यहां, Ca 2 पर प्रभाव के आकलन के लिए दो मध्यम-थ्रप्ट assays+-सिग्नलिंग और मानव शुक्राणु में अग्रपिंडक प्रतिक्रिया वर्णित हैं । इन assays के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है जल्दी और आसानी से के लिए यौगिकों की बड़ी मात्रा में स्क्रीन Ca पर प्रभाव2 +-संकेतन और मानव शुक्राणु में अग्रपिंडक प्रतिक्रिया.
Ca2 +-संकेतन सामांय शुक्राणु सेल समारोह और पुरुष प्रजनन क्षमता के लिए आवश्यक है । इसी तरह, अग्रपिंडक प्रतिक्रिया एक मानव शुक्राणु कोशिका की क्षमता के लिए महत्वपूर्ण है zona पेल्यूसिडा घुसना और अंडे खाद । इसलिए यह महान ब्याज के यौगिकों का परीक्षण करने के लिए है (जैसे, पर्यावरणीय रसायनों या दवा उंमीदवारों) Ca पर उनके प्रभाव के लिए2 +-संकेतन और मानव शुक्राणु में अग्रपिंडक प्रतिक्रिया या तो मानव शुक्राणु सेल समारोह पर संभावित प्रतिकूल प्रभाव की जांच करने के लिए या गर्भनिरोधक के रूप में संभावित भूमिका की जांच करना । यहां, दो मध्यम-थ्रप्ट assays वर्णित हैं: 1) एक प्रतिदीप्ति-Ca पर प्रभाव के मूल्यांकन के लिए परख2 +-मानव शुक्राणु में संकेतन, और 2) मानव शुक्राणु में अग्रपिंडक प्रतिक्रिया के आकलन के लिए एक छवि cytometric परख । इन assays Ca पर प्रभाव के लिए यौगिकों की एक बड़ी संख्या स्क्रीन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है2 +-सिग्नलिंग और मानव शुक्राणु में अग्रपिंडक प्रतिक्रिया. इसके अलावा, assays अत्यधिक विशिष्ट खुराक उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है-व्यक्तिगत यौगिकों की प्रतिक्रिया घटता, दो या अधिक यौगिकों के लिए संभावित additivity/synergism का निर्धारण, और प्रतिस्पर्धी निषेध के माध्यम से कार्रवाई की औषधीय मोड का अध्ययन करने के लिए catsper inhibitors के साथ प्रयोग ।
दो assays यहां वर्णित के प्रयोजन के लिए 2 पर प्रभाव की जांच कर रहा है+-सिग्नलिंग और मानव शुक्राणु में अग्रपिंडक प्रतिक्रिया, के रूप में कई यौगिकों के लिए दिखाया गया है अनेक इन assays को रोजगार प्रकाशनों1,2, 3,4,5,6,7. Ca2 +-संकेतन और अग्रपिंडक प्रतिक्रिया दोनों सामांय मानव शुक्राणु सेल समारोह और पुरुष प्रजनन क्षमता के लिए महत्वपूर्ण हैं ।
एक मानव शुक्राणु कोशिका के समग्र लक्ष्य के लिए अंडे खाद है । को सफलतापूर्वक और स्वाभाविक रूप से अंडा खाद करने में सक्षम हो, शुक्राणु कोशिका के कार्य कसकर मादा प्रजनन पथ के माध्यम से शुक्राणु कोशिका की यात्रा के दौरान विनियमित किया जाना चाहिए8,9. शुक्राणु कोशिका कार्यों के कई इंट्रासेलर Ca के माध्यम से विनियमित रहे हैं2 +-एकाग्रता [Ca2 +]मैं (जैसे, शुक्राणु गतिशीलता, chemotaxis, और अग्रपिंडक प्रतिक्रिया)10. इसके अलावा, एक परिपक्वता प्रक्रिया संधारित्र कहा जाता है, जो अंडा निषेचित करने में सक्षम शुक्राणु कोशिका renders, आंशिक रूप से विनियमित है [Ca2 +]मैं10. ca2 +-extruding ca2 +-atpase पंपों11 बनाए रखने के एक लगभग २०.००० गुना ca2 +-मानव शुक्राणु कोशिका झिल्ली पर ढाल, एक आराम के साथ [Ca2 +]i of 50-100 nM. यदि ca2 + सेल झिल्ली को पार करने की अनुमति दी है (जैसे, ca के उद्घाटन के माध्यम से2 +-चैनल), ca 2 की एक खासी आमद+ होता है, की एक पदोंनति को जंम दे [ca2 +]i। हालांकि, शुक्राणु कोशिका भी इंट्रासेलुलर ca2 +-भंडार है, जो ca2 जारी कर सकते है + और, इसलिए भी वृद्धि एक [ca2 +]मैं12की तरक्की दे । दिलचस्प है, सभी चैनल-मध्यस्थता Ca2 +-मानव शुक्राणु कोशिकाओं में आमद अब तक catsper (कैटईओण चैनल के एसपेrm), जो केवल शुक्राणु कोशिकाओं11में व्यक्त किया जाता है के माध्यम से घटित करने के लिए पाया गया है । मानव शुक्राणु कोशिकाओं में, catsper अंतर्जात लिगन्स प्रोजेस्टेरोन और उपलब्ध अलग संलग्नी बाध्यकारी साइटों के माध्यम से सक्रिय है13,14,15, एक तेजी से Ca करने के लिए अग्रणी2 +-में तांता शुक्राणु कोशिका । अंडे के पास दो मुख्य स्रोत इन अंतर्जात लिगन्स के उच्च स्तर प्रदान करते हैं । एक कूपिक द्रव है कि प्रोजेस्टेरोन के उच्च स्तर में शामिल है16. कूपिक द्रव ovulation पर अंडे के साथ एक साथ परिपक्व कूप से जारी किया गया है और अंडवाहिनी17के भीतर तरल पदार्थ के साथ घोला जा सकता है । अंय मुख्य स्रोत है मेघपुंज कोशिकाओं है कि अंडे के चारों ओर और प्रोजेस्टेरोन और prostaglandins के उच्च स्तर जारी है । प्रोजेस्टेरोन-प्रेरित Ca2 +-शुक्राणु कोशिकाओं में आमद9,18, नियंत्रण शुक्राणु गतिशीलता19,20 की ओर chemotaxis मध्यस्थता करने के लिए दिखाया गया है और अग्रपिंडक उत्तेजित प्रतिक्रिया२१. इन व्यक्ति के ट्रिगर [Ca2 +]मैंविनियमित शुक्राणु सही क्रम में कार्य करता है और सही समय पर अंडा8के निषेचन के लिए महत्वपूर्ण है । इस के साथ लाइन में, एक सबऑप्टिमल प्रोजेस्टेरोन प्रेरित Ca2 +-तांता कम पुरुष प्रजनन के साथ जुड़ा हुआ पाया गया है22,23,24,25,26 ,27,28,29 और कार्यात्मक catsper पुरुष प्रजनन क्षमता के लिए आवश्यक है26,30,31,३२, ३३,३४,३५,३६.
के रूप में शुक्राणु कोशिकाओं के अंडे तक पहुंचने, घटनाओं के एक अनुक्रम में होने के लिए निषेचन के लिए जगह ले जाना चाहिए: 1) शुक्राणु कोशिकाओं आसपास के मेघपुंज कोशिका परत घुसना चाहिए, 2) zona pellucida के लिए बाध्य, 3) exocytose acrosomal सामग्री, तथाकथित अग्रपिंडक प्रतिक्रिया ३७, 4) zona पेल्यूसिडा घुसना, और 5) अंडे की झिल्ली के साथ फ्यूज३८निषेचन को पूरा करने के लिए । इन कदमों के माध्यम से जाने के लिए और अंडे खाद करने में सक्षम होना करने के लिए, शुक्राणु कोशिका पहले capacitation11से गुजरना होगा, जो शुरू होता है के रूप में शुक्राणु कोशिकाओं “decapacitating” कारकों३९ और महिला के तरल पदार्थ में तैरने युक्त मौलिक द्रव छोड़ बिसारबोनेट और एल्ब्युमिन३७के उच्च स्तर के साथ प्रजनन पथ । capacitation शुक्राणु कोशिकाओं hyperactivation से गुजरना करने में सक्षम renders, एक जोरदार flagellum की धड़कन के साथ गतिशीलता का एक रूप, और अग्रपिंडक प्रतिक्रिया३७. hyperसक्रियित गतिशीलता zona पेल्यूसिडा४०के प्रवेश के लिए आवश्यक है, और अग्रपिंडक विभिंन hydrolytic एंजाइमों कि इस प्रवेश प्रक्रिया४१सहायता शामिल है । इसके अतिरिक्त, अग्रपिंडक प्रतिक्रिया शुक्राणु के शुक्राणु के लिए आवश्यक सतह पर विशिष्ट झिल्ली प्रोटीन को उजागर करके अंडे के साथ fusing में सक्षम कोशिकाओं को renders-अंडा फ्यूजन४२। नतीजतन, hyperactivation और अग्रपिंडक प्रतिक्रिया से गुजरना करने की क्षमता दोनों अंडे४०,४२के सफल निषेचन के लिए आवश्यक हैं । क्या माउस शुक्राणु कोशिकाओं के लिए देखा गया है के विपरीत४३,४४,४५, केवल मानव शुक्राणु कोशिकाओं है कि acrosome हैं-बरकरार zona पेल्यूसिडा४६के लिए बाध्य कर सकते हैं. जब मानव शुक्राणु कोशिकाओं zona पेल्यूसिडा वे अग्रपिंडक प्रतिक्रिया से गुजरना करने के लिए दोनों zona पेल्यूसिडा४१ घुसना और विशिष्ट झिल्ली प्रोटीन है कि३८अंडे के साथ फ्यूजन के लिए आवश्यक हैं बेनकाब करने के लिए बाध्य कर रहे हैं. मानव शुक्राणु में अग्रपिंडक प्रतिक्रिया के समय इस प्रकार निषेचन होने के लिए महत्वपूर्ण है ।
जैसा कि ऊपर वर्णित है, ca2 +-संकेतन सामान्य शुक्राणु सेल समारोह के लिए महत्वपूर्ण है8, और यह है, इसलिए, महान ब्याज के लिए Ca पर प्रभाव के लिए यौगिकों की बड़ी संख्या स्क्रीन करने में सक्षम होना2 +-मानव शुक्राणु कोशिकाओं में संकेतन. इसी तरह, के रूप में केवल मानव शुक्राणु कोशिकाओं है कि सही समय और जगह पर अग्रपिंडक प्रतिक्रिया से गुजरना zona पेल्सिडा घुसना और अंडे४६,४७खाद कर सकते हैं, यह भी महान ब्याज की अपनी क्षमता के लिए यौगिकों का परीक्षण करने में सक्षम होना करने के लिए मानव शुक्राणु में अग्रपिंडक प्रतिक्रिया को प्रभावित. इस अंत करने के लिए, दो मध्यम throughput स्क्रीनिंग assays वर्णित हैं: 1) Ca 2 पर प्रभाव के लिए एक परख+मानव शुक्राणु कोशिकाओं में संकेतन, और 2) मानव शुक्राणु कोशिकाओं में अग्रपिंडक प्रतिक्रिया प्रेरित करने की क्षमता के लिए एक परख ।
1 परख एक मध्यम throughput Ca2 +-संकेतन परख है । यह प्रतिदीप्ति प्लेट पाठक-आधारित तकनीक कई कुओं में एक साथ समय के एक समारोह के रूप में प्रतिदीप्ति में परिवर्तन पर नज़र रखता है. ca2 +-संवेदनशील फ्लोरोसेंट डाई, fluo-4 ca के लिए एक Kd है2 +≈ ३३५ एनएम और सेल है-AM (acetoxymethyl) एस्टर के रूप में permeant. fluo-4 का उपयोग करना, यह [Ca में परिवर्तन को मापने के लिए संभव है2 +]मैं समय के साथ और शुक्राणु कोशिकाओं के लिए ब्याज के यौगिकों के अलावा के बाद. परख २०११13 में timo strünker की प्रयोगशाला द्वारा विकसित किया गया था और बाद से कई अध्ययनों में Ca 2 पर प्रभाव के लिए स्क्रीन यौगिकों के लिए इस्तेमाल किया गया है+-मानव शुक्राणु में संकेतन1,2,3, 4,5. इसके अलावा एक ऐसी ही विधि के लिए कई दवा उंमीदवारों४८स्क्रीन का इस्तेमाल किया गया है । इसके अलावा, इस परख कार्रवाई के औषधीय मोड का आकलन करने के लिए भी उपयोगी है1,2,3,4,5, खुराक-प्रतिक्रिया घटता1, 2,3,4,5, प्रतिस्पर्धी अवरोध1, 2, योज्यता1,2, और synergism3 of ब्याज के यौगिकों ।
2 परख एक मध्यम थ्र्रपुट अग्रपिंडक प्रतिक्रिया परख है । इस छवि cytometer आधारित तकनीक के उपाय व्यवहार्य अग्रपिंडक एक नमूने में शुक्राणु कोशिकाओं की राशि, तीन फ्लोरोसेंट रंजक का उपयोग कर: प्रोपिडियम आयोडाइड (पीआई), fitc-युग्मित लेक्टिन पिसम साटिवुम (fitc-पीएसए), और hoechst-३३३४२. परख एक समान प्रवाह cytometry से संशोधित किया गया zoppino एट अल.४९ द्वारा विधि आधारित है और कई अध्ययन में इस्तेमाल किया गया है6,7। Ca 2 के लिए के रूप में+-संकेतन परख, इस अग्रपिंडक प्रतिक्रिया परख भी खुराक का आकलन किया जा सकता है-प्रतिक्रिया घटता, निषेध, additivity, और ब्याज के यौगिकों के synergism.
मध्यम प्रवाह Ca2 + संकेतन परख एकल microwells प्रत्येक २५०,००० शुक्राणु कोशिकाओं के बारे में युक्त से प्रतिदीप्ति के मापन पर आधारित है । कब्जा कर लिया संकेत अच्छी तरह से सभी व्यक्तिगत शुक्राणु कोशिकाओं से औ?…
The authors have nothing to disclose.
लेखकों एआर और डले के पर्यवेक्षण के लिए टिमो strünker की प्रयोगशाला अपनी प्रयोगशाला में अपने रहता है के दौरान स्वीकार करना चाहते हैं । इसके अलावा, हम विकास और प्रजनन के विभाग में हमारे सहयोगियों का शुक्रिया अदा करना चाहूंगा, कोपेनहेगन विश्वविद्यालय अस्पताल, इन दो assays स्थापित करने के साथ उनकी सहायता के लिए rigshospitalet । इस काम को नवाचार कोष डेनमार्क (अनुदान संख्या 005-2010-3 और 14-2013-4) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था ।
0.2 µm pore filter | Thermo Fisher Scientific, USA | 296-4545 | |
1 L measuring cylinder | Thermo Fisher Scientific, USA | 3662-1000 | |
1,4 and 2 mL plastic tubes | Eppendorf, Germany | 30120086 and 0030120094 | |
12-channel pipette | Eppendorf, Germany | 4861000813 | |
384 multi-well plates | Greiner Bio-One, Germany | 781096 | |
15 and 50 mL platic tubes | Eppendorf, Germany | 0030122151 and 30122178 | |
A2-slide | ChemoMetec, Denmark | 942-0001 | |
Automatic repeater pipette | Eppendorf, Germany | 4987000010 | |
CaCl2 | |||
Centrifuge | |||
Clean wide-mouthed plastic container for semen sample | |||
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | |||
FITC-coupled lectin of Pisum sativum (FITC-PSA) | Sigma-Aldrich, Germany | L0770 | |
Fluo-4 AM | Thermo Fisher Scientific, USA | F14201 | |
FLUOstar OMEGA fluorescence microplate reader | BMG Labtech, Germany | ||
Glucose anhydrous | |||
HEPES | |||
Hoechst-33342 | ChemoMetec, Denmark | 910-3015 | |
Human serum albumin (HSA) | Irvine Scientific | 9988 | For addition to HTF+ |
Immobilizing solution containing 0.6 M NaHCO3 and 0.37% (v/v) formaldehyde in distilled water | |||
Incubator | |||
KCl | |||
KH2PO4 | |||
Magnetic stirrer | |||
MgSO4 | |||
Na-Lactate | |||
NaCl | |||
NaHCO3 | |||
NC-3000 image cytometer | ChemoMetec, Denmark | 970-3003 | |
Pipettes and piptting tips | |||
propidium iodide (PI) | ChemoMetec, Denmark | 910-3002 | |
Purified water | |||
Rack for placing 50 mL plastic tubes in 45° angle | |||
S100 buffer | ChemoMetec, Denmark | 910-0101 | |
SP1-cassette | ChemoMetec, Denmark | 941-0006 | |
Volumetric flasks of appropriate sizes | |||
Vortexer |