Summary
Hier presenteren we een protocol om te beoordelen van de labeling homogeniteit voor elke soort eiwit in een complexe eiwitSteekproef op het niveau van één molecuul.
Abstract
Cel proteomes worden vaak gekenmerkt met behulp van elektroforese testen, waar alle soorten eiwitten in de cellen worden niet-specifiek aangeduid met een fluorescente kleurstof en zijn gespot door een foto-elektrische cel na hun scheiding. Enkel molecuul fluorescentie imaging kan voorzien haar vermogen voor het visualiseren van individuele fluorescerende moleculen ultrasensitive eiwit detectie. De toepassing van deze krachtige imaging methode voor elektroforese bepalingen wordt echter belemmerd door het gebrek aan manieren om de homogeniteit van het fluorescerende labeling van elke soort eiwit over de Proteoom karakteriseren. Hier, wij een methode ontwikkeld om de labeling homogeniteit het proteoom op basis van een enkel molecuul fluorescentie imaging assay evalueren. In onze meting met behulp van een steekproef van HeLa cel, het aandeel van eiwitten, aangeduid met ten minste één kleurstof, die we genoemd 'labelen bezetting' (LO), was vastbesloten om bereik van 50% tot 90%, ter ondersteuning van het grote potentieel van de toepassing van één molecuul imaging te gevoelige en nauwkeurige Proteoom-analyse.
Introduction
Proteoom analyse, die is gericht op het kwantificeren van de hele set van eiwitmolecules uitgedrukt in de cel, is een waardevolle benadering in huidige biologische en medische studies. Deze analyse is vaak afhankelijk van de Spectrometrie van de massa, waarmee eiwit soorten op basis van spectra gegenereerd door eiwit ionisatie1,2,3. Een alternatieve methode voor proteoom-analyse is elektroforese, met inbegrip van polyacrylamide gelelektroforese (pagina), capillaire elektroforese en tweedimensionale (2D) gelelektroforese. Deze methode is afhankelijk van de aspecifieke fluorescerende etikettering van alle de eiwitmolecules in de geanalyseerde cellen, gevolgd door elektroforetische scheiding en opsporing en kwantificering van elke soort eiwit. Om te bereiken dat de vereiste aspecifieke eiwit labeling, is een strategie het gebruik van fluorescente kleurstoffen die aan eiwitten via elektrostatische en hydrofobe interacties, zoals Coomassie Blue en Sypro-Ruby4,5,6 binden kunnen . Een alternatieve strategie is het gebruik van covalente labelen met kleurstoffen met N-hydroxysuccinimide (NHS) ester- of maleimide, die covalent aan eiwitten door middel van gemeenschappelijke residuen zoals primaire amines en thiolen binden kan, respectievelijk7, 8.
Ondertussen, de gevoeligheid van de fluorescentie detectie is ideaal voor het analyseren van lage-overvloed eiwitten en kleine aantallen cellen. Enkel molecuul fluorescentie imaging is één van de meest gevoelige methodes waarmee de detectie van individuele fluorescente kleurstoffen en gelabelde proteïnen in vitro en in vivo9,10,11,12, 13,14,15. Toepassing van deze beeldvorming methode elektroforese gebaseerde Proteoom analyse wordt verwacht om zeer gevoelige en kwantitatieve tests door het tellen van afzonderlijke fluorescently gelabelde proteïnen. Het blijft echter onduidelijk of labelen met fluorescente kleurstoffen is homogeen genoeg over alle de eiwitmolecules, en hoe deze homogeniteit wordt beïnvloed door verschillende eiwit soorten (Figuur 1). Eenvoudige bulk oplossing metingen kunnen worden gebruikt voor het verkrijgen van een molaire ratio van fluorescente kleurstoffen aan eiwitten 'koppeling efficiëntie'8 of 'labelen efficiëntie' genoemd, maar deze eigenschap biedt geen informatie op de homogeniteit van de etikettering onder eiwitmolecules.
Hier beschrijven we het protocol voor een bepaling te onderzoeken de labeling homogeniteit voor alle soorten van de eiwitten in de cel (Figuur 2)16. De twee belangrijkste stappen van deze bepaling zijn EiwitReiniging en beeldvorming. In de eerste stap, alle van de eiwitten in de cellen worden fluorescently aangeduid en biotinyleerd, vervolgens uitgepakt afzonderlijk met behulp van gelelektroforese gevolgd door electroelution. In de tweede stap, worden fluorescentie-eigenschappen van individuele eiwitmolecules in de uitgepakte monsters geëvalueerd op basis van één molecuul imaging. Van deze gegevens, parameters die belangrijk zijn voor het tellen analyse, zoals het percentage eiwitten aangeduid met ten minste een kleurstof, die wij noemen labeling bezetting (LO)16, en het gemiddelde aantal fluorescente kleurstoffen gebonden aan een molecule één eiwit (n̄ kleurstof), kan worden gekarakteriseerd. In het protocol, een geoptimaliseerde procedure voor het labelen van de HeLa cel Proteoom met NHS ester gebaseerde Cyanine 3 (Cy3) kleurstof wordt gepresenteerd als een voorbeeld, en kan worden aangepast met andere labeling procedures volgens onderzoek van de gewenste doelstellingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. cel voorbereiding
- Cultiveren van HeLa cellen in een 10 cm schotel bij 37 ° C minder dan 5% CO,2 in Dulbecco gewijzigd van Eagle's medium met 10% foetale runderserum.
- Verzamelen exponentieel groeiende cellen zodra zij 70% confluentie, na ATCC instructies17hebben bereikt.
- Spoel de cellen met 5 mL 1 x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) (pH 7.4). Verwijderen van PBS.
- Voeg vervolgens 1 mL 0,1% trypsine-ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA). Incubeer 5 minuten bij 37 ° C.
- De progressie van cel dissociatie door microscopie volgen.
- Zodra de cellen worden ronde en zijn losgemaakt van de schotel, Voeg 4 mL groeimedium, en cel agglomeratie breken door pipetteren.
- Het aantal cellen met behulp van een cel counter.
- Centrifugeer bij 150 x g gedurende 10 minuten in een centrifugebuis. Verwijder het medium en resuspendeer de pellet cel met 5 mL 1 x PBS (pH 7.4).
- Herhaal stap 1.2.6. Resuspendeer de cellen in 1 x PBS (pH 7.4) om een eindconcentratie van 106 cellen/mL met behulp van het nummer van de graaf in stap 1.2.5.
Opmerking: De celsuspensie kunnen aliquoted en opgeslagen bij-80 ° C voor enkele maanden. Herhalen van een vorst/dooi cyclus moet worden vermeden.
2. cel lysis en fluorescerende labeling
- Breng 10 mL lysing van buffer (0,1 M boraat, 1% natrium dodecyl sulfaat (SDS) en 1% Tween-20). Aangepast aan de pH 12 met behulp van 2 M NaOH.
Let op: Geconcentreerde NaOH is corrosief. Draag geschikte handschoenen en bril bij de voorbereiding van deze oplossing.
Opmerking: Lysing buffer kan worden opgeslagen voor tot een week bij kamertemperatuur. - Mix 100 μl van het lysing van buffer met 1 μL van 1 M dithiothreitol (DTT) en 4 μL van 50% 3-[(3-cholamidopropyl)-dimethylammonio] -1-propanesulfonate (CHAPS).
- Meng 1 μL van de cultuur van de cel (ongeveer 1000 cellen) met de gemengde lysing buffer uit stap 2.2. Meng de oplossing door langzaam pipetteren Voorkom bubbels. Incubeer in het donker bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten met zachte agitatie. Meng de oplossing opnieuw door pipetteren langzaam.
- Voeg 1 μl van 2 μg/mL Cy3 NHS-ester kleurstof. Meng de oplossing door langzaam pipetteren Voorkom bubbels. Incubeer gedurende 5 min. in het donker bij kamertemperatuur met zachte agitatie.
Opmerking: De hoge pH van deze buffer veroorzaakt neutralisatie van lysine residuen in eiwitten, wat leidt tot een hogere reactiviteit. - Herhaal de toevoeging van 1 μL van 2 μg/mL Cy3 NHS-ester kleurstof. Meng de oplossing door langzaam pipetteren Voorkom bubbels. Incubeer gedurende 10 min in het donker bij kamertemperatuur met zachte agitatie.
Opmerking: Dit herhaald toevoeging van NHS-ester kleurstof kan labeling efficiënter omdat sommige van de kleurstof Cy3 NHS-ester is gehydrolyseerd en gedeactiveerd door het hoge pH van de buffer van de reactie. - Aanpassen aan pH 7,2 door toevoeging van 100 μl van 0,8 M 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic zuur (HEPES)-NaOH pH 7,2 om quench de reactie. Meng de oplossing door langzaam pipetteren Voorkom bubbels.
- Toevoegen van 20 μL van 19 mg/mL Biotine-(polyethyleenglycol (PEG))2-amine en 5 μl van 20 mg/mL 1-ethyl - 3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC). Meng de oplossing door langzaam pipetteren Voorkom bubbels. Incubeer gedurende 1 uur in het donker bij kamertemperatuur met zachte agitatie.
Opmerking: Deze stap biotinylation is nodig om de eiwitmolecules op een Microscoop dekglaasje aan bij een vaste dichtheid en met geen bias voor eiwit soorten vast te stellen. - Verwijder spoorverontreiniging labeling reagentia en concentreren van het monster met behulp van een kolom ultrafiltratie met 10 kDa cut-off, na instructies van de fabrikant.
Opmerking: Het protocol kan hier worden gepauzeerd. Het monster kan worden achtergelaten bij-80 ° C voor enkele weken.
3. Proteoom scheiding en terugwinning
- Voeg 4 x SDS monster buffer (200 mM Tris-HCl pH 6.8, van 4% SDS, 4% glycerol en 0,4% bromophenol blauw).
Opmerking: Om te voorkomen beschadiging van de kleurstof, de eiwitSteekproef zoals gedaan in standaard SDS-pagina niet verwarmd moet worden, en moet bij kamertemperatuur worden bewaard. - Standaard SDS-pagina voor de eiwitSteekproef en een moleculaire ladder, met behulp van 20% acrylamide gel uitvoeren. Migreren van het monster in de gel met een constante spanning (160 V) tot de migratie voorkant verlaat net de gel.
- Het imago van de gel ter identificatie van de locatie van de eiwit-bands (Figuur 3).
- Knip uit de delen van de gel met inbegrip van eiwitfracties van belang met behulp van een scherp mes, gebaseerd op de locaties van de band. Fractioning op 16, 23, 55 en 120 kDa toppen, en op 19 – 25, 25-32, 32 – 42, 42-54, 54 – 69, 69 – 97, 97 – 136 en 136-226 kDa regio's zijn afgebeeld in Figuur 3.
- Uittreksel eiwitten met behulp van een dialyzer door electroelution met een poriegrootte van 6 tot en met 8 kDa, na instructies van de fabrikant.
Opmerking: Het uitgepakte monster kan worden achtergelaten bij-80 ° C voor enkele weken.
4. Microscoop dekglaasje aan voorbereiding
- 200 μL van avidin buffer (5 mM HEPES-NaOH pH 7,2, 10 ng/mL avidin en 2 mg/mL bovien serumalbumine (BSA)) voorbereiden op elk monster.
- Coverslips van 22 x 22 mm en 0,15 mm dikte voor te bereiden. Bloot de coverslips om lucht plasma met behulp van een plasma cleaner voor 1 min te reinigen en activeren hun oppervlakken.
- Jas de coverslips met avidin door 200 μL van de spin-coating van avidin buffer met behulp van een draai-coater gedurende 5 seconden bij 500 t/min, gevolgd door 30 seconden bij 1000 omwentelingen per minuut. Incubeer de coverslips gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur laten drogen.
- Coverslips voorbereiden op de eiwitSteekproef.
- Verdun de eiwitSteekproef (vanaf 3.5) 100 keer in de 5 mM HEPES-NaOH pH 7,2.
- Plaats 100 μl van het verdunde monster op het oppervlak in het midden van de avidin-gecoate dekglaasje aan (uit stap 4.3).
- In het donker gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur incuberen.
- Voorbereiden van de positieve controle.
- Plaats 100 μl van 10 ng/mL gezuiverd fluorescerende Biotine in 5 mM HEPES-NaOH pH 7,2 in het midden van de avidin bekleed dekglaasje aan (uit stap 4.3).
- In het donker gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur incuberen.
Opmerking: Deze positieve controle dekglaasje aan biedt de dichtheid van avidin bindende vlekken, die wordt gebruikt voor het berekenen van de LO.
- De negatieve controle voor te bereiden.
- Spin-jas het plasma gereinigd dekglaasje aan met 200 μL van 5 mM BSA HEPES-NaOH en 2 mg/mL (zonder avidin).
- Incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur drogen.
- Voeg 100 μl van 10 ng/mL gezuiverd fluorescerende Biotine in 5 mM HEPES-NaOH pH 7,2.
- In het donker gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur incuberen.
Opmerking: Deze negatieve controle dekglaasje aan biedt de hoeveelheid niet-specifieke binding van fluorescerende Biotine aan het dekglaasje aan zonder avidin.
- Spoel elke dekglaasje aan met 200 μL van gedestilleerd water door pipetteren aan de rand van het dekglaasje aan om niet te raken het midden van het dekglaasje aan met de tip. Herhaal dit wassen drie keer.
Opmerking: Na het zuigen water op het dekglaasje aan, water moet worden onmiddellijk gelegd terug op het dekglaasje aan om te voorkomen dat het volledig uitdrogen. - Bloot lucht plasma naar hetzelfde nummer van coverslips zoals in stap 4.2.
- Plaats de schoongemaakte dekglaasje aan op de monster-gebonden dekglaasje aan vanaf stap 4.7 om te voorkomen dat het drogen.
5. observatie met enkel molecuul fluorescentie microscopie
- Opstarten van een veld van het breed-gebied of vluchtig fluorescentie Microscoop.
Let op: Direct of verspreide laserstraling kan leiden tot oog of beschadiging van de huid. Draag geschikte beschermende bril en schild van de laser licht weg.
Opmerking: Voor de installatie van Microscoop, Raadpleeg onze vorige publicatie16. Kortom, een breed-gebied of vluchtig veld fluorescentie Microscoop voorzien van een high-power 488 nm laser excitatie, een objectief van hoge numerieke diafragma en een hoge gevoeligheid camera kan worden gebruikt voor deze meting. Verder, voor een geautomatiseerde meting, een computergestuurde XY translationeel monster stadium, mechanische luiken voor laser excitaties en een auto-focus systeem aanbevolen te worden geïnstalleerd. - Stel het dekglaasje aan op de Microscoop en vinden de focus.
- Het uitvoeren van een scan van de tegel te verkrijgen van ten minste 100 afbeeldingen.
Opmerking: De laser verlichting moet worden gecontroleerd met mechanische luiken worden blootgesteld aan het monster alleen bij het opnemen van beelden met de camera, om te minimaliseren photobleaching. Als er veel monsters, wordt geautomatiseerde meting met behulp van een computerprogramma om te controleren de Microscoop apparaten aanbevolen. Elke afbeelding bevat meestal 100-500 enkel molecuul plekken bij het gebruik van een objectief 60 x.
6. analyse en extractie van informatie van het beeld
- Als de afbeelding oneffenheden als gevolg van de laser verlichting patroon heeft, verrichten beeld processing om te corrigeren18.
- Verwerven een referentiebeeld door te meten met een dekglaasje aan steekproef uit uniform-spread kleurstoffen met behulp van een camera instellen gelijk aan stap 5.3.
- Offset afbeeldingen inlezen door te meten met de excitatie van geen laser met behulp van dezelfde camera instelling.
- Elke pixelwaarde in elk monster beeld en het referentiebeeld met de waarde van de verschoven afbeelding aftrekken.
- Verdeel elke pixelwaarde in de afgetrokken sample images door de waarde in het afgetrokken referentiebeeld.
- Goed verworven beelden verzamelen en verwijderen van de achtergrond van de afbeelding.
- Afbeeldingen met grote fluorescerende aggregaten handmatig verwijderen.
- Verwijder de achtergrond van de afbeelding door de rollen-bal algoritme19 met een bal straal van 50 pixels met behulp van ImageJ20toe te passen.
- Afbeeldingen verscherpen door af te trekken onscherpe beelden met behulp van ImageJ (scherper beeld functie).
- Vinden en analyseren van één molecuul plekken in beelden.
- Enkel molecuul vlekken inleven in de Yen drempel algoritme21 ImageJ gebruiken.
- Filteren van spots met minder dan twee pixels uit te sluiten van donkere geluid van de camera en de vlekken meer dan 20 pixels als u wilt uitsluiten van de verzamelingen van proteïnen met behulp van ImageJ (ROI manager).
- Het aantal plekken in elke afbeelding. Met behulp van de verlichting gecorrigeerde beelden (stap 6.1.4), analyseren total intensiteiten in pixels voor elke vlek met behulp van ImageJ.
- Bereken de labeling bezetting (LO), met de volgende formule:
LO = (aantal graven in de steekproef / aantal graven in de positieve controle) x 100 - Bereken het gemiddelde aantal fluorescente kleurstoffen gebonden aan een enkele eiwit molecule (n̄kleurstof).
- Een histogram van de intensiteit van elke plek te analyseren.
Opmerking: Het histogram heeft meestal diverse toppen, en elke piek vertegenwoordigt een verschillend aantal kleurstof moleculen gebonden aan een eiwit. De eerste, tweede en derde piek in het histogram komt overeen met 1, 2 en 3 moleculen, respectievelijk. - Bereken de gemiddelde intensiteit van het histogram. Ook de piek intensiteit van de eerste piek te berekenen door het toepassen van een Gaussian montage.
- Berekenen n̄kleurstof door te delen met de piek intensiteit de gemiddelde intensiteit.
- Een histogram van de intensiteit van elke plek te analyseren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 4 vertegenwoordigt onbewerkte afbeeldingsgegevens voor moleculair gewicht van de verschillende fracties van eiwitten uit HeLa cel lysate, evenals de positieve en negatieve controle. Terwijl zowel de eiwitSteekproef en de positieve controle tentoonstelling 100-500 plekken per beeld, geeft de negatieve controle geen of een paar plekken, waaruit blijkt dat het protocol remt voldoende niet-specifieke binding van kleurstoffen op het oppervlak van het dekglaasje aan. Ter plaatse intensiteit histogrammen voor de eiwitsteekproeven en de positieve controle presenteren meerdere pieken, stochastische binding van kleurstoffen tot primaire amines in eiwitten en avidin tetrameer structuren22, respectievelijk. Alle spots toonde knipperende en stapsgewijze photobleaching met continue laser excitatie, markeren observatie op het niveau van één molecuul (figuur 5AB).
De LO is berekend op basis van de verhouding van het aantal plekken in elke eiwitSteekproef daartoe in de positieve controle. De LO gemeten vanaf de HeLa cel lysate monster varieerden van 50% voor de kleinere molecuulgewicht (16 kDa) breuk met 90% voor de hogere moleculair gewicht (120 kDa) breuk en was 72% voor de hele Proteoom monster zonder scheiding (Figuur 6). Dienovereenkomstig, n̄kleurstof neiging om te verhogen met het verhogen van de moleculaire gewicht. Deze toenemende tendensen worden beschouwd als optreden als gevolg van de hogere getallen van lysine residuen, wat leidt tot verhoogde NHS-ester kleurstof bindend. Bijvoorbeeld, heeft de 23 kDa breuk een hoge waarde van de LO vanwege de grote aantallen van lysine residuen in Histon kaaseiwitten in deze fractie.
Figuur 1: Effect van Proteoom labeling homogeniteit op eiwit nummer tellen. Het nummer van de graaf van de eiwitten is sterk afhankelijk van hoe sterk en homogeen eiwitmolecules worden aangeduid, in plaats van de nummer verhouding tussen eiwitten aan kleurstoffen. De homogeniteit kan worden Gescored met een parameter labeling bezetting (LO), waarin de waarschijnlijkheid van gelabelde eiwitmolecules tegen totale eiwitmolecules genoemd. Deze waarde geeft de efficiëntie van het eiwit tellen (dat wil zeggen, hogere LO opbrengsten hoger tellen getallen (links) en vice versa (rechts)). Terwijl een LO-waarde van 100% ideaal is, LO van < 100% een demping factor voor het schatten van absolute eiwit nummers kan bieden. Dit cijfer is gewijzigd van Leclerc et al.16 Copyright 2018 American Chemical Society. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: Assay werkstroom. Eerst, coverslips (een) en (b) worden behandeld met avidin om een vaste dichtheid. Tweede, fluorescently-geëtiketteerden monster eiwitten zijn biotinyleerd en die via de avidin-Biotine interactie op het dekglaasje aan (een) aangesloten. Parallel, is bijna 100% fluorescently-geëtiketteerden gezuiverde Biotine geïmmobiliseerd op het dekglaasje aan (b). Ten derde, de coverslips zijn beeld door single-molecuul fluorescentie microscopie te verkrijgen van de verdeling van het aantal en de helderheid van fluorescentie vlekken. Tot slot, de homogeniteit parameter, LO, is berekend op basis van de verhouding van plek getallen in (een) daartoe in (b). Dit cijfer is gewijzigd van Leclerc et al.16 Copyright 2018 American Chemical Society. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: scheiding van een HeLa cel Proteoom monster met behulp van SDS-pagina. Fluorescently label biotinyleerd cel lysate zijn gemigreerd op twee verschillende gels (20% acrylamide) en eiwitten gevisualiseerd met behulp van de gel-viewer, met een 5 min en 10 min belichtingstijd voor gel 1 en 2, respectievelijk gel. De rode vakken vertegenwoordigen de gel-regio's die werden uitgesneden en uitgepakt. Dit cijfer is gewijzigd van Leclerc et al.16 Copyright 2018 American Chemical Society. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: Single molecuul beelden van Proteoom monsters. Fluorescentie spot afbeeldingen (van links) en histogrammen van plek intensiteiten (rechts) verkregen uit verschillende moleculair gewicht Proteoom breuken. De bar van de schaal is 10 μm. Pijlen in de positieve controle geven aan de verschillende labeling stap van avidin. Dit cijfer is gewijzigd van Leclerc et al.16 Copyright 2018 American Chemical Society. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: Photobleaching van fluorescerende vlekken. (A) Time-lapse beelden van fluorescerende vlekken onder continue laser excitatie. (B) tijd sporen van de intensiteit van de fluorescentie op verschillende plekken. De sporen Toon ofwel één - of two - One-Step photobleaching, vermelding van de respectieve aantallen van kleurstoffen waren gekoppeld aan het eiwit op de plek van gezuiverde BSA monster. Dit cijfer is gewijzigd van Leclerc et al.16 Copyright 2018 American Chemical Society. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6: Labeling van homogeniteit van Proteoom monsters. LO (blauw) en n̄kleurstof (donkerrood) verkregen uit verschillende moleculair gewicht breuken. Gegevens worden uitgedrukt als bedoel ± s.e. 98, 46, 27, 77, 44, 39, 62, 101, 65, 62, 82, 61 en 70 afbeeldingen werden geanalyseerd voor de hele cel lysate, 16, 23, 55, 120, 19-25, 25 – 32, 32 – 42, 42-54, 54 – 69, 69-97, 97 – 136 en 136-226 kDa breuken , respectievelijk. Dit cijfer is gewijzigd van Leclerc et al.16 Copyright 2018 American Chemical Society. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit witboek beschrijft een protocol om te kwantificeren van de labeling homogeniteit van elke soort gelabelde proteïnen in cellen na scheiding met SDS-pagina (stap 3). De methode van scheiding kan met andere methoden, zoals vloeibare chromatografie of capillaire elektroforese, waarmee scheiding en versplintering van cellulaire eiwitten met een hoge resolutie, terwijl het vereisen van speciale apparatuur23worden vervangen. De labeling methode met behulp van NHS-ester in het huidige protocol kan worden vervangen door andere methoden, bijvoorbeeld via maleimide-ester of antilichamen.
De eis voor het labelen van homogeniteit analyse hangt af van hoeveel de labeling van een eenvoudige random proces afwijkt, zoals aangenomen in de koppeling efficiëntie-analyse. Onze recente studie16 aangegeven dat de etikettering van de NHS-ester van eiwitten van een willekeurig proces afhankelijk van de omstandigheden zoals pH en detergenten afwijkt. We hebben vastgesteld dat bepaalde voorwaarden wordt voldaan heterogeniteit door coöperatieve binding van kleurstoffen aan eiwitten of het bestaan van een fractie van niet-reactieve proteïnen als gevolg van onvolledige solubilisatie of verlaagde affiniteit voor de kleurstof veroorzaakte. Daarentegen verminderd andere voorwaarden heterogeniteit door de volledige afhankelijkheid van reactieve residuen binnen een eiwit aan de kleurstof.
Wij zijn van mening dat pH is een van de meest invloedrijke factoren op de labeling homogeniteit. Hoge pH kan leiden tot neutralisatie van lysine residuen in eiwitten, wat leidt tot een hogere reactiviteit met de kleurstof van de NHS-ester. Bovendien, hoge pH lysis van de cel kan veroorzaken en kan denatureren eiwitten. Echter, aangezien hoge pH de lading van eiwitten negatief maakt en niet geschikt voor sommige experimenten zoals de Elektroforese van het elektrisch of 2D elektroforese is, de pH-voorwaarde moet zorgvuldig overwogen worden afhankelijk van het doel van het onderzoek.
Precies meten de labeling homogeniteit in de analyse, is het belangrijk dat u genoeg eiwitSteekproef biotinyleerd. Dit is omdat de bepaling wordt ervan uitgegaan dat eiwitten met verzadiging aan elke avidin molecule op het dekglaasje aan, en onvoldoende eiwit concentratie leidt tot een onderwaardering van de LO binden. Onze vorige studie16 heeft aangetoond dat meestal meer dan 10 pg van eiwit nodig voor verzadigde bindende is, en dit zelfs na fractionering van ongeveer 1.000 HeLa cellen24, kan worden verkregen. Het is aanbevolen om het maken van een verdunningsreeks van het eiwitSteekproef te bevestigen de verzadiging van de avidin plekken. We constateren ook dat de dichtheid van de avidin op het dekglaasje aan dus niet wellicht tot overlappingen tussen plekken in opgenomen beelden, terwijl het geven van voldoende plek nummers voor statistische analyse worden geoptimaliseerd.
Deze test wordt ervan uitgegaan dat een staalgrijs avidin molecuul22 op het dekglaasje aan één eiwit kunt binden. Inderdaad, de positieve controlegegevens in onze eerdere studie aangegeven dat een avidin molecuul kan binden aan maximaal vier fluorescently geëtiketteerde biotins, maar de meerderheid (55%) van avidin moleculen binden slechts één of twee moleculen van biotine. Want eiwitten groter dan Biotine zijn, hun sterische effecten moeten leiden tot een minder eiwitten gebonden aan één avidin. Onze veronderstelling wordt verder ondersteund door het feit dat n̄kleurstof blijft constant als meten van gemengde monsters van label ongelabelde proteïnen in verschillende verhoudingen16.
Afhankelijk van de soort eiwit optreden aspecifieke binding van eiwitten aan het dekglaasje aan aanzienlijk zelfs met een coating van de BSA. Als dit het geval, kan één optie worden voor het meten van een besturingselement waar biotinyleerd eiwitten aan het dekglaasje aan zonder avidin, in plaats van fluorescerende Biotine bij stap 4.6.3 zijn bekleed. Het effect van de aspecifieke bindt LO kan wiskundig worden geëlimineerd door af te trekken van het aantal plekken van dit besturingselement aan het eiwit monster.
Dit protocol zal zijn onschatbare waarde voor proteoom-wide single-molecuul eiwit tellen analyses. De gevoeligheid van één molecuul kan analyse van eiwit bedragen voor elke soort eiwit ongeacht hun overvloed in de cel-25. Dit kan worden gerealiseerd door Proteoom scheiding gevolgd door kwantificering van het aantal fluorescentie plekken in combinatie met eiwitten. Verder, de hoge gevoeligheid zal ook toestaan eencellige analyse, waardoor onderzoekers te onderzoeken van heterogeniteit in cel populaties en stelt hiervoor clustering van cellulaire25,26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren de volgende concurrerende financiële interesseren: RIKEN heeft een octrooi-aanvraag ingediend over deze resultaten met S.L. en Y.T. genoemd als mede-uitvinders.
Acknowledgments
De auteurs bedanken Masae Ohno en Kazuya Nishimura voor experimentele hulp en advies. Dit werk werd gesteund door PRESTO (JPMJPR15F7), Japan-Science and Technology Agency, Grants-in-aid voor jonge wetenschappers (A) (24687022), uitdagende verkennend onderzoek (26650055) en wetenschappelijkonderzoek op innovatieve gebieden (23115005), Japan Society for de bevordering van wetenschap, en door subsidies van de Takeda Science Foundation en de Mochida Memorial Foundation voor medische en farmaceutische Research. S.L. erkent ondersteuning vanuit de RIKEN International-programma koppelen (IPA) programma.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 22x22x0.15 mm coverslip | VWR | 470019-004 | |
| 488 nm Argon laser | Coherent | Innova 70C | |
| 488 nm dichroic mirror | Semrock | FF495-Di03 | |
| 488 nm emission filter | Semrock | FF02-520/28 | |
| 560 nm dichroic filter | Semrock | Di02-R561 | |
| 560 nm emission filter | Semrock | FF02-617/73 | |
| 560 nm fiber laser | MBP Communications | F-04306-2 | |
| 60x oil immersion lens | Olympus | PLAPON 60x | |
| Avidin | Nacalai-tesque | 03553-64 | |
| Biotin-PEG-amine | Thermo Scientific | 21346 | |
| Biotinylated Alexa Fluor 488 | Nanocs | ||
| Borate | Nacalai-tesque | ||
| BSA | Sigma-Aldrich | A9547 | |
| CHAPS | Dojindo | C008-10 | |
| Cy3 NHS-ester dye | GE Healthcare | PA13101 | |
| Dialyzer - D-tube, 6-8 kDa | Merck Millipore | 71507-M | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | ||
| DTT | Nacalai-tesque | 14112-94 | |
| EDC | Nacalai-tesque | ||
| EMCCD camera | Andor | IiXon 897 | |
| Epi fluorescence microscope | Olympus | IX81 | |
| Gel viewer | GE Healthcare | ImageQuant LAS 4000 | |
| Penicillin, streptomycine and Amphoterecin mix | Gibco | ||
| Plasma cleaner | Diener Electronic | ||
| SDS | Wako | NC0792960 | |
| Size purification column 10K | Merck Millipore | UFC5010 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 |
References
- Wilhelm, M., et al. Mass-spectrometry-based draft of the human proteome. Nature. 509 (7502), 582-587 (2014).
- Guo, A., et al. Immunoaffinity enrichment and mass spectrometry analysis of protein methylation. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (1), 372-387 (2014).
- Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).
- Neuhoff, V., Arold, N., Taube, D., Ehrhardt, W. Improved staining of proteins in polyacrylamide gels including isoelectric focusing gels with clear background at nanogram sensitivity using Coomassie Brilliant Blue G-250 and R-250. Electrophoresis. 9 (6), 255-262 (1988).
- Berggren, K., et al. Background-free, high sensitivity staining of proteins in one- and two-dimensional sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels using a luminescent ruthenium complex. Electrophoresis. 21 (12), 2509-2521 (2000).
- Butt, R. H., Coorssen, J. R. Coomassie blue as a near-infrared fluorescent stain: a systematic comparison with Sypro Ruby for in-gel protein detection. Molecular & cellular proteomics. 12 (12), 3834-3850 (2013).
- Nanda, J. S., Lorsch, J. R. Labeling a protein with fluorophores using NHS ester derivitization. Methods in Enzymology. , 87-94 (2014).
- Kim, Y., et al. Efficient site-specific labeling of proteins via cysteines. Bioconjugate chemistry. 19 (3), 786-791 (2008).
- Dickson, R. M., Cubitt, A. B., Tsien, R. Y., Moerner, W. E. On/off blinking and switching behaviour of single molecules of green fluorescent protein. Nature. 388 (6640), 355-358 (1997).
- Penna, A., et al. The CRAC channel consists of a tetramer formed by Stim-induced dimerization of Orai dimers. Nature. 456 (7218), 116-120 (2008).
- Ji, W., et al. Functional stoichiometry of the unitary calcium-release-activated calcium channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (36), 13668-13673 (2008).
- Ulbrich, M. H., Isacoff, E. Y. Subunit counting in membrane-bound proteins. Nature Methods. 4 (4), 319-321 (2007).
- Sugiyama, Y., Kawabata, I., Sobue, K., Okabe, S. Determination of absolute protein numbers in single synapses by a GFP-based calibration technique. Nature Methods. 2 (9), 677-684 (2005).
- Puchner, E. M., Walter, J. M., Kasper, R., Huang, B., Lim, W. A. Counting molecules in single organelles with superresolution microscopy allows tracking of the endosome maturation trajectory. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (40), 16015-16020 (2013).
- Grassart, A., et al. Actin and dynamin2 dynamics and interplay during clathrin-mediated endocytosis. The Journal of Cell Biology. 205 (5), 721-735 (2014).
- Leclerc, S., Arntz, Y., Taniguchi, Y. Extending Single Molecule Imaging to Proteome Analysis by Quantitation of Fluorescent Labeling Homogeneity in Complex Protein Samples. Bioconjugate chemistry. 29 (8), 2541-2549 (2018).
- Ian Freshney, R. Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications. , John Wiley & Sons. (2015).
- Taniguchi, Y., et al. Quantifying E. coli proteome and transcriptome with single-molecule sensitivity in single cells. Science. 329 (5991), 533-538 (2010).
- Sternberg, Biomedical Image Processing. Computer. 16 (1), 22-34 (1983).
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
- Yen, J. C., Chang, F. J., Chang, S. A new criterion for automatic multilevel thresholding. IEEE Transactions on Image Processing. 4 (3), 370-378 (1995).
- Livnah, O., Bayer, E. A., Wilchek, M., Sussman, J. L. Three-dimensional structures of avidin and the avidin-biotin complex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (11), 5076-5080 (1993).
- Mostovenko, E., Hassan, C., Rattke, J., Deelder, A. M., van Veelen, P. A., Palmblad, M. Comparison of peptide and protein fractionation methods in proteomics. EuPA Open Proteomics. 1, 30-37 (2013).
- Volpe, P., Eremenko-Volpe, T. Quantitative studies on cell proteins in suspension cultures. European Journal of Biochemistry. 12 (1), 195-200 (1970).
- Huang, B., et al. Counting low-copy number proteins in a single cell. Science. 315 (5808), 81-84 (2007).
- Johnson, A. C., Bowser, M. T. H. igh- High-Speed, Comprehensive, Two Dimensional Separations of Peptides and Small Molecule Biological Amines Using Capillary Electrophoresis Coupled with Micro Free Flow Electrophoresis. Analytical Chemistry. 89 (3), 1665-1673 (2017).
