malignità del linfocita B.
Zebrafish offrono potenti attributi, ad esempio manipolabilità genetica, alta fecondità, ottico traslucenza e rapido sviluppo che semplificano lo sviluppo vertebrato Studio utilizzando approcci genetici. Questi vantaggi, insieme con le funzionalità condivise di teleostei e mammiferi ematopoiesi, rendono d. rerio ideale per analisi in vivo della funzione del linfocita e linfopoiesi, dalla loro prima apparizione nelle larve durante l’età adulta. Sviluppo di sangue in zebrafish si basa su processi genetici ben conservati che vengono condivisi con i mammiferi, e questi si estendono per il sistema immunitario adattativo. Inoltre, i meccanismi molecolari che regolano lo sviluppo linfoide notevolmente sono conservate tra zebrafish e mammiferi1.
Negli ultimi 2 decenni, linee transgeniche d. rerio lignaggi di sangue specifico tale etichetta e linee mutanti carenti in queste linee cellulari sono state create2,3,4,5. Uno di questi, la linea transgenica lck:eGFP , utilizza il promotore di zebrafish del linfocita proteina tirosina chinasi (lck) a guidare la GFP espressione6. Questo gene, che è altamente espressa da precursori di LAL-T e i linfociti T maturi, permette in vivo monitoraggio dello sviluppo della cellula T timica ed ex vivo purificazione delle cellule di T-stirpe di FACS7. In precedenza, abbiamo usato questa linea in uno schermo di mutagenesi ENU avanti-genetica per identificare i mutanti di germline inclini a LAL-T e per studiare eventi genetici somatico acquisito legati a cellula T oncogenesi8,9.
Recentemente, il nostro laboratorio esteso ulteriormente l’utilità di lck:eGFP zebrafish. In transgenici doppio rag2:hMYC (MYC umano), lck:eGFP D. rerio che sono noti per sviluppare LAL-T 10, abbiamo scoperto che LAL-B si verificano anche11. A differenza di LAL-T in questo modello, che reagiscono in brillantemente dovuto l’alta espressione di GFP, B-tutti sono scarsamente-fluorescenti a causa di bassi livelli di GFP, permettendo il pesce con B-ALL per essere distinti grossolanamente da quelli con LAL-T da microscopia fluorescente. Questa espressione di GFP differenziale consente inoltre la separazione di cellule GFPlo B-tutti da GFPCiao cellule T-ALL usando FACS11. Inoltre, espressione di basso lck non è univoco per zebrafish B-ALL, come umano anche esprimere bassi livelli di B-ALL di LCK11,12. Allo stesso modo, le cellule normali di B-stirpe di d. rerio, topi e gli esseri umani esprimono anche bassi livelli di lck/LckLCK, con cellule di B acerbe che hanno la più alta espressione11,13. Su una base per cellula, le cellule di B-stirpe in linee di zebrafish o derivato di lckeGFP express 1-10% tanto GFP come linfociti T. Questi GFPlo cellule espressa caratteristica delle cellule di B mRNA come pax5, cd79b, blnk, btk, ighm, ighze altri e possa essere purificate dal midollo osseo, timo, milza o periferico 11del sangue. Di conseguenza, entrambi LAL-B e T-cellule possono essere isolato da lckeGFP zebrafish e nel caso di rag2hMYC, lckeGFP animali, anche le cellule di B – e T-ALL11.
Qui, vi presentiamo il nostro protocollo efficiente FACS-purificare B cellule benigne da lck:eGFP zebrafish e benigne o maligne cellule di B di rag2hMYC; LCK:EGFP pesce, utilizzando vari tessuti di origine. Tali cellule allo stesso modo possono essere quantificate mediante citometria a flusso senza isolamento FACS, se lo si desidera. Scoperta di espressione bassa lck – e di conseguenza bassa espressione di GFP-di B cellule apre nuove porte di possibilità sperimentali per lckeGFP zebrafish, come in vivo B cella studi evolutivi. Così, questa linea transgenica, primo luogo segnalata in 2004, ha una nuova vita come cerchiamo di utilizzarlo per raccogliere nuove intuizioni relative all’immunità adattativa zebrafish.
Abbiamo sviluppato e fornire un protocollo per isolare le cellule B da lck:eGFP zebrafish transgenici, l’aggiunta di questo ad altri modelli di d. rerio con B-stirpe etichette3,4. Abbastanza sorprendentemente, l’identificazione delle GFPlo B cellule in questa linea passò inosservato dalla relativa descrizione nel 2004. In genere, lck è considerato specifico delle cellule T6, ma recenti studi trovano …
The authors have nothing to disclose.
Vorremmo ringraziare Megan Malone-Perez per cura di zebrafish e il nucleo di cytometry di flusso OUHSC. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni da Hyundai Hope su ruote, il centro dell’Oklahoma per l’avanzamento della scienza e tecnologia (HRP-067), un premio del progetto pilota di NIH/NIGMS INBRE (P20 GM103447). JKF detiene il E.L. & Thelma Gaylord dotata di sedia in ematologia-oncologia pediatrica della Fondazione Ospedale dei bambini.
35 µm mesh | Sefar Filter technology | 7050-1220-000-13 | |
5 ml Polystyrene round-Bottom tube with cell-strainer cap | Falcon Corning Brand | 352235 | |
50 ml conical tube | VWR international | 525-0448 | |
AZ APO 100 Fluorescent microscope | Nikon | ||
Cytoflex | Beckman Coulter | ||
DS-Qi1MC camara | Nikon | ||
Ethyl 3-aminobenzoate methansesulfonate; MS-222 | Sigma | E-10521 | |
FACSJazz | BD Biosciences | ||
Fetal bovine Serum | Thermo Fisher | 10437028 | |
FlowJo v10.2 | FlowJo, LLC | ||
lck:eGFP | See Langeneu et al., 2004 | ||
NIS Elements software | Nikon | Version 4.13 | |
Penicilin -Streptomycin | Sigma | P4333 | |
Pestle micro-tube homogenizers | Electron Microscopy Sciences | 64788-20 | |
Plastic Transfer pippetes | |||
rag2:hMYC-ER | See Gutierrez et al., 2011 | ||
RPMI Media 1640 1X | Life Technologies | 11835-030 |