Summary
Burada, karmaşık protein örnek tek molekül düzeyinde her protein türler için etiketleme homojenliği değerlendirmek için bir protokol mevcut.
Abstract
Hücre proteomes kez Elektroforez deneyleri, nerede proteinler hücrelerdeki tüm türlerin özellikle sigara floresan bir boya ile etiketlenir ve ayırma takip photodetector tarafından fark kullanarak karakterizedir. Tek molekül Floresans görüntüleme NEMS protein algılama bireysel floresan moleküllerin görüntülenmesi için onun yetenek sağlayabilir. Ancak, bu güçlü görüntüleme yöntemi uygulamaya Elektroforez deneyleri floresan her protein türleri arasında Proteom etiketleme homojenliği karakterize için yollar eksikliği ile engel oluyor. Burada, bir tek molekül Floresans görüntüleme tahlil dayalı Proteom genelinde etiketleme homojenliği değerlendirmek için bir yöntem geliştirdi. Bir HeLa hücre örnek, biz 'doluluk etiketleme' olarak adlandırdığı en az bir boya ile etiketli protein oranı kullanarak bizim ölçüm (LO), Aralık için uygulamanın tek molekül görüntüleme için yüksek potansiyel destekleyen %90 %50 belirlendi duyarlı ve hassas Proteom analizleri.
Introduction
Protein molekülleri hücre içinde ifade kümesinin tamamını ölçmek için amaçlayan Proteom analizleri, mevcut biyolojik ve tıbbi çalışmalar değerli bir yaklaşımdır. Bu analizin yaygın spectra protein iyonlaşma1,2,3ile oluşturulan temel protein türü tanımlar kütle spektrometresi kullanır. Elektroforez, polyacrylamide Jel Elektroforez (sayfa) dahil olmak üzere, Kapiler Elektroforez ve iki boyutlu (2D) Jel Elektroforez Proteom analizler için alternatif bir yöntem olduğunu. Bu yöntem belirsiz floresan elektroforetik ayrımı ve algılama ve miktar her protein türlerin takip analiz hücrelerdeki tüm protein molekülleri etiketlerine göre üzerinde dayanır. Gerekli non-spesifik protein etiketleme elde etmek için bir strateji proteinler Coomassie mavi ve Sypro Ruby4,gibi5,6 Elektrostatik ve hidrofobik etkileşimler yoluyla bağlayabilirsiniz floresan boyalar kullanmaktır . N-hydroxysuccinimide (NHS) ester veya hangi kovalent proteinler Birincil aminler ve thiols gibi ortak artıkları ile bağlayabilirsiniz, maleimide, sırasıyla7, içeren boya ile kovalent etiketleme kullanmak için alternatif bir stratejidir 8.
Bu arada, Floresans algılama hassasiyeti düşük-bereket proteinler ve az sayıda hücre analiz etmek için idealdir. Tek molekül Floresans görüntüleme bireysel floresan boyalar ve in vitro ve içinde vivo9,10,11,12etiketli proteinler algılanmasını sağlayan en önemli yöntemlerinden biridir, 13,14,15. Bu görüntüleme yönteminin uygulamaya Proteom Elektroforez tabanlı analiz bireysel fluorescently etiketli protein sayımı tarafından son derece hassas ve kantitatif testleri etkinleştirmek için bekleniyor. Ancak, bu floresan boyalar ile etiketleme tüm protein molekülleri yeterince homojen olup olmadığı ve nasıl bu homojenliği farklı protein türler (şekil 1) tarafından etkilenir belirsizdir. Basit toplu çözüm ölçümleri8 'verimlilik kaplin' veya 'verimlilik etiketleme' denilen proteinlere floresan boyalar molar oranı elde etmek için kullanılabilir, ancak bu özellik arasında etiketleme homojenliği ilgili bilgi sağlamaz protein molekülleri.
Burada, biz tüm protein türleri16hücre (Şekil 2) için etiketleme homojenliği araştırmak bir tahlil için protokol tanımlamak. Bu testin iki anahtar adım protein saflaştırma ve görüntüleme vardır. İlk adımda, hücrelerdeki tüm proteinler fluorescently etiketlenir ve biotinylated sonra ayrı ayrı Jel Elektroforez kullanarak ayıklanır, electroelution tarafından takip. İkinci adımda, ayıklanan örneklerinde bireysel protein, Floresans özelliklerini tek molekül görüntüleme üzerinde göre değerlendirilir. Bu veri, parametreleri gibi proteinler yüzdesi ile en azından bir tane etiketli sayım çözümleme için önemli boya, hangi etiketleme doluluk (LO)16dediğimiz ve floresan boyalar ortalama sayısı bir tek protein molekülüne bağlı (n̄ boya), karakterize edilebilir. İletişim kuralı ' HeLa hücre Proteom NHS ester tabanlı siyanür 3 (Cy3) boya ile etiketleme için en iyi duruma getirilmiş bir yordam bir örnek olarak sunulur ve istenen araştırma hedeflerine göre etiketleme diğer yordamlar ile değiştirilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. hücre hazırlık
- HeLa hücreleri 37 ° C'de 10 cm tabak içinde yetiştirmek altında %5 CO2 ' Dulbecco'nın modifiye kartal orta % 10 fetal sığır serum içeren.
- % 70 confluency, ATCC yönergeleri17takip alabilirseniz katlanarak büyüyen hücreleri toplamak.
- 1 fosfat tamponlu tuz (PBS) (pH 7,4) x 5 mL hücrelerle durulayın. PBS kaldırın.
- 1 mL %0.1 tripsin-ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) ekleyin. 37 ° C'de 5 dk kuluçkaya
- İlerlemesini hücre ayrılma mikroskobu tarafından izlemek.
- Hücreleri yuvarlak haline gelir ve yemek müstakil kez büyüme orta 4 mL ekleyin ve pipetting tarafından hücre Aglomerasyon kırmak.
- Bir hücre sayaç kullanarak hücreleri saydırmak.
- 150 x g bir santrifüj tüpü 10 min için de santrifüj kapasitesi. Orta kaldırmak ve hücre Pelet ile 5 mL 1 x PBS (pH 7,4) de resuspend.
- 1.2.6 arasındaki adımları yineleyin. 1 x 106 hücre/mL sayısı adımda 1.2.5 kullandığı, son bir konsantrasyon (pH 7,4) PBS'ye hücrelerde resuspend.
Not: Hücre süspansiyon için birkaç ay bölünmemeli ve-80 ° C'de depolanmış olabilir. Donma/çözülme döngüsü yinelenen kaçınılmalıdır.
2. hücre lizis ve floresan etiketleme
- Arabellek lysing 10 mL olun (0.1 M Borat, % 1 Sodyum Lauryl Sülfat (SDS) ve % 1'i ara 20). PH 12 2 M NaOH kullanarak ayarlayın.
Dikkat: Konsantre NaOH aşındırıcı. Bu çözüm hazırlarken uygun eldiven ve gözlük giymek.
Not: Lysing arabellek oda sıcaklığında bir hafta kadar depolanabilir. - 1 M dithiothreitol (DTT) 1 μL ile tampon ve 4 lysing, Mix 100 μL μL %50 3-[(3-cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propanesulfonate (çocuklar).
- Mix 1 μL karışık lysing arabellek adım 2.2 ile hücre kültür (yaklaşık 1.000 hücreleri). Çözüm yavaş yavaş kabarcıklar önlemek için pipetting tarafından lunaparkçı. Nazik ajitasyon ile 5 min için oda sıcaklığında karanlıkta kuluçkaya. Çözüm yavaş yavaş pipetting tarafından yeniden lunaparkçı.
- 2 μg/ml Cy3 NHS-ester boya 1 μL ekleyin. Çözüm yavaş yavaş kabarcıklar önlemek için pipetting tarafından lunaparkçı. Karanlıkta nazik ajitasyon ile oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya.
Not: Bu arabelleği yüksek pH yüksek reaktivite için önde gelen proteinler, nötralizasyon lizin kalıntılarının neden olur. - 2 μg/ml Cy3 NHS-ester boya 1 μL ilavesi yineleyin. Çözüm yavaş yavaş kabarcıklar önlemek için pipetting tarafından lunaparkçı. Karanlıkta nazik ajitasyon ile oda sıcaklığında 10 dakika için kuluçkaya.
Not: Bu bazı Cy3 NHS-ester boya hidrolize ve reaksiyon arabellek yüksek pH tarafından devre dışı bırakıldı çünkü NHS-ester boya ilavesi etiketleme verimliliği artırabilir tekrar. - PH 7.2 0.8 m 100 μL ekleyerek 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic asit (HEPES) ayarlamak-NaOH pH 7.2 tepki gidermek için. Çözüm yavaş yavaş kabarcıklar önlemek için pipetting tarafından lunaparkçı.
- 19 mg/mL biotin-(polietilen glikol (PEG))220 μL eklemek-Amin ve 20 mg/ml 1 5 μL-etil - 3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC). Çözüm yavaş yavaş kabarcıklar önlemek için pipetting tarafından lunaparkçı. Karanlıkta nazik ajitasyon ile oda sıcaklığında 1 h için kuluçkaya.
Not: Bu biotinylation adım protein molekülleri sabit bir yoğunluk ve protein türler için hiçbir önyargı ile mikroskop coverslip gidermek gereklidir. - Unreacted etiketleme reaktifler kaldırmak ve üreticinin yönergeleri izleyin 10 kDa kesme ile bir Ultrafiltrasyon sütun kullanarak örnek konsantre.
Not: Protokol burada duraklatılmış. Örnek-80 ° C'de birkaç hafta saklanır.
3. Proteom ayrılık ve kurtarma
- 4 x SDS örnek arabellek (200 mM Tris-HCl pH 6.8, % 4 SDS, % 4 gliserol ve % 0,4 bromophenol mavi) ekleyin.
Not: boya zarar görmemesi için protein örnek olarak standart SDS-sayfa içinde ısıtmalı değil ve oda sıcaklığında tutulmalıdır. - Standart SDS-sayfa protein örnek ve % 20 Akrilamid jel kullanarak moleküler bir merdiven için gerçekleştirin. Örnek göç göç kadar sabit voltaj (160 V), jel içinde açık sadece jel çıkar.
- Protein bantları (şekil 3) konumunu belirlemek için jel görüntü.
- Protein kesirler üzerindeki bant konumlar dayalı keskin bir bıçak kullanarak ilgi de dahil olmak üzere jel bölümlerini kesip. Fractioning 16, 23, 55 ve 120 kDa tepeler ve 19-25, 25-32, 32-42, 42 – 54, 54-69, 69-97, 97-136 ve 136 – 226 kDa bölgeleri şekil 3' te gösterilmektedir.
- 6 – 8 kDa, üreticinin yönergeleri izleyerek gözenek büyüklüğü ile electroelution bir dialyzer kullanarak proteinler ayıklayın.
Not: Ayıklanan örnek-80 ° C'de birkaç hafta saklanır.
4. mikroskop coverslip hazırlık
- Avidin arabelleği (5 mM HEPES NaOH pH 7.2, 10 ng/mL avidin ve 2 mg/mL sığır serum albumin (BSA)) 200 μL her örnek için hazırlayın.
- 22 x 22 mm ve 0.15 mm kalınlıkta coverslips hazırlayın. Temiz ve onların yüzeyleri etkinleştirmek için bir plazma temizleyici 1 dk ile plazma hava coverslips maruz.
- Kat ile avidin spin-kaplama 200 μL 500 RPM, 1000 devir/dakika, 30 saniye ve ardından 5 saniye için bir spin coater kullanarak avidin arabelleği tarafından coverslips. Coverslips kuru bildirmek için oda sıcaklığında 15 dk için kuluçkaya.
- Coverslips protein örnek için hazırlayın.
- (3.5) alınan protein örneğin 100 kere 5 mM HEPES NaOH pH 7.2 oranında seyreltin.
- Yer 100 μL seyreltilmiş örnek yüzeyinde avidin kaplı coverslip ortasına (Adım 4.3).
- 15 dakika oda sıcaklığında karanlıkta kuluçkaya.
- Pozitif kontrol hazırlayın.
- Yer 100 μL 10 ng/mL, 5 mM HEPES NaOH pH 7.2 avidin ortasındaki kaplı coverslip (Kimden adım 4.3) floresan biotin saf.
- 15 dakika oda sıcaklığında karanlıkta kuluçkaya.
Not: Bu olumlu denetim coverslip avidin yoğunluğu bağlama noktaları, LO hesaplamak için kullanılan sağlar.
- Negatif kontrol hazırlayın.
- Spin-ceket plazma coverslip 5 mm HEPES NaOH ve 2 mg/mL BSA (olmadan avidin) 200 μL ile temizledim.
- 15 dakika kuruması için oda sıcaklığında kuluçkaya.
- 10 ng/mL saf floresan biotin 100 μL 5 mM HEPES NaOH pH 7.2 ekleyin.
- 15 dakika oda sıcaklığında karanlıkta kuluçkaya.
Not: Bu negatif kontrol coverslip non-spesifik bağlama avidin olmadan coverslip için floresan biotin miktarda sağlar.
- Coverslip ucu orta dokunmak coverslip kenarlarında pipetting her coverslip 200 μL distile su ile durulayın. Bu yıkama üç kere tekrar edin.
Not: coverslip su alıyorum sonra su hemen geri coverslip tamamen kurumasını önlemek için üzerinde yer almalıdır. - Hava plazma coverslips adım 4.2 olduğu gibi aynı sayıda için maruz.
- Temizlenmiş coverslip kurutma önlemek için adım 4.7 örnek bağlı coverslip yerleştirin.
5. gözlem tek molekül Floresans mikroskobu ile
- Bir geniş-alan veya fani alan Floresans mikroskobu başlatın.
Dikkat: Doğrudan veya dağınık lazer radyasyon veya deri hasar göz neden olabilir. Uygun koruyucu gözlük giymek ve lazer ışık yolunu kalkan.
Not: mikroskop kurulum için lütfen bizim önceki yayın16' bakın. Kısaca, bir yüksek güçlü 488 nm lazer uyarma, yüksek sayısal diyafram objektif lens ve yüksek hassasiyet kamera ile donatılmış geniş-alan veya fani alan floresan mikroskop bu ölçüm için kullanılabilir. Ayrıca, otomatik bir ölçüm için bir bilgisayar kontrollü XY translasyonel örnek sahne, lazer uyarilmalar için mekanik panjurlar ve bir otomatik odaklama sistemi yüklenecek tavsiye edilir. - Coverslip mikroskobunun ayarla ve odak bulmak.
- En az 100 adet fotoğraf elde etmek için bir kiremit taraması gerçekleştirin.
Not: Lazer aydınlatma için örnek resimleri photobleaching en aza indirmek için kamera ile kaydederken kullandığı için mekanik panjurlar ile kontrol edilmelidir. Pek çok örnekleri varsa, otomatik ölçüm mikroskop aygıtları denetlemek için bir bilgisayar programı kullanarak önerilir. Her resim bir 60 x objektif lens kullanırken genellikle 100-500 tek molekül noktalar içerir.
6. görüntü analizi ve bilgi çıkarma
- Görüntü olmayacak nedeniyle lazer aydınlatma desen varsa,18düzeltmek için görüntü işleme dışarı taşımak.
- Bir başvuru yansıması düzgün yayılmış boyalar ile aynı adım 5.3 ayarlama bir kamera ile oluşan bir coverslip örnek ile ölçerek elde etmek.
- Mahsup görüntüyü aynı kamera ayarı kullanarak hiçbir lazer uyarma ile ölçerek elde etmek.
- Her örnek görüntü ve referans görüntü her piksel değeri mahsup resmin değeri ile çıkarın.
- Her piksel değeri subtracted örnek görüntüler subtracted başvurusu görüntüsünde bölün.
- Düzgün alınan görüntüleri toplamak ve görüntü arka plan çıkarmak.
- Görüntüleri büyük floresan toplamları içeren el ile kaldırın.
- Görüntü arka plan top inişli çıkışlı algoritması19 50 piksel ImageJ20kullanarak topu RADIUS ile uygulanarak kaldırın.
- ImageJ kullanarak bulanık görüntüleri çıkararak görüntüleri netleştirmek (görüntü işlevi keskinleştirmek).
- Bulmak ve tek molekül noktalar görüntülerde çözümleyebilirsiniz.
- Tek molekül noktalar ImageJ kullanarak Yen eşik algoritma21 ile tanımlayın.
- Noktalar toplamalardan ImageJ (ROI Yöneticisi) kullanarak proteinlerin dışlamak için 20'den fazla piksel kamera ve noktalar karanlık gürültü çıkarmak için ikiden az piksel ile filtre.
- Her görüntü sıralarda saymak. Düzeltilmiş görüntüleri (adım 6.1.4), analiz aydınlatma kullanarak toplam piksel her nokta için yoğunluklarını ImageJ kullanarak.
- Etiketleme doluluk (LO) aşağıdaki formülü kullanarak hesaplar:
LO = (sayı sayıları örnekteki / olumlu denetim sayıları sayı) x 100 - Floresan boyalar tek protein molekül (n̄boya) bağlı ortalama sayısını hesaplayın.
- Bir çubuk grafik her spot yoğunluklarını analiz.
Not: Histogram genellikle birkaç tepeler vardır ve her tepe boya molekülleri bir protein bağlı farklı bir sayısını gösterir. Birinci, ikinci ve üçüncü en yüksek histogram karşılık gelen molekülleri, 1, 2 ve 3 sırasıyla. - Histogram üzerinden ortalama yoğunluğu hesaplayabilirsiniz. De ilk tepe tepe yoğunluğunu uygun bir Gauss uygulayarak hesaplar.
- N̄boya ortalama yoğunluğu en yüksek yoğunluğu ile bölerek hesaplayın.
- Bir çubuk grafik her spot yoğunluklarını analiz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 4 ham görüntü verilerine HeLa hücre lysate proteinlerin farklı molekül ağırlığı kesirler için hem de pozitif ve negatif Denetim temsil eder. Sergi 100-500 noktalar resim başına protein örnek ve pozitif kontrol, negatif kontrol yok veya birkaç noktalar, protokol yeterince coverslip yüzeye boyalar spesifik olmayan bağlama engeller gösterilen görüntüler. Nokta yoğunluğu histogramlar protein örnekleri ve olumlu denetim boyalar Stokastik bağlayıcı proteinler ve avidin tetramer yapıları22, Birincil aminler sırasıyla gösteren birden çok doruklarına mevcut. Tüm noktalar sürekli lazer uyarma, gözlem (şekil 5AB) tek molekül düzeyinde vurgulama ile yanıp sönen ve kademeli photobleaching gösterdi.
LO noktaların her protein örnek sayısını oranı için olumlu denetiminde hesaplanır. LO daha küçük molekül ağırlıklı (16 kDa) kısmı için % 50 daha yüksek molekül ağırlıklı (120 kDa) kısmı için % 90 arasında değişiyordu HeLa hücre lysate örnek üzerinden ölçülür ve ayırma (şekil 6) olmadan tüm Proteom örnek için % 72 oldu. Buna bağlı olarak, n̄boya molekül ağırlığı ile artacaktır eğiliminde. Bu eğilimler artan artan NHS-ester için önde gelen lizin kalıntılarının yüksek sayılar nedeniyle gerçekleşmesi için kabul edilir boya bağlama. Örneğin, 23 kDa kesir bu kesir içerdiği Histon proteinleri lizin kalıntılarında çok sayıda nedeniyle yüksek bir LO değeri vardır.
Şekil 1: protein sayı sayma üzerinde homojenliği etiketleme Proteom etkisi. Protein sayısı sayısı ne kadar güçlü son derece bağımlı ve homojen protein molekülleri, proteinler boyalar için numara oranı yerine etiketlenir. Homojenliği etiketli protein molekülleri toplam protein molekülleri karşı olasılığını tanımlar etiketleme doluluk (LO) olarak adlandırdığı bir parametresi kullanılarak attı. Bu değer protein sayma verimlilik sağlar (yani, yüksek LO verimleri daha yüksek sayılar (solda) ve Yardımcısı sayısı (sağda) çok yönlü). İken %100 LO değeri ideal, LO, < % 100 mutlak protein numaraları tahmin etmek için bir zayıflama faktör sağlayabilir. Bu rakam Leclerc vd.16 telif hakkı 2018 Amerikan Kimya Derneği değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: tahlil iş akışı. İlk olarak, coverslips (bir) ve (b) avidin ile sabit bir yoğunluğu sağlamak için kabul edilir. İkinci, fluorescently etiketli örnek protein biotinylated vardır ve coverslip (bir) avidin-biotin etkileşim bağlı. Buna paralel olarak, yaklaşık coverslip (b) % 100 saf biotin fluorescently etiketli immobilize. Üçüncü olarak, coverslips floresan noktalar sayı ve parlaklık dağılımı elde etmek için tek molekül Floresans mikroskobu tarafından görüntüsü. Son olarak, homojenizasyon parametresi, LO, (bir) nokta numaraları oranı için (b) hesaplanır. Bu rakam Leclerc vd.16 telif hakkı 2018 Amerikan Kimya Derneği değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: SDS-sayfa kullanarak bir HeLa hücre Proteom örnek ayrılması. Fluorescently etiketli ve biotinylated hücre lysate iki farklı jelleri (% 20 Akrilamid) göç ve proteinler için 5 min ve 10 dk çekim hızı ile jel Görüntüleyicisi'ni kullanarak görüntülenir jel 1 ve 2, sırasıyla jel. Kırmızı kutuları kesip ve çıkarılan jel bölgeleri temsil eder. Bu rakam Leclerc vd.16 telif hakkı 2018 Amerikan Kimya Derneği değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: tek molekül görüntüleri Proteom örneklerinin. Floresans nokta görüntüleri (solda) ve farklı molekül ağırlığı Proteom kesirler elde edilen çubuk spot yoğunluklarını (sağda). Ölçek çubuğu 10 mikron olduğunu. Pozitif kontrol okları avidin farklı etiketleme aşamasını gösterir. Bu rakam Leclerc vd.16 telif hakkı 2018 Amerikan Kimya Derneği değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5: floresan yerlerinden Photobleaching. (A)altında sürekli lazer uyarma floresan noktalar hızlandırılmış görüntülerini. (B) zaman Floresans yoğunluklarını farklı noktalarda izler. Boyalar ilgili sayıda protein saf BSA örnek noktada birleştiğinde belirten ya bir ya da iki adım photobleaching, göstermektedir. Bu rakam Leclerc vd.16 telif hakkı 2018 Amerikan Kimya Derneği değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 6: Proteom örnekleri polimerlerin etiketleme. LO (mavi) ve farklı molekül ağırlığı kesirler elde edilen n̄boya (Bordo). Veri ifade ± se 98, 46, 27, 77, 44, 39, 62, 101, 65, 62, 82, 61 ve 70 görüntüler anlamına gibi lysate, Bütün hücre için analiz edildi 16, 23, 55, 120, 19-25, 25-32, 32-42, 42 – 54, 54-69, 69-97 97-136 ve 136 – 226 kDa kesirler , sırasıyla. Bu rakam Leclerc vd.16 telif hakkı 2018 Amerikan Kimya Derneği değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu kağıt ayırma SDS-sayfa (Adım 3) ile sonra etiketleme homojenliği hücrelerdeki her etiketli protein türlerin ölçmek için bir protokol açıklar. Ayırma yöntemi ayrılık ve ayırma proteinlerin yüksek çözünürlüklü, özel ekipman23gerektiren süre izin sıvı Kromatografi veya kapiller Elektroforez, gibi diğer yöntemleri ile yedek olabilir. NHS-ester içinde geçerli protokolü kullanılarak etiketleme yöntemi maleimide-ester veya antikorlar, örneğin kullanarak diğer yöntemleri ile değiştirilebilir.
Homojenliği analiz etiketleme için gereksinimin üzerinde basit bir rasgele süreç sapma ne kadar etiketleme olarak kaplin verimliliği analizde kabul bağlıdır. Bizim son çalışma16 NHS-ester proteinlerin etiketleme pH ve deterjanlar gibi tepki şartlarına bağlı olarak rasgele bir işlemi sapma belirtti. Biz bazı koşullar heterojenite boyalar proteinler için kooperatif bağlama ya da bir kısmını eksik solubilization veya boya için indirdi ilgi nedeniyle non-reaktif protein varlığını tarafından indüklenen gözlenen. Buna karşılık, diğer koşullar heterojenite boya için bir proteinin içinde reaktif kalıntılarının tam bağlama tarafından azaltılmış.
Biz bu pH etiketleme homojenliği üzerinde en etkili faktörlerden biridir düşünün. Yüksek pH nötralize lizin kalıntılarının proteinler, NHS-ester boya ile daha yüksek reaktivite yol açan neden olabilir. Buna ek olarak, yüksek pH hücre lizis tetikleyebilir ve proteinler denatüre. Bu yana yüksek pH proteinler fiyat istemek negatif yapar ve isoelectric Elektroforez veya 2D Elektroforez gibi bazı deneyleri için uygun değildir, ancak, pH koşulu araştırma amacına bağlı dikkatle düşünülmesi gerekiyor.
Tam olarak tahlil etiketleme homojenliği ölçmek için yeterli biotinylated protein örneği kullanmak önemlidir. Bunun nedeni proteinler her avidin molekül coverslip ve yetersiz protein konsantrasyonu sonuçlarında LO küçümseme ile doygunluğu ile bağlamak tahlil varsayar. Bizim önceki çalışma16 genellikle protein 10'dan fazla pg doymuş bağlama için gereklidir ve bu bile ayırma sonra yaklaşık 1000 HeLa hücreleri24, elde edilebilir göstermiştir. Bu avidin noktalar doygunluk onaylamak için protein örnek seyreltme serisi oluşturmak için tavsiye edilir. Ayrıca coverslip üzerinde avidin yoğunluğu çok optimize değil neden olduğu kaydedilen görüntüleri istatistiksel analiz için yeterli nokta numaraları verirken, noktalar arasında örtüşen gerekebilir unutmayın.
Bu tahlil bir varsayar tetravalent avidin molekül22 coverslip bir protein bağlamak. Gerçekten de, bizim önceki çalışmanın olumlu denetim verileri bu bir avidin molekül dört fluorescently etiketli biotins ama çoğunluk (% 55) bağlayabilirsiniz belirtilen avidin molekülleri yalnızca bir veya iki biotin molekül bağlamak. Proteinler biotin büyük olduğundan, steric etkileri daha az proteinler için bir avidin bağlı sonuçlanmalıdır. Varsayımımız daha fazla Aslında tarafından desteklenen karma örnekleri ölçme etiketli ve etiketsiz proteinler farklı oranlara16o n̄boya sabit kalır.
Bağlı olarak protein türleri, proteinlerin coverslip belirsiz bağlama önemli ölçüde bile BSA kaplama ile ortaya çıkabilir. Bu durumda ise, bir seçenek nerede biotinylated proteinler üzerinde coverslip adımda 4.6.3 floresan biotin yerine avidin olmadan kaplı olan bir denetim ölçmek için olabilir. Belirsiz bağlama LO üzerinde etkisini matematiksel olarak bu protein örneği bu denetimden noktaların sayısını çıkarılarak ortadan kaldırılabilir.
Bu iletişim kuralı için Proteom genelinde tek molekül protein analizleri sayma paha biçilmez olacak. Tek molekül duyarlılık analizi protein miktarları her protein türü ne olursa olsun onların bereket için hücre25' izin verir. Bu proteinler ile birleştiğinde Floresans noktaların sayısını miktar ardından Proteom ayırma tarafından fark. Ayrıca, yüksek hassasiyet-ecek da bırakmak tek hücre analizi, araştırmacılar hücre popülasyonlarının heterojenite incelemek için etkinleştirme ve hücresel kümeleme için25,26devletler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar aşağıdaki rakip mali interest(s) ilan: RIKEN S.L. ve yardımcı mucitler adlandırılan Y.T. ile bu sonuçlar üzerinde bir patent başvurusu under.
Acknowledgments
Yazarlar Masae Ohno ve Kazuya Nishimura deneysel yardım ve tavsiye için teşekkür ederiz. Bu eser PRESTO (JPMJPR15F7), Japonya bilim ve teknoloji ajansı, genç bilim adamları (A) (24687022), araştırmacı araştırma (26650055) zorlu ve yenilikçi alanlara (23115005), Japonya Derneği bilimsel araştırma için Grants-in-aid tarafından desteklenmiştir Bilim ve hibe Takeda Bilim Vakfı ve Mochida Anıtı Vakfı tarafından promosyon Medikal ve ilaç araştırma için. S.L. RIKEN Uluslararası Program ilişkilendirmek (IPA) programından destek kabul eder.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 22x22x0.15 mm coverslip | VWR | 470019-004 | |
| 488 nm Argon laser | Coherent | Innova 70C | |
| 488 nm dichroic mirror | Semrock | FF495-Di03 | |
| 488 nm emission filter | Semrock | FF02-520/28 | |
| 560 nm dichroic filter | Semrock | Di02-R561 | |
| 560 nm emission filter | Semrock | FF02-617/73 | |
| 560 nm fiber laser | MBP Communications | F-04306-2 | |
| 60x oil immersion lens | Olympus | PLAPON 60x | |
| Avidin | Nacalai-tesque | 03553-64 | |
| Biotin-PEG-amine | Thermo Scientific | 21346 | |
| Biotinylated Alexa Fluor 488 | Nanocs | ||
| Borate | Nacalai-tesque | ||
| BSA | Sigma-Aldrich | A9547 | |
| CHAPS | Dojindo | C008-10 | |
| Cy3 NHS-ester dye | GE Healthcare | PA13101 | |
| Dialyzer - D-tube, 6-8 kDa | Merck Millipore | 71507-M | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | ||
| DTT | Nacalai-tesque | 14112-94 | |
| EDC | Nacalai-tesque | ||
| EMCCD camera | Andor | IiXon 897 | |
| Epi fluorescence microscope | Olympus | IX81 | |
| Gel viewer | GE Healthcare | ImageQuant LAS 4000 | |
| Penicillin, streptomycine and Amphoterecin mix | Gibco | ||
| Plasma cleaner | Diener Electronic | ||
| SDS | Wako | NC0792960 | |
| Size purification column 10K | Merck Millipore | UFC5010 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 |
References
- Wilhelm, M., et al.
- Guo, A., et al. Immunoaffinity enrichment and mass spectrometry analysis of protein methylation. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (1), 372-387 (2014).
- Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).
- Neuhoff, V., Arold, N., Taube, D., Ehrhardt, W. Improved staining of proteins in polyacrylamide gels including isoelectric focusing gels with clear background at nanogram sensitivity using Coomassie Brilliant Blue G-250 and R-250. Electrophoresis. 9 (6), 255-262 (1988).
- Berggren, K., et al. Background-free, high sensitivity staining of proteins in one- and two-dimensional sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels using a luminescent ruthenium complex. Electrophoresis. 21 (12), 2509-2521 (2000).
- Butt, R. H., Coorssen, J. R. Coomassie blue as a near-infrared fluorescent stain: a systematic comparison with Sypro Ruby for in-gel protein detection. Molecular & cellular proteomics. 12 (12), 3834-3850 (2013).
- Nanda, J. S., Lorsch, J. R. Labeling a protein with fluorophores using NHS ester derivitization. Methods in Enzymology. , 87-94 (2014).
- Kim, Y., et al. Efficient site-specific labeling of proteins via cysteines. Bioconjugate chemistry. 19 (3), 786-791 (2008).
- Dickson, R. M., Cubitt, A. B., Tsien, R. Y., Moerner, W. E. On/off blinking and switching behaviour of single molecules of green fluorescent protein. Nature. 388 (6640), 355-358 (1997).
- Penna, A., et al. The CRAC channel consists of a tetramer formed by Stim-induced dimerization of Orai dimers. Nature. 456 (7218), 116-120 (2008).
- Ji, W., et al. Functional stoichiometry of the unitary calcium-release-activated calcium channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (36), 13668-13673 (2008).
- Ulbrich, M. H., Isacoff, E. Y.
- Sugiyama, Y., Kawabata, I., Sobue, K., Okabe, S. Determination of absolute protein numbers in single synapses by a GFP-based calibration technique. Nature Methods. 2 (9), 677-684 (2005).
- Puchner, E. M., Walter, J. M., Kasper, R., Huang, B., Lim, W. A. Counting molecules in single organelles with superresolution microscopy allows tracking of the endosome maturation trajectory. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (40), 16015-16020 (2013).
- Grassart, A., et al. Actin and dynamin2 dynamics and interplay during clathrin-mediated endocytosis. The Journal of Cell Biology. 205 (5), 721-735 (2014).
- Leclerc, S., Arntz, Y., Taniguchi, Y. Extending Single Molecule Imaging to Proteome Analysis by Quantitation of Fluorescent Labeling Homogeneity in Complex Protein Samples. Bioconjugate chemistry. 29 (8), 2541-2549 (2018).
- Ian Freshney, R. Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications. , John Wiley & Sons. (2015).
- Taniguchi, Y., et al. Quantifying E. coli proteome and transcriptome with single-molecule sensitivity in single cells. Science. 329 (5991), 533-538 (2010).
- Sternberg,
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
- Yen, J. C., Chang, F. J., Chang, S. A new criterion for automatic multilevel thresholding. IEEE Transactions on Image Processing. 4 (3), 370-378 (1995).
- Livnah, O., Bayer, E. A., Wilchek, M., Sussman, J. L.
- Mostovenko, E., Hassan, C., Rattke, J., Deelder, A. M., van Veelen, P. A., Palmblad, M. Comparison of peptide and protein fractionation methods in proteomics. EuPA Open Proteomics. 1, 30-37 (2013).
- Volpe, P., Eremenko-Volpe, T. Quantitative studies on cell proteins in suspension cultures. European Journal of Biochemistry. 12 (1), 195-200 (1970).
- Huang, B., et al. Counting low-copy number proteins in a single cell. Science. 315 (5808), 81-84 (2007).
- Johnson, A. C., Bowser, M. T. H. igh- High-Speed, Comprehensive, Two Dimensional Separations of Peptides and Small Molecule Biological Amines Using Capillary Electrophoresis Coupled with Micro Free Flow Electrophoresis. Analytical Chemistry. 89 (3), 1665-1673 (2017).
