Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biology

Orta-den geçerek deneyleri Ca2 +etkileri değerlendirilmesi için eleme-sinyal ve insan Sperm Acrosome reaksiyon

doi: 10.3791/59212 Published: March 1, 2019

Summary

Burada, iki orta-den geçerek deneyleri Ca2 +etkileri değerlendirilmesi için-sinyalizasyon ve acrosome tepki insan sperm olarak açıklanmıştır. Bu deneyleri bileşikler üzerinde Ca2 +etkileri için büyük miktarda hızlı ve kolay bir ekran için kullanılabilir-insan sperm sinyal ve acrosome reaksiyon.

Abstract

CA2 +-sinyal normal sperm hücre işlevi ve erkek üreme için gerekli. Benzer şekilde, acrosome tepki zona pelusida nüfuz ve yumurtayı döllemek için insan bir sperm hücresi yetenek için çok önemlidir. Bu nedenle büyük ilgi için onların etkisi Ca2 +bileşikleri (örneğin, çevresel kimyasal madde veya ilaç adaylarının) test etmek için-insan sperm sinyal ve acrosome reaksiyon ya insan sperm hücre işlevi üzerinde olası olumsuz etkileri incelemek için veya bir gebelik önleyici olarak olası bir rol araştırmak için. Burada, iki orta-den geçerek deneyleri açıklanmıştır: 1) bir floresan tabanlı tahlil Ca2 +etkileri değerlendirilmesi için-insan sperm ve 2) bir görüntü sitometrik tahlil acrosome tepki insan sperm olarak değerlendirilmesi için sinyal. Bu deneyleri bileşikler üzerinde Ca2 +etkileri için çok sayıda ekran için kullanılabilir-insan sperm sinyal ve acrosome reaksiyon. Ayrıca, deneyleri çok özel doz-yanıt eğrileri bireysel bileşiklerin oluşturmak, iki veya daha fazla bileşikler için potansiyel additivity/synergism belirlemek için ve eylem yoluyla rekabetçi inhibisyon farmakolojik modu çalışmaya kullanılabilir CatSper inhibitörleri ile deneyler.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Burada açıklanan iki deneyleri amacı Ca2 +etkileri incelemektir-sinyalizasyon ve acrosome tepki insan sperm için gösterildiği gibi çeşitli yayınlar bunlar istihdam içinde birden çok bileşikleri deneyleri1,2, 3,4,5,6,7. CA2 +-sinyalizasyon ve acrosome tepki hayati normal insan sperm hücre işlevi ve erkek üreme vardır.

Bir insan sperm hücre genel yumurtayı döllemek için hedeftir. Başarıyla ve doğal olarak yumurtayı döllemek için sperm hücre fonksiyonları sıkıca sperm hücresi ile kadın üreme sistemi8,9yolculuk sırasında düzenlenmiş olması gerekir. Sperm hücresi işlevlerin çoğunu düzenlenmektedir intrasellüler Ca2 +-konsantrasyon [Ca2 +]10ben (örneğin, sperm hareketliliği, kemotaksis ve acrosome reaksiyon). Ayrıca, sperm hücresi yumurtayı dölleme yeteneğine işler, capacitation denilen bir olgunlaşma sürecini kısmen düzenlenmiş tarafından [Ca2 +]ben10' dur. CA2 +-ekstrüzyon Ca2 +-ATPaz pompalar11 korumak bir yaklaşık 20.000 kat Ca2 +-bir dinlenme [Ca2 +]ben 50-100 nm ile insan sperm hücre zarı üzerinde gradyan. CA2 + hücre zarı geçmeye izin verilip verilmediğini (örneğin, Ca2 +delikten-kanalları), Ca2 + bir büyükçe akını oluşur, sebebiyet veren [Ca2 +]benbir ayrıcalık. Ancak, sperm hücresi de intrasellüler Ca2 +taşır-Ca2 + serbest bırakabilirsiniz mağazaları ve bu nedenle, da vermek bir ayrıcalık yükselmesi [Ca2 +]ben12artış. İlginçtir, tüm kanal-aracılı Ca2 +-akın insan sperm hücrelerinde CatSper (kediiyonik kanal SpeRM), sadece sperm hücresi11' de gösterilen üzerinden gerçekleşmesi için defa bulunmuştur. İnsan sperm hücrelerinde CatSper endojen ligandlar progesteron ve prostaglandin ayrı ligand siteleri13,14,15, bağlama aracılığıyla bir hızlı Ca2 +için önde gelen harekete-akını içine sperm hücresi. İki ana kaynağı yumurta yakınındaki bu endojen ligandlar yüksek düzeyde sağlar. Progesteron16yüksek düzeyde içeren foliküler sıvı biridir. Foliküler sıvı olgun foliküller yumurta yumurtlama ve karışımları oviducts17içinde sıvı ile birlikte yayımlanır. Diğer ana yumurta surround ve progesteron ve prostaglandin yüksek düzeyde yayın kümülüs hücreleri kaynağıdır. Progesteron kaynaklı Ca2 +-akın sperm hücresi içinde yumurta9,18doğru kemotaksisi aracılık, sperm hareketliliği19,20 kontrol ve acrosome teşvik gösterilen reaksiyon21. Bu bireysel [Ca2 +]benuyarının harekete geçirilmesine karşılık-düzenlenmiş sperm fonksiyonları doğru sırada ve doğru zamanda8yumurta döllenme için önemlidir. Bu, bir suboptimal progesteron kaynaklı Ca2 +doğrultusunda-akın bulundu ilişkili olmak azaltılmış erkek üreme22,23,24,25,26 ,27,28,29 ve fonksiyonel CatSper erkek üreme26,30,31,32için, temel 33,34,35,36.

Sperm hücresi yumurtayı ulaştığı fertilizasyon oluştuğu için olaylar dizisi gerçekleşmesi gerekir: 1) sperm hücreleri çevreleyen kümülüs hücre katmanı nüfuz gerekir, 2) bağlamak için zona pelusida, 3) exocytose acrosomal içerik, sözde acrosome tepki 37, 4) zona pelusida ve 5 nüfuz) sigorta fertilizasyon38tamamlamak için yumurta membran ile. Bu adım adım gitmek ve yumurtayı döllemek muktedir, sperm hücresi ilk olarak sperm hücresi "decapacitating" faktörler39 içeren meni bırakın ve dişi sıvı yüzmek başlar capacitation11, geçmeleri gerekir üreme yolu düzeyi yüksek olan bikarbonat ve albümin37. Capacitation hyperactivation, hareketliliği ile kamçı ve acrosome tepki37dinç dayak şeklinde geçmesi mümkün sperm hücreleri oluşturur. Hyperactivated motilite zona pelusida40penetrasyon için gereklidir ve acrosome bu penetrasyon süreci41yardım çeşitli hydrolytic enzimler içerir. Ayrıca, acrosome reaksiyonu sperm hücresi yumurta ile sperm yumurta füzyon42için gerekli sperm yüzeyinde belirli zar proteinleri açarak eritme yeteneğine işler. Sonuç olarak, hyperactivation ve acrosome reaksiyon geçmesi yeteneği vardır ikisi de yumurta40,42başarılı gübreleme için gereklidir. Ne için fare sperm hücresi43,44,45görülmüştür aksine, acrosome olduğu gibi sadece insan sperm hücreleri zona pelusida46için bağlayabilirsiniz. İnsan sperm hücreleri zona pelusida bağlı acrosome tepki zona pelusida41 nüfuz ve yumurta38ile fusion için gerekli olan belirli zar proteinleri ortaya çıkarmak için geçmesi gerekmektedir. Zamanlaması acrosome tepki olarak insan sperm böylece fertilizasyon oluştuğu önemlidir.

CA2 +yukarıda açıklandığı gibi-sinyal hayati için normal sperm hücre işlevi8ve bu nedenle, bileşenleri, Ca2 +etkileri için çok sayıda ekran için büyük ilgi olduğunu-insan sperm hücreleri sinyal. Doğru zaman ve yerde acrosome tepki tabi sadece insan sperm hücreleri zona pelusida nüfuz ve yumurta46,47döllemek benzer şekilde, aynı zamanda bileşiklerin onların yetenek-e doğru için test edebilmek için büyük ilgi olduğu insan sperm acrosome tepki etkiler. Bu amaçla, iki orta-den geçerek tarama deneyleri açıklanmıştır: etkileri üzerinde Ca2 +1) bir tahlil-insan sperm hücreleri ve 2) bir tahlil acrosome tepki insan sperm hücrelerinde ikna yeteneği için sinyal.

Tahlil 1 olduğunu orta-den geçerek Ca2 +-tahlil sinyal. Bu floresan plaka okuyucu tabanlı teknik Floresans zaman aynı anda birden fazla wells bir işlev olarak yapılan değişiklikleri izler. Ca2 +-hassas floresan boya, Fluo-4 Kd Ca2 +≈ 335 için vardır nM ve hücre-AM (acetoxymethyl) ester formunda permeant. Fluo-4 kullanarak, zamanla ve bileşikleri sperm hücresi ilgilendiren yanı sıra sonra [Ca2 +]i değişiklikleri ölçmek mümkündür. Tahlil Timo Strünker laboratuarda 201113 tarafından geliştirilen ve beri ekran bileşikler için çeşitli çalışmalarda etkisi Ca2 +için kullanılmıştır-insan sperm1,2,3' te, sinyal 4,5. Ayrıca benzer bir yöntem birden çok uyuşturucu adaylar48ekran kullanılmaya başlanmıştır. Buna ek olarak, bu tahlil de farmakolojik modu eylem1,2,3,4,5, doz-yanıt eğrileri1değerlendirmek için yararlı olduğunu, 2,3,4,5, rekabetçi inhibisyon1,2, additivity1,2ve synergism3 bileşikler ilgi.

Tahlil 2 Orta-den geçerek acrosome tepki tahlil olduğunu. Bu görüntü sitometresi tabanlı teknik uygun miktarını ölçer acrosome tepki sperm hücresi üç floresan boyalar kullanarak bir örnek: propidium iyodür (PI), FITC birleştiğinde lektin Pisum sativum (FITC-PSA) ve Höchst-33342. Tahlil bir benzer Akış Sitometresi tabanlı yönteminden Zoppino vd.49 tarafından değiştirildi ve kullanılmış içinde çeşitli çalışmalar6,7. Gelince Ca2 +-sinyal tahlil, bu acrosome tepki tahlil doz-yanıt eğrileri, inhibisyon, additivity ve synergism ilgi bileşiklerin değerlendirmek için de kullanılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Toplama ve analiz protokolleri insan meni örnekleri Danimarka başkenti bölge araştırma Etik Komitesi kuralları takip eder. Tüm sperm örneği Onam sonra gönüllü bağış elde edilmiştir. Doğumdan sonra örnekleri tam anonimleştirilir. Onların rahatsızlık için her donör 500 DKK (yaklaşık $75 dolar) örnek başına bir ücret aldı. Örnekleri teslim günü analiz ve laboratuvar deneyleri hemen sonra yok etti.

Not: Orta verimi Ca2 +-tahlil adım 4-5 ve 6 ile 7 orta üretilen iş acrosome tepki tahlil açıklanan sinyal. Protokol insan tubal sıvı (HTF+) orta hazırlamak için 1. adımda anlatılan ve arıtma sperm hücre deneyleri için 2-3 adımda anlatılan.

1. insan Tubal sıvı (HTF+) orta hazırlanması

Not: Kullanım hacimsel şişeler uygun ölçüde, bir 1 L ölçme silindir, bir manyetik karıştırıcı, Tablo 1 ' de listelenen gibi tuzları ve Tablo 2, arıtılmış su, 0.2 µm filtre ve 50 mL plastik tüpler gözenek.

  1. Tuzları saf su (tablo 1) hisse senedi çözümleri hazırlayın.
    1. Tablo 1 ' de listelenen uygun büyüklükte volumetric flask için tuz miktarı eklenir, biraz aşağıda istenen birimin arıtılmış su ekleyin ve iyi bir manyetik karıştırıcı kullanarak karıştırın.
    2. Tuz tamamen çözüldüğünde, mıknatıs ve istenen son hacim için saf su ile doldurun kaldırın.
  2. Hisse senedi çözüm için bir şişe aktarın ve kadar kullanmak depolayın.
    Not: Hisse senedi çözümleri devam etti ve daha uzun süreler için yeniden: glikoz ve HEPES-20 ° C'de ve oda sıcaklığında (RT) hisse senedi diğer çözümleri.
  3. 1 L HTF+ orta hisse senedi Çözümleri (Tablo 2) hazırlayın.
    1. Tüm hisse senedi çözümler tamamen çözülmüş ve iyi karışık kullanmadan önce emin olun.
    2. Hisse senedi çözüm ve Tablo 2 ' ye 1 silindir ölçme L listelenen tuz miktarı eklenir ve 900 mL saf su ekleyin.
    3. İyi bir manyetik karıştırıcı kullanarak mix ve pH 7,35 NaOH çözüm için ayarlayın.
    4. Mıknatıs kaldırın ve 1000 mL saf su ekleyin.
  4. Steril filtrate HTF+ orta bir 0.2 µm gözenek filtre, 50 mL plastik tüpler ve mağaza kullanımı kadar 4 ° C'de aliquot HTF+ orta aracılığıyla.
  5. Sadece bir deney çalıştırmadan önce Na-pyruvate 165 µL 0,33 mM son Na pyruvate konsantrasyon almak için 50 mL aliquot ekleyin.
    Not: İnsan tubal sıvı orta de çeşitli ticari sağlayıcılarından edinilebilir. 4 mM HCO3- orta kullanırken, örnekleri ilave CO2 pH büyük sürüklenir olmadan hava içinde olmadan bir kuluçka kapalı kapakları ile inkübe. CO2 kuluçka kullanılabilir durumdaysa, Henderson-Hasselbalch denklemi kullanarak ve kullanılan CO2 karşılık gelen tutarı hesaplanabilir. 25 mM HCO3- orta kullanıyorsanız, örnekleri CO2 kuluçka açık kapakları ile CO2 (genellikle % 5-10 arasında atmosferik basınç bağlıdır) karşılık gelen bir miktar içeren hava ile inkübe pH bir drift önlemek için. CO2 tam miktarı Henderson-Hasselbalch denklemi kullanılarak hesaplanabilir.

2. hareketli Sperm hücresi Swim-up (Şekil 1) yolu ile saflaştırılması

Not: Temiz-geniş ağızlı plastik konteyner kullanmak için semen örneği, kuluçka, 50 mL plastik tüpler, 50 mL plastik tüpler 45 ° açı, HTF+ orta (hazırlanan adım 1 ya da elde edilen ticari sağlayıcısından), santrifüj ve insan serumu yerleştirmek için bir raf Albümin (HSA).

  1. Mastürbasyon üretilen ve geniş ağızlı bir temiz plastik konteyner içine boşalmış bir taze bağışlanan insan meni örneği elde etmek. Sadece WHO laboratuvar kılavuzun muayene ve işleme, insan meni tarafından kurulan parametreleri yerine getirmek sperm örneği kullanın.
  2. Örnek 37 ° C'de eritmek için 15-30 dakika izin vermek için kuluçkaya.
  3. HCO3- 37 ° c ısı yukarıya HTF+ orta ile 4 mM 50 mL
  4. Yer (sıvı arasında yüzey alanı artırmak için) 45 ° açıyla bir raf temiz 50 mL plastik tüplerde. Ham meni mL başına 1 tüp kullanın.
  5. Önceden ısıtılmış HTF+ orta 4 mL her tüpler için ekleyin.
  6. Dikkatli bir şekilde Önceden ısıtılmış HTF+4 mL içeren her tüpün dibine sıvılaştırılmış meni örneğinin 1 mL pipet. Serbest bırakmak-in hava kabarcıkları kaçının.
  7. Kapakları kapatın ve tüpler için 1 h 37 ° C'de kuluçkaya.
  8. Yavaşça Aspire edin ve üst kesir (HTF+ hareketli sperm hücreleri ile) daha fazla mümkün olduğunca bir yeni 15 mL plastik tüp için alt kesir (immotile ve ölü hücreleri ile meni) sıfırdan bulunur dikkat ederken aktarın. Genellikle, alt kesir bozmadan üst fraksiyonunun 3,5 mL aktarmak güvenlidir. Emme türbülans önlemek için daha büyük bir açıklık elde etmek için bir 45 ° açıyla en dıştaki 1-2 mm pipet ucu kesilmiş.
  9. 15 mL plastik tüp hücreleri yıkamak ve tüp vasıl 700 x g RT., 10 dk santrifüj kapasitesi HTF+ ile doldurmak
  10. Yavaşça Aspire edin ve süpernatant kaldırmak ve sperm hücresi Pelet HTF+2 mL resuspend.
  11. İki küçük plastik tüpler sperm konsantrasyonu değerlendirilmesi için sperm süspansiyon 20 µL aktarmak (bkz. Adım 3).
  12. 15 mL plastik tüp hücreleri yıkamak ve tüp vasıl 700 x g RT., 10 dk santrifüj kapasitesi HTF+ ile doldurmak
  13. Yavaşça Aspire edin ve süpernatant kaldırmak ve sperm hücresi Pelet 10 x 106 hücre/ml (2,11 adımda değerlendirilen hücre konsantrasyonu bağlı olarak) resuspend.
    1. Un capacitated sperm hücreleri kullanarak deneyler için (rutin Ca2 +-tahlil sinyal)
      1. HTF+ hücrelerde 4 mM HCO3ile-resuspend.
      2. İnsan serum albumin (HSA) (100 mg/mL) 30 µL mL HTF+ 3 mg/mL nihai bir konsantrasyon almak için ekleyin.
      3. Kapakları kapatın ve 37 ° C'de s ≥1 için kuluçkaya
    2. Sperm hücresi (acrosome tepki tahlil) kullanarak deneyler için capacitated
      1. HTF+ hücrelerde 25 mM HCO3ile-resuspend.
      2. HSA (100 mg/mL) 30 µL mL HTF+ 3 mg/mL nihai bir konsantrasyon almak için ekleyin.
      3. Kapakları gevşek iliştirin ve CO2 karşılık gelen miktarda 37 ° C'de ≥3 saatlerce kuluçkaya (bkz. Adım 1, genellikle % 5-10 CO2arasında).

3. Sperm hücrelerinin sayma

Not: Sperm hücresi de el ile50 veya kullanarak bir görüntü sitometresi51, burada açıklandığı şekilde sayılabilir. S100 arabellek, SP1 kasetli swim-up sperm hücresi (2. adımda hazırlanan) saf, bir görüntü sitometresi, bir vortexer kullanın.

  1. 20 µL 10, 20, 30, 50 veya 90 (Pelet adım 2.10 el ile muayene tarafından değerlendirilen) beklenen konsantrasyon göre yuvarlak alt 2 mL tüp kullanarak S100 arabellekte bir faktör aliquot oranında seyreltin. (Yani, sonra yüzmek-up bekleniyor mL başına 15 x 106 sperm hücreleri bir konsantrasyon sonra 20 µL sperm örneği ile 380 µL S100 arabelleği [seyreltme faktörü 20] seyreltik) kullanım için konsantrasyon en yakın seyreltme beklenen.
  2. Mix 10 için iyi s maksimal 700 rpm bir girdap Mikser ile SP1-kaset örnek sokmak ve tamamen aspiratı örnek bir aliquot aşağı beyaz dalgıç kaset tuşuna basın.
  3. Görüntü sitometresi açın, kaset tepsisine yerleştirin ve uygulamalı seyreltme faktörü (3.1. adımda seçilen) göre tahlil Sayısı, PI lekeli insan Sperm hücresi tahlil çalıştırın.
  4. 3.1-3.3 ile ilk 20 µL örnekten elde edilen ölçülen konsantrasyonu en yakın bir seyreltme faktörü kullanarak, başka bir 20 µL örnek arasındaki adımları yineleyin.
  5. İki ölçüm üzerinden ortalama sperm hücre konsantrasyonu hesaplayın.
  6. Sperm hücre konsantrasyon toplam sperm hücre sayısı elde etmek için özgün birimi ile çarpın anlamına gelecektir (2. adımda bu özgün birim 2 mL'dir).

4. değişmek içinde ücretsiz intrasellüler Ca2 +ölçümü-konsantrasyon ([Ca2 +]Ben) kullanarak Ca2 +- fluorimetry (Şekil 2)

Not: Bir floresan plaka okuyucu, 384 çok iyi Kaplamalar, Fluo-4 kullanmak AM, yüzmek-up arıtılmış sperm hücresi (hazırlanan adım 2), faiz bileşikler de olumlu ve olumsuz olarak denetimleri, bir otomatik Tekrarlayıcı pipet ve 12 kanallı pipet.

  1. 2 mM Fluo-4 hazırlamak AM hisse senedi 50 µg Fluo-4 şişe için Dimetil sülfoksit (DMSO) 22,7 µL ekleyerek AM ve tüp iyice karıştırın.
  2. Bir aliquot 700 µL swim-up kurtarılan sperm süspansiyon (capacitated veya un capacitated olarak anahat içinde adım 2), yeni bir test tüpünde ekleyin. 700 µL sperm örneği bir satır (3 denetimleri ve 9 bileşikler birini içinde test etmek için kullanılır) 384-microwell plaka 24 Wells çözümlemek için gereken tutardır.
  3. 3.5 µL Fluo-4 eklemek AM AM hisse senedi eriyik için 10 µM son bir konsantrasyon elde etmek için sperm süspansiyon 700 µL Fluo-4.
  4. Örnek ışıktan korunan 37 ° C'de 45 dk için kuluçkaya.
  5. Örnek vasıl 700 x g 10 dk santrifüj kapasitesi, Aspire edin ve aşırı Fluo-4 kaldırmak için süpernatant atın.
  6. 5 x 106 hücre/ml (yani, kullanım 2 adım 4.2 hücre süspansiyon hacmi x) lekeli Pelet HTF+ resuspend
  7. Dilutions bileşikleri ve denetimlerin (Adım 4.4 ve 4.5, kuluçka ve Santrifüjü dönemlerde sırasıyla yapılabilir) hazırlayın.
    1. Bileşikleri, hem de negatif kontrol (araç ile tampon) ve HTF+olumlu bir denetimde (progesteron) oranında seyreltin. Adım 4.16 sperm hücreleri eklendiğinde seyreltilmiş 1:3 oldukları gibi bileşikler ve istenen son konsantrasyonu x 3 denetimlere oranında seyreltin.
    2. Dilutions tüplerini 4.16 adımda kullanılan 12 kanallı pipet pipet uçları arasındaki mesafe karşılık gelen borular arasında bir mesafe ile bir raf yerleştirin.
  8. Bir otomatik Tekrarlayıcı pipet (24 adımlardan 50 µL) kullanın.
    1. Mix Fluo-4 sperm örneği yavaşça yukarı ve aşağı bir kez tüm tutarını pipetting tarafından lekeli.
    2. 50 µL aliquots 384-microwell plaka üst üste 24 kuyu ekleyin.
  9. Bir floresan plaka okuyucu 30 ° C'de microwell tabak yerleştirin ve çekmeceyi kapat.
  10. Uygun iletişim kuralını Fluo-4 için seçin. 480 nm, floresan ve kayıt emisyon 520, heyecanlandırmak nm. Mümkün olan en hızlı döngüsü saat ayarı ile kullanın.
    Not: İyi ve alt optik, başına en az 10 yanıp söner Mümkünse kullanın.
  11. Bir de satır seçin ve kazanç % 20 hedef değerine ayarlayın.
  12. Ölçüm başlatın.
  13. Satır taban çizgisi ilk 5 döngüsü sırasında kontrol.
    1. Floresan okuma artıyor veya azalıyor zamanla, denemeyi durdurmak, kazanç yeniden düzenlemek ve deneme yeniden başlatın.
    2. Satır taban çizgisi çok üst üste bireysel kuyular arasında farklıysa, 4,8 adımda pipetting unprecise oldu ya örnek yeterince iyi pipetting önce karışık oldu değil. Deneme atın.
    3. Floresan okuma wells satır arasında karşılaştırılabilir ve sabit 5 ilk döngüsü sırasında ise, sonraki adıma geçin.
  14. (Temel için kullanılan) 10 döngüsünden sonra deneme duraklatın.
  15. Microwell plaka ile çekmece çıkarma.
  16. 12 kanallı pipet (25 µL 2 adım), hızlı bir şekilde kullanarak bileşikler ve denetimlerden (Adım 4.7) bir satır 12 iyi çiftleri (24 kuyu) için hazırlanmış çözümler 25 µL ekleyin. Kuyuları zaten 50 µL lekeli sperm örneği içeren çözümler seyreltilmiş 1:3, olacaktır.
  17. Ölçüm mümkün (eklenen bileşikler tarafından indüklenen herhangi bir floresan sinyallerini eksik önlemek için çekmece kapanacak otomatik olarak) ve denetimleri olarak hızlı bir şekilde devam edin. Değişiklikler floresan (ek bileşenleri ve denetimleri şimdi çekilecek sonra ΔF).
  18. Floresan sinyallerini olumlu denetim ve faiz bileşikler kaydetmiş olduğunuz kadar deneme çalıştırın.
  19. Denemeyi durdurup adım 5 olduğu gibi analiz etmek için ham Floresans veri verin.
    Not: Genellikle Fluo-4 AM kullanılan Ca2 +-hassas fluorophore tahlil, ama diğer Ca2 +-hassas fluorophores Ayrıca uyarma ve emisyon spectra ile floresan plaka okuyucu filtrelerde sığıyorsa kullanılabilir. Fluorophore seçime bağlı olarak, kazanç düzeyinde indüklenen floresan doruklarına alet ölçüm aralığı içinde nerede bir "güvenli" düzeyinde ayarlanmış olduğundan emin olun. Bu ionomycin belirli kazanç ayarı tek bir kuyuda ekleyerek test edilebilir. Bu eşiğin floresan bir sinyal indüklenen, kazanç alt ve yeniden deneyin. Bazı Pluronic F-127 Fluo-41,13yüklenmesini yardım etmek için kullanın, ancak bu gerekli2değil bulundu. Aynı anda Ölçülen satır maksimal sayısı iki faktöre bağlıdır. 1) araç döngü süresi: döngü süresi çok uzun ise, indüklenen Peaks'e [Ca2 +]ben kaçırmış. Aynı anda döngü süresi düşük tutmak için iki satır en fazla ölçün; 2) 4.16. adımda pipetting hızı: 12 kanallı pipet kullanarak, hızlı bir şekilde (örneğin, bir satır ile araç önceden inkübe ve önceden bir inhibitörü ile inkübe bir satır) 1 veya 2 satır 12 yinelenen wells (24 kuyu) 12 farklı çözümler eklemek mümkündür , indüklenen Ca2 + peaks eksik olmadan. Ancak, pipetting ipuçları sayede indüklenen Ca2 + peaks cevapsız iki sıralı pipetting adımları arasında değiştirilmesi gerekecektir 24 farklı çözümler eşzamanlı ölçmek, iki satır eklemek denemek için tavsiye edilmez.

5. Ca2 +fluorimetry - gelen veri analizi

  1. Elde edilen ve adım 4'te verilen ham Floresans veri açın.
  2. Yinelenen kuyulardan ortalamasını hesapla. Yinelemeler arasında büyük farklılıklar varsa, verileri belirli kuyulardan atmak.
  3. Temel 10 ilk devir tanımlayın.
  4. ΔF/F0 (%) hesaplamak yüzde olarak değişim floresan (ΔF) ek bileşenleri ve denetimleri ile ilgili 10 ilk döngüleri (temel) sırasında ortalama Bazal floresan (F0) sonra zaman içinde.
  5. Verileri doz-yanıt eğriler oluşturmak için kullanıyorsanız, kuyulardan pipetting eserler kaldırmak için diğer, negatif kontrol okuma çıkarma.

6. ölçüm Acrosome tepki

Not: Kullanmak bir görüntü sitometresi, kuluçka, floresan boyalar: PI, FITC-PSA ve Höchst-33342, pozitif ve negatif denetimlerin, 0,6 M NaHCO3 ve distile suda %0,37 (v/v) formaldehit içeren bir immobilizing çözüm yanı sıra, faiz bileşikler bir A2 slayt ve capacitated yüzmek-up sperm hücresi (2. adımda hazırlanan) saf.

  1. PI içeren bir boyama çözüm hazırlamak (5 µg/mL), FITC-PSA (50 µg/mL) ve Höchst-33342 (100 µg/mL) HTF+, iyi bir girdap Mikser kullanarak karıştırın ve ışıktan kadar kullanmak korumak.
  2. Seyreltilmiş 1:10 adımda 6.5 oldukları gibi bileşikler ve denetimlerin çözümleri istenen son konsantrasyonu x 10 hazır olun. Her zaman bir negatif (araç) ve iki pozitif denetimi içerir: progesteron 10 µM son konsantrasyon ve ionomycin 2 µM son konsantrasyon.
  3. Aliquots (2. adımda hazırlanan) capacitated sperm hücrelerinin 240 µL plastik tüpler aktarın.
  4. Eriyik-e doğru her tüp boyama 30 µL ekleyin. Lekeleri son konsantrasyonu olacak: 0,5 µg/mL PI, 5 µg/mL FITC-PSA ve 10 µg/mL Höchst-33342.
  5. Her tüpün 30 µL çözümleri denetimleri veya bileşikler ile eklemek (1:10 seyreltme).
  6. Örnekleri karışımı yavaşça yukarı ve aşağı birkaç kez veya hafif vortexing pipetting. Mekanik stres nedeniyle aşırı karıştırma önlemek.
  7. 30 dk 37 ° C'de kuluçkaya.
  8. Yeni plastik tüpler immobilizing çözümünün 0,6 M NaHCO3 ve distile su, bir tüp başına %0,37 (v/v) formaldehit içeren 100 µL ile hazırlayın.
  9. Kuluçka sonra örnekleri de pipetting tarafından mix ve bir tüp 100 µL immobilizing çözüm ile 50 µL test örneği ekleyin.
  10. Bir A2 slayt odaları yüklemeden önce örnek de pipetting tarafından karıştırın. Odalar dikkatle hava kabarcıkları oluşturmadan yaklaşık 30 µL ile doldurun.
    Not: Kuluçka sırasında hareketli sperm hücresi eğilimindedir toplamak. (Onlar hariç olsa bile) hücre kümeleri ölçümleri rahatsız edemez. Bu nedenle, bir ayrıntılı karıştırma kuluçka sonra pipetting tarafından çok önemlidir. Aynı şekilde, hava kabarcıkları odalarında ölçümleri rahatsız edemez. Bu nedenle, Oda yavaş yavaş doldurun ve sıvı kenarlarını yaklaşık karşılamak ve bir hava kabarcığı oluşturmak istiyorsak pipet açısını değiştirmek.
  11. Yüklenen slayt görüntü sitometresi tepsiye yerleştirin ve kapatmak belgili tanımlık tepsi.
  12. FlexiCyte protokol ve basın Çalıştır seçin.
    1. FlexiCyte iletişim kuralı için aşağıdaki ayarları seçin: analitik kanal sayısı: 2; Kanal maskeleme: UV (LED365), bu görüntü segmentasyonu için; kullanılan kanal Kanal 1: Mavi (LED475), pozlama süresi 3.000 ms, emisyon filtre 560/35; Kanal 2: Yeşil (LED530), pozlama zaman 500 ms, emisyon filtre 675/75; En az analiz hücre sayısı: 5000; Birleştirilmiş hücreleri hariç: Evet.
  13. Tüm örneklerini ölçülen kadar 6,9-6.12 tekrarlayın.

7. veri--dan imge Sitometresi Analizi

  1. 6. adımda alınan açık verileri.
  2. Ölçümler değerlendirmek için iki aşağıdaki araziler oluşturun.
    1. Bir dağılım çizim Höchst-33342 yoğunluk Höchst-33342 alan vs biexponential ölçekler üzerinde oluşturun. Bu kapı dışarı ya da çok küçük olan Höchst-33342 olumlu nesneler için kullanılan veya insan sperm hücreleri olmak çok büyük olabilir.
    2. Bir dağılım çizim FITC-PSA yoğunluğu ve PI yoğunluk biexponential ölçekler üzerinde oluşturun. Bu arsa kullanılabilir kıçlarını acrosome miktarda sperm hücresi tarafından Arsa (şekil 3) üzerinde dört gruba ayıran bir çeyreği kapı kullanımı tepki gösterdi: 1) bir PI pozitif ve olumlu FITC-PSA grubu: Acrosome tepki nonviable sperm hücresi; 2) bir PI negatif ve pozitif FITC-PSA grubu: Acrosome tepki sperm hücrelerin; 3) bir PI pozitif ve FITC-PSA grubu negatif: Acrosome sağlam nonviable sperm hücresi; ve 4) bir PI negatif ve FITC-PSA grubu negatif: Acrosome olduğu gibi canlı sperm hücresi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Temsilcisi sonuçları pozitif (progesteron) ve negatif (arabellek) denetimi [Ca2 +]i ile birlikte 4 bileşikler (A, B, C ve D) etkisini orta-den geçerek Ca2 +kullanarak insan sperm testi bir deneme-sinyal tahlil şekil 4agörülebilir. Şekil 4b', progesteron bir doz yanıt eğrisi, en yüksek ΔF/F0 ile (%) elde gösterilir progesteron, seri olarak seyreltilmiş konsantrasyonları tarafından indüklenen verileri test orta-den geçerek Ca2 +kullanarak başka bir deneyde-tahlil sinyal. Ca2 +verilerden analizi-sinyal tahlil adım 5'te açıklanmıştır. Temsilcisi acrosome tepki indüksiyon capacitated insan hücrelerinde sperm negatif kontrol (DMSO) veya orta-den geçerek acrosome tepki tahlil olabilir iki olumlu denetim (progesteron ve ionomycin) kullanarak test bir deney sonuçlarından şekil 3üst paneldeki görülebilir. Geçişli çeyreği scatter araziler 3 test koşullarından görülmektedir. 7. adımda acrosome tepki verilerin analizi açıklanmıştır.

Tablo 1: stok HTF hazırlanması için çözümler + . Hisse senedi çözümleri devam etti ve daha uzun süreler, glikoz ve HEPES-20 ° C'de ve oda sıcaklığında hisse senedi diğer çözümleri için yeniden kullanılabilir. Tüm çözümler tamamen çözülmüş ve iyi karışık kullanmadan önce emin olun.

Tablo 2: HTF hazırlanması + 4 veya 25 mM HCO 3 - tuzları (tablo 1'de hazır) hisse senedi çözümlerinden. Na-laktat-ebilmek var olmak mülhak şurup % 60 (w/w) veya toz. NaHCO3 toz olarak eklenir.

Figure 1
Şekil 1: Swim-up arıtma hareketli insan sperm hücrelerinin. Sol: HTF+ orta ile tüp ve bir aliquot sıvılaştırılmış meni örneği HTF+ orta pipetted. Sağ: swim-up 37 ° C'de 1 saat sonra hareketli sperm hücresi kadar HTF+ orta swum. Sperm hücrelerinin yanı sıra immotile ve ölü sperm hücresi sperm HTF+ orta altında görüntülenmeye devam eder. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2: Orta-den geçerek Ca2 +şeması-tahlil sinyal. (bir) Sperm hücresi yüklü bir Ca2 +ile-hassas fluorophore, yıkanmış ve aliquots 384-şey plaka wells için kaplama. (b) 384-şey plaka bir floresan plaka okuyucu 30 ° C'de konumlandırılmış (c) floresan önce ve sonra ek bileşenleri, pozitif kontrolü (progesteron) ve negatif kontrol (araç ile tampon) kaydedilir. Okumayı ΔF/F0 (%) negatif ve pozitif kontrolü eklenmesinden sonra (oklar) (c) alt gösterilmiştir. Christian Schiffer izniyle kullanılan illüstrasyon. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: değerlendirme görüntü sitometresi kullanarak acrosome tepki. (Üst panel) Dörtgen Bölümlü geçişli dağılım negatif araç kontrol (DMSO) ve pozitif denetimleri progesteron (Prog, 10 µM) ve ionomycin (Iono, 2 µM) çizer. Sağ alt kadranda hücrelerdeki bir artış (acrosome tepki hücrelerin) DMSO denetim olumlu denetimlere karşılaştırırken görülür. (Alt paneli) Mikroskobik görüntüleri de dahil olmak üzere tüm dört gruba hücrelerden fluorescently etiketli sperm hücrelerinin. BF = parlak alanlar, Höchst Höchst-33342, PSA = Pisum Sativum Agglutinin, PI = Propidium iyodür =. Ölçek çubuğu 10 µm =. Bu rakam adına Palme vd. 20187' den değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4: Örnek Ca2 +- fluorimetry veri. [Ca2 +]ben (bir) değişimler negatif kontrol, progesteron ve bileşik A, B, C ve ö. (b) progesteron doz-yanıt eğrisi tarafından indüklenen. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Tahlil Floresans tek microwells üzerinden tedavinin temel sinyal orta üretilen iş Ca2 + yaklaşık 250.000 sperm hücreleri içeren. Yakalanan sinyal iyi tüm bireysel sperm hücrelerinden ortalama. Tahlil böylece sperm hücre [Ca2 +]ben özellikle neresinde hakkında bilgi kayma yok değişti, [Ca2 +]i bir değişiklik yer, ya da ne kadar türdeş olmayan yanıttır alır sperm hücrelerinin bir kısmı ne büyüklükte sağlar tek tek hücreleri arasında. Bu tür bilgiler edinmek için tek hücre çözünürlük ile deneyler (örneğin,50,52açıklandığı gibi) istihdam gerekir. Başka bir tekniği sırasına saniyedir zamansal çözünürlük dezavantajıdır. 50 µL sperm örnekleri 25 zaman iyi karışık olsa bile µL çözümler eklenir, sonra çok iyi plakalı çekmece geri Floresans plaka okuyucu içinde ölçümleri ilk başlatılan. Daha yüksek zamansal çözünürlük elde etmek için başka teknikler istihdam gerekir (örneğin, bir durdu akışı fluorimetry13,50). Orta-den geçerek Ca2 +avantajı-tahlil, tek hücreli veya tek-şey yöntemlerine göre sinyal olduğunu Mikroplaka okuyucu kullanarak birden fazla microwells aynı anda ölçümü hızlı ve kolay katları test etmek için izin verir pozitif ve negatif kontrolleri ile yan yana bileşikleri (Şekil 4)1, 2, bireysel bileşikler (şekil 4)1,2,3 doz-yanıt eğrileri kolay nesil , 4 , 5, değerlendirme additivity1,2 ve synergism3 için iki veya daha fazla bileşikleri, hem de eylem bileşikler yine de rekabetçi inhibisyon deneyleri çalışmaları ve özel kullanımı farmakolojik inhibitörleri (örneğin, CatSper inhibitörleri1,2,3,4,5). Ayrıca, fluorophore değiştirerek, tahlil diğer hücre içi değişiklikleri (örneğin, pHı1,2) incelemek için istihdam edilebilir. Son olarak, birden fazla fluorophore aynı anda aynı anda birden çok hücre içi değişiklikleri ölçmek için kullanılır. Gelecekte, orta-den geçerek Ca2 +-tahlil için ilgi ekran bileşikler üzerinde Ca2 +etkileri için kullanılabilir sinyal-potansiyel olumsuz incelemek insan sperm (örneğin, çevresel kimyasal madde veya ilaç adaylarının) sinyal etkileri insan sperm hücre işlevi veya bir gebelik önleyici olarak olası bir rol araştırmak için.

Orta-den geçerek acrosome tepki tahlil insan acrosome tepki bir floresan mikroskop kullanarak el ile değerlendirme göre değerlendirmek için çekici bir alternatif teşkil görüntü sitometresi temel alır. Sağlam ya da tepki/tepki acrosomes boyama desen her zaman net değildir ve bir büyük içi bireysel değişim sonucu hükümleri, sözleşme konusu olabilir. Görüntü sitometresi ile görüntüleri elde ve otomatik olarak analiz edilebilir. Maskeleme kanal, bu durumda Höchst-33342 içinde hücreleri tanımlar ve bu belirli alanlarda sadece floresan sinyallerini veri analize dahil. Dolayısıyla, artık sitoplazma içeren enucleated organlarının boyama veri analizi dahil değildir. Ayrıca, Sayım istatistikleri Floresans mikroskobu üstündür. Mikroskop TemizlikFleksibl ile 200 hücreleri saymak için zor ve zaman alıcı bir görev ama görüntü sitometresi ile en az 5.000 hücre analizi daha az bir kaç dakika sürer. Ancak, görüntü sitometresi düşük büyütme, nedeniyle ölçümleri değerlendirmek yeteneği kaybolur ve bir lekeli örnek floresan mikroskop getirmek zorunda kalacak. Bu nedenle, denetimleri dahil ölçümleri doğrulamak için dıştaki önem taşımaktadır. Denetimleri beklendiği gibi tepki yok, bir deney sonuçlarından atılmalıdır. Burada açıklanan protokol kim insan acrosome tepki Akış Sitometresi tarafından değerlendirilen Zoppino vd.49, çalışmalarından ilham oldu. Onlar daha fazla gerçek zamanlı Floresans mikroskobu tarafından nasıl PSA acrosomal bölme membran-füzyon gözenekleri acrosome tepki indüksiyon görünür girer nitelendirdi. Bir kez acrosomal bölmesi içinde PSA takunya ve daha uzun süreler için istikrarlı bir işareti oluşturur. Hiçbir fiksasyon veya permeabilization iletişim kuralında uygulanır ve bu nedenle sonuç yorumlanması açıktır: PSA uygun bir sperm hücresi acrosomal bölmesi içinde eşittir acrosome tepki. Gelince Ca2 +-tahlil, sinyal acrosome tepki tahlil doz-yanıt eğrileri, inhibisyon, additivity ve synergism ilgi bileşiklerin değerlendirmek için de kullanılabilir. Gelecekte, orta-den geçerek acrosome tepki tahlil de ilgi ekran bileşikler için acrosome tepki insan sperm (örneğin, çevresel kimyasal madde veya ilaç adaylarının) üzerindeki etkileri için potansiyel yan etkileri bu insan incelemek için kullanılabilir sperm hücre işlevi veya bir gebelik önleyici olarak olası bir rol araştırmak için.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Yazarlar Timo Strünker laboratuvar laboratuarına onların kalır sırasında AR ve DLE gözetiminin kabul etmek istiyorum. Ayrıca, bizim meslektaşları bölümü büyüme ve üreme, Kopenhag Üniversitesi Hastanesi, Rigshospitalet kadar bu iki deneyleri ayarı ile onların yardım için teşekkür etmek istiyorum. Bu eser hibe yenilik Fonu Danimarka (grant numaraları 005-2010-3 ve 14-2013-4) tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 µm pore filter Thermo Fisher Scientific, USA 296-4545
1 L measuring cylinder Thermo Fisher Scientific, USA 3662-1000
1, 4, and 2 mL plastic tubes Eppendorf, Germany 30120086 and 0030120094
12-channel pipette Eppendorf, Germany 4861000813
384 multi-well plates Greiner Bio-One, Germany 781096
15 and 50 mL platic tubes Eppendorf, Germany 0030122151 and 30122178
A2-slide ChemoMetec, Denmark 942-0001
Automatic repeater pipette Eppendorf, Germany 4987000010
CaCl2
Centrifuge
Clean wide-mouthed plastic container for semen sample
Dimethyl sulfoxide (DMSO)
FITC-coupled lectin of Pisum sativum (FITC-PSA) Sigma-Aldrich, Germany L0770
Fluo-4 AM Thermo Fisher Scientific, USA F14201
FLUOstar OMEGA fluorescence microplate reader BMG Labtech, Germany
Glucose anhydrous
HEPES
Hoechst-33342 ChemoMetec, Denmark 910-3015
Human serum albumin (HSA) Irvine Scientific 9988 For addition to HTF+
Immobilizing solution containing 0.6 M NaHCO3 and 0.37% (v/v) formaldehyde in distilled water
Incubator
KCl
KH2PO4
Magnetic stirrer
MgSO4
Na-Lactate
NaCl
NaHCO3
NC-3000 image cytometer ChemoMetec, Denmark 970-3003
Pipettes and piptting tips
propidium iodide (PI) ChemoMetec, Denmark 910-3002
Purified water
Rack for placing 50 mL plastic tubes in 45° angle
S100 buffer ChemoMetec, Denmark 910-0101
SP1-cassette ChemoMetec, Denmark 941-0006
Volumetric flasks of appropriate sizes
Vortexer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schiffer, C., et al. Direct action of endocrine disrupting chemicals on human sperm. EMBO reports. (2014).
  2. Rehfeld, A., Dissing, S., Skakkebæk, N. E. Chemical UV Filters Mimic the Effect of Progesterone on Ca(2+) Signaling in Human Sperm Cells. Endocrinology. 157, (11), 4297-4308 (2016).
  3. Brenker, C., et al. Synergistic activation of CatSper Ca2+ channels in human sperm by oviductal ligands and endocrine disrupting chemicals. Human Reproduction (Oxford, England). 33, (10), 1915-1923 (2018).
  4. Brenker, C., et al. The CatSper channel: a polymodal chemosensor in human sperm. The EMBO Journal. 31, (7), 1654-1665 (2012).
  5. Brenker, C., et al. Action of steroids and plant triterpenoids on CatSper Ca2+ channels in human sperm. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, (3), E344-E346 (2018).
  6. Rehfeld, A., et al. Chemical UV filters can affect human sperm function in a progesterone-like manner. Endocrine Connections. (2017).
  7. Egeberg Palme, D. L., et al. Viable acrosome-intact human spermatozoa in the ejaculate as a marker of semen quality and fertility status. Human Reproduction. Oxford, England. (2018).
  8. Publicover, S., Harper, C. V., Barratt, C. [Ca2+]i signalling in sperm--making the most of what you've got. Nature Cell Biology. 9, (3), 235-242 (2007).
  9. Publicover, S. J., et al. Ca2+ signalling in the control of motility and guidance in mammalian sperm. Frontiers in Bioscience. 13, 5623-5637 (2008).
  10. Publicover, S., Harper, C. V., Barratt, C. [Ca2+]i signalling in sperm--making the most of what you've got. Nature Cell Biology. 9, (3), 235-242 (2007).
  11. Lishko, P. V., et al. The control of male fertility by spermatozoan ion channels. Annual Review Of Physiology. 74, 453-475 (2012).
  12. Morris, J., et al. Cell-penetrating peptides, targeting the regulation of store-operated channels, slow decay of the progesterone-induced [Ca2+]i signal in human sperm. Molecular Human Reproduction. 21, (7), 563-570 (2015).
  13. Strünker, T., et al. The CatSper channel mediates progesterone-induced Ca2+ influx in human sperm. Nature. 471, (7338), 382-386 (2011).
  14. Lishko, P. V., Botchkina, I. L., Kirichok, Y. Progesterone activates the principal Ca2+ channel of human sperm. Nature. 471, (7338), 387-391 (2011).
  15. Miller, M. R., et al. Unconventional endocannabinoid signaling governs sperm activation via the sex hormone progesterone. Science (New York, N.Y.). 352, (6285), 555-559 (2016).
  16. Revelli, A., et al. Follicular fluid content and oocyte quality: from single biochemical markers to metabolomics. Reproductive Biology And Endocrinology RB&E. 7, 40 (2009).
  17. Lyons, R. A., Saridogan, E., Djahanbakhch, O. The effect of ovarian follicular fluid and peritoneal fluid on Fallopian tube ciliary beat frequency. Human Reproduction. 21, (1), Oxford, England. 52-56 (2006).
  18. Eisenbach, M., Giojalas, L. C. Sperm guidance in mammals - an unpaved road to the egg. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 7, (4), 276-285 (2006).
  19. Alasmari, W., et al. The clinical significance of calcium-signalling pathways mediating human sperm hyperactivation. Human Reproduction. 28, (4), Oxford, England. 866-876 (2013).
  20. Alasmari, W., et al. Ca2+ signals generated by CatSper and Ca2+ stores regulate different behaviors in human sperm. The Journal of Biological Chemistry. 288, (9), 6248-6258 (2013).
  21. Tamburrino, L., et al. The CatSper calcium channel in human sperm: relation with motility and involvement in progesterone-induced acrosome reaction. Human Reproduction. 29, (3), Oxford, England. 418-428 (2014).
  22. Krausz, C., et al. Intracellular calcium increase and acrosome reaction in response to progesterone in human spermatozoa are correlated with in-vitro fertilization. Human Reproduction. 10, (1), Oxford, England. 120-124 (1995).
  23. Oehninger, S., et al. Defective calcium influx and acrosome reaction (spontaneous and progesterone-induced) in spermatozoa of infertile men with severe teratozoospermia. Fertility and Sterility. 61, (2), 349-354 (1994).
  24. Shimizu, Y., Nord, E. P., Bronson, R. A. Progesterone-evoked increases in sperm [Ca2+]i correlate with the egg penetrating ability of sperm from fertile but not infertile men. Fertility and Sterility. 60, (3), 526-532 (1993).
  25. Falsetti, C., et al. Decreased responsiveness to progesterone of spermatozoa in oligozoospermic patients. Journal of Andrology. 14, (1), 17-22 (1993).
  26. Williams, H. L., et al. Specific loss of CatSper function is sufficient to compromise fertilizing capacity of human spermatozoa. Human Reproduction. 30, (12), Oxford, England. 2737-2746 (2015).
  27. Forti, G., et al. Effects of progesterone on human spermatozoa: clinical implications. Annales d'Endocrinologie. 60, (2), 107-110 (1999).
  28. Krausz, C., et al. Two functional assays of sperm responsiveness to progesterone and their predictive values in in-vitro fertilization. Human Reproduction. 11, (8), Oxford, England. 1661-1667 (1996).
  29. Kelly, M. C., et al. Single-cell analysis of [Ca2+]i signalling in sub-fertile men: characteristics and relation to fertilization outcome. Human Reproduction. 33, (6), Oxford, England. 1023-1033 (2018).
  30. Brown, S. G., et al. Homozygous in-frame deletion in CATSPERE in a man producing spermatozoa with loss of CatSper function and compromised fertilizing capacity. Human Reproduction. 33, (10), Oxford, England. 1812-1816 (2018).
  31. Avenarius, M. R., et al. Human male infertility caused by mutations in the CATSPER1 channel protein. American Journal of Human Genetics. 84, (4), 505-510 (2009).
  32. Smith, J. F., et al. Disruption of the principal, progesterone-activated sperm Ca2+ channel in a CatSper2-deficient infertile patient. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, (17), 6823-6828 (2013).
  33. Hildebrand, M. S., et al. Genetic male infertility and mutation of CATSPER ion channels. European Journal of Human Genetics. 18, (11), 1178-1184 (2010).
  34. Avidan, N., et al. CATSPER2, a human autosomal nonsyndromic male infertility gene. European Journal of Human Genetic. 11, (7), 497-502 (2003).
  35. Zhang, Y., et al. Sensorineural deafness and male infertility: a contiguous gene deletion syndrome. BMJ Case Reports. 2009, (2009).
  36. Jaiswal, D., Singh, V., Dwivedi, U. S., Trivedi, S., Singh, K. Chromosome microarray analysis: a case report of infertile brothers with CATSPER gene deletion. Gene. 542, (2), 263-265 (2014).
  37. Visconti, P. E., Krapf, D., de la Vega-Beltrán, J. L., Acevedo, J. J., Darszon, A. Ion channels, phosphorylation and mammalian sperm capacitation. Asian Journal of Andrology. 13, (3), 395-405 (2011).
  38. Wassarman, P. M., Jovine, L., Litscher, E. S. A profile of fertilization in mammals. Nature Cell Biology. 3, (2), E59-E64 (2001).
  39. Leahy, T., Gadella, B. M. Sperm surface changes and physiological consequences induced by sperm handling and storage. Reproduction. 142, (6), Cambridge, England. 759-778 (2011).
  40. Suarez, S. S. Control of hyperactivation in sperm. Human Reproduction Update. 14, (6), 647-657 (2008).
  41. Liu, D. Y., Baker, H. W. Inhibition of acrosin activity with a trypsin inhibitor blocks human sperm penetration of the zona pellucida. Biology of Reproduction. 48, (2), 340-348 (1993).
  42. Okabe, M. The cell biology of mammalian fertilization. Development. 140, (22), Cambridge, England. 4471-4479 (2013).
  43. Inoue, N., Satouh, Y., Ikawa, M., Okabe, M., Yanagimachi, R. Acrosome-reacted mouse spermatozoa recovered from the perivitelline space can fertilize other eggs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, (50), 20008-20011 (2011).
  44. Jin, M., et al. Most fertilizing mouse spermatozoa begin their acrosome reaction before contact with the zona pellucida during in vitro fertilization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, (12), 4892-4896 (2011).
  45. Hirohashi, N., Yanagimachi, R. Sperm acrosome reaction: its site and role in fertilization. Biology of Reproduction. 99, (1), 127-133 (2018).
  46. Liu, D. Y., Garrett, C., Baker, H. W. G. Acrosome-reacted human sperm in insemination medium do not bind to the zona pellucida of human oocytes. International Journal of Andrology. 29, (4), 475-481 (2006).
  47. Overstreet, J. W., Hembree, W. C. Penetration of the zona pellucida of nonliving human oocytes by human spermatozoa in vitro. Fertility and Sterility. 27, (7), 815-831 (1976).
  48. Martins da Silva, S. J., et al. Drug discovery for male subfertility using high-throughput screening: a new approach to an unsolved problem. Human Reproduction. Oxford, England. 1-11 (2017).
  49. Zoppino, F. C. M., Halón, N. D., Bustos, M. A., Pavarotti, M. A., Mayorga, L. S. Recording and sorting live human sperm undergoing acrosome reaction. Fertility and Sterility. 97, (6), 1309-1315 (2012).
  50. Mata-Martínez, E., et al. Measuring intracellular Ca2+ changes in human sperm using four techniques: conventional fluorometry, stopped flow fluorometry, flow cytometry and single cell imaging. Journal of Visualized Experiments. (75), e50344 (2013).
  51. Egeberg, D. L., et al. Image cytometer method for automated assessment of human spermatozoa concentration. Andrology. 1, (4), 615-623 (2013).
  52. Nash, K., et al. Techniques for imaging Ca2+ signaling in human sperm. Journal of Visualized Experiments. (40), (2010).
Orta-den geçerek deneyleri Ca<sup>2 +</sup>etkileri değerlendirilmesi için eleme-sinyal ve insan Sperm Acrosome reaksiyon
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rehfeld, A., Egeberg Palme, D. L., Almstrup, K., Juul, A., Skakkebaek, N. E. Medium-throughput Screening Assays for Assessment of Effects on Ca2+-Signaling and Acrosome Reaction in Human Sperm. J. Vis. Exp. (145), e59212, doi:10.3791/59212 (2019).More

Rehfeld, A., Egeberg Palme, D. L., Almstrup, K., Juul, A., Skakkebaek, N. E. Medium-throughput Screening Assays for Assessment of Effects on Ca2+-Signaling and Acrosome Reaction in Human Sperm. J. Vis. Exp. (145), e59212, doi:10.3791/59212 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter