Summary
Aquí, presentamos un protocolo para evaluar la homogeneidad de etiquetado para cada especie de proteína en una muestra de proteína compleja en el nivel de molécula única.
Abstract
Proteomas celulares se caracterizan a menudo usando análisis de electroforesis, donde todas las especies de proteínas en las células no específicamente están marcadas con un colorante fluorescente y son vistas por un fotodetector tras su separación. Imágenes de fluorescencia de una molécula pueden proporcionar detección ultrasensible de la proteína con su capacidad para la visualización de las moléculas fluorescentes individuales. Sin embargo, la aplicación de este método de proyección de imagen de gran alcance para ensayos de electroforesis es obstaculizada por la falta de formas de caracterizar la homogeneidad de las etiquetas fluorescentes de cada especie de proteína en el proteoma. Aquí, se desarrolló un método para evaluar la homogeneidad de etiquetado en el proteoma basado en un análisis de imágenes de fluorescencia de sola molécula. En nuestra medición en una muestra de células HeLa, la proporción de proteínas con al menos un tinte, que denomina 'etiquetado ocupación' (LO), se determinó al rango del 50% al 90%, apoyando el potencial de la aplicación de la proyección de imagen de una molécula a Análisis del proteoma sensible y precisa.
Introduction
Análisis del proteoma, que tiene como objetivo cuantificar el conjunto de moléculas de la proteína expresada en la célula, es un enfoque valioso en estudios biológicos y medicamentos actuales. Este análisis se basa comúnmente en espectrometría de masa, que identifica especies de proteínas basadas en espectros generados a través de proteínas ionización1,2,3. Un método alternativo para el análisis del proteoma es la electroforesis, incluyendo electroforesis de geles de poliacrilamida (PAGE) y electroforesis capilar, electroforesis en dos dimensiones (2D). Este método se basa en etiquetado fluorescente no específicos de todas las moléculas de proteína en las células analizadas, seguidas por separación electroforética y la detección y cuantificación de cada especie de proteína. Para lograr el etiquetado requiere proteína no específica, una estrategia es utilizar tintes fluorescentes que pueden unirse a proteínas a través de interacciones electrostáticas e hidrofóbicas, tales como azul de Coomassie y Sypro Ruby4,5,6 . Una estrategia alternativa es usar etiquetado covalente con tintes que contengan éster N-hydroxysuccinimide (NHS) o maleimida, que puede unirse covalentemente a proteínas a través de residuos comunes tales como aminas primarias y tioles, respectivamente7, 8.
Mientras tanto, la sensibilidad de detección de fluorescencia es ideal para el análisis de proteínas de baja abundancia y al pequeño número de células. Imágenes de fluorescencia de una molécula es uno de los métodos más sensibles que permite la detección de tintes fluorescentes individuales y etiquetadas proteínas en vitro y en vivo9,10,11,12, 13,14,15. Se espera que la aplicación de este método de imagen para el análisis del proteoma basado en electroforesis permiten análisis altamente sensibles y cuantitativos por contar proteínas individuales marcada con fluorescencia. Sin embargo, no queda claro si etiquetado con tintes fluorescentes es bastante homogéneo en todas las moléculas de proteína, y cómo esta homogeneidad es afectada por especies diferentes de proteínas (figura 1). Simples medidas de solución a granel pueden utilizarse para obtener un cociente molar de tintes fluorescentes para proteínas llamadas 'eficiencia de acoplamiento'8 o 'etiquetado eficiencia', pero esta propiedad no proporciona información sobre la homogeneidad de las etiquetas entre moléculas de la proteína.
Aquí, describimos el protocolo de un ensayo investigar la homogeneidad Etiquetadora para todas las especies de proteínas en la célula (figura 2)16. Los dos pasos claves de este ensayo son la proyección de imagen y purificación de proteínas. En el primer paso, todas las proteínas en las células llevan la etiqueta fluorescente y biotinilado, luego extraída por separado mediante electroforesis en gel seguido por electroelución. En el segundo paso, propiedades de fluorescencia de las moléculas individuales de proteínas en las muestras extraídas son evaluadas en base a proyección de imagen de molécula única. De estos datos, parámetros importantes para el análisis de la cuenta, tales como el porcentaje de proteínas etiquetados con uno menos tinte, que llamamos etiquetado ocupación (LO)16, y el número promedio de tintes fluorescentes enlazado a una molécula de proteína sola (n̄ tinte), se puede caracterizar. En el protocolo, un procedimiento optimizado para el etiquetado el proteoma de células HeLa con tinte de Cianina 3 (Cy3) basado en éster NHS se presenta como un ejemplo y puede modificarse con otros procedimientos de etiquetado según objetivos de investigación deseada.
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Protocol
1. preparación de la célula
- Cultivar células HeLa en un plato de 10 cm a 37 ° C debajo del 5% de CO2 en Dulbecco de modificado medio de Eagle con 10% suero bovino fetal.
- Recoger las células de crecimiento exponencial una vez que han llegado a la confluencia de 70%, siguiendo las instrucciones de ATCC17.
- Lavar las células con 5 mL de 1 x de tampón fosfato salino (PBS) (pH 7.4). Retirar el PBS.
- Añadir 1 mL de 0.1% tripsina-dihidratada del ácido (EDTA). Incubar 5 min a 37 ° C.
- Controlar la progresión de la disociación de células por microscopía.
- Una vez que las células se convierten en la redondeos y son independientes de la fuente, añadir 4 mL de medio de cultivo y romper la aglomeración de células mediante pipeteo.
- Contar el número de células usando un contador de células.
- Centrifugue a 150 x g durante 10 min en un tubo de centrífuga. Quitarlo del medio y resuspender el sedimento celular con 5 mL de 1 x PBS (pH 7.4).
- Repita el paso 1.2.6. Resuspender las células en PBS 1 x (pH 7,4) a una concentración final de 106 células/mL utilizando el número de cuenta en el paso 1.2.5.
Nota: La suspensión de células puede ser alícuotas y almacenados a-80 ° C durante varios meses. Debe evitarse repetir un ciclo de congelamiento/descongelamiento.
2. la célula lysis y etiquetado fluorescente
- Tomar 10 mL de buffer de lisis (borato de 0,1 M, 1% sodio dodecil sulfato (SDS) y 1% Tween 20). Ajustar a pH 12 con 2 M NaOH.
PRECAUCIÓN: NaOH concentrado es corrosivo. Usar gafas y guantes adecuados al preparar esta solución.
Nota: Tampón de lisis puede almacenarse hasta por una semana a temperatura ambiente. - Mezclar 100 μL de lisis buffer con 1 μL de Ditiotreitol (DTT) de 1 M y 4 μL de 50% 3 [(3-cholamidopropyl) dimetilamonio] -1-propanesulfonate (caps).
- Mezclar 1 μL de cultivo celular (células aproximadamente 1.000) con el tampón de lisis mezclado en el paso 2.2. Homogeneizar la solución transfiriendo lentamente para evitar burbujas. Incubar en la oscuridad a temperatura ambiente durante 5 minutos con agitación suave. Volver a homogeneizar la solución transfiriendo poco a poco.
- Añadir 1 μL de 2 μg/mL tinte Cy3 NHS-éster. Homogeneizar la solución transfiriendo lentamente para evitar burbujas. Incubar por 5 min en la oscuridad a temperatura ambiente con agitación suave.
Nota: El pH alto de este buffer hace neutralización de los residuos de lisina en las proteínas, llevando a una mayor reactividad. - Repetir la adición de 1 μL de 2 μg/mL tinte Cy3 NHS-éster. Homogeneizar la solución transfiriendo lentamente para evitar burbujas. Incubar por 10 min en la oscuridad a temperatura ambiente con agitación suave.
Nota: Esto repetida adición de colorante de NHS-éster puede aumentar la eficacia de etiquetado porque el tinte Cy3 NHS-ester es hidrolizado y desactivado por el alto pH del buffer de reacción. - Ajustar a pH 7,2 añadiendo 100 μL de 0,8 M 4-(2-hydroxyethyl)-1--1-ácido ácido (HEPES)-NaOH pH 7.2 para calmar la reacción. Homogeneizar la solución transfiriendo lentamente para evitar burbujas.
- Añadir 20 μL de 19 mg/mL (glicol de polietileno (clavija)) de biotina-2-amina y 5 μL de 20 mg/mL 1-etil - 3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC). Homogeneizar la solución transfiriendo lentamente para evitar burbujas. Incubar durante 1 h en la oscuridad a temperatura ambiente con agitación suave.
Nota: Este paso de Biotinilación es necesario fijar las moléculas de proteína en un cubreobjetos microscopio con una densidad fija y sin sesgo para especies de proteína. - Eliminar reactivos Etiquetadoras no reaccionados y concentrar la muestra mediante una columna de ultrafiltración con atajo del kDa 10, siguiendo las instrucciones del fabricante.
Nota: El protocolo se puede detener aquí. La muestra puede conservarse a-80 ° C durante varias semanas.
3. proteoma separación y recuperación
- Añadir 4 x tampón de muestra de SDS (200 mM Tris-HCl pH 6.8, 4% SDS, glicerol 4% y 0.4% azul de bromofenol).
Nota: Para evitar el daño del tinte, la muestra de proteína no se debe calentar como hecho en estándar SDS-PAGE y debe conservarse a temperatura ambiente. - Presentación estándar SDS-PAGE para la muestra de proteína y una escala molecular, utilizando 20% gel de acrilamida. Migrar la muestra del gel a una tensión constante (160 V) hasta la migración delantera solo sale el gel.
- Imagen del gel para identificar la ubicación de las bandas de proteínas (figura 3).
- Cortar las porciones de gel incluyendo fracciones de la proteína de interés usando una cuchilla afilada, basada en la ubicación de la banda. Fraccionamiento en picos de 16, 23, 55 y 120 kDa y en kDa 19-25, 25-32, 32-42, 42 – 54, 54-69, 69-97, 97-136 y 136 – 226 regiones se muestran en la figura 3.
- Extraer las proteínas utilizando un dializador por electroelución con un tamaño de poro de 6 a 8 kDa, siguiendo las instrucciones del fabricante.
Nota: La muestra extraída puede almacenarse a-80 ° C durante varias semanas.
4. preparación de cubreobjetos microscopio
- Preparar 200 μL de tampón de avidina (5 mM HEPES-NaOH pH 7.2, 10 avidina ng/mL y 2 mg/mL albúmina sérica bovina (BSA)) para cada muestra.
- Preparar el cubreobjetos de 22 x 22 mm y 0.15 mm de espesor. Exponga el cubreobjetos para aire plasma usando un plasma cleaner durante 1 min para limpiar y activar sus superficies.
- Cubrir el cubreobjetos con avidina por spin-coating 200 μL de tampón de avidina mediante un recubridor de centrifugado durante 5 segundos a 500 rpm, seguido por 30 segundos a 1.000 rpm. Incubar el cubre-objetos durante 15 min a temperatura ambiente para que deje que se seque.
- Preparar el cubreobjetos de la muestra de proteína.
- Diluir la muestra de proteína (de 3,5) 100 veces en 5 mM HEPES-NaOH de pH 7.2.
- Coloque 100 μL de la muestra diluida en la superficie en el centro del cubreobjetos recubierto de avidina (desde el paso 4.3).
- Incubar en la oscuridad durante 15 min a temperatura ambiente.
- Preparar el control positivo.
- Coloque 100 μL de 10 ng/mL purificada fluorescente biotina en 5 mM HEPES-NaOH pH 7.2 en el centro de la avidina revestido cubreobjetos (desde el paso 4.3).
- Incubar en la oscuridad durante 15 min a temperatura ambiente.
Nota: Este control positivo cubreobjetos proporciona la densidad de avidina puntos de enlace, que se utiliza para calcular la LO.
- Preparar el control negativo.
- Spin-capa el plasma había limpiado cubreobjetos con 200 μL de 5 mM HEPES-NaOH y 2 mg/mL BSA (sin avidina).
- Incubar durante 15 min a temperatura ambiente para que seque.
- Añada 100 μL de 10 ng/mL purificada fluorescente biotina en 5 mM HEPES-NaOH de pH 7.2.
- Incubar en la oscuridad durante 15 min a temperatura ambiente.
Nota: Este control negativo cubreobjetos proporciona la cantidad de fijación no específica de cubreobjetos sin avidina biotina fluorescente.
- Enjuague cada cubreobjetos con 200 μL de agua destilada por pipeteo en los bordes del cubreobjetos para que no se toque el centro del cubreobjetos con la punta. Repita este lavado tres veces.
Nota: Después de aspirar el agua sobre el cubreobjetos, agua debe inmediatamente colocarse en el cubreobjetos para evitar que se seque completamente. - Exponga el aire plasma el mismo número de cubreobjetos como en el paso 4.2.
- Coloque el cubreobjetos limpio sobre el cubreobjetos muestra limite de paso 4,7 para evitar que se sequen.
5. observación con microscopía de fluorescencia de una molécula
- Puesta en marcha de un microscopio de fluorescencia de campo de campo amplio o evanescente.
PRECAUCIÓN: Directa o radiación dispersa de láser puede causar ojo o daño de la piel. Utilice gafas protectoras adecuadas y el escudo de la trayectoria de la luz láser.
Nota: Para la configuración del microscopio, por favor consulte nuestra anterior publicación16. Brevemente, un microscopio de fluorescencia de campo amplio o evanescente campo equipado con una alta potencia 488 nm láser la excitación, un alta abertura numérica del objetivo y una cámara de alta sensibilidad se puede utilizar para esta medida. Además, para una medición automatizada, una etapa controlada por ordenador XY muestra traslacional, persianas mecánicas para excitaciones láser y un sistema de enfoque automático se recomiendan para ser instalado. - El cubreobjetos en el microscopio y encontrar el foco.
- Realizar un análisis del azulejo para obtener imágenes por lo menos 100.
Nota: La iluminación de láser debe controlarse con obturadores mecánicos expuestos a la muestra sólo cuando la grabación de imágenes con la cámara, para minimizar el fotoblanqueo. Si hay muchas muestras, se recomienda medición automatizada mediante un programa informático para el control de los dispositivos de microscopio. Cada imagen incluye típicamente 100-500 puntos de molécula única cuando se utiliza una lente de objetivo de 60 x.
6. Análisis y extracción de información de la imagen
- Si la imagen tiene desnivel debido al patrón de iluminación láser, realizar procesamiento de imágenes para corregirla18.
- Adquirir una imagen de referencia midiendo con una muestra de cubreobjetos de tintes de propagación uniformemente usando una cámara de configuración de la misma como en el paso 5.3.
- Adquirir una imagen compensada midiendo con ninguna excitación láser, usando la misma configuración de cámara.
- Restar a cada valor de píxel en cada imagen de muestra y la imagen de referencia con el valor de la imagen compensada.
- Dividir cada valor de píxel en las imágenes de la muestra resta el valor de la imagen de referencia resta.
- Recoger imágenes debidamente adquiridos y quitar el fondo de la imagen.
- Eliminar imágenes que contienen grandes fluorescentes agregados manualmente.
- Quitar el fondo de la imagen mediante la aplicación de la balanceo-bola algoritmo19 con un radio de bola de 50 píxeles con ImageJ20.
- Enfocar imágenes por sustracción de imágenes borrosas con ImageJ (enfocar la función de la imagen).
- Encontrar y analizar puntos de molécula única en imágenes.
- Identificar puntos de molécula única con el Yen umbral algoritmo21 con ImageJ.
- Filtro de puntos con menos de dos píxeles para excluir oscuro ruido de la cámara y puntos de más de 20 píxeles para excluir los agregados de proteínas mediante ImageJ (Gerente de ROI).
- Contar el número de puntos en cada imagen. Usando la imágenes corregidas (paso 6.1.4), analizar la iluminación total de intensidades dentro de píxeles para cada punto con ImageJ.
- Calcular la capacidad de etiquetado (LO) usando la siguiente fórmula:
LO = (número de cuentas de la muestra / número de cuentas en el control positivo) x 100 - Calcular el número promedio de tintes fluorescentes enlazado a una molécula de proteína sola (n̄tinte).
- Análisis de un histograma de las intensidades de cada lugar.
Nota: El histograma generalmente tiene varios picos, y cada pico representa un número diferente de moléculas de colorante, unida a una proteína. El primero, segundo y tercer pico en el histograma corresponde a las moléculas 1, 2 y 3, respectivamente. - Calcular la intensidad media de histograma. Calcular también la intensidad de pico del primer pico aplicando un ajuste gaussiano.
- Calcular n̄tinte dividiendo la intensidad media con la intensidad de pico.
- Análisis de un histograma de las intensidades de cada lugar.
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Representative Results
Figura 4 representa los datos de imagen raw para las fracciones de diferente peso molecular de proteínas de célula HeLa lisada, así como el control positivo y negativo. Mientras que la muestra de proteína y positivo controlan de exhibición de 100 – 500 puntos por imagen, el control negativo muestra ninguno o pocos puntos, demostrando que el protocolo lo suficientemente inhibe la fijación no específica de los tintes a la superficie del cubreobjetos. Intensidad de mancha histogramas para las muestras de proteínas y el control positivo presentan múltiples picos, que representan Unión estocástica de tintes a aminas primarias de las proteínas y estructuras del tetrámero de avidina22, respectivamente. Todos los puntos demostraron fotoblanqueo intermitente y progresivo con excitación láser continuo, destacando la observación en el nivel de molécula única (figura 5AB).
El LO se calcula la relación de la cantidad de puntos en cada muestra de proteína para en el control positivo. El LO medido de la muestra de lisado de células HeLa varió de 50% para la fracción de (16 kDa) de peso molecular menor a 90% por el mayor peso molecular (120 kDa) fracción y fue 72% para la muestra de proteoma entero sin separación (figura 6). En consecuencia, n̄tinte tendió a aumentar con el aumento de peso molecular. Aumento de las tendencias se consideran ocurrir debido a un número mayor de residuos de lisina, conduce a aumento de NHS-éster enlace del tinte. Por ejemplo, la fracción de 23 kDa tiene un alto valor LO debido al gran número de residuos de lisina en las proteínas de la histona contenidas en esta fracción.
Figura 1: efecto de etiquetado homogeneidad en el recuento del número de proteínas proteoma. El número de cuenta de la proteína es altamente dependiente de cómo fuertemente y homogéneo se etiquetan las moléculas de proteína, en lugar de la relación entre número de proteínas a los tintes. La homogeneidad puede ser anotó mediante un parámetro denominado ocupación etiquetado (LO), que define la probabilidad de que las moléculas de la proteína marcada contra moléculas de la proteína total. Este valor proporciona la eficacia de la proteína cuenta (es decir, un mayor rendimiento LO más alto contar números (izquierda) y vice versa (derecha)). Mientras que un valor LO de 100% es ideal, LO de < 100% puede proporcionar un factor de atenuación para la estimación de números absolutos de la proteína. Esta figura ha sido modificada de Leclerc et al16 Copyright 2018 American Chemical Society. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: flujo de trabajo de análisis. En primer lugar, cubreobjetos (una) y (b) se tratan con avidina para lograr una densidad fija. En segundo lugar, marcada con fluorescencia muestra proteínas son biotinilado y al cubreobjetos (una) a través de la interacción de la avidina-biotina. En paralelo, casi 100% marcada con fluorescencia biotina purificado se inmoviliza sobre el cubreobjetos (b). En tercer lugar, los cubreobjetos son imágenes por microscopía de fluorescencia de una sola molécula para obtener la distribución de brillo y el número de puntos de fluorescencia. Por último, el parámetro de homogeneidad, LO, se calcula la relación de números de punto en (un) que en (b). Esta figura ha sido modificada de Leclerc et al16 Copyright 2018 American Chemical Society. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: separación de una muestra de proteoma de células HeLa mediante SDS-PAGE. Etiqueta fluorescente biotinilado celular lysate se migraron en dos distintos geles (20% acrilamida) y proteínas visualizadas utilizando el visor de gel, con un tiempo de exposición de 5 min y 10 min para gel 1 y gel 2, respectivamente. Los cuadros rojos representan a las regiones de gel cortadas y extraídas. Esta figura ha sido modificada de Leclerc et al16 Copyright 2018 American Chemical Society. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: solo imágenes de la molécula de proteoma muestras. Fluorescencia del punto imágenes (izquierdas) e histogramas de intensidades spot (derecha) obtenidas de fracciones de diferente peso molecular proteoma. La barra de escala es 10 μm. Las flechas en el control positivo indican el paso etiquetado diferentes de avidina. Esta figura ha sido modificada de Leclerc et al16 Copyright 2018 American Chemical Society. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: fotoblanqueo de puntos fluorescentes. (A) imágenes de Time-lapse de manchas fluorescentes bajo excitación láser continuo. (B) tiempo huellas de intensidades de fluorescencia en diferentes puntos. Las huellas muestran ya sea uno o dos paso fotoblanqueo, indicando los respectivos números de colorantes fueron acoplados a la proteína en el lugar de muestra purificada de BSA. Esta figura ha sido modificada de Leclerc et al16 Copyright 2018 American Chemical Society. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: etiquetado de homogeneidad de las muestras de proteoma. LO (azul) y n̄colorante (rojo oscuro) Obtenido de fracciones de diferente peso molecular. Los datos se expresan como promedio ± imágenes s.e. 98, 46, 27, 77, 44, 39, 62, 101, 65, 62, 82, 61 y 70 fueron analizados para la célula entera lisada, 16, 23, 55, 120, 19-25, 25 – 32, 32-42, 42-54, 54-69, 69-97, 97-136 y 136 – 226 fracciones kDa , respectivamente. Esta figura ha sido modificada de Leclerc et al16 Copyright 2018 American Chemical Society. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Este papel describe un protocolo para cuantificar la homogeneidad Etiquetadora de cada especie de etiquetado de proteínas en las células después de la separación con SDS-PAGE (paso 3). El método de separación puede ser sustituido con otros métodos como la cromatografía líquida o electroforesis capilar, que permiten la separación y fraccionamiento de proteínas celulares con alta resolución, mientras que requieren equipo especial23. El método de etiquetado con NHS-ester en el protocolo actual puede reemplazarse con otros métodos usando maleimida-ester o anticuerpos, por ejemplo.
El requisito para el análisis de homogeneidad de etiquetado depende de cuánto el etiquetado se desvía de un proceso aleatorio simple, como se supone en el análisis de eficiencia de acoplamiento. Nuestro reciente estudio16 indicó que el etiquetado de NHS-éster de proteínas se desvía de un proceso aleatorio dependiendo de las condiciones de reacción tales como pH y detergentes. Observamos que algunas condiciones inducidas por heterogeneidad por Cooperativa Unión de tintes a las proteínas o la existencia de una fracción de proteínas no reactiva debido a la solubilización incompleta o de baja afinidad para el colorante. Por el contrario, otras condiciones reducen heterogeneidad por la Unión completa de residuos reactivos dentro de una proteína para el tinte.
Consideramos que el pH es uno de los factores más influyentes sobre la homogeneidad de etiquetado. PH alto puede causar neutralización de los residuos de lisina en las proteínas, llevando a una mayor reactividad con el tinte de NHS-éster. Además, alto pH puede inducir lisis celular y puede desnaturalizar proteínas. Sin embargo, puesto que pH alto hace que la carga de proteínas negativo y no es conveniente para algunos experimentos como la electroforesis isoeléctrico o electroforesis 2D, la condición de pH debe considerarse con cuidado dependiendo de la finalidad de la investigación.
Para medir con precisión la homogeneidad etiquetadora en el ensayo, es importante usar suficiente muestra de proteína biotinilada. Esto es porque el análisis asume que las proteínas se unen con saturación a cada molécula de avidina en el cubreobjetos y los resultados de concentración insuficiente de proteínas en la subestimación de LO. Nuestro anterior estudio16 ha demostrado que por lo general más de 10 pg de proteína es necesario para enlace saturado, y esto puede obtenerse de las células de HeLa alrededor 1.00024, hasta después fraccionamiento. Se recomienda crear una serie de diluciones de la muestra de proteína para confirmar la saturación de spots de avidina. También observamos que la densidad de avidina en cubreobjetos deba optimizarse así no provocar solapamientos entre puntos en imágenes grabadas, dando números de lugares suficientes para el análisis estadístico.
Este análisis asume que una molécula de avidina tetravalente22 sobre el cubreobjetos puede unir una proteína. De hecho, los datos de control positivo en nuestro estudio anterior indican que una molécula de avidina puede enlazar hasta cuatro biotins fluorescencia etiquetadas, pero la mayoría (55%) de moléculas de avidina se unen sólo una o dos moléculas de biotina. Porque las proteínas son más grandes que la biotina, sus efectos estérico deben resultar menos proteínas a una avidina. Nuestra hipótesis es apoyado por el hecho de que n̄tinte permanece constante al medir muestras mixtas de etiquetados y sin etiqueta proteínas en diferentes relaciones16.
Dependiendo de la especie de proteína, Unión inespecífica de proteínas para el cubreobjetos puede suceder significativamente incluso con una capa de BSA. Si este es el caso, puede ser una opción para medir un control donde proteínas biotiniladas son cubiertas sobre el cubreobjetos sin avidina, en lugar de fluorescente biotina a paso 4.6.3. El efecto de la fijación inespecífica en LO puede eliminar matemáticamente restando el número de puntos de este control de la muestra de proteína.
Este Protocolo será muy valiosa para la proteína de una sola molécula de todo el proteoma contando análisis. La sensibilidad a la sola molécula permitirá análisis de cantidades de proteína para cada especie de proteína independientemente de su abundancia en la celda25. Esto se podría observar por proteoma separación seguida por la cuantificación del número de manchas de fluorescencia juntada con las proteínas. Además, la alta sensibilidad también permite análisis unicelular, permitiendo a los investigadores examinar la heterogeneidad entre las poblaciones de la célula hacer clustering de celular Estados y25,26.
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Disclosures
Los autores declaran la interest(s) financiera competencia siguientes: RIKEN ha presentado una solicitud de patente sobre estos resultados con S.L. y Y.T. nombrado como inventores Co.
Acknowledgments
Los autores agradecen a Masae Ohno y Kazuya Nishimura para asesoramiento y asistencia experimental. Este trabajo fue apoyado por PRESTO (JPMJPR15F7), Japón Agencia de ciencia y tecnología, subvenciones para jóvenes científicos (A) (24687022), desafiando la investigación exploratoria (26650055) y la investigación científica en áreas innovadoras (23115005), sociedad japonesa para la promoción de la ciencia y por las subvenciones de la Fundación de ciencia de Takeda y el Mochida Memorial Foundation para la investigación farmacéutica y médica. S.L. reconoce apoyo del programa de RIKEN internacional programa asociado (IPA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 22x22x0.15 mm coverslip | VWR | 470019-004 | |
| 488 nm Argon laser | Coherent | Innova 70C | |
| 488 nm dichroic mirror | Semrock | FF495-Di03 | |
| 488 nm emission filter | Semrock | FF02-520/28 | |
| 560 nm dichroic filter | Semrock | Di02-R561 | |
| 560 nm emission filter | Semrock | FF02-617/73 | |
| 560 nm fiber laser | MBP Communications | F-04306-2 | |
| 60x oil immersion lens | Olympus | PLAPON 60x | |
| Avidin | Nacalai-tesque | 03553-64 | |
| Biotin-PEG-amine | Thermo Scientific | 21346 | |
| Biotinylated Alexa Fluor 488 | Nanocs | ||
| Borate | Nacalai-tesque | ||
| BSA | Sigma-Aldrich | A9547 | |
| CHAPS | Dojindo | C008-10 | |
| Cy3 NHS-ester dye | GE Healthcare | PA13101 | |
| Dialyzer - D-tube, 6-8 kDa | Merck Millipore | 71507-M | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | ||
| DTT | Nacalai-tesque | 14112-94 | |
| EDC | Nacalai-tesque | ||
| EMCCD camera | Andor | IiXon 897 | |
| Epi fluorescence microscope | Olympus | IX81 | |
| Gel viewer | GE Healthcare | ImageQuant LAS 4000 | |
| Penicillin, streptomycine and Amphoterecin mix | Gibco | ||
| Plasma cleaner | Diener Electronic | ||
| SDS | Wako | NC0792960 | |
| Size purification column 10K | Merck Millipore | UFC5010 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 |
References
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