Summary
Her presenterer vi en protokoll for å vurdere merking homogenitet for hver protein arter i en kompleks protein prøve på ett molekyl nivå.
Abstract
Celle proteomes er ofte preget med geleelektroforese analyser, hvor alle arter av proteiner i cellene nonspecifically merket med et fluorescerende farge og er oppdaget av en photodetector etter deres atskillelse. Ett molekyl fluorescens bildebehandling kan gi ultrasensitive proteinet oppdagelsen sin evne til å visualisere fluorescerende molekyler. Men er anvendelsen av denne kraftige bildebehandling metode til geleelektroforese analyser hindret av mangelen på måter å karakterisere homogenitet av fluorescerende merking av hver protein Art over proteom. Her utviklet vi en metode for å vurdere merking homogenitet over proteom basert på en enkelt molekyl fluorescens tenkelig analysen. I vår måling ved hjelp av et jakten celle utvalg, andelen av proteiner merket med minst ett fargestoff, som vi kalt 'merking bruk' (LO), identifiserte utvalg fra 50% til 90%, støtter det høye potensialet av ett molekyl avbildning til følsom og presis proteom analyse.
Introduction
Proteom analyse, som tar sikte på å kvantifisere hele settet med protein molekyler i cellen, er en verdifull tilnærming i gjeldende biologiske og medisinske studier. Denne analysen er vanligvis avhengig av massespektrometri, som identifiserer protein arter basert på spectra generert gjennom protein ionisering1,2,3. En alternativ metode for proteom analyse er geleelektroforese, inkludert polyakrylamid gel geleelektroforese (side), kapillære gelelektroforese og todimensjonal (2D) gel geleelektroforese. Denne metoden bruker ikke-spesifikk fluorescerende merking av alle protein molekyler i analysert cellene, etterfulgt av electrophoretic separasjon og gjenkjenning og måling av hver protein art. For å oppnå den nødvendige uspesifisert protein merking, er en strategi å bruke fluorescerende fargestoffer som kan binde til proteiner via elektrostatisk og hydrofobe interaksjoner, for eksempel Coomassie blå og Sypro-Ruby4,5,6 . En alternativ strategi er å bruke kovalente merking med fargestoffer med N-hydroxysuccinimide (NHS) ester eller maleimide, som kan covalently binde proteiner gjennom felles rester som primære aminer og thiols, henholdsvis7, 8.
Samtidig er følsomheten til fluorescens gjenkjenning ideelle for å analysere lav-overflod proteiner og lite antall celler. Ett molekyl fluorescens imaging er en av de mest følsomme metodene som gjør påvisning av personlige fluorescerende fargestoffer og merket proteiner i vitro og i vivo9,10,11,12, 13,14,15. Anvendelsen av denne bildebehandling metode til geleelektroforese-baserte proteom analyse forventes å aktivere svært sensitive og kvantitative analyser ved å telle personlige fluorescently-merket proteiner. Men det er fortsatt uklart om merking med fluorescerende fargestoffer er homogen nok over alle protein molekyler, og hvordan dette homogenitet påvirkes av annet protein arter (figur 1). Enkel bulk løsning mål kan brukes til å få molar forholdet fluorescerende fargestoffer proteiner kalt 'kopling effektivitet'8 eller "merking effektivitet", men denne egenskapen gir ikke informasjon på homogenitet av merkingen blant protein molekyler.
Her beskriver vi protokollen for analysen undersøke merking homogenitet for alle protein arter i cellen (figur 2)16. De to viktigste trinnene av denne analysen er protein rensing og bildebehandling. I det første trinnet, alle proteiner i cellene merket fluorescently og biotinylated, så utdraget separat ved hjelp av gel geleelektroforese etterfulgt av electroelution. I det andre trinnet evalueres fluorescens egenskaper for personlige protein molekyler i utdraget prøvene basert på ett molekyl bildebehandling. Fra disse dataene parametere viktig for telling analyse, som andelen proteiner merket med minst en farge, som vi kaller merking belegg (LO)16, og gjennomsnittlig antall fluorescerende fargestoffer bundet til et enkelt protein molekyl (n̄ farge), kan være preget. I protokollen, en optimalisert prosedyre for merking HeLa celle proteom med NHS ester-basert Cyanine 3 (Cy3) fargestoff er presentert som et eksempel og kan endres med andre merking etter ønsket forskning mål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. celle forberedelse
- Dyrke HeLa celler i en 10 cm rett på 37 ° C under 5% CO2 i Dulbecco modifiserte Eagle's medium som inneholder 10% fosterets bovin serum.
- Samle eksponentielt voksende celler når de har nådd 70% confluency, etter ATCC instruksjoner17.
- Skyll celler med 5 mL 1 x fosfat bufret saltvann (PBS) (pH 7.4). Fjerne PBS.
- Legg 1 mL av 0,1% trypsin-ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA). Inkuber 5 min på 37 ° C.
- Overvåke utviklingen av cellen dissosiasjon ved mikroskopi.
- Når celler bli runde og er løsrevet fra parabolen, Legg 4 mL oppblomstringen medium, og bryte celle agglomeration av pipettering.
- Tell antall celler med en celle teller.
- Sentrifuge 150 x g i 10 minutter i en sentrifuge rør. Fjern mediet og resuspend celle pellets med 5 mL 1 x PBS (pH 7.4).
- Gjenta trinn 1.2.6. Resuspend celler i 1 x PBS (pH 7.4) til en siste konsentrasjon av 106 celler/mL med antallet i trinn 1.2.5.
Merk: Cellen suspensjon kan være aliquoted og lagret på-80 ° C i flere måneder. Gjenta en fryse/tine syklus bør unngås.
2. celle lyse og fluorescerende merking
- Gjøre 10 mL lysing buffer (0.1 M borate, 1% natrium dodecyl sulfate (SDS) og 1% mellom 20). Justere pH 12 med 2 M NaOH.
FORSIKTIG: Konsentrert NaOH er etsende. Bruk egnede vernehansker og -briller når forbereder denne løsningen.
Merk: Lysing bufferen kan lagres i opptil en uke ved romtemperatur. - Mix 100 μL lysing buffer med 1 μL 1 M dithiothreitol (DTT) og 4 μL 50% 3-[(3-cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propanesulfonate (CHAPS).
- Mix 1 μL cellekultur (ca 1000 celler) med blandet lysing bufferen fra trinn 2.2. Homogenize løsningen av sakte pipettering for å unngå bobler. Inkuber i mørket ved romtemperatur for 5 min med mild agitasjon. Nytt homogenize løsningen av pipettering sakte.
- Tilsett 1 μL av 2 μg/mL Cy3 NHS-ester fargestoff. Homogenize løsningen av sakte pipettering for å unngå bobler. Inkuber i 5 min i mørket ved romtemperatur med mild agitasjon.
Merk: Høy pH i bufferen forårsaker nøytralisering av lysin rester i proteiner, fører til et høyere reaktivitet. - Gjenta tillegg av 1 μL 2 μg/mL Cy3 NHS-ester fargestoff. Homogenize løsningen av sakte pipettering for å unngå bobler. Inkuber i 10 min i mørket ved romtemperatur med mild agitasjon.
Merk: Dette gjentatte tillegg NHS-ester fargestoff kan effektivisere merking fordi noen av Cy3 NHS-ester fargestoff hydrolyzed og deaktivert av høy pH i bufferen som reaksjon. - Justere pH 7.2 ved å legge til 100 μL 0,8 M 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic syre (HEPES)-NaOH pH 7.2 å slukke reaksjonen. Homogenize løsningen av sakte pipettering for å unngå bobler.
- Legge til 20 μL 19 mg/mL biotin-(polyetylenglykol (PEG))2-Amin og 5 μL 20 mg/mL 1-etyl - 3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC). Homogenize løsningen av sakte pipettering for å unngå bobler. Inkuber 1t i mørket ved romtemperatur med mild agitasjon.
Merk: Denne biotinylation trinnet er nødvendig å fikse protein molekyler på et mikroskop dekkglassvæske en fast tetthet og med ingen skjevhet for protein arter. - Fjern Ureagert merking reagenser og konsentrere prøven med en ultrafiltrasjon kolonne med 10 kDa avkuttede og følge instruksjonene fra produsenten.
Merk: Protokollen kan pauses her. Prøven kan lagres ved-80 ° C i flere uker.
3. proteom separasjon og gjenoppretting
- Legge til 4 x SDS eksempel buffer (200 mM Tris-HCl pH 6.8, 4% SDS, 4% glyserol og 0,4% bromophenol blå).
Merk: For å unngå fargestoff skade, protein prøven må ikke varmes som gjort i standard SDS-side, og bør holdes ved romtemperatur. - Utføre standard SDS-siden for protein prøven og en molekylær stige, med 20% akrylamid gel. Overføre prøven i gel med en konstant spenning (160 V) før overføringen foran bare avslutter gel.
- Bilde gel for å identifisere plasseringen av protein band (Figur 3).
- Kuttet ut gel deler inkludert protein fraksjoner av interesse med et skarpe blad, basert på bandet plasseringene. Fractioning ved 16, 23, 55 og 120 kDa topper og 19-25, 25 – 32, 32-42, 42-54, 54-69, 69-97, 97-136 og 136-226 kDa regioner er vist i Figur 3.
- Ekstra proteiner ved hjelp av en dialyzer av electroelution med en porestørrelse på 6 – 8 kDa, følg produsentens instruksjoner.
Merk: Utdraget utvalget kan lagres ved-80 ° C i flere uker.
4. mikroskop dekkglassvæske forberedelse
- Klargjør 200 μL av avidin buffer (5 mM HEPES-NaOH pH 7.2, 10 ng/mL avidin og 2 mg/mL bovin serum albumin (BSA)) for hvert utvalg.
- Forberede coverslips av 22 x 22 mm og 0.15 mm tykkelse. Utsett coverslips som lufter plasma bruker en plasma renere 1 min å rydde og aktivere deres overflater.
- Coat coverslips med avidin av spin belegg 200 μL av avidin buffer ved hjelp en spinn coater 5 sekunder på 500 rpm, etterfulgt av 30 sekunder på 1000 rpm. Inkuber coverslips i 15 min ved romtemperatur å la dem tørke.
- Forberede coverslips protein prøven.
- Fortynne protein prøven (fra 3,5) 100 ganger i 5 mM HEPES-NaOH pH 7.2.
- Sted 100 μL utvannet prøven på overflaten midt i avidin-belagt dekkglassvæske (fra trinn 4.3).
- Inkuber i mørket i 15 min ved romtemperatur.
- Forberede positiv kontrollen.
- Sted 100 μL 10 ng/mL renset fluorescerende biotin i 5 mM HEPES-NaOH pH 7.2 i sentrum av avidin belagt dekkglassvæske (fra trinn 4.3).
- Inkuber i mørket i 15 min ved romtemperatur.
Merk: Denne positive kontroll dekkglassvæske gir tettheten av avidin binding flekker, som brukes til å beregne LO.
- Forberede kontrollen negative.
- Spin-coat plasma renset dekkglassvæske med 200 μL av 5 mM HEPES-NaOH og 2 mg/mL BSA (uten avidin).
- Inkuber i 15 min ved romtemperatur å tørke.
- Tilsett 100 μL av 10 ng/mL renset fluorescerende biotin i 5 mM HEPES-NaOH pH 7.2.
- Inkuber i mørket i 15 min ved romtemperatur.
Merk: Denne negativ kontroll dekkglassvæske gir mengden ikke-spesifikk binding av fluorescerende biotin til dekkglassvæske uten avidin.
- Skyll hver dekkglassvæske med 200 μL destillert vann av pipettering langs kantene av dekkglassvæske for ikke å berøre midten av dekkglassvæske spissen. Gjenta denne vask tre ganger.
Merk: Etter aspirating vannet på dekkglassvæske, vann umiddelbart plasseres tilbake på dekkglassvæske å forhindre det tørker ut helt. - Utsett luft plasma til samme antall coverslips som i trinn 4.2.
- Plass den renset dekkglassvæske på prøve-bundet dekkglassvæske fra trinn 4.7 å unngå tørking.
5. observasjon med ett molekyl fluorescens mikroskopi
- Starte et bredt felt eller evanescent fluorescens mikroskop.
FORSIKTIG: Direkte eller spredte laserstråling kan forårsake øye eller skader huden. Bruk egnet beskyttende briller og skjerme laser lys banen.
Merk: For mikroskop oppsett, se vår forrige publikasjonen16. Kort, wide-feltet eller evanescent fluorescens mikroskop utstyrt med en høyeffekts 488 nm laser eksitasjon, en høy numeriske blenderåpning linsen og en høy følsomhet kameraet kan brukes for dette målet. Videre, for en automatisert måling, en datastyrt XY translasjonsforskning eksempel scene, mekanisk skodder for laser excitations og bilen-fokusere system anbefales å bli installert. - Angi dekkglassvæske på mikroskopet og finne fokus.
- Skanner flis å få minst 100 bilder.
Merk: Laser lys bør kontrolleres med mekanisk skodder utsettes prøven før innspilling bilder med kameraet å minimere photobleaching. Hvis det er mange prøver, anbefales automatisert måling ved hjelp av et dataprogram til å kontrollere mikroskop enhetene. Hvert bilde inneholder vanligvis 100-500 ett molekyl flekker ved en 60 x linsen.
6. image analyse og utvinning av informasjon
- Hvis bildet har ujevnheter på grunn av laser belysning mønsteret, utføre bildeprosessering for å rette det18.
- Kjøpe en referanseavbildning ved å måle med en dekkglassvæske prøve bestående av jevnt oppslag fargestoffer bruker et kamera innstillingen som trinn 5.3.
- Hent en offset bilde av måling med ingen laser eksitasjon bruke innstillingen samme kamera.
- Trekk fra hver piksel verdien i hver Eksempelbilde og referansebildet verdien på offset bildet.
- Dele hver piksel verdien i trukket fra testbildene med verdien i trukket fra referansebildet.
- Samle riktig ervervet bilder og fjerne bildebakgrunnen.
- Fjerne bilder som inneholder store fluorescerende aggregater manuelt.
- Fjerne bildebakgrunnen ved å rulle ballen algoritmen19 med en ball radius på 50 bildepunkter med ImageJ20.
- Skjerpe bilder ved å trekke uskarpe bilder ved hjelp av ImageJ (skjerpe image funksjonen).
- Finn og analysere ett molekyl flekker i bilder.
- Identifiser enkelt molekyl flekker med Yen terskelen algoritmen21 bruker ImageJ.
- Filtrere flekker med mindre enn to piksler utelate mørke støy av kameraet og flekker mer enn 20 piksler hvis du vil utelate samlinger av proteiner med ImageJ (ROI manager).
- Telle antall steder i hvert bilde. Bruke belysning korrigert bilder (trinn 6.1.4), analysere total intensiteter i piksler for hver spot bruker ImageJ.
- Beregne merking belegget (LO) bruker følgende formel:
LO = (antall teller i utvalget / antall teller i kontrollen positiv) x 100 - Beregne gjennomsnittlig antall fluorescerende fargestoffer bundet til et enkelt protein molekyl (n̄fargestoff).
- Analysere et histogram for intensiteter av hver spot.
Merk: Histogrammet har vanligvis flere topper, og enhver høysesong representerer et annet antall fargestoff molekyler er bundet til et protein. Først, andre og tredje topp i histogrammet tilsvarer 1, 2 og 3 molekyler, henholdsvis. - Beregne gjennomsnittlig intensiteten fra histogrammet. Også beregne peak intensiteten av første toppen ved å bruke en Gaussian passende.
- Beregne n̄fargestoff ved gjennomsnittlig intensiteten med topp intensiteten.
- Analysere et histogram for intensiteter av hver spot.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 4 representerer rå bildedata for ulike molekylvekt fraksjoner av proteiner fra HeLa celle lysate, i tillegg til positive og negative kontrollen. Mens både protein prøve og positivt kontrollere utstillingen 100-500 flekker per bilde, viser kontrollen negative ingen eller noen flekker, viser at protokollen tilstrekkelig hemmer uspesifisert binding av fargestoffer til dekkglassvæske overflaten. Spot intensitet histogrammer for protein prøvene og positiv kontrollen presenterer flere topper, som representerer Stokastisk binding av fargestoffer primære aminer i proteiner og avidin tetramer strukturer22, henholdsvis. Alle flekker viste blinker og gradvis photobleaching med kontinuerlig laser eksitasjon, utheving observasjon på ett molekyl nivå (figur 5AB).
LO beregnes fra forholdet mellom antall flekker i hver protein utvalg som i positiv kontrollen. LO målt fra HeLa celle lysate eksempel varierte fra 50% for den mindre molekylvekt (16 kDa) brøken til 90% for høyere molekylvekt (120 kDa) brøken og var 72% for hele proteom prøven uten separasjon (figur 6). Tilsvarende tendens n̄fargestoff til å øke med økende molekylvekt. Økende tendenser betraktes som skyldes høyere antall lysin rester, fører til økt NHS-ester fargestoff bindende. 23 kDa brøken har for eksempel en høy LO-verdi på grunn av det store antallet lysin rester i histone proteiner i denne fraksjonen.
Figur 1: effekten av proteom merking homogenitet på protein nummer telling. Antallet protein er svært avhengig av hvor sterkt homogent protein molekyler er merket, i stedet for tall forholdet mellom proteiner til fargestoffer. Homogenitet kan være scoret bruker en parameter kalt merking belegg (LO), som angir sannsynligheten for merket protein molekyler mot totalt protein molekyler. Verdien angir effektiviteten av protein teller (dvs. høyere LO gir høyere telle tall (venstre) og vice versa (høyre)). Mens LO verdien 100% er ideell, LO av < 100% kan gi en demping faktor for å estimere absolutt protein tall. Dette tallet er endret fra Leclerc et al.16 Copyright 2018 American Chemical Society. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: analysen arbeidsflyten. Først behandles coverslips (en) og (b) med avidin å oppnå en bestemt tetthet. Andre, fluorescently-merket eksempel proteiner er biotinylated og festet til dekkglassvæske (en) via avidin-biotin samhandlingen. Parallelt, er nesten 100% fluorescently-merket renset biotin immobilisert på dekkglassvæske (b). Tredje, coverslips er fotografert av enkelt-molekylet fluorescens mikroskopi å få nummeret og lysstyrke fordelingen av fluorescens flekker. Endelig er parameteren homogenitet, LO, beregnet på forholdet mellom spot tall i (en) som i (b). Dette tallet er endret fra Leclerc et al.16 Copyright 2018 American Chemical Society. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: separasjon av en HeLa celle proteom utvalget med SDS side. Merket fluorescently biotinylated celle lysate ble overført på to forskjellige gels (20% akrylamid) og proteiner visualisert gel betrakteren, med en 5 min og 10 min eksponeringstid for gel 1 og gel 2, henholdsvis. De røde boksene representerer gel regionene som ble kuttet ut og utdraget. Dette tallet er endret fra Leclerc et al.16 Copyright 2018 American Chemical Society. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: enkel molekyl bilder av proteom prøver. Fluorescens spot bilder (venstre) og histogrammer for spot intensiteter (høyre) fra ulike molekylvekt proteom fraksjoner. Skala baren er 10 μm. Pilene i positiv kontrollen angir de ulike merking trinnet i avidin. Dette tallet er endret fra Leclerc et al.16 Copyright 2018 American Chemical Society. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Photobleaching av fluorescerende. (A) Time-lapse bilder av fluorescerende flekker under kontinuerlig laser eksitasjon. (B) tid spor av fluorescens intensiteter på forskjellige steder. Spor viser enten en - eller to - trinns photobleaching, som indikerer respektive antall fargestoffer var koblet til proteinet i stedet til renset BSA prøven. Dette tallet er endret fra Leclerc et al.16 Copyright 2018 American Chemical Society. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: merking homogenitet av proteom prøver. LO (blå) og n̄dye (mørk rød) fra ulike molekylvekt fraksjoner. Dataene er uttrykt som betyr ± se 98, 46, 27, 77, 44, 39, 62, 101, 65, 62, 82, 61 og 70 bilder ble analysert for hele cellen lysate, 16, 23, 55, 120, 19-25, 25 – 32, 32-42, 42-54, 54-69, 69-97, 97-136 og 136-226 kDa brøker , henholdsvis. Dette tallet er endret fra Leclerc et al.16 Copyright 2018 American Chemical Society. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette dokumentet beskriver en protokoll for å kvantifisere merking homogenitet av hver merket protein Art i cellene etter separasjonen SDS-side (trinn 3). Metoden separasjon kan erstattes med andre metoder som flytende kromatografi eller kapillært geleelektroforese, som tillater separasjon og fraksjoneres av mobilnettet proteiner med høy oppløsning, samtidig som den krever spesialutstyr23. Merking metoden bruker NHS-ester i gjeldende protokollen kan bli erstattet med andre metoder med maleimide-ester eller antistoffer, for eksempel.
Kravet for merking homogenitet analyse avhenger hvor mye merkingen avviker fra en enkel tilfeldig prosess, som forutsatt i kopling effektivitet analysen. Våre siste studie16 indikerte at NHS-ester merkingen av proteiner avviker fra en tilfeldig prosess avhengig av reaksjon forholdene som pH og vaskemidler. Vi observerte at noen forhold indusert heterogenitet av samarbeidende binding av fargestoffer proteiner eller eksistensen av en brøkdel av ikke-reaktivt protein skyldes ufullstendig solubilization eller senket affinitet for fargestoff. Derimot redusert andre forhold heterogenitet ved fullstendig binding av reaktive rester i et protein til farge.
Vi anser at pH er en av de mest innflytelsesrike faktorene på merking homogenitet. Høy pH kan føre nøytralisering av lysin rester i proteiner, fører til et høyere reaktivitet med NHS-ester fargestoff. I tillegg høy pH kan indusere celle lyse og kan denature proteiner. Imidlertid siden høy pH gjør ansvaret for proteiner negative og er ikke egnet for noen eksperimenter som isoelectric geleelektroforese eller 2D geleelektroforese, må pH betingelsen vurderes nøye avhengig av forskning formålet.
For å presist måle merking homogenitet i analysen, er det viktig å bruke nok biotinylated protein prøven. Dette er fordi analysen forutsetter at proteiner bindes med metning til hver avidin molekyl i dekkglassvæske og utilstrekkelig protein konsentrasjonen resulterer i undervurdering av LO. Våre tidligere studie16 har vist at mer enn 10 pg protein er vanligvis nødvendig for mettet bindende, og dette kan fås fra rundt 1000 HeLa celler24, selv etter fraksjoneres. Det anbefales å opprette en fortynning rekke protein prøven å bekrefte metning av avidin flekker. Vi også oppmerksom på at avidin tetthet på dekkglassvæske må optimaliseres så ikke å forårsake overlapper mellom flekker på lagrede bilder, samtidig som det gir nok plass tall for statistisk analyse.
Denne analysen antar at ett tetravalent avidin molekyl22 på dekkglassvæske kan binde Vigelandsparken. Faktisk indikerte positiv kontrolldataene i vår forrige undersøkelse at ett avidin molekyl kan binde til opptil fire fluorescently merket biotins, men fleste (55%) avidin molekyler binde bare én eller to biotin molekyler. Fordi proteiner er større enn biotin, skal deres steric effekter resultere i færre proteiner bundet til en avidin. Vår antagelse støttes av faktum at n̄fargestoff forblir konstant når måle blandet prøver av merket og umerkede proteiner på ulike forhold16.
Avhengig av protein arter, kan uspesifikke binding av proteiner til dekkglassvæske oppstå betydelig selv med BSA belegg. Hvis dette er tilfelle, kan ett alternativ være å måle en kontroll der biotinylated proteiner er belagt på dekkglassvæske uten avidin, i stedet for fluorescerende biotin på trinn 4.6.3. Effekten av uspesifikke bindingen på LO kan matematisk fjernes ved å trekke antall av denne kontrollen fra at protein prøven.
Denne protokollen vil være uvurderlig for proteom hele enkelt-molekyl protein teller analyser. Ett molekyl følsomheten tillater analyse av protein for hvert protein arter uansett sin overflod i cellen25. Dette kan bli realisert ved proteom separasjon etterfulgt av kvantifisering av antall fluorescens flekker kombinert med proteiner. Videre høy følsomhet kan også enkelt celle analyse, slik at forskere til å undersøke heterogenitet over celle populasjoner og gjør klynger av mobilnettet sier25,26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklære den følgende konkurrerende økonomisk interesse (r): RIKEN har arkivert en patent på disse resultatene med S.L. og Y.T. navngitt som co-oppfinnere.
Acknowledgments
Forfatterne takker Masae Ohno og Kazuya Nishimura for eksperimentell hjelp og råd. Dette arbeidet ble støttet av PRESTISJE (JPMJPR15F7), Japan vitenskap og teknologi Agency, Grants-in-aid for unge forskere (A) (24687022), utfordrende utforskende forskning (26650055) og vitenskapelig forskning på nyskapende områder (23115005), Japan Society for Fremme av vitenskap, og tilskudd fra Takeda Science Foundation og Mochida Memorial Foundation for medisinsk og farmasøytisk forskning. S.L. anerkjenner støtte fra RIKEN International Program knytte (IPA) programmet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 22x22x0.15 mm coverslip | VWR | 470019-004 | |
| 488 nm Argon laser | Coherent | Innova 70C | |
| 488 nm dichroic mirror | Semrock | FF495-Di03 | |
| 488 nm emission filter | Semrock | FF02-520/28 | |
| 560 nm dichroic filter | Semrock | Di02-R561 | |
| 560 nm emission filter | Semrock | FF02-617/73 | |
| 560 nm fiber laser | MBP Communications | F-04306-2 | |
| 60x oil immersion lens | Olympus | PLAPON 60x | |
| Avidin | Nacalai-tesque | 03553-64 | |
| Biotin-PEG-amine | Thermo Scientific | 21346 | |
| Biotinylated Alexa Fluor 488 | Nanocs | ||
| Borate | Nacalai-tesque | ||
| BSA | Sigma-Aldrich | A9547 | |
| CHAPS | Dojindo | C008-10 | |
| Cy3 NHS-ester dye | GE Healthcare | PA13101 | |
| Dialyzer - D-tube, 6-8 kDa | Merck Millipore | 71507-M | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | ||
| DTT | Nacalai-tesque | 14112-94 | |
| EDC | Nacalai-tesque | ||
| EMCCD camera | Andor | IiXon 897 | |
| Epi fluorescence microscope | Olympus | IX81 | |
| Gel viewer | GE Healthcare | ImageQuant LAS 4000 | |
| Penicillin, streptomycine and Amphoterecin mix | Gibco | ||
| Plasma cleaner | Diener Electronic | ||
| SDS | Wako | NC0792960 | |
| Size purification column 10K | Merck Millipore | UFC5010 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 |
References
- Wilhelm, M., et al.
- Guo, A., et al. Immunoaffinity enrichment and mass spectrometry analysis of protein methylation. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (1), 372-387 (2014).
- Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).
- Neuhoff, V., Arold, N., Taube, D., Ehrhardt, W. Improved staining of proteins in polyacrylamide gels including isoelectric focusing gels with clear background at nanogram sensitivity using Coomassie Brilliant Blue G-250 and R-250. Electrophoresis. 9 (6), 255-262 (1988).
- Berggren, K., et al. Background-free, high sensitivity staining of proteins in one- and two-dimensional sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels using a luminescent ruthenium complex. Electrophoresis. 21 (12), 2509-2521 (2000).
- Butt, R. H., Coorssen, J. R. Coomassie blue as a near-infrared fluorescent stain: a systematic comparison with Sypro Ruby for in-gel protein detection. Molecular & cellular proteomics. 12 (12), 3834-3850 (2013).
- Nanda, J. S., Lorsch, J. R. Labeling a protein with fluorophores using NHS ester derivitization. Methods in Enzymology. , 87-94 (2014).
- Kim, Y., et al. Efficient site-specific labeling of proteins via cysteines. Bioconjugate chemistry. 19 (3), 786-791 (2008).
- Dickson, R. M., Cubitt, A. B., Tsien, R. Y., Moerner, W. E. On/off blinking and switching behaviour of single molecules of green fluorescent protein. Nature. 388 (6640), 355-358 (1997).
- Penna, A., et al. The CRAC channel consists of a tetramer formed by Stim-induced dimerization of Orai dimers. Nature. 456 (7218), 116-120 (2008).
- Ji, W., et al. Functional stoichiometry of the unitary calcium-release-activated calcium channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (36), 13668-13673 (2008).
- Ulbrich, M. H., Isacoff, E. Y.
- Sugiyama, Y., Kawabata, I., Sobue, K., Okabe, S. Determination of absolute protein numbers in single synapses by a GFP-based calibration technique. Nature Methods. 2 (9), 677-684 (2005).
- Puchner, E. M., Walter, J. M., Kasper, R., Huang, B., Lim, W. A. Counting molecules in single organelles with superresolution microscopy allows tracking of the endosome maturation trajectory. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (40), 16015-16020 (2013).
- Grassart, A., et al. Actin and dynamin2 dynamics and interplay during clathrin-mediated endocytosis. The Journal of Cell Biology. 205 (5), 721-735 (2014).
- Leclerc, S., Arntz, Y., Taniguchi, Y. Extending Single Molecule Imaging to Proteome Analysis by Quantitation of Fluorescent Labeling Homogeneity in Complex Protein Samples. Bioconjugate chemistry. 29 (8), 2541-2549 (2018).
- Ian Freshney, R. Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications. , John Wiley & Sons. (2015).
- Taniguchi, Y., et al. Quantifying E. coli proteome and transcriptome with single-molecule sensitivity in single cells. Science. 329 (5991), 533-538 (2010).
- Sternberg,
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
- Yen, J. C., Chang, F. J., Chang, S. A new criterion for automatic multilevel thresholding. IEEE Transactions on Image Processing. 4 (3), 370-378 (1995).
- Livnah, O., Bayer, E. A., Wilchek, M., Sussman, J. L.
- Mostovenko, E., Hassan, C., Rattke, J., Deelder, A. M., van Veelen, P. A., Palmblad, M. Comparison of peptide and protein fractionation methods in proteomics. EuPA Open Proteomics. 1, 30-37 (2013).
- Volpe, P., Eremenko-Volpe, T. Quantitative studies on cell proteins in suspension cultures. European Journal of Biochemistry. 12 (1), 195-200 (1970).
- Huang, B., et al. Counting low-copy number proteins in a single cell. Science. 315 (5808), 81-84 (2007).
- Johnson, A. C., Bowser, M. T. H. igh- High-Speed, Comprehensive, Two Dimensional Separations of Peptides and Small Molecule Biological Amines Using Capillary Electrophoresis Coupled with Micro Free Flow Electrophoresis. Analytical Chemistry. 89 (3), 1665-1673 (2017).
