Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att bedöma märkning homogenitet för varje protein art i ett komplex protein prov på nivån enda molekyl.
Abstract
Cell proteom kännetecknas ofta med elektrofores analyser, där alla arter av proteiner i celler är icke-specifikt märkta med ett fluorescerande färgämne och är fläckig av en fotodetektor efter deras separation. Enda molekyl fluorescens imaging kan detektera ultrasensitive protein med dess förmåga för att visualisera individuella fluorescerande molekyler. Tillämpningen av denna kraftfulla bildgivande metod på elektrofores analyser hämmas dock av bristen på sätt att karakterisera homogenitet fluorescerande märkning av varje art som protein över proteomet. Här, utvecklat vi en metod för att utvärdera märkning homogenitet över det proteomet baserat på en enda molekyl fluorescens imaging test. I vår mätning HeLa cellen prov, andelen proteiner märkt med minst ett färgämne, som vi kalla 'märkning beläggning' (LO), var fast besluten att spänna från 50% till 90%, stödja tillämpningen av enda molekyl imaging att hög potential känslig och exakt proteomet analys.
Introduction
Proteomet analys, som syftar till att kvantifiera hela uppsättningen av proteinmolekyler uttryckt i cellen, är en värdefull metod i nuvarande biologiska och medicinska studier. Denna analys är vanligen beroende av masspektrometri, som identifierar protein arter baserat på spectra genereras genom protein jonisering1,2,3. En alternativ metod för proteomet analys är elektrofores, inklusive polyakrylamid gelelektrofores (sida), kapillärelektrofores och tvådimensionell (2D) gelelektrofores. Denna metod förlitar sig på icke-specifik fluorescerande märkning av alla proteinmolekyler i de analyserade celler, följt av elektroforetisk separation och detektion och kvantifiering av varje art som protein. För att uppnå krävs icke-specifika protein märkning, är en strategi att använda fluorescerande färgämnen som kan binda till proteiner via elektrostatiska och hydrofoba interaktioner, till exempel Coomassie blå och Sypro-Ruby4,5,6 . En alternativ strategi är att använda kovalent märkning med färgämnen som innehåller N-hydroxysuccinimide (NHS) ester eller maleimide, som kovalent kan bindas till proteiner genom gemensamma rester såsom primära aminer och Tioler, respektive7, 8.
Samtidigt är fluorescens upptäckt känslighet idealisk för att analysera låg-överflöd proteiner och litet antal celler. Enda molekyl fluorescens bildbehandling är en av de mest känsliga metoder som möjliggör upptäckt av individuella fluorescerande färgämnen och märkta proteiner i vitro och in vivo9,10,11,12, 13,14,15. Tillämpningen av denna bildgivande metod till elektrofores-baserade proteomet analys väntas möjliggöra mycket känsliga och kvantitativa analyser genom att räkna enskilda fluorescently-märkt proteiner. Det är dock fortfarande oklart om märkning med fluorescerande färgämnen är tillräckligt homogena över alla proteinmolekyler, och hur denna homogenitet påverkas av olika protein arter (figur 1). Enkla bulk mätningar kan användas för att erhålla en molar förhållandet av fluorescerande färgämnen till proteiner som kallas 'koppling effektivitet'8 eller 'märkning effektivitet', men detta boende ger inte information om homogenitet märkning bland proteinmolekyler.
Här beskriver vi protokollet för ett test att undersöka märkning homogenitet för alla protein arter i cellen (figur 2)16. De två viktigaste stegen av denna analys är protein rening och imaging. I det första steget, alla proteiner i celler märks fluorescently och biotinylerade, sedan extraherade separat med gelelektrofores följt av electroelution. I det andra steget utvärderas fluorescens egenskaper för enskilda proteinmolekyler i de extraherade proverna baserat på enda molekyl imaging. Från dessa data, parametrar viktigt för räknande analysen, såsom andelen proteiner märkt med åtminstone en färga, som vi kallar märkning beläggning (LO)16, och det genomsnittliga antalet fluorescerande färgämnen bunden till en enda proteinmolekyl (n̄ färgämne), kan karakteriseras. I protokollet, en optimerad förfarandet för märkning i HeLa cellen proteomet med NHS esterbaserade cyanin 3 (Cy3) färgämne presenteras som ett exempel, och kan ändras med andra märkning förfaranden enligt önskad forskning mål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. cell förberedelse
- Odla HeLa celler i en 10 cm skålen vid 37 ° C under 5% CO2 i Dulbecco ändrade örnens medium innehållande 10% fetalt bovint serum.
- Samla in exponentiellt växande celler när de har nått 70% konfluens, efter ATCC instruktioner17.
- Skölj celler med 5 mL av 1 x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) (pH 7,4). Ta bort PBS.
- Tillsätt 1 mL 0,1% trypsin-etylendiamintetraättiksyrans dinatriumsalt (EDTA). Inkubera i 5 minuter vid 37 ° C.
- Övervaka utvecklingen av cell dissociation av mikroskopi.
- När celler blir runda och är fristående från skålen, tillsätt 4 mL odlingsmedium och bryta cell gytter av pipettering.
- Räkna antalet celler som använder en cell räknare.
- Centrifugera vid 150 x g i 10 min i ett centrifugrör. Ta bort mediet och resuspendera cellpelleten med 5 mL 1 x PBS (pH 7,4).
- Upprepa steg 1.2.6. Att resuspendera cellerna i 1 x PBS (pH 7,4) till en slutlig koncentration av 106 celler/mL med hjälp av greve nummer i steg 1.2.5.
Obs: Cellsuspension kan vara aliquoted och lagras vid-80 ° C i flera månader. Upprepar en frysning/upptining cykeln bör undvikas.
2. cell lysis och fluorescerande märkning
- Gör 10 mL lyseringslösning buffert (0,1 M Borat, 1% sodium dodecyl sulfate (SDS) och 1% Tween-20). Justera till pH 12 använda 2 M NaOH.
FÖRSIKTIGHET: Koncentrerad NaOH är frätande. Använd lämpliga skyddshandskar och glasögon när förbereda denna lösning.
Obs: Lyseringslösning buffert kan lagras i upp till en vecka i rumstemperatur. - Blanda 100 μL av lyseringslösning buffert med 1 μL av 1 M Ditiotreitol (DTT) och 4 μL av 50% 3-[(3-cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propanesulfonate (KÄKAR).
- Blanda 1 μL av cellkulturen (cirka 1000 celler) med blandade lysing bufferten från steg 2.2. Homogenisera lösningen genom pipettering långsamt för att undvika bubblor. Inkubera i mörker vid rumstemperatur i 5 min med försiktig skakning. Re homogenisera lösningen genom pipettering långsamt.
- Tillsätt 1 μL av 2 μg/mL Cy3 NHS-ester färgämne. Homogenisera lösningen genom pipettering långsamt för att undvika bubblor. Inkubera i 5 min i mörker vid rumstemperatur med försiktig skakning.
Obs: Denna buffert hög pH orsakar neutralisering av lysin rester i proteiner, vilket leder till en högre reaktivitet. - Upprepa tillägg av 1 μL av 2 μg/mL Cy3 NHS-ester färgämne. Homogenisera lösningen genom pipettering långsamt för att undvika bubblor. Inkubera i 10 min i mörker vid rumstemperatur med försiktig skakning.
Obs: Detta upprepas tillägg av NHS-ester färgämne kan effektivisera märkning eftersom några av Cy3 NHS-ester färgämnet är hydrolyserat och avaktiveras genom hög pH reaktion bufferten. - Justera till pH 7,2 genom att tillsätta 100 μL av 0,8 M 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic syra (HEPES)-NaOH pH 7,2 att släcka reaktionen. Homogenisera lösningen genom pipettering långsamt för att undvika bubblor.
- Tillsätt 20 μL av 19 mg/mL biotin-(polyetylenglykol (PEG))2-Amin och 5 μL av 20 mg/mL 1-etyl - 3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC). Homogenisera lösningen genom pipettering långsamt för att undvika bubblor. Inkubera i 1 h i mörker vid rumstemperatur med försiktig skakning.
Obs: Detta biotinylation steg är nödvändigt att fastställa proteinmolekyler på ett Mikroskop täckglas på en fast täthet och med ingen bias för protein arter. - Ta bort oreagerad märkning reagenser och koncentrera provet med en ultrafiltrering kolumn med 10 kDa cut-off, följa tillverkarens instruktioner.
Obs: Protokollet kan pausas här. Provet kan förvaras vid-80 ° C i flera veckor.
3. proteomet separations- och
- Lägga till 4 x SDS prov buffert (200 mM Tris-HCl pH 6.8, 4% SDS, 4% glycerol och 0,4% bromofenolblått).
Obs: För att undvika färgämnet skador, protein provet bör inte värmas som gjort i standard SDS-PAGE, och bör förvaras vid rumstemperatur. - Utföra standard SDS-PAGE för protein provet och en molekylär stege, med 20% akrylamid gel. Migrera provet i gel vid en konstant spänning (160 V) tills migreringen framsidan bara matas ut gelen.
- Bild gelen för att identifiera platsen för banden protein (figur 3).
- Klipp ut de gel delar inklusive protein fraktioner av intresse med hjälp av ett vasst blad, baserat på platserna som band. Fractioning 16, 23, 55 och 120 kDa toppar och 19 – 25, 25-32, 32 – 42, 42 – 54, 54 – 69, 69 – 97, 97 – 136 och 136 – 226 kDa regioner visas i figur 3.
- Extrahera proteiner med en dialysator genom electroelution med en porstorlek på 6 – 8 kDa, följa tillverkarens instruktioner.
Obs: Det extraherade provet kan förvaras vid-80 ° C i flera veckor.
4. mikroskopet täckglas förberedelse
- Förbereda 200 μL avidinen buffert (5 mM HEPES-NaOH pH 7,2, 10 ng/mL avidinen och 2 mg/mL bovint serumalbumin (BSA)) för varje prov.
- Förbereda coverslips 22 x 22 mm och 0,15 mm tjocklek. Utsätta coverslips för plasma med en plasma cleaner för 1 min att rengöra och aktivera deras ytor.
- Kappa av coverslips med metoden av spin-beläggning 200 μL av metoden buffert med en spin coater för 5 sekunder på 500 rpm, följt av 30 sekunder vid 1000 rpm. Inkubera i coverslips för 15 min att låta dem torka i rumstemperatur.
- Förbereda coverslips protein provet.
- Späd provet protein (från 3,5) 100 gånger i 5 mM HEPES-NaOH pH 7,2.
- Plats 100 μL av det utspädda provet på ytan i mitten av det avidinen-belagda täckglaset (från steg 4,3).
- Inkubera i mörkret under 15 minuter vid rumstemperatur.
- Förbereda den positiva kontrollen.
- Plats 100 μL 10 ng/ml renat fluorescerande biotin i 5 mM HEPES-NaOH pH 7,2 i mitten av avidinen belagda täckglas (från steg 4,3).
- Inkubera i mörkret under 15 minuter vid rumstemperatur.
Obs: Denna positiva kontrollen täckglas ger tätheten av avidinen bindande ställen, som används för att beräkna LO.
- Förbereda den negativa kontrollen.
- Spinn-rocken plasma rengöras täckglas med 200 μL av 5 mM HEPES-NaOH och 2 mg/mL BSA (utan avidinen).
- Inkubera i 15 min i rumstemperatur att torka.
- Tillsätt 100 μL av 10 ng/mL renat fluorescerande biotin i 5 mM HEPES-NaOH pH 7,2.
- Inkubera i mörkret under 15 minuter vid rumstemperatur.
Obs: Denna negativa kontrollen täckglas ger mängden icke-specifik bindning av fluorescerande biotin till täckglaset utan avidinen.
- Skölj varje täckglas med 200 μl destillerat vatten genom pipettering vid kanterna på täckglaset så att inte tryck mitt på täckglas med spets. Upprepa detta tvätta tre gånger.
Obs: Efter aspirera vatten på täckglaset, vatten bör omedelbart placeras tillbaka på den täckglas till hindra den från att torka ut helt. - Exponera luft plasma till samma antal coverslips som i steg 4,2.
- Placera det rengjorda täckglaset på de prov-bundna täckglaset från steg 4.7 att undvika uttorkning.
5. observation med enda molekyl fluorescensmikroskopi
- Starta upp ett wide-fält eller flyktig fältet fluorescens Mikroskop.
FÖRSIKTIGHET: Direkt eller spridda laserstrålning kan orsaka ögat eller hudskador. Använd lämpliga skyddsglasögon och sköld laser ljusstrålen.
Obs: För den Mikroskop setup, hänvisas till vår tidigare publikation16. Kort, wide-fält eller flyktig fältet fluorescens Mikroskop utrustat med en högeffekts 488 nm laser excitation, en hög numerisk bländarobjektiv och en hög känslighet kamera kan användas för denna mätning. Vidare, för en automatiserad mätning rekommenderas en datorstyrd XY translationell prov scenen, mekaniska luckor för laser Magnetiseringar och en autofokus system installeras. - Ange täckglaset på mikroskopet och hitta fokus.
- Genomsökning av kakel för att få minst 100 bilder.
Obs: Laser belysning bör kontrolleras med mekaniska fönsterluckor att utsättas för provet endast vid inspelning av bilder med kameran, för att minimera fotoblekning. Om det finns många prover, rekommenderas automatiserad mätning med hjälp av ett datorprogram för att styra Mikroskop. Varje bild innehåller vanligtvis 100 – 500 enda molekyl ställen när du använder en 60 x objektiv.
6. bild analys och utvinning av information
- Om bilden har ojämnheter på grund av mönstret laser belysning, utföra bildbehandling för att korrigera det18.
- Förvärva en referensavbildning genom att mäta med ett täckglas prov bestående av jämnt-spread färgämnen använda en kamera inställning densamma som steg 5.3.
- Förvärva en förskjuten bild genom att mäta med ingen laser excitation med samma kamera inställning.
- Subtrahera varje pixelvärde i varje prov bild och referensavbildningen med värdet för offset bilden.
- Dela varje pixelvärde i subtraherade exempelbilderna av värdet i subtraherade referensavbildningen.
- Samla korrekt förvärvade bilder och ta bort bild bakgrunden.
- Ta bort bilder som innehåller stora fluorescerande aggregat manuellt.
- Ta bort bild bakgrunden genom att tillämpa den rullande-ball algoritm19 med bollen radie 50 pixlar med ImageJ20.
- Skärpa bilder genom att subtrahera suddiga bilder med ImageJ (vässa bildfunktion).
- Hitta och analysera enda molekyl fläckar i bilder.
- Identifiera enda molekyl ställen med Yen tröskel algoritm21 använda ImageJ.
- Filtrera ställen med mindre än två pixlar att utesluta mörka buller av kameran och ställen mer än 20 pixlar för att utesluta aggregeringar av proteiner med hjälp av ImageJ (ROI manager).
- Räkna antalet ställen i varje bild. Med hjälp av belysningen korrigerade bilder (steg 6.1.4), analysera summa intensiteter inom pixlar för varje plats med hjälp av ImageJ.
- Beräkna den märkning beläggning (LO) med följande formel:
LO = (antal räknas i provet / antal räknas i den positiva kontrollen) x 100 - Beräkna det genomsnittliga antalet fluorescerande färgämnen bunden till en enda proteinmolekyl (n̄färgämne).
- Analysera ett histogram över stödnivåer för varje plats.
Obs: Histogram har oftast flera toppar, och varje topp representerar olika antal dye molekyler bundna till ett protein. Först, andra och tredje topp i histogrammet motsvarar 1, 2 och 3 molekyler, respektive. - Beräkna den genomsnittliga intensiteten från histogrammet. Även beräkna peak intensiteten i den första toppen genom att tillämpa en Gaussisk passande.
- Beräkna n̄dye genom att dividera den genomsnittliga intensiteten med maximal intensitet.
- Analysera ett histogram över stödnivåer för varje plats.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 4 representerar råbilddata för olika molekylvikt fraktioner av proteiner från HeLa cell lysate, liksom positiva och negativa kontrollen. Medan både protein prov och positiv kontroll uppvisar 100 – 500 ställen per bild, visar den negativa kontrollen ingen eller några fläckar, visar att protokollet tillräckligt hämmar icke-specifik bindning av färgämnen på täckglas ytan. Spot intensitet histogram för protein proverna och den positiva kontrollen presenterar flera toppar, som representerar stokastiska bindningen av färgämnen till primära aminer i proteiner och metoden tetramer strukturer22, respektive. Alla ställen visade blinkande och stegvis fotoblekning med kontinuerlig laser magnetisering, belysa observation på nivån enda molekyl (figur 5AB).
LO beräknas utifrån förhållandet mellan antalet ställen i varje protein prov som i den positiva kontrollen. LO mätt från HeLa cell lysate provet varierade från 50% för de mindre molekylvikt (16 kDa) andelen till 90% för andelen högre molekylvikt (120 kDa) och var 72% för hela proteomet provet utan avskiljande (figur 6). På motsvarande sätt tenderat n̄dye att öka med ökande molekylvikt. Dessa ökande tendenser anses uppstå på grund av högre antal lysin rester, leder till ökad NHS-ester färga bindande. Den 23 kDa fraktionen har exempelvis ett högt LO-värde på grund av det stora antalet rester av lysin i Histon proteiner i denna fraktion.
Figur 1: effekten av proteomet märkning homogenitet på protein siffrorna räknas. Antalet protein count är starkt beroende av hur starkt och homogeneously proteinmolekyler är märkta, snarare än antalet förhållandet av proteiner till färgämnen. Homogenitet kan vara poängsätts använda en parameter som kallas märkning beläggning (LO), som anger Sannolikheten för märkt proteinmolekyler mot totalt proteinmolekyler. Detta värde ger effektivitet protein räknar (dvs. högre LO avkastning högre räkna siffror (vänster) och vice versa (höger)). Medan LO värdet 100% är perfekt, LO av < 100% kan ge en dämpning faktor för skattning av absolut protein nummer. Denna siffra har ändrats från Leclerc et al.16 Copyright 2018 American Chemical Society. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: analys arbetsflöde. Först behandlas coverslips (en) och (b) med metoden att uppnå en fast densitet. Andra, fluorescently-märkt urval proteiner är biotinylerade och bifogas täckglaset (en) via avidinen-biotin interaktionen. Parallellt, är nästan 100% fluorescently-märkt renat biotin orörlig på täckglas (b). För det tredje är coverslips fotograferad av singel-molekyl fluorescensmikroskopi att få nummer och ljusstyrka fördelningen av fluorescens ställen. Slutligen beräknas parametern homogenitet, LO, utifrån förhållandet mellan plats nummer i (en) som i (b). Denna siffra har ändrats från Leclerc et al.16 Copyright 2018 American Chemical Society. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Separation av HeLa cellen Proteomet prov med hjälp av SDS-PAGE. Märkt fluorescently och biotinylerade cell lysate migrerats på två olika geler (20% akrylamid), och proteiner som visualiseras i visningsprogrammet gel, med 5 min och 10 min exponeringstid för gel 1 gel 2, respektive. De röda rutorna representerar Regionkommittén gel som skars och extraheras. Denna siffra har ändrats från Leclerc et al.16 Copyright 2018 American Chemical Society. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: enkel molekyl bilder av proteomet prover. Fluorescens spot bilder (vänster) och histogram av spot stödnivåer (höger) erhålls från olika molekylvikt proteomet fraktioner. Skalstapeln är 10 μm. Pilarna i den positiva kontrollen anger de olika märkning steget i metoden. Denna siffra har ändrats från Leclerc et al.16 Copyright 2018 American Chemical Society. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Fotoblekning av fluorescerande fläckar. (A) Time-lapse bilder av fluorescerande fläckar under kontinuerlig laser excitation. (B) tid spår av fluorescens intensiteter på olika ställen. Spåren visar antingen en - eller två - steg fotoblekning, som anger respektive nummer av färgämnen var kopplad till proteinet i plats av renat BSA provet. Denna siffra har ändrats från Leclerc et al.16 Copyright 2018 American Chemical Society. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: märkning homogenitet proteomet prover. LO (blå) och n̄dye (mörkröd) erhålls från olika molekylvikt fraktioner. Uppgifter uttrycks som menar ± s.ö. 98, 46, 27, 77, 44, 39, 62, 101, 65, 62, 82, 61 och 70 bilder analyserades för hela cell lysate, 16, 23, 55, 120, 19 – 25, 25-32, 32 – 42, 42 – 54, 54 – 69, 69 – 97, 97 – 136 och 136 – 226 kDa fraktioner , respektive. Denna siffra har ändrats från Leclerc et al.16 Copyright 2018 American Chemical Society. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta dokument beskriver ett protokoll för att kvantifiera märkning homogenitet av varje art som heter protein i cellerna efter separation med SDS-PAGE (steg 3). Metoden separation kan ersättas med andra metoder såsom vätskekromatografi eller kapillär elektrofores, som tillåter separation och fraktionering av cellulära proteiner med hög upplösning, samtidigt som kräver särskild utrustning23. Metoden märkning med NHS-ester i det nuvarande protokollet kan ersättas med andra metoder som använder maleimide-ester eller antikroppar, till exempel.
Kravet på märkning homogenitet analys beror på hur mycket märkning avviker från en enkel slumpmässig process, som antas i kopplingen effektivitet analysen. Vår senaste studie16 anges att NHS-ester märkning av proteiner avviker från en slumpmässig process beroende på reaktion villkor såsom pH och rengöringsmedel. Vi observerade att vissa villkor inducerad heterogenitet av kooperativ bindning av färgämnen till proteiner eller förekomsten av en bråkdel av icke-reaktivt protein på grund av ofullständig lösbarhet eller sänkt affinitet för färgen. Däremot minskade andra villkor heterogenitet av komplett bindningen av reaktiva rester inom ett protein till färgen.
Vi anser att pH är en av de mest inflytelserika faktorerna på märkning homogenitet. Högt pH kan orsaka neutralizationen av lysin rester i proteiner, vilket leder till en högre reaktivitet med NHS-ester färgämnet. Dessutom högt pH kan inducera cell lysis och kan denaturera proteiner. Eftersom högt pH gör laddningen av proteiner negativa och lämpar sig inte för några experiment såsom isoelektrisk elektrofores eller 2D elektrofores, måste pH villkoret dock noga övervägas beroende på syftet forskning.
För att exakt mäta märkning homogenitet i analysen, är det viktigt att använda tillräckligt biotinylerade protein provet. Detta beror på att analysen utgår från att proteiner binder med mättnad till varje avidinen molekyl på täckglas och otillräcklig protein koncentration leder till underskattning av LO. Vår tidigare studie16 har visat att vanligtvis mer än 10 pg av protein är nödvändigt för mättade bindande, och detta kan erhållas från cirka 1000 HeLa celler24, även efter fraktionering. Det rekommenderas att skapa en utspädning serie av protein provet att bekräfta mättnaden i avidinen ställen. Vi noterar också att metoden tätheten på täckglaset kan behöva optimeras så att inte orsaka överlappningar mellan ställen i bilderna, ger tillräcklig plats nummer för statistisk analys.
Denna analys förutsätter att ett tetravalent avidinen molekyl22 på täckglaset kan binda ett protein. Faktiskt, den positiva kontrolldata i vår tidigare studie anges att en avidinen molekyl kan binda till upp till fyra fluorescently märkt biotins, men en majoritet (55%) av metoden binder molekyler bara en eller två biotin molekyler. Eftersom proteiner är större än biotin, bör deras Sterisk effekter resultera i färre proteiner bunden till en avidinen. Vårt antagande stöds av faktumen att n̄dye förblir konstant när mätning blandade prover av märkt och omärkt proteiner olika nyckeltal16.
Beroende på protein art uppstå ospecifik bindning av proteiner till täckglaset betydligt även med en BSA beläggning. Om så är fallet, kan ett alternativ vara att mäta en kontroll där biotinylerade proteiner är belagda på täckglas utan avidinen, i stället för fluorescerande biotin vid steg 4.6.3. Effekten av ospecifik bindning på LO kan matematiskt elimineras genom att subtrahera antalet fläckar av denna kontroll från som protein provet.
Detta protokoll kommer att vara ovärderlig för proteom-wide singel-molekyl protein räknar analyser. Den enda molekyl känsligheten kommer att möjliggöra analys av protein beloppen för varje protein arter oavsett deras överflöd i cell25. Detta skulle kunna realiseras genom proteomet separation följt av kvantifiering av antalet fluorescens ställen tillsammans med proteiner. Dessutom hög känslighet kommer också att tillåta enstaka cell analys, att möjliggöra för forskare att undersöka heterogenitet över cellpopulationer och gör klustring av cellular påstår25,26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar den följande konkurrerande finansiella interest(s): RIKEN har lämnat in en patentansökan på dessa resultat med S.L. och Y.T. benämn så samtidig uppfinnare.
Acknowledgments
Författarna tackar Masae Ohno och Kazuya Nishimura för experimental stöd och råd. Detta arbete stöddes av PRESTO (JPMJPR15F7), Japan Science och Technology Agency, Grants-in-aid för unga forskare (A) (24687022), utmanande förberedande forskning (26650055) och vetenskaplig forskning på innovativa områden (23115005), Japan Society for Främjande av vetenskap, och genom bidrag från stiftelsen Takeda vetenskap och Mochida Memorial Foundation för medicinsk och farmaceutisk forskning. S.L. erkänner stöd från programmet RIKEN internationella Program Associate (IPA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 22x22x0.15 mm coverslip | VWR | 470019-004 | |
| 488 nm Argon laser | Coherent | Innova 70C | |
| 488 nm dichroic mirror | Semrock | FF495-Di03 | |
| 488 nm emission filter | Semrock | FF02-520/28 | |
| 560 nm dichroic filter | Semrock | Di02-R561 | |
| 560 nm emission filter | Semrock | FF02-617/73 | |
| 560 nm fiber laser | MBP Communications | F-04306-2 | |
| 60x oil immersion lens | Olympus | PLAPON 60x | |
| Avidin | Nacalai-tesque | 03553-64 | |
| Biotin-PEG-amine | Thermo Scientific | 21346 | |
| Biotinylated Alexa Fluor 488 | Nanocs | ||
| Borate | Nacalai-tesque | ||
| BSA | Sigma-Aldrich | A9547 | |
| CHAPS | Dojindo | C008-10 | |
| Cy3 NHS-ester dye | GE Healthcare | PA13101 | |
| Dialyzer - D-tube, 6-8 kDa | Merck Millipore | 71507-M | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | ||
| DTT | Nacalai-tesque | 14112-94 | |
| EDC | Nacalai-tesque | ||
| EMCCD camera | Andor | IiXon 897 | |
| Epi fluorescence microscope | Olympus | IX81 | |
| Gel viewer | GE Healthcare | ImageQuant LAS 4000 | |
| Penicillin, streptomycine and Amphoterecin mix | Gibco | ||
| Plasma cleaner | Diener Electronic | ||
| SDS | Wako | NC0792960 | |
| Size purification column 10K | Merck Millipore | UFC5010 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 |
References
- Wilhelm, M., et al.
- Guo, A., et al. Immunoaffinity enrichment and mass spectrometry analysis of protein methylation. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (1), 372-387 (2014).
- Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).
- Neuhoff, V., Arold, N., Taube, D., Ehrhardt, W. Improved staining of proteins in polyacrylamide gels including isoelectric focusing gels with clear background at nanogram sensitivity using Coomassie Brilliant Blue G-250 and R-250. Electrophoresis. 9 (6), 255-262 (1988).
- Berggren, K., et al. Background-free, high sensitivity staining of proteins in one- and two-dimensional sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels using a luminescent ruthenium complex. Electrophoresis. 21 (12), 2509-2521 (2000).
- Butt, R. H., Coorssen, J. R. Coomassie blue as a near-infrared fluorescent stain: a systematic comparison with Sypro Ruby for in-gel protein detection. Molecular & cellular proteomics. 12 (12), 3834-3850 (2013).
- Nanda, J. S., Lorsch, J. R. Labeling a protein with fluorophores using NHS ester derivitization. Methods in Enzymology. , 87-94 (2014).
- Kim, Y., et al. Efficient site-specific labeling of proteins via cysteines. Bioconjugate chemistry. 19 (3), 786-791 (2008).
- Dickson, R. M., Cubitt, A. B., Tsien, R. Y., Moerner, W. E. On/off blinking and switching behaviour of single molecules of green fluorescent protein. Nature. 388 (6640), 355-358 (1997).
- Penna, A., et al. The CRAC channel consists of a tetramer formed by Stim-induced dimerization of Orai dimers. Nature. 456 (7218), 116-120 (2008).
- Ji, W., et al. Functional stoichiometry of the unitary calcium-release-activated calcium channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (36), 13668-13673 (2008).
- Ulbrich, M. H., Isacoff, E. Y.
- Sugiyama, Y., Kawabata, I., Sobue, K., Okabe, S. Determination of absolute protein numbers in single synapses by a GFP-based calibration technique. Nature Methods. 2 (9), 677-684 (2005).
- Puchner, E. M., Walter, J. M., Kasper, R., Huang, B., Lim, W. A. Counting molecules in single organelles with superresolution microscopy allows tracking of the endosome maturation trajectory. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (40), 16015-16020 (2013).
- Grassart, A., et al. Actin and dynamin2 dynamics and interplay during clathrin-mediated endocytosis. The Journal of Cell Biology. 205 (5), 721-735 (2014).
- Leclerc, S., Arntz, Y., Taniguchi, Y. Extending Single Molecule Imaging to Proteome Analysis by Quantitation of Fluorescent Labeling Homogeneity in Complex Protein Samples. Bioconjugate chemistry. 29 (8), 2541-2549 (2018).
- Ian Freshney, R. Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications. , John Wiley & Sons. (2015).
- Taniguchi, Y., et al. Quantifying E. coli proteome and transcriptome with single-molecule sensitivity in single cells. Science. 329 (5991), 533-538 (2010).
- Sternberg,
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
- Yen, J. C., Chang, F. J., Chang, S. A new criterion for automatic multilevel thresholding. IEEE Transactions on Image Processing. 4 (3), 370-378 (1995).
- Livnah, O., Bayer, E. A., Wilchek, M., Sussman, J. L.
- Mostovenko, E., Hassan, C., Rattke, J., Deelder, A. M., van Veelen, P. A., Palmblad, M. Comparison of peptide and protein fractionation methods in proteomics. EuPA Open Proteomics. 1, 30-37 (2013).
- Volpe, P., Eremenko-Volpe, T. Quantitative studies on cell proteins in suspension cultures. European Journal of Biochemistry. 12 (1), 195-200 (1970).
- Huang, B., et al. Counting low-copy number proteins in a single cell. Science. 315 (5808), 81-84 (2007).
- Johnson, A. C., Bowser, M. T. H. igh- High-Speed, Comprehensive, Two Dimensional Separations of Peptides and Small Molecule Biological Amines Using Capillary Electrophoresis Coupled with Micro Free Flow Electrophoresis. Analytical Chemistry. 89 (3), 1665-1673 (2017).
