Summary
Vi præsenterer her, en protokol for at vurdere den mærkning ensartethed for hvert protein arter i et komplekst protein prøve på enkelt-molekyle niveau.
Abstract
Celle proteomes er ofte karakteriseret ved hjælp af elektroforese assays, hvor alle arter af proteiner i cellerne er ikke specielt mærket med et fluorescerende farvestof og er spottet af en fotodetektor efter deres adskillelse. Enkelt molekyle fluorescens imaging kan give ultrasensitive protein detection med sin evne til at visualisere individuelle fluorescerende molekyler. Anvendelsen af denne kraftfulde billedmetoden til elektroforese assays hæmmes imidlertid af manglen på måder at karakterisere homogeniteten af fluorescerende mærkning af hvert protein arter på tværs af proteomet. Her udviklede vi en metode til at vurdere den mærkning homogenitet på tværs af proteomet baseret på et enkelt molekyle fluorescens imaging assay. I vores måling ved hjælp af en HeLa cell sample, andelen af proteiner markeret med mindst ét farvestof, som vi kalder 'mærkning belægning' (LO), var fast besluttet på at vifte fra 50% til 90%, støtte det høje potentiale af anvendelsen af enkelt molekyle imaging til følsom og præcis proteomet analyse.
Introduction
Proteom analyse, som har til formål at kvantificere hele sættet af proteinmolekyler udtrykt i cellen, er en værdifuld fremgangsmåde i nuværende biologiske og medicinske undersøgelser. Denne analyse bygger ofte på massespektrometri, som identificerer protein arter baseret på spektre genereret gennem protein ionisering1,2,3. En alternativ metode til proteomet analyse er elektroforese, herunder polyacrylamid gelelektroforese (side), kapillær elektroforese og todimensionale (2D) gelelektroforese. Denne metode bygger på ikke-specifikke fluorescerende mærkning af alle proteinmolekyler i de analyserede celler, efterfulgt af elektroforetisk separation og påvisningen og kvantificeringen af hvert protein arter. For at opnå kræves ikke-specifik protein mærkning, er én strategi at bruge fluorescerende farvestoffer, der kan bindes til proteiner via elektrostatiske og hydrofobe interaktioner, såsom Coomassie blå og Sypro-Ruby4,5,6 . En alternativ metode er at bruge kovalente mærkning med farvestoffer, der indeholder N-hydroxysuccinimide (NHS) ester eller maleimide, som kan kovalent binder sig til proteiner gennem fælles rester som primære aminer og dithioler, henholdsvis7, 8.
I mellemtiden, fluorescens påvisning følsomhed er ideel til at analysere lav-overflod proteiner og det lille antal celler. Enkelt molekyle fluorescens imaging er en af de mest følsomme metoder, der tillader detektering af individuelle fluorescerende farvestoffer og mærket proteiner i in vitro og in vivo9,10,11,12, 13,14,15. Anvendelsen af denne billedmetoden til elektroforese-baserede proteomet analyse forventes at aktivere meget følsomme og kvantitative analyser af tælle enkelte fluorescently mærket proteiner. Men det er fortsat uklart, om mærkning med fluorescerende farvestoffer er homogene nok på tværs af alle proteinmolekyler, og hvordan denne homogenitet påvirkes af forskellige protein arter (figur 1). Simpel bulk løsning målinger kan bruges til at opnå en kindtand forholdet mellem fluorescerende farvestoffer til proteiner kaldet 'kobling effektivitet'8 eller 'mærkning effektivitet', men denne egenskab indeholder ikke oplysninger om homogeniteten af mærkning blandt proteinmolekyler.
Her beskriver vi protokol for en analyse at undersøge den mærkning ensartethed for alle arter, protein i cellen (figur 2)16. De to vigtigste skridt i denne analyse er protein oprensning og billedbehandling. I det første trin, alle proteiner i cellerne navngives fluorescently og biotinylated, derefter udvundet separat ved hjælp af gelelektroforese efterfulgt af electroelution. I det andet trin evalueres fluorescens egenskaberne for individuelle proteinmolekyler i de ekstraherede prøver baseret på enkelt molekyle billeddannelse. Fra disse data, parametre vigtigt for tælle analyse, som procentdelen af proteiner markeret med en mindst en farve, som vi kalder mærkning belægning (LO)16, og det gennemsnitlige antal fluorescerende farvestoffer bundet til en enkelt protein molekyle (n̄ farvestof), kan karakteriseres. I protokollen, en optimeret procedure for mærkning HeLa celler proteomet med NHS ester-baserede Cyanine 3 (Cy3) farvestof er præsenteret som et eksempel, og kan ændres med andre mærkning procedurer i overensstemmelse med ønskede forskningsmål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. celle forberedelse
- Dyrke HeLa celler i en 10 cm parabol ved 37 ° C under 5% CO2 i Dulbecco ændrede Eagles medie som indeholder 10% føtal bovint serum.
- Indsamle eksponentielt voksende celler, når de har nået 70% confluency, efter ATCC instruktioner17.
- Skyl celler med 5 mL af 1 x fosfatbufferet saltopløsning (PBS) (pH 7,4). Fjerne PBS.
- Der tilsættes 1 mL af 0,1% trypsin-ethylendiamintetra syre (EDTA). Inkuber 5 min ved 37 ° C.
- Overvåge udviklingen af celle dissociation ved mikroskopi.
- Når celler bliver runde og er løsrevet fra fadet, tilsættes 4 mL af vækstmediet, og bryde celle bymæssigt område af pipettering.
- Tæl antallet af celler ved hjælp af en celle counter.
- Der centrifugeres ved 150 x g i 10 min i et centrifugeglas. Fjern mediet og resuspenderes celle med 5 mL af 1 x PBS (pH 7,4).
- Gentag trin 1.2.6. Resuspend celler i 1 x PBS (pH 7,4) til en slutkoncentration på 106 celler/mL ved hjælp af tælle antallet i trin 1.2.5.
Bemærk: Cellesuspension kan være aliquoted og opbevares ved-80 ° C i flere måneder. Gentage en fryse/tø cyklus bør undgås.
2. celle lysis og fluorescerende mærkning
- Gøre 10 mL af lysing buffer (0,1 M Borat, 1% natriumsulfat dodecylbenzensulfonsyremethylester (SDS) og 1% Tween 20). Justere pH 12 ved hjælp af 2 M NaOH.
Forsigtig: Koncentreret NaOH er ætsende. Bære egnede handsker og briller, når du forbereder denne løsning.
Bemærk: Lysing buffer kan opbevares i op til en uge ved stuetemperatur. - Mix 100 μL lysing buffer med 1 μL af 1 M dithiothreitol (DTT) og 4 μL af 50% 3-[(3-cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propanesulfonate (CHAPS).
- Mix 1 μL af cellekultur (cirka 1.000 celler) med den blandede lysing buffer fra trin 2.2. Homogeniseres løsningen af langsomt pipettering for at undgå boblerne. Inkuber i mørke ved stuetemperatur i 5 min. med blid agitation. Re homogeniseres løsningen af pipettering langsomt.
- Tilføj 1 μL 2 μg/mL Cy3 NHS-ester farvestof. Homogeniseres løsningen af langsomt pipettering for at undgå boblerne. Inkuber i 5 min i mørke ved stuetemperatur med blid agitation.
Bemærk: Denne buffer høj pH medfører neutralisering af lysin restkoncentrationer i proteiner, fører til en højere reaktivitet. - Gentag tilsætning af 1 μL 2 μg/mL Cy3 NHS-ester farvestof. Homogeniseres løsningen af langsomt pipettering for at undgå boblerne. Der inkuberes i 10 min. i mørke ved stuetemperatur med blid agitation.
Bemærk: Dette gentages tilsætning af NHS-ester farvestof kan øge mærkning effektivitet, fordi nogle af Cy3 NHS-ester farvestof er hydrolyseret og deaktiveres ved højt pH i reaktion bufferen. - Justere pH 7,2 ved at tilsætte 100 μL af 0,8 M 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic syre (HEPES)-NaOH pH 7,2 til at slukke reaktionen. Homogeniseres løsningen af langsomt pipettering for at undgå boblerne.
- Tilsæt 20 μL af biotin-(polyethylenglycol (PEG)) 19 mg/mL2-Amin og 5 μl af 20 mg/mL 1-ethyl - 3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC). Homogeniseres løsningen af langsomt pipettering for at undgå boblerne. Inkuber i 1 time i mørke ved stuetemperatur med blid agitation.
Bemærk: Denne biotinylation trin er nødvendigt at fastsætte proteinmolekyler på et mikroskop coverslip på en fast tæthed og med ingen bias for protein arter. - Fjerne ureageret mærkning reagenser og koncentrere prøven ved hjælp af en ultrafiltrering kolonne med 10 kDa cut-off, efter fabrikantens anvisninger.
Bemærk: Protokollen kan pause her. Prøven kan opbevares ved-80 ° C i flere uger.
3. proteomet udtagelsesret og
- Tilføj 4 x SDS prøvebuffer (200 mM Tris-HCl pH 6,8, 4% SDS, 4% glycerol og 0,4% bromophenol blå).
Bemærk: For at undgå farvning af skader, protein prøve bør ikke opvarmes, som gjort i standard SDS-PAGE og bør opbevares ved stuetemperatur. - Udføre standard SDS-PAGE for eksemplet protein og en molekylær stige, ved hjælp af 20% acrylamid gel. Overføre prøven i gel ved en konstant spænding (160 V) indtil overførslen front bare udgange gel.
- Image gel til at identificere placeringen af protein bands (figur 3).
- Skære gel dele herunder protein brøkdele af interesse ved hjælp af en skarp kniv, baseret på band steder. Fractioning på 16, 23, 55 og 120 kDa toppe, og på 19-25, 25-32, 32-42, 42-54, 54-69, 69-97, 97-136 og 136-226 kDa regioner er vist i figur 3.
- Uddrag proteiner ved hjælp af en dialyzer af electroelution med en porestørrelse på 6 – 8 kDa, efter fabrikantens anvisninger.
Bemærk: Den udpakkede prøve kan opbevares ved-80 ° C i flere uger.
4. mikroskop coverslip forberedelse
- Forberede hver prøve 200 μl af begærlighed buffer (5 mM HEPES-NaOH pH 7,2, 10 ng/mL begærlighed og 2 mg/mL bovint serumalbumin (BSA)).
- Forberede coverslips af 22 mm x 22 mm og 0,15 mm tykkelse. Udsætte coverslips til air plasma ved hjælp af en plasma renere for 1 min at rense og aktivere deres overflader.
- Frakke coverslips med avidin af spin-coating 200 μl af begærlighed buffer ved hjælp af en spin coater 5 sekunder på 500 rpm, efterfulgt af 30 sekunders ved 1000 rpm. Inkubér coverslips i 15 min. ved stuetemperatur til at lade dem tørre.
- Forberede coverslips for protein prøve.
- Fortynd protein prøven (fra 3,5) 100 gange i 5 mM HEPES-NaOH pH 7,2.
- Plads 100 μl af de fortyndede prøve på overfladen på midten af den begærlighed-coated coverslip (fra trin 4.3).
- Inkuber i mørke i 15 min. ved stuetemperatur.
- Forberede den positive kontrol.
- Plads 100 μl af 10 ng/mL renset fluorescerende biotin i 5 mM HEPES-NaOH pH 7,2 på midten af begærlighed coated coverslip (fra trin 4.3).
- Inkuber i mørke i 15 min. ved stuetemperatur.
Bemærk: Denne positive kontrol coverslip giver tætheden af begærlighed bindende steder, som bruges til at beregne LO.
- Forberede den negative kontrol.
- Spin-coat plasma rengøres coverslip med 200 μl af 5 mM HEPES-NaOH og 2 mg/mL BSA (uden begærlighed).
- Inkuber i 15 min. ved stuetemperatur til tørre.
- Tilsæt 100 μL af 10 ng/mL renset fluorescerende biotin i 5 mM HEPES-NaOH pH 7,2.
- Inkuber i mørke i 15 min. ved stuetemperatur.
Bemærk: Denne negative kontrol coverslip giver det ikke-specifik binding af fluorescerende biotin til coverslip uden begærlighed.
- Skyl hver coverslip med 200 μl destilleret vand af pipettering på kanterne af coverslip for ikke at røre ved midten af coverslip med spids. Gentag denne vask tre gange.
Bemærk: Efter sugning vand på coverslip, vand bør straks lægges tilbage på coverslip at forhindre udtørring helt. - Udsætte luft plasma til det samme antal coverslips som i trin 4.2.
- Placer de rensede coverslip på prøve-bundet coverslip fra trin 4.7 at undgå udtørring.
5. observation med enkelt molekyle Fluorescens mikroskopi
- Starte et wide-felt eller flygtige felt fluorescens mikroskop.
Forsigtig: Direkte eller spredte laserstråling kan forårsage øjet eller hud skader. Bære egnede beskyttelsesbriller og skjold laser lys sti.
Bemærk: For opsætningen af mikroskop, henvises til vores tidligere publikation16. Kort, et wide-felt eller flygtige felt fluorescens mikroskop udstyret med en high-power 488 nm laser excitation, en høj numerisk blænde mål linse og en høj følsomhed kamera kan bruges til denne måling. Yderligere, for en automatiseret måling, en computer-styrede XY translationel prøve fase, mekaniske skodder for laser excitationer og en auto-fokus system anbefales til at blive installeret. - Find fokus og indstille coverslip på mikroskopet.
- Udføre en flise scanning for at få mindst 100 billeder.
Bemærk: Laser belysningsstyrke bør kontrolleres med mekanisk skodder til at blive udsat for prøven, kun når du optager billeder med kameraet, for at minimere photobleaching. Hvis der er mange prøver, anbefales automatiseret måling ved hjælp af et edb-program til at styre mikroskop enheder. Hvert billede indeholder typisk 100-500 enkelt molekyle steder, når du bruger en 60 x mål linse.
6. billede analyse og udvinding af oplysninger
- Hvis billedet har ujævnheder på grund af laser belysningsstyrke mønster, udføre billedbehandling for at korrigere det18.
- Erhverve en referenceafbildning ved måling med et coverslip stikprøve ensartet spredning farvestoffer ved hjælp af et kamera indstilling den samme som i trin 5.3.
- Erhverve en offset billede ved at måle med ingen laser excitation ved hjælp af samme kameraindstilling.
- Trække hver enkelt pixelværdi i hver prøve billede og referenceafbildningen med værdien af offset billedet.
- Opdele hver pixelværdi i fratrukkede prøven billeder af værdien i fratrukkede referencebillede.
- Indsamle korrekt erhvervede billeder og fjerne billede baggrund.
- Fjerne billeder, der indeholder store fluorescerende aggregater manuelt.
- Fjerne billedet baggrund ved at anvende rullende bold algoritme19 med en kugle radius på 50 pixel ved hjælp af ImageJ20.
- Sharpen billeder ved at trække slørede billeder ved hjælp af ImageJ (skarpere billede funktion).
- Finde og analysere enkelt molekyle steder i billeder.
- Identificere enkelt molekyle steder med Yen tærskel algoritme21 bruger ImageJ.
- Filtrer steder med mindre end to pixels til at udelukke mørke støj af kamera og steder mere end 20 pixel for at udelukke sammenlægninger af proteiner ved hjælp af ImageJ (ROI manager).
- Tæl antallet af Steder i hvert billede. Ved belysning korrigerede billeder (trin 6.1.4), analysere alt intensiteter i pixel for hver plet ved hjælp af ImageJ.
- Beregne den mærkning belægning (LO) ved hjælp af følgende formel:
LO = (antallet af tællinger i stikprøven / antallet af tæller i den positive kontrol) x 100 - Beregne det gennemsnitlige antal fluorescerende farvestoffer bundet til en enkelt protein molekyle (n̄farvestof).
- Analysere et histogram af støtteintensiteter af hver plet.
Bemærk: Histogrammet har normalt flere toppe, og hver peak repræsenterer et forskelligt antal farvestof molekyler er bundet til et protein. Først, anden og tredje peak i histogrammet svarer til 1, 2 og 3 molekyler, henholdsvis. - Beregn den gennemsnitlige intensitet fra histogrammet. Også beregne peak intensiteten af den første bjergtop ved at anvende en Gaussisk montering.
- Beregn n̄farvestof ved at dividere den gennemsnitlige intensitet med peak intensitet.
- Analysere et histogram af støtteintensiteter af hver plet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 4 repræsenterer rå billeddata til forskellige molekylvægt brøkdele af proteiner fra HeLa celle lysate, såvel som den positive og den negative kontrol. Mens både protein prøve og positiv kontrol udstille 100-500 steder pr billede, viser den negative kontrol ingen eller et par steder, viser, at protokollen tilstrækkeligt hæmmer ikke-specifik binding af farvestoffer til coverslip overflade. Spot intensitet histogrammer for protein prøver og den positive kontrol præsentere flere toppe, der repræsenterer stokastiske binding af farvestoffer til primære aminer i proteiner og begærlighed tetramer strukturer22, henholdsvis. Alle steder viste blinkende og trinvis photobleaching med kontinuerlig laser excitation, fremhæve observation på enkelt-molekyle niveau (figur 5AB).
LO er beregnet ud fra forholdet mellem antallet af Steder i hvert protein prøve at der i den positive kontrol. LO målt fra HeLa celler lysate prøven varierede fra 50% til mindre molekylvægt (16 kDa) brøkdel til 90% for den højere molekylvægt (120 kDa) brøkdel og var 72% for hele proteomet prøve uden adskillelse (figur 6). Tilsvarende, n̄farvestof tendens til at stige med stigende molekylvægt. Disse stigende tendenser anses for at opstå på grund af højere numre af lysin rester, fører til øget NHS-ester farvestof bindende. For eksempel, har 23 kDa brøkdel en høj LO værdi på grund af det store antal lysin restkoncentrationer i Histon proteiner i denne fraktion.
Figur 1: effekt af proteomet mærkning homogenitet på protein nummer optælling. Protein tælle antallet er meget afhængig af hvor kraftigt og administrationsprocedurerne proteinmolekyler er mærket, i stedet for nummer forholdet mellem proteiner til farvestoffer. Homogenitet kan blive scoret ved hjælp af en parameter kaldes mærkning belægning (LO), som definerer sandsynligheden for mærket proteinmolekyler mod total proteinmolekyler. Denne værdi indeholder af protein tælle effektivitet (dvs. højere LO udbytter højere tælle numre (venstre) og vice versa (til højre)). Mens en LO værdi af 100% er ideelle, LO af < 100% kan give en dæmpning faktor for estimering absolutte protein numre. Dette tal er blevet ændret fra Leclerc et al.16 Copyright 2018 American Chemical Society. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Assay arbejdsproces. Først, coverslips (en) og (b) behandles med begærlighed at opnå en fast tæthed. Andet, fluorescently mærket prøve proteiner er biotinylated og knyttet til coverslip (en) via begærlighed-biotin interaktion. Sideløbende har er næsten 100% fluorescently mærket renset biotin immobiliseret på coverslip (b). For det tredje, coverslips er afbildet af enkelt-molekyle Fluorescens mikroskopi til at opnå den nummer og lysstyrke fordeling af fluorescens steder. Endelig, parameteren homogenitet, LO, beregnes ud fra forholdet mellem spot numre i (et), i (b). Dette tal er blevet ændret fra Leclerc et al.16 Copyright 2018 American Chemical Society. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: adskillelse af en HeLa celler proteomet prøve ved hjælp af SDS-PAGE. Mærket fluorescently og biotinylated celle lysate blev overført på to forskellige geler (20% acrylamid), og proteiner visualiseres ved hjælp af gel fremviser, med en 5 min og 10 min eksponeringstid for gel 1 og gel 2, henholdsvis. De røde bokse repræsenterer regionerne gel, der var skåret ud og udvindes. Dette tal er blevet ændret fra Leclerc et al.16 Copyright 2018 American Chemical Society. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: enkelt molekyle billeder af proteomet prøver. Fluorescens spot billeder (venstre) og histogrammer af spot intensiteter (til højre) fra forskellige molekylvægt proteomet fraktioner. Skalalinjen er 10 μm. Pilene i den positive kontrol angiver de forskellige mærkning trin af begærlighed. Dette tal er blevet ændret fra Leclerc et al.16 Copyright 2018 American Chemical Society. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Photobleaching af fluorescerende steder. (A) Time-lapse billeder af fluorescerende steder under kontinuerlig laser excitation. (B) tid spor af fluorescens intensiteter på forskellige steder. Sporene vise enten én eller to trins photobleaching, med angivelse af respektive antal farvestoffer blev koblet til protein i stedet for renset BSA prøve. Dette tal er blevet ændret fra Leclerc et al.16 Copyright 2018 American Chemical Society. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: mærkning homogenitet af proteomet prøver. LO (blå) og n̄farvestof (mørkerød) opnået fra forskellige molekylvægt fraktioner. Dataene udtrykt som betyder ± s.e. 98, 46, 27, 77, 44, 39, 62, 101, 65, 62, 82, 61 og 70 billeder blev analyseret for hele cellen lysate, 16, 23, 55, 120, 19-25, 25-32, 32-42, 42-54, 54-69, 69-97, 97-136 og 136-226 kDa fraktioner , henholdsvis. Dette tal er blevet ændret fra Leclerc et al.16 Copyright 2018 American Chemical Society. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette papir beskriver en protokol for at kvantificere den mærkning ensartethed af hver mærket protein arter i celler efter separation med SDS-PAGE (trin 3). Metoden adskillelse kan erstattes med andre metoder såsom væskekromatografi eller kapillær elektroforese, som giver mulighed for adskillelse og fraktionering af cellulære proteiner med høj opløsning, mens der kræver særligt udstyr23. Metoden mærkning ved hjælp af NHS-ester i den nuværende protokol kan erstattes med andre metoder, ved hjælp af maleimide-ester eller antistoffer, f.eks.
Kravet om mærkning homogenitet analyse afhænger af hvor meget den mærkning afviger fra en simpel tilfældig proces, som antaget i effektivitetsanalyse kobling. Vores seneste undersøgelse16 anførte, at NHS-ester mærkning af proteiner afviger fra en tilfældig proces afhængigt af reaktionsbetingelser såsom pH og rengøringsmidler. Vi observeret, at nogle betingelser induceret heterogenitet af kooperative binding af farvestoffer til proteiner eller eksistensen af en brøkdel af ikke-reaktive proteiner på grund af ufuldstændige oploesning eller sænket affinitet for farvestoffet. Derimod reduceret andre betingelser heterogenitet af komplet bindingen af reaktive restkoncentrationer i et protein til farvestoffet.
Vi mener, at pH er en af de mest indflydelsesrige faktorer på mærkning homogenitet. Høj pH kan forårsage neutralisering af lysin reststoffer i proteiner, fører til en højere reaktivitet med NHS-ester farvestof. Desuden høj pH kan fremkalde celle lysis og kan denaturerer proteiner. Men da høj pH-værdi gør afgift af proteiner negativt og er ikke egnet til nogle eksperimenter som isoelektrisk elektroforese eller 2D elektroforese, pH tilstand skal overvejes nøje afhængigt af forskning formål.
At netop måle mærkning homogenitet i analysen, er det vigtigt at bruge nok biotinylated protein prøve. Dette er fordi analysen forudsætter, at proteiner binder med mætning til hver begærlighed molekyle på coverslip, og utilstrækkelig protein koncentration resultater i undervurdering af LO. Vores tidligere undersøgelse16 viser, at mere end 10 pg protein er normalt nødvendige for mættede bindende, og dette kan fås fra omkring 1.000 HeLa celler24, selv efter fraktionering. Det anbefales at oprette en fortyndingsrække af protein prøve at bekræfte mætning af begærlighed steder. Vi bemærker også, at begærlighed tæthed på coverslip muligvis skal optimeres så ikke at medføre overlapninger mellem steder i optagne billeder, samtidig giver tilstrækkelig spot tal for statistisk analyse.
Denne analysen forudsætter at en tetravalente begærlighed molekyle22 på coverslip kan binde et protein. Faktisk, positive kontroldata i vores tidligere undersøgelse indiceret at en begærlighed molekyle kan binde op til fire fluorescently mærket biotins, men fleste (55%) avidin molekyler bind kun én eller to biotin molekyler. Fordi proteiner er større end biotin, bør deres sterisk virkninger resultere i færre proteiner bundet til én begærlighed. Vores antagelse understøttes yderligere af faktum, at n̄farvestof forbliver konstant, når måling blandet prøver af mærket og umærket proteiner på forskellige nøgletal16.
Dyrearten protein kan uspecifik binding af proteiner til at coverslip opstå betydeligt selv med en BSA belægning. Hvis dette er tilfældet, kan en mulighed være at måle en kontrol hvor biotinylated proteiner er belagt på coverslip uden begærlighed, i stedet for fluorescerende biotin på trin 4.6.3. Effekten af uspecifik bindingen på LO kan matematisk elimineres ved at fratrække antallet af steder af denne kontrol fra som protein prøven.
Denne protokol vil være uvurderlig for proteom-wide enkelt-molekyle protein tælle analyser. Enkelt molekyle følsomhed vil tillade analyse af protein beløb for hvert protein arter uanset deres overflod i celle25. Dette kunne realiseres af proteomet separation efterfulgt af kvantificering af antallet af fluorescens steder kombineret med proteiner. Høj følsomhed vil også tillade enkelt celle analyse, gør det muligt for forskere at undersøge heterogenitet på tværs af cellepopulationer, og for at gøre klynger af cellulære hedder25,26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer den følgende konkurrerende finansielle interest(s): RIKEN har indgivet en patentansøgning på disse resultater med S.L. og Y.T. benævnt nemlig Co opfindere.
Acknowledgments
Forfatterne takke Masae Ohno og Kazuya Nishimura for eksperimenterende assistance og rådgivning. Dette arbejde blev støttet af PRESTO (JPMJPR15F7), Japan videnskab og teknologi agentur, Grants-in-aid for unge forskere (A) (24687022), udfordrende sonderende forskning (26650055) og videnskabelig forskning på Innovative områder (23115005), Japan samfundet for Fremme af videnskab, og ved tilskud fra Takeda Science Foundation og Mochida Memorial Foundation for medicinsk og farmaceutisk forskning. S.L. anerkender støtte fra programmet RIKEN International Program tilknytte (IPA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 22x22x0.15 mm coverslip | VWR | 470019-004 | |
| 488 nm Argon laser | Coherent | Innova 70C | |
| 488 nm dichroic mirror | Semrock | FF495-Di03 | |
| 488 nm emission filter | Semrock | FF02-520/28 | |
| 560 nm dichroic filter | Semrock | Di02-R561 | |
| 560 nm emission filter | Semrock | FF02-617/73 | |
| 560 nm fiber laser | MBP Communications | F-04306-2 | |
| 60x oil immersion lens | Olympus | PLAPON 60x | |
| Avidin | Nacalai-tesque | 03553-64 | |
| Biotin-PEG-amine | Thermo Scientific | 21346 | |
| Biotinylated Alexa Fluor 488 | Nanocs | ||
| Borate | Nacalai-tesque | ||
| BSA | Sigma-Aldrich | A9547 | |
| CHAPS | Dojindo | C008-10 | |
| Cy3 NHS-ester dye | GE Healthcare | PA13101 | |
| Dialyzer - D-tube, 6-8 kDa | Merck Millipore | 71507-M | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | ||
| DTT | Nacalai-tesque | 14112-94 | |
| EDC | Nacalai-tesque | ||
| EMCCD camera | Andor | IiXon 897 | |
| Epi fluorescence microscope | Olympus | IX81 | |
| Gel viewer | GE Healthcare | ImageQuant LAS 4000 | |
| Penicillin, streptomycine and Amphoterecin mix | Gibco | ||
| Plasma cleaner | Diener Electronic | ||
| SDS | Wako | NC0792960 | |
| Size purification column 10K | Merck Millipore | UFC5010 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 |
References
- Wilhelm, M., et al.
- Guo, A., et al. Immunoaffinity enrichment and mass spectrometry analysis of protein methylation. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (1), 372-387 (2014).
- Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).
- Neuhoff, V., Arold, N., Taube, D., Ehrhardt, W. Improved staining of proteins in polyacrylamide gels including isoelectric focusing gels with clear background at nanogram sensitivity using Coomassie Brilliant Blue G-250 and R-250. Electrophoresis. 9 (6), 255-262 (1988).
- Berggren, K., et al. Background-free, high sensitivity staining of proteins in one- and two-dimensional sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels using a luminescent ruthenium complex. Electrophoresis. 21 (12), 2509-2521 (2000).
- Butt, R. H., Coorssen, J. R. Coomassie blue as a near-infrared fluorescent stain: a systematic comparison with Sypro Ruby for in-gel protein detection. Molecular & cellular proteomics. 12 (12), 3834-3850 (2013).
- Nanda, J. S., Lorsch, J. R. Labeling a protein with fluorophores using NHS ester derivitization. Methods in Enzymology. , 87-94 (2014).
- Kim, Y., et al. Efficient site-specific labeling of proteins via cysteines. Bioconjugate chemistry. 19 (3), 786-791 (2008).
- Dickson, R. M., Cubitt, A. B., Tsien, R. Y., Moerner, W. E. On/off blinking and switching behaviour of single molecules of green fluorescent protein. Nature. 388 (6640), 355-358 (1997).
- Penna, A., et al. The CRAC channel consists of a tetramer formed by Stim-induced dimerization of Orai dimers. Nature. 456 (7218), 116-120 (2008).
- Ji, W., et al. Functional stoichiometry of the unitary calcium-release-activated calcium channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (36), 13668-13673 (2008).
- Ulbrich, M. H., Isacoff, E. Y.
- Sugiyama, Y., Kawabata, I., Sobue, K., Okabe, S. Determination of absolute protein numbers in single synapses by a GFP-based calibration technique. Nature Methods. 2 (9), 677-684 (2005).
- Puchner, E. M., Walter, J. M., Kasper, R., Huang, B., Lim, W. A. Counting molecules in single organelles with superresolution microscopy allows tracking of the endosome maturation trajectory. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (40), 16015-16020 (2013).
- Grassart, A., et al. Actin and dynamin2 dynamics and interplay during clathrin-mediated endocytosis. The Journal of Cell Biology. 205 (5), 721-735 (2014).
- Leclerc, S., Arntz, Y., Taniguchi, Y. Extending Single Molecule Imaging to Proteome Analysis by Quantitation of Fluorescent Labeling Homogeneity in Complex Protein Samples. Bioconjugate chemistry. 29 (8), 2541-2549 (2018).
- Ian Freshney, R. Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications. , John Wiley & Sons. (2015).
- Taniguchi, Y., et al. Quantifying E. coli proteome and transcriptome with single-molecule sensitivity in single cells. Science. 329 (5991), 533-538 (2010).
- Sternberg,
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
- Yen, J. C., Chang, F. J., Chang, S. A new criterion for automatic multilevel thresholding. IEEE Transactions on Image Processing. 4 (3), 370-378 (1995).
- Livnah, O., Bayer, E. A., Wilchek, M., Sussman, J. L.
- Mostovenko, E., Hassan, C., Rattke, J., Deelder, A. M., van Veelen, P. A., Palmblad, M. Comparison of peptide and protein fractionation methods in proteomics. EuPA Open Proteomics. 1, 30-37 (2013).
- Volpe, P., Eremenko-Volpe, T. Quantitative studies on cell proteins in suspension cultures. European Journal of Biochemistry. 12 (1), 195-200 (1970).
- Huang, B., et al. Counting low-copy number proteins in a single cell. Science. 315 (5808), 81-84 (2007).
- Johnson, A. C., Bowser, M. T. H. igh- High-Speed, Comprehensive, Two Dimensional Separations of Peptides and Small Molecule Biological Amines Using Capillary Electrophoresis Coupled with Micro Free Flow Electrophoresis. Analytical Chemistry. 89 (3), 1665-1673 (2017).
