Summary
דג זברה מהונדס lck:eGFP אקספרס GFP מאוד לימפוציטים מסוג T, השתמשו ללמוד פיתוח תא T ו לוקמיה לימפובלסטית חריפה. הקו הזה יכול לשמש כדי מחקר B תאים, אשר אקספרס lck ברמות נמוכות. פרוטוקול זה מתאר טיהור תאי B ממאיר, שאינם ממאירים של דג זברה lck:eGFP .
Abstract
דג זברה (רזבורה rerio) הם במודל רב עוצמה ללמוד פיתוח לימפוציטים. כמו של יונקים, rerio ד בעלי מערכת חיסונית אדפטיבית הכוללת B ו- T לימפוציטים. מחקרים של דג זברה lymphopoiesis קשים בגלל נוגדנים זיהוי סמני פני שטח התא rerio ד הם בדרך כלל לא זמין, שמסבך בידוד ואפיון של אוכלוסיות שונות לימפוציט, כולל B-היוחסין תאים. קווים הטרנסגניים עם שושלת היוחסין הספציפי fluorophore ביטוי משמשים לעתים קרובות כדי לעקוף את האתגר הזה. הקו הטרנסגניים lck:eGFP שימש ללמוד פיתוח תא T rerio ד , יש גם מנוצל ועד פיתוח מודל T cell לוקמיה לימפובלסטית חריפה (T-ALL). למרות lck:eGFP דגים היה בשימוש נרחב כדי לנתח את T-שושלת היוחסין, הם לא שימשו ללמוד תאי B. לאחרונה גילינו כי הרבה תאים דג זברה B גם להביע lck, אם כי ברמות נמוכות. כתוצאה מכך, lck:eGFP B תאים לבטא גם רמות נמוכות של GFP. על סמך ממצא זה, פיתחנו פרוטוקול לטהר תאים B-השושלת lck:eGFP דג זברה, אשר אנחנו מדווחים כאן. השיטה שלנו מתאר כיצד לנצל את סדרן תא לפעיל על-פלורסנט (FACS) לטהר בתאי B lck:eGFP דגים או שורות קשורים, כגון כפול-הטרנסגניים rag2:hMYC; דגים lck:eGFP . בשורות אלו, בתאי B, במיוחד לא בוגר B תאים, אקספרס GFP ברמות נמוכות אבל לזיהוי, ולאפשר להם להיות מכובד מתאי T, המבטאות GFP מאוד. בתאי B יכול להיות מבודד מח, בלוטת התימוס, הטחול, דם או רקמות אחרות. פרוטוקול זה מספק שיטה חדשה לטהר את תאי B rerio ד , המאפשר לימודים ממוקד בנושאים כמו התפתחות תא B ו- B לימפוציטים גידולים ממאירים.
Introduction
דג זברה מציעים תכונות רב עוצמה, כגון manipulability גנטי, פוריות גבוהה, המוגבהת אופטי והתפתחות מהירה המאפשרים לימוד פיתוח חוליות שימוש בגישות גנטיות. יתרונות אלו, יחד עם התכונות המשותפות של hematopoiesis teleost, יונקים, להפוך rerio ד אידיאלי עבור ניתוחים ויוו של הפונקציה lymphopoiesis, לימפוציטים, מהמראה שלהם המוקדם בהזחלים לאורך הבגרות. פיתוח דם דג זברה מתבססת שנשמרת היטב תהליכים גנטיים משותפים עם יונקים, אלה להרחיב מערכת החיסון מסתגלת. בנוסף, מולקולרית מנגנונים המסדירים פיתוח הלימפה נשמרים להפליא בין דג זברה ויונקים1.
במהלך העשורים האחרונים 2, הטרנסגניים rerio ד קווים שושלות דם ספציפית את התווית, חסר מבחינות אלה שושלות מוטציה קווים נוצרו2,3,4,5. באחת מהן, הקו הטרנסגניים lck:eGFP , משתמשת דג זברה לימפוציט חלבון טירוזין קינאז (מזל) יזם לנהוג GFP ביטוי6. גן זה, אשר מתבטאת במיוחד על ידי T-השושלת מבשרי והן לימפוציטים T בוגרים, מאפשר ויוו מעקב אחר התפתחות הרתי תא T ו- ex-vivo טיהור תאי T-היוחסין מאת FACS7. בעבר, השתמשנו הקו הזה ב מסך מוטגנזה מכוונת ENU קדימה-גנטית כדי לזהות מוטציות germline נוטה T-כל וכדי ללמוד רכשה תחושתיים אירועים גנטיים הקשורים תא T-oncogenesis-8,-9.
לאחרונה, המעבדה שלנו עוד הרחיב את התועלת של דג זברה lck:eGFP . בכפול-הטרנסגניים rag2:hMYC (MYC אנושי), rerio lck:eGFP ד ידועים לפתח T-כל 10, גילינו B-השושלת כל להתרחש גם11. בניגוד T-כל במודל זה, אשר לזרוח בהירים עקב גבוה ביטוי GFP, B-כל הם במעומעם פלורסנט עקב רמות נמוכות GFP, ומאפשר דג עם B-כל להיות מכובד בגסות מאלה עם T-כל על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. ביטוי זה-GFP דיפרנציאלית מאפשרת גם ההפרדה של GFPהלאו B-כל התאים של GFPהיי תאי T-כל שימוש FACS11. יתר על כן, ביטוי נמוך lck אינה ייחודית דג זברה B-כל, בתור האדם B-כל רמות גם צ'ק נמוך של LCK11,12. באופן דומה, תאים נורמליים B-היוחסין של rerio ד, בעכברים ובבני אדם לבטא גם רמות נמוכות של מזל/מזל/LCK, עם תאי B לא בשלה יש11,הביטוי הגבוהה ביותר13. על בסיס לכל תא, B-שושלת התאים בשורות דג זברה או נגזרות lckeGFP אקספרס 1-10% GFP באותה מידה כמו לימפוציטים מסוג T. האלה GFPהלאו תאים מאפיין אקספרס תא B mRNAs כגון pax5, cd79b, blnk, ה"לקשור, ighm, ighzואחרים, ואני יכול להיטהר מן מח, בלוטת התימוס, טחול או ציוד היקפי דם11. לכן, שני B - ו T-שושלת התאים יכולים להיות מבודדים מן lckeGFP דג זברה, ובמקרה של rag2hMYC, lckeGFP חיות, B - ו T-כל התאים גם11.
כאן, אנחנו מציגים פרוטוקול שלנו ביעילות לטהר FACS שאינם ממאירים בתאי B lck:eGFP דג זברה, ואת תאי B שאינם ממאירים או ממאיר של rag2hMYC; lck:eGFP דג, באמצעות רקמות מקור שונים. באופן דומה ניתן לכמת תאים כאלה על ידי cytometry זרימה ללא בידוד FACS, אם רצונך בכך. גילוי של ביטוי נמוך lck -כתוצאה מכך, נמוך ביטוי GFP-מאת B תאים פותח דלתות חדשות של אפשרויות ניסיוני lckeGFP דג זברה, כגון vivo ב B תא מחקרים התפתחותיים. לפיכך, הקו הזה מהונדס, דווח לראשונה בשנת 2004, יש חיים חדשים אנו שואפים לנצל את זה כדי ללקט תובנות טריים בדבר חסינות מסתגלת דג זברה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
בכל ההליכים הכרוכים דג זברה אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) במרכז למדעי הבריאות באוניברסיטה של אוקלהומה.
1. בידוד שאינם ממאירים B ו- T לימפוציטים מ הטרנסגניים lck:eGFP דגים
- עזים ומתנגד הדג באמצעות tricaine 0.02% (MS-222) במים מערכת דגים.
- בחן דגים בן 2-6 חודש עבור פלורסנט thymi, אשר ממוקמים על ההיבט dorsomedial של חלל branchial של דג זברה, אחרים teleosts14. השתמש במיקרוסקופ epifluorescence (470/40 עירור גל ו מסנן פליטה 525/50) כדי לזהות GFP.
- להכין מראש 50 מ של עיקור מסנן 1 x רוזוול פארק אנדרטת מכון בינוני (RPMI) המכיל 1% עוברית שור סרום ו 1% פניצילין-סטרפטומיצין (מיון מדיה). ניתן לאחסן מדיה המיון שאינה בשימוש ב 4 ° C עד 2 חודשים.
- המתת חסד הדג על-ידי הצבתו בתוך המכיל 0.2% Tricaine במשך כ- 5 דקות, ואחריו טבילה אמבט קרח. לאשר מוות על ידי הפסקת תנועת opercular (גיל).
- מניחים את הדג לאללה בצלחת פטרי ומנתחים איברי הלימפה של עניין, שימוש במיקרוסקופ פלואורסצנטי לנתח את GFP+ thymi14, ואת הגדרות מיקרוסקופיית שדה בהיר לנתח את הכליה מח וה טחול15. התוצאות המובאות כאן התקבלו באמצעות דגים בן חודש 3. לימפוציט הפרופורציות ואת מספרים מוחלטים משתנים בהתאם לגיל גנוטיפ (ראה דיון לפרטים נוספים).
- מקם כל איבר ואיבר ביתור צינור 1.5 mL המכיל 500 µL של קור מיון מדיה.
- Homogenize הרקמה על קרח באמצעות מהמגן מיקרו-שפופרת של המרוסקים.
- עוברים רקמות הומוגני מסנן רשת מיקרומטר 35 ליצירת השעיה תא בודד. לשמור את התאים על הקרח עד הניתוח.
2. בידוד לימפוציטים ממאירים מ כפול-הטרנסגניים rag2:hMYC; lck:eGFP דג זברה
-
החל בגיל 2-4 חודשים, ברמה המיקרוסקופית מסך rag2:hMYC; lck:eGFP דג אחר דפוסים GFP חריג.
הערה: B תאים הם GFPהלאו ברקע lck:eGFP , אז B-כל דורש תרגול להכיר; T-כל ברור, כי תאי T הם GFPשלום. כתוצאה מכך, rag2:hMYC, קו כפול-הטרנסגניים lck:eGFP יש שני פנוטיפים: במאור פנים פלורסנט T-כל, אשר בדרך כלל נובעים התימוס להרחיב לתוך הגוף ועל במעומעם פלורסנט B-כל.- באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, מסך הדג באמצעות הגדרות "חשיפה נמוכה" (200 ms, 2.4 x רווח) כדי לזהות כל T בהיר (איור 1 א') ואת "חשיפה גבוהה" (1.5 s, 3.4 x רווח) כדי לזהות עמום B-כל (איור 1 א'). פקדים WT ודגים טרום לוקמיה יש GFP לשפות אחרות רק ב בלוטת התימוס (איור 1B).
- עזים ומתנגד ולבחון את הדגים כמתואר בצעדים 1.1-1.2.
- לסווג את הדגים בהתבסס על היקף GFP פלורסצנטיות, באמצעות מערכת פשוטה קטגוריה 3:
הערה: רמה 1: זריחה מופיע גידול הרתי עם רק התפשטות מקומית מוגבלת.
רמה 2: זריחה מופיע מעבר התימוס, מעורבים < 50% של הגוף.
רמה 3: זריחה מרחיב מעבר ל- 50% של הגוף. - הפרד את הדג עם כל מאלה ללא סרטן. לפקח על הדג טרום לוקמיה (קרי, דגים ללא גידולים GFP+ ) פעם אחת מדי חודש להתפתחותם של כל חדש. ~ 9 חודשים, כל rag2:hMYC, דג lck:eGFP לפתח T-כל, B-כל, או שניהם.
- עבור T - או B-כל תא בידוד, בחר רמה 3 דגים (כולם מעורבים > 50% של הגוף), אשר תשואה יותר מ 2 x 106 כל התאים, ועוד רבים בדרך כלל.
- המתת חסד את הדגים כמו שלב 1.4.
הערה: קיימות שתי שיטות לקבלת כל התאים: כל גוף המגון ואת טכניקת שטיפת הצפק16. השיטות נבדלים המספר המוחלט של התאים שנאספו לצורך מיון, לפיכך, כמויות FACS הזמן הנדרש ועלות (ראה דיון לפרטים נוספים). - עבור אחת מהשיטות, תחילה מניחים את הדג לאללה בצלחת פטרי, באמצעות סכין גילוח, להסיר את הראש כולל באזור הרתי. זה ניתן לעבד בנפרד, אם רצונך בכך, או המשמש עבור צביעת היסטולוגית.
-
שיטת שטיפת הצפק
- באמצעות פיפטה P1000, לשטוף את חלל הצפק דגים עם 500 µL של קור מיון מדיה, איסוף את התאים ואת התקשורת שפופרת 5 מ.
- באמצעות טיפ פיפטה טריים, להזריק µL 200 – 300 נוספים של אמצעי המיון קר לתוך חלל הגוף. לאחר מכן, משתמש קצה פיפטה, להחיל לחץ עדין על הגוף דגים כדי הבלטת התאים מתוך חלל הגוף. לאסוף מדיה זו ולהוסיף שפופרת 5 מ.
- חזור על שלב 2.8.2 2 – 3 פעמים. שמור את התאים שנאספו מיון מדיה על קרח.
- לסנן את המתלים תא למרות רשת מיקרומטר 35 לסנן לפני cytometry זרימה/FACS ולשמור את התאים על הקרח עד הניתוח.
-
המגון כל הגוף
- לאחר הסרת ראש דג, למקם את הגוף צינור 1.5 mL המכיל 200 µL של מיון מדיה.
- Homogenize על הגוף באמצעות מהמגן מיקרו-שפופרת של המרוסקים.
- להוסיף על µL 300 נוספים של קור מיון מדיה. לסנן את המתלים תא למרות מסנן רשת 35 מיקרומטר. הוסף מדיה מיון לפי הצורך כדי לשטוף את כל התאים דרך המסנן, עד רק רקמות פסולת נשאר על המסנן. לשמור את התאים על הקרח עד הניתוח.
3. Cytometric ניתוח של לימפוציטים B נורמלית או ממאיר
- ניתוח cytometric תזרים קבוע ו/או FACS פרמטרים על פי המדריך של היצרן.
-
רוכשים מספר אירועים בתחילה לאפיין את הדגימה הרצוי. לנתח את עונה 1 פרק 104 כדי 5 x 10 אירועים4 לפני מיון לקביעת השערים ספציפי עבור והשלבים המיון.
- לקבוע שערים: הגדרת שערים תא לימפוציט, קדמון באמצעות פיזור קדמי (FSC) ופרמטרים פיזור (האס) בצד, למעט פסולת הסלולר (איור 2 א-ג)17. FSC ואת האס יתאימו תא גודל/קוטר, צפיפות, בהתאמה.
הערה: GFP–, GFPהלאוותאים GFPשלום שונים 10 ל- 100-קיפול מבחינת עוצמת קרינה פלואורסצנטית שלהם GFP, עושה הפרדה בין אוכלוסיות אלה פשוטה (איורים 2-5). אפליה חי-מת יכול להידרש בשלב זה באמצעות יוד propidium (PI) או 7-aminoactinomycin מכתים הכדאיות D (7-AAAD). ניסויים קודמים עם PI בדרך כלל להדגים > 95% הכדאיות של GFP+ תאים לאחר FACS. - אל תכלול את התא doublets, על פי הפרמטרים של המכונה FACS בשימוש.
- בתוך השערים הלימפה או קודמן, לקבוע את המספר ואת אחוז תאים GFP+ .
- לקבוע שערים: הגדרת שערים תא לימפוציט, קדמון באמצעות פיזור קדמי (FSC) ופרמטרים פיזור (האס) בצד, למעט פסולת הסלולר (איור 2 א-ג)17. FSC ואת האס יתאימו תא גודל/קוטר, צפיפות, בהתאמה.
- שימוש phycoerythrin (PE) ועוצמות GFP, להגדיר שער עבור GFP– לעומת GFPהלאו לעומת GFPשלום תאים.
הערה: בתאי B התערוכה פלורסצנטיות GFP עמום ולהראות בתאי T GFP בהיר בקווים lck:eGFP . איברי הלימפה או דגימות הגידול רבים מכילים שתי האוכלוסיות GFP+ . B-השושלת תאים/B-כל ה-GFPהלאו הינם השושלת T תאים/T-כל הם GFPשלום. הגדרת שערים כדי להבחין בין GFP–, GFPהלאוותאים GFPשלום , ולאסוף אוכלוסיות אלה בנפרד (איור 2A-C, איור 3 א-C, איור 4A ו- איור 5A). - למיין כל האוכלוסייה תא שונים 15 מ"ל צינורות פוליפרופילן המכיל 2 מ"ל של מיון מדיה, או ישירות לתוך צינורות שונים mL 1.5 המכיל מאגר המתאים עבור ניתוחים נוספים (למשל, ה-RNA, דנ א או חלבון החילוץ, מאפשר-השתלת, וכו '.).
- לשמור תאים מטוהרת על הקרח לפני ניתוח נוסף.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
השתמשנו cytometry זרימה כדי לנתח, FACS לבודד GFPהלאו ותאים GFPשלום התימוס, מח הכליות, הטחול של דג זברה מהונדס lck:eGFP . ניתוח של דגים בת 3 חודשים גילה שהתימוס הכיל בעיקר לימפוציטים GFP+ . GFP+ תאים במידה רבה הוגבלו לשער הלימפה שתואר קודם לכן על-ידי Traver et al.17. שתי האוכלוסיות GFP+ ברורים GFPהלאו, GFPשלום,יכול להיות שנצפו התימוס. GFPשלום לימפוציטים ייצג את אחוז גבוה יותר, כ 60%, בעוד GFPהלאו התאים היו פחות בשפע, המייצג ~ 40% סה כ הרתי לימפוציטים (טבלה 1). בניגוד יונקים, דגים מח hematopoietic הוא מקומי בתוך הכליה, ולא בתוך העצם. אנחנו נקבע בתאי B המתגוררים כליות מח האקספרס נמוכה, גם רמות GFP (איור 2B ו- 3B איור). GFPהלאו תאים במח היו בשפע, בעוד GFPשלום התאים היו נדירים (איור 2B ו- 3B איור)), המציין כי רק אחוז קטן של לימפוציטים מסוג T נכחו במח בגיל 3 חודשים של גיל. דוגמאות הטחול גם הראתה אחוזים גבוהים של GFPהלאו מאשר GFPשלום תאים (2C איור , איור 3C). ניתחנו גם לימפוציטים שאינם ממאירים התימוס, מח, הטחול של דג זברה מהונדס-כפול lck:eGFP; rag2:hMYC , אשר נוטים שניהם B - ו T-כל11. דג זה היה עדיין לא מפותח כל תוצאות התימוס, מח, הטחול היו דומים יחיד-הטרנסגניים lck:eGFP דגים. עם זאת, היו המספרים של לימפוציטים לכל איבר גדל (איור 3), ככל הנראה מונחה-MYC הרחבה של אוכלוסיות B ו- T cell ילדותי איפה האמרגן rag2 פעילה.
ניתחנו גם דגים זוגית-הטרנסגניים עם B - ו/או T-כל זה פיתחו פלורסנט סרטן בשישה חודשים. כצפוי, B-כל דג עם סרטן במעומעם פלורסנט הכילה בעיקר GFPהלאו תאים (איור 4A). לעומת זאת, במאור פנים פלורסנט דגים יכול הנמל T-הכל מבודד או מעורב אוכלוסיות של GFPהלאו B-כל והן GFPשלום T-כל התאים (איור 5). דוגמה של מעורבות כל, אשר מכיל ברורים B ו- T-הכל -, מוצגים כאן (איור 5). כדי לאשר את זהותם של GFPהלאו ותאים GFPשלום כמו B - ו T-שושלת היוחסין, בהתאמה, ניתחנו את התמלילים B ו- T-תא-ספציפי על-ידי PCR כמותי בזמן אמת (לרביעיית-PCR). התוצאות שלנו להראות GFPהלאו תאים אקספרס רמות גבוהות יותר של הפרוטוקולים תא B ולבטא GFPשלום תאים רמות גבוהות יותר של תא T גנים (איור דו-ממדי, דמותתלת-ממד, איור4B ו איור 5B). יתר על כן, ביטוי lck GFP ב GFPהלאו כל שיתאימו פלורסצנטיות GFP עמום ויוו של B-כל (איור דו-ממדי, דמותתלת-ממד, איור4B , איור5B; לרביעיית-PCR תחל ותנאים רצפים שתואר קודם לכן על-ידי Borga et al.) 11.
איור 1: דפוסים ברורים פלורסצנטיות בדגים הטרנסגניים lck:eGFP . תמונות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (A) של דגים rag2:hMYC; lck:eGFP עם במאור פנים פלורסנט T-כל (משמאל) או במעומעם פלורסנט B-כל (מימין). T-כל הוא גלוי עם הגדרות חשיפה נמוכה; B-כל שאפשר לראות רק באמצעות חשיפות גבוהה. הגדרות חשיפה גבוהה (B) מראים קרינה פלואורסצנטית הרתי חלש (מעגלים צהובים) פראי-סוג lck:eGFP דגים (משמאל), rag2:hMYC; lck:eGFP דגים כפול-הטרנסגניים ללא כל (מימין). גודל ברים = 20 מ מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: לימפוציט לאוכלוסייה lck:eGFP דג זברה. להראות תמונות בחלק העליון של WT בן חודש 3, lck:eGFP דג עם הגדרות חשיפה גבוהה או ממוחשבת (כדי להקל על ויזואליזציה). גודל ברים = 20 מ מ. זרימה cytometric ניתוחים של בלוטת התימוס (A), מח (B), וה טחול (C). לוחות שמאלה מראים FSC (ציר x) האס (ציר y), עם שחור אליפסות המציין לימפוציט שערים. לוחות האמצעי מתארים מבוסס על-ידי קרינה פלואורסצנטית gating עם GFP (ציר x) ו- PE (ציר y). GFPשלום (מלבן כחול), ה-GFPהלאו (מלבן ירוק) ואוכלוסיות GFP– (אליפסות שחור) מוצגים. לוחות נכון להציג היסטוגרמות של GFPשלום ותאים GFPהלאו . קווים מקווקווים מציינים קריטריונים המגביל פאנלים האמצעי. Thymi lck:eGFP (ד) WT מיינת לשם GFPשלום (כחול) ואני GFPהלאו (ירוק). ביטוי של גנים תא B (pax5), גנים ספציפיים תא T (cd4))מזל , GFP. התוצאות הן מנורמל כדי ניקיון הגנים (β-אקטין ו eef1a1l1) מוצגים כמו קיפול-שינוי ± שגיאה סטנדרטית (חווה). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: אוכלוסיות לימפוציט בדג זברה טרום לוקמיה rag2:hMYC; lck:eGFP . הצג תמונות בחלק העליון של 3-חודש - דגישן rag2:hMYC; lck:eGFP עם חשיפות גבוהה ו משופרת המחשב. סרגל קנה מידה = 20 מ מ. לוחות של חלקי A-D מתוארים בפורמט זהה באיור 2. (D) הביטוי של pax5, cd4, lck GFP ב FACS מטוהר הרתי GFPהלאו (ירוק) GFPשלום (כחול) תא אוכלוסיות של דגים lck:eGFP . לרביעיית-PCR תוצאות מוצגות כפי קיפול-שינוי ± S.E. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: ניתוח של B-כל הדגים הטרנסגניים rag2:hMYC; lck:eGFP . (א) העליון: דג בן 6 חודשים rag2:hMYC; lck:eGFP עם B-כל באמצעות חשיפה גבוהה הגדרה. ניתוחים cytometric זרימה של תאים סרטניים מבודד מהגוף דגים הם בפורמט זהה באיור 2. (B) ביטוי גנים ב GFP B-כלהלאו תאים (שער ירוק באיור 4A), rag2:hMYC; lck:eGFP GFPשלום thymocytes (כחול שער ב איור 3A), ותאי T-כל GFPשלום (שער כחול ב איור 5A ). ביטוי של B (pax5, cd79a), גנים ספציפיים תא T (cd4), lck GFP. התוצאות הן מנורמל כדי ניקיון הגנים (β-אקטין ו eef1a1l1) מוצגים כמו קיפול-שינוי ± S.E. סולם בר = 20 מ מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5: ניתוח של מעורבות כל rag2:hMYC; lck:eGFP דגים הטרנסגניים. (א) העליון: 6 דגים בן חודש rag2:hMYC; lck:eGFP עם מעורבות-כל באמצעות חשיפה גבוהה הגדרה. ניתוחים cytometric זרימה של תאים סרטניים מבודד מהגוף דגים הם בפורמט זהה באיור 2. (B) GFPשלום (כחול) ושערים GFPהלאו (ירוק) FACS. ביטוי של B (pax5, cd79a), גנים ספציפיים תא T (cd4), lck GFP. התוצאות הן מנורמל כדי ניקיון הגנים (β-אקטין ו eef1a1l1) מוצגים כמו קיפול-שינוי ± S.E. סולם בר = 20 מ מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פיתח ואנו מספקים פרוטוקול כדי לבודד תאים B lck:eGFP דג זברה מהונדס, הוספת זה דגמים אחרים rerio ד עם B-השושלת תוויות3,4. באופן מפתיע למדי, הזיהוי של ה-GFPהלאו B תאים בשורה זו הלכה מעיניהם מאז התיאור שלו בשנת 2004. באופן כללי, lck נחשבת תא T ספציפי6, אך מחקרים אחרונים מצאו ביטוי בלתי צפוי lck על ידי הרוצח הטבעי, מיאלואידית תאים, כמו גם כמו בתאי B כמוצג כאן18,19. מסכים עם התגלית שלנו כי דג זברה B תאים GFPהלאו, pre-B, תמים, בוגר B תאים בבני אדם לבטא גם רמות נמוכות של LCK11,13.
עקב רמות GFP שונות בתאים B ו- T של דגים אלה, תאים של שתי שושלות עכשיו ניתן לבודד מהקו הזה. למרות בעלי חיים אלה שימשו בסגנון קלאסי ללמוד פיתוח לימפוציט T הרתי ומעקב, נדגים כי מחקרים דומים גם אפשריות עם תאי B. לשם כך, אנו מזהים B תאים התימוס, מח כליות, טחול, ו דם היקפיים ובמקומות עבודה מוקדמת11.
זיהוי B-כל ב rag2:hMYC; lck:eGFP דגים דורש עין חדה, אבל עם תרגול, היא פשוטה. לאחר מכן, בחירת באיזו שיטה להשתמש לטהר את כל התאים הוא קריטי. כאן, אנו מציגים שתי שיטות: שטיפת הצפק, המגון כל הגוף. כביסה פריטוניאלית התשואות מספר נמוך יותר של תאים הכולל, אבל אחוז גבוה מאוד של תאים GFP+ . כתוצאה מכך, מעט זמן FACS נדרש, מזעור העלות. עבור יישומים במורד הזרם, שבו התשואה הכוללת פחות חשוב (למשל, לרביעיית-PCR), כך יעיל יותר. לחלופין, כל הגוף המגון תוצאות ב השעיות תא בודד גדול המכיל הרבה יותר תאים, אך אחוז נמוך יותר של תאים יהיו GFP+. לפיכך, יותר FACS זמן נדרש כדי לאסוף את אותו מספר של תאים GFP+ עם כביסה הצפק, אבל מיליונים יותר תאים יכול להיטהר. ללימודים במורד הזרם, שבו חשוב תשואה גבוהה (למשל, תספיג), זה עשוי לקזז את העלות הנוספת. בנוסף, ללימודים כל, הגוף הכולל המגון לוכדת המגוון של תאים סרטניים הנוכחי, יותר מדויק המייצג הגידול הטרוגניות. אמנם אינו רשום בפרוטוקול שלנו, זה גם ריאלי לנתח רק GFP+ הגוף אזורים/איברים של דגים עם כל המגון על-ידי הא בצלחת פטרי, ובכך להקטין FACS זמן ועלות הכולל, דומה כביסה הצפק.
GFP הרתי, ביטוי דגים lck:eGFP הראו כי ה-GFP הוא לזיהוי מוקדם ככל 5 dpf6. המחקרים שלנו כאן בוצעו בדגים הבוגרים 3 חודשים ומעלה, ולהראות כי בגיל הזה, בתאי B הם בשפע מח כליות וטחול, אבל תאי T הם נדירים. מחקרים מאוחרים יותר עם דגים בגילאים שונים יידרש כדי לקבוע אם תאי T נפוץ יותר בנקודות זמן שונות. באופן דומה, 3 חודשים, תאי T הם מועשרים התימוס, אבל מספר ניכר של תאים B הרתי נוכחות גם הן. אם אוכלוסיות לימפוציטים אלה משתנים בגילאים שונים הוא כרגע לא ידוע, אך קרינה פלואורסצנטית. באופן כללי, הרתי נמוג בדגים lck:eGFP שמתחילים בבגרות מינית (~ 3 חודשים), אז סביר להניח כי המספרים תא T לצמצם עם הגיל, עשויים תאים B . גם. באופן דומה, כאשר לישוב GFPהלאו B תאים התימוס דג זברה היא כרגע לא ידוע. שימוש lck:eGFP דגים, עכשיו זה אפשרי לעקוב אחר הרתי B ו- T cell, זרם, בזרימת ופיתוח של קינטיקה ספציפי של אירועים אלה. בנוסף, שאלות כאלה הם גם רלוונטית לאתרים אחרים אנטומיים שבו שוכנות בתאי B, כגון מח כליות, טחול, דם המעי (נתונים לא מוצג).
מלבד תא B מחקרים התפתחותיים, לאחרונה מצאנו B-כל lck:eGFP; rag2:hMYC דגים זוגית-הטרנסגניים11. הטרנסגניים rag2:hMYC היה ידוע לזירוז T-כל10 אך B-כל הלך לא מזוהה. עקב penetrance גבוהה של אונקוגן זה, שני סוגי כל נפוצים בדגים אלה, ולפתח דגים רבים למעשה שניהם כל סוגי בו-זמנית11. מאז B-כל ה-GFPהלאו, בעוד T-כל הם GFPשלום, משתנה GFP ביטוי מאפשרת שתי המהויות האלה להיות מבודדת על ידי FACS, גם כאשר המתרחשים אותה חיה (איור 5A). ויותר חשוב, לימפוציטים נורמלית והן ממאירים, לרביעיית-PCRresults מדגימים כי GFPהלאו ותאים GFPשלום בעקביות מתאימות B - ו T-שושלות, בהתאמה (איור 2 , איור 3).
פוטנציאל לא ממומש של דגים lck:eGFP היה מרכזי כדי שזה יעבוד, הדגשת העובדה הקיימת מראש הטרנסגניים קווים רבים סביר השירות מעבר לייעודו שלהם. כאן, אנו מציגים פרוטוקול הרומן לבודד תאים B ו- T rerio ד עם הטרנסגניים lck:eGFP, פותח את הדלת כדי דרכים חדשות לניסויים קליניים בנוגע לימפוציטים B נורמלית וממאירים. התוצאות של מחקרים כאלה ללא ספק לוקס כבר מה משאב יקר-ערך hematopoiesis, lymphopoiesis וסרטן ביולוגיה שדות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים ללא ניגוד אינטרסים.
Acknowledgments
ברצוננו להודות מייגן מאלון-פרז לטיפול דג זברה, OUHSC הליבה cytometry זרימה. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים יונדאי תקווה על גלגלים, אוקלהומה המרכז לקידום של המדע והטכנולוגיה (HRP-067), פרס הפרויקט טייס NIH/NIGMS INBRE (P20 GM103447). JKF מחזיק את תיאורטית יבשה & תלמה גיילורד הקתדרה של ילדים המטולוגיה-אונקולוגית לילדים החולים קרן.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 µm mesh | Sefar Filter technology | 7050-1220-000-13 | |
| 5 mL Polystyrene round-Bottom tube with cell-strainer cap | Falcon Corning Brand | 352235 | |
| 50 mL conical tube | VWR international | 525-0448 | |
| AZ APO 100 Fluorescent microscope | Nikon | ||
| Cytoflex | Beckman Coulter | ||
| DS-Qi1MC camara | Nikon | ||
| Ethyl 3-aminobenzoate methansesulfonate; MS-222 | Sigma | E-10521 | |
| FACSJazz | BD Biosciences | ||
| Fetal bovine Serum | Thermo Fisher | 10437028 | |
| FlowJo v10.2 | FlowJo, LLC | ||
| lck:eGFP | See Langeneu et al., 2004 | ||
| NIS Elements software | Nikon | Version 4.13 | |
| Penicilin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Pestle micro-tube homogenizers | Electron Microscopy Sciences | 64788-20 | |
| Plastic Transfer pippetes | |||
| rag2:hMYC-ER | See Gutierrez et al., 2011 | ||
| RPMI Media 1640 1x | Life Technologies | 11835-030 |
References
- Paik, E. J., Zon, L. I.
- Kasheta, M., et al. Identification and characterization of T reg-like cells in zebrafish. Journal of Experimental Medicine. 214 (12), 3519-3530 (2017).
- Liu, X., et al. Zebrafish B Cell Development without a Pre-B Cell Stage, Revealed by CD79 Fluorescence Reporter Transgenes. Journal of Immunology. 199 (5), 1706-1715 (2017).
- Page, D. M., et al. An evolutionarily conserved program of B-cell development and activation in zebrafish. Blood. 122 (8), e1-e11 (2013).
- Schorpp, M., et al. Conserved functions of Ikaros in vertebrate lymphocyte development: genetic evidence for distinct larval and adult phases of T cell development and two lineages of B cells in zebrafish. Journal of Immunology. 177 (4), 2463-2476 (2006).
- Langenau, D. M., et al. In vivo tracking of T cell development, ablation, and engraftment in transgenic zebrafish. Proceedings of National Academy of Sciences U S A. 101 (19), 7369-7374 (2004).
- Trede, N. S., Langenau, D. M., Traver, D., Look, A. T., Zon, L. I. The use of zebrafish to understand immunity. Immunity. 20 (4), 367-379 (2004).
- Frazer, J. K., et al. Heritable T-cell malignancy models established in a zebrafish phenotypic screen. Leukemia. 23 (10), 1825-1835 (2009).
- Rudner, L. A., et al. Shared acquired genomic changes in zebrafish and human T-ALL. Oncogene. 30 (41), 4289-4296 (2011).
- Gutierrez, A., et al. Pten mediates Myc oncogene dependence in a conditional zebrafish model of T cell acute lymphoblastic leukemia. Journal of Experimental Medicine. 208 (8), 1595-1603 (2011).
- Borga, C., et al. Simultaneous B and T cell acute lymphoblastic leukemias in zebrafish driven by transgenic MYC: implications for oncogenesis and lymphopoiesis. Leukemia. , (2018).
- Haferlach, T., et al. Clinical utility of microarray-based gene expression profiling in the diagnosis and subclassification of leukemia: report from the International Microarray Innovations in Leukemia Study Group. Journal of Clinical Oncology. 28 (15), 2529-2537 (2010).
- Novershtern, N., et al. Densely interconnected transcriptional circuits control cell states in human hematopoiesis. Cell. 144 (2), 296-309 (2011).
- Menke, A. L., Spitsbergen, J. M., Wolterbeek, A. P., Woutersen, R. A. Normal anatomy and histology of the adult zebrafish. Toxicology Pathology. 39 (5), 759-775 (2011).
- Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of organs from the adult zebrafish. Journal of Visualized Experiments. , (2010).
- Pruitt, M. M., Marin, W., Waarts, M. R., de Jong, J. L. O. Isolation of the Side Population in Myc-induced T-cell Acute Lymphoblastic Leukemia in Zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (37), (2017).
- Traver, D., et al. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants. Nature Immunology. 4 (12), 1238-1246 (2003).
- Carmona, S. J., et al. Single-cell transcriptome analysis of fish immune cells provides insight into the evolution of vertebrate immune cell types. Genome Research. 27 (3), 451-461 (2017).
- Tang, Q., et al. Dissecting hematopoietic and renal cell heterogeneity in adult zebrafish at single-cell resolution using RNA sequencing. Journal of Experimental Medicine. 214 (10), 2875-2887 (2017).
