Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biology

Medium-throughput Screening Assays til vurdering af virkninger på Ca2 +-signalering og Acrosome reaktion i menneskelige sædceller

doi: 10.3791/59212 Published: March 1, 2019

Summary

Her, to medium-overførselshastighed assays til vurdering af virkninger på Ca2 +-signalering og acrosome reaktion i menneskelige sædceller er beskrevet. Disse assays kan bruges til hurtigt og nemt skærmen store mængder af stoffer for effekter på Ca2 +-signalering og acrosome reaktion i menneskelige sædceller.

Abstract

Ca2 +-signalering er afgørende for normal sæd cellefunktion og mandlige fertilitet. Ligeledes, acrosome reaktionen er afgørende for evne til menneskelige sædcellen trænger zona pellucida og befrugte ægget. Det er derfor af stor interesse at teste forbindelser (f.eks. Miljøkontaminanter eller lægemiddelkandidater) for deres effekt på Ca2 +-signalering og acrosome reaktion i menneskelige sædceller enten at undersøge de potentielle negative virkninger på menneskers sædcelle funktion eller at undersøge en mulig rolle som et præventionsmiddel. Her, to medium-overførselshastighed assays er beskrevet: 1) et fluorescens-baseret analyse til vurdering af virkninger på Ca2 +-signalering i menneskelige sædceller og 2) et billede cytometric analyse til vurdering af acrosome reaktion i menneskelige sædceller. Disse assays kan bruges til at screene et stort antal stoffer for effekter på Ca2 +-signalering og acrosome reaktion i menneskelige sædceller. Desuden, assays kan bruges til at generere meget specifikke dosis-respons kurver af enkelte forbindelser, bestemme potentielle additivity/synergi for to eller flere forbindelser og studere den farmakologiske virkningsmekanisme gennem konkurrencedygtige hæmning eksperimenter med CatSper hæmmere.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Formålet med de to assays beskrevet her er at undersøge virkningerne på Ca2 +-signalering og acrosome reaktion i menneskelige sædceller, som har været vist flere forbindelser i flere publikationer beskæftiger disse undersøgelser1,2, 3,4,5,6,7. Ca2 +-signalering og acrosome reaktion er afgørende for normale menneskelige sædceller cellefunktion og mandlige fertilitet.

Det overordnede mål med en menneskelig sædcelle er at befrugte ægget. For at være i stand til med succes og naturligvis befrugte ægget, skal funktioner af sædcellen være reguleret stramt under rejsen af sædcellen gennem den kvindelige forplantningsorganerne8,9. Mange af funktionerne sædcelle er reguleret via den intracellulære Ca2 +-koncentration [Ca2 +]jeg (fx, sperm motilitet, chemotaxis og acrosome reaktion)10. Også, en modningsproces, kaldet retsevne, som gengiver sædcellen i stand til at befrugte ægget, er delvis reguleret af [Ca2 +]jeg10. Ca2 +-ekstrudering af Ca2 +-ATPase pumper11 opretholde en cirka 20.000 fold Ca2 +-gradienten over menneskelige sædceller cellemembranen, med en hvilende [Ca2 +]jeg af 50-100 nM. Hvis Ca2 + er tilladt at krydse cellemembranen (f.eks. gennem åbningen af Ca2 +-kanaler), en betydelig tilstrømning af Ca2 + opstår, giver anledning til en højde af [Ca2 +],jeg. Dog sædcellen også bærer intracellulære Ca2 +-butikker, som kan frigive Ca2 + og derfor også giver anledning en udvidelse af [Ca2 +]i12. Interessant, alle kanal-medieret Ca2 +-tilstrømning i menneskelige sædceller er hidtil blevet fundet for at forekomme via CatSper (kationisk kanal SpeRM), som er kun udtrykt i sædceller11. I menneskelige sædceller, CatSper er aktiveret af endogene ligander progesteron og prostaglandiner gennem særskilte ligand bindende websteder13,14,15, fører til en hurtig Ca2 +-tilstrømning til sædcelle. To hovedkilder nær ægget giver høje niveauer af disse endogene ligander. En er den follikulære væske, der indeholder høje niveauer af progesteron16. Follikulært væsken er frigivet fra modne follikler sammen med æg på ægløsning og blander sig med væsken i æggelederne17. Den andre vigtigste kilde er de cumulus celler, der omgiver ægget og slip høje niveauer af progesteron og prostaglandiner. De progesteron-induceret Ca2 +-tilstrømning i sædceller har vist sig at mægle chemotaxis mod æg9,18, styre sperm motilitet19,20 og stimulere acrosome reaktion21. Udløsning af disse individuelle [Ca2 +]jeg-regulerede sperm funktioner i den rigtige rækkefølge og på det rigtige tidspunkt er afgørende for befrugtning af ægget8. I denne, en suboptimal progesteron-induceret Ca2 +-tilstrømning er blevet fundet at være associeret med reduceret mandlige fertilitet22,23,24,25,26 er vigtigt for mandlige fertilitet26,30,31,32, ,27,28,29 og funktionelle CatSper 33,34,35,36.

Da sædceller nå ægget, en sekvens af begivenheder skal finde sted for befrugtning forekommer: 1) sædcellerne skal trænge igennem de omkringliggende cumulus cellelag, 2) binder sig til zona pellucida, 3) exocytose acrosomal indhold, den såkaldte acrosome reaktion 37, 4) trænge igennem zona pellucida og 5) fuse med æg membranen at fuldføre befrugtning38. Hvis du vil være i stand til at gå gennem disse trin og befrugte ægget, skal sædcellen først gennemgå retsevne11, der begynder som sædcellerne forlade den sædvæske, der indeholder "decapacitating" faktorer39 og svømme ind i væsker for kvindelige forplantningsorganerne med høje niveauer af bikarbonat og albumin37. Retsevne gengiver i stand til at gennemgå hyperactivation, en form for motilitet med en kraftig slå fimrehår, og acrosome reaktion37sædceller. Hyperactivated motilitet kræves til penetration af zona pellucida40, og acrosome indeholder forskellige hydrolytiske enzymer, at støtte denne penetration proces41. Derudover gengiver acrosome reaktion sædceller i stand til at fusionere med ægget ved at udsætte specifikke Membranproteiner på sæd overfladen nødvendige for sperm-æg fusion42. Evnen til at gennemgå hyperactivation og acrosome reaktion er derfor både nødvendige for vellykket befrugtning af æg40,42. I modsætning til hvad er blevet set for musen sædceller43,44,45, kan kun menneskelige sædceller, der er acrosome-intakt binde til zona pellucida46. De skal gennemgå acrosome reaktion at trænge igennem zona pellucida41 og afdække specifikke Membranproteiner, der er nødvendige for fusion med æg38, når de menneskelige sædceller er bundet til zona pellucida. Timingen af acrosome reaktionen i menneskelige sædceller er således afgørende for befrugtning at forekomme.

Som beskrevet ovenfor, Ca2 +-signalering er af afgørende betydning for normale sæd celle funktion8, og det er derfor af stor interesse at skærmen stort antal forbindelser for effekter på Ca2 +-signalering i menneskelige sædceller. På samme måde, som kun menneskelige sædceller, der undergår acrosome reaktion på rette tid og sted kan trænge igennem zona pellucida og befrugte ægget46,47, det er også af stor interesse at kunne teste forbindelser for deres evne til at påvirke acrosome reaktionen i menneskelige sædceller. Til dette formål to medium-throughput screening-assays er beskrevet: 1) en analyse af virkninger på Ca2 +-signalering i menneskelige sædceller og 2) en analyse for evnen til at fremkalde acrosome reaktion i menneskelige sædceller.

Analyse 1 er en medium-overførselshastighed Ca2 +-signalering assay. Denne fluorescens plade reader-baseret teknik overvåger ændringer i fluorescens som funktion af tiden samtidig i flere brønde. Ca2 +-følsomme fluorescerende farvestof, Fluo-4 har en Kd for Ca2 +≈ 335 nM og er celle-permeant i AM (acetoxymethyl) ester form. Med Fluo-4, er det muligt at måle ændringer i [Ca2 +]jeg over tid og efter tilsætning af forbindelser af interesse for sædceller. Analysen blev udviklet af laboratoriet af Timo Strünker i 201113 og er siden blevet brugt i flere undersøgelser at skærmen stoffer for effekter på Ca2 +-signalering i menneskelige sædceller1,2,3, 4,5. Også har en lignende metode været anvendt til at screene flere drug kandidater48. Desuden, er denne analyse også nyttige til at vurdere den farmakologiske tilstand af aktion1,2,3,4,5, dosis-respons kurver1, 2,3,4,5, konkurrencedygtige hæmning1,2, additivity1,2og synergi3 af forbindelser af interesse.

Analysen 2 er en medium-overførselshastighed acrosome reaktion assay. Dette billede Flowcytometret-baseret teknik måler mængden af levedygtige acrosome reagerede sædceller i en prøve, ved hjælp af tre fluorescerende farvestoffer: propidium Iodid (PI), FITC-kombineret lektin Pisum sativum (FITC-PSA), og Hoechst-33342. Analysen blev ændret fra en lignende flow flowcytometri-baserede metode af Zoppino et al.49 og har været anvendt i flere undersøgelser6,7. For Ca2 +-signalering assay, denne acrosome reaktion assay kan også bruges til at vurdere dosis-respons-kurver, hæmning, additivity og synergi af forbindelser af interesse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Indsamling og analyse af menneskelige sæd prøver i protokollerne følger retningslinjerne i den videnskabsetisk Komité for Region Hovedstaden. Alle sæd prøver har opnået efter informeret samtykke fra frivillige donorer. Efter levering, var prøverne fuldt anonymiseret. For deres ulejlighed modtaget hver donor et gebyr på 500 kr. (omkring $75 amerikanske. dollars) pr. prøve. Prøverne blev analyseret på dagen for levering og derefter destrueres straks efter laboratorieforsøg.

Bemærk: Medium gennemløb Ca2 +-signalering assay er beskrevet i trin 4-5 og medium gennemløb acrosome reaktion assay i trin 6-7. Protokol til at forberede menneskelige tubal væske (HTF+) medium er beskrevet i trin 1 og oprensning af sædceller for assays er beskrevet i trin 2-3.

1. forberedelse af menneskelige Tubal væske (HTF+) Medium

Bemærk: Brug målekolber i passende størrelser, en 1 L måling cylinder, magnetomrører, salte som anført i tabel 1 og tabel 2, renset vand, en 0,2 µm pore filter og 50 mL plasticrør.

  1. Forberede stamopløsninger af salte i renset vand (tabel 1).
    1. Tilføje mængden salt, der er anført i tabel 1 til en målekolbe af en passende størrelse, tilføje renset vand til lidt under den ønskede lydstyrke og bland godt med en magnetomrører.
    2. Når salt er fuldt opløst, fjerne magnet og fyld med renset vand til det ønskede endelige rumfang.
  2. Stock opløsning overføres til en flaske og gemme indtil brug.
    Bemærk: Stamopløsninger kan holdes og genbruges i længere perioder: glucose og HEPES ved-20 ° C og de andre stamopløsninger ved stuetemperatur (RT).
  3. Forberede 1 L HTF+ medium fra stamopløsninger (tabel 2).
    1. Sikre, at alle stamopløsninger er helt opløst og godt blandet før brug.
    2. Tilføje mængden af stamopløsning og salt, der er anført i tabel 2 til en 1 L måling cylinder og tilføje renset vand til 900 mL.
    3. Bland godt med en magnetomrører og justere pH til 7,35 med NaOH opløsning.
    4. Fjerne magneten og tilføje renset vand til 1000 mL.
  4. Sterile filtratet HTF+ medium gennem en 0,2 µm pore filter, alikvot HTF+ medium til 50 mL plasticrør, og opbevares ved 4 ° C indtil brug.
  5. Lige før du kører et eksperiment, skal du tilføje 165 µL af Na-pyruvat til 50 mL prøve at få en endelig Na-pyruvat koncentration på 0,33 mM.
    Bemærk: Menneskelige tubal flydende medium kan også fås fra forskellige kommercielle udbydere. Når du bruger 4 mM HCO3- medium, kan prøverne inkuberes med lukket låg i en inkubator uden ekstra CO2 i luften uden store driver i pH. Hvis en CO2 rugemaskine er tilgængelige, kan den tilsvarende mængde CO2 beregnes ved hjælp af Henderson-Hasselbalch ligningen og anvendes. Hvis du bruger 25 mM HCO3- medium, bør prøver være inkuberes med åbent låg i en CO2 kuvøse med luft indeholdende en tilsvarende mængde CO2 (afhænger af atmosfærisk tryk, sædvanligvis mellem 5-10%) for at undgå et skred i pH. Det nøjagtige beløb af CO2 kan beregnes ved hjælp af Henderson-Hasselbalch ligningen.

2. rensning af Motile sædceller via Swim-up (figur 1)

Bemærk: Brug en ren bred åbning plastikbeholder til sædprøven, en inkubator, 50 mL plasticrør, en rack for at placere 50 mL plastik rør på en 45° vinkel, HTF+ mediet (parat i trin 1 eller opnået fra kommerciel udbyder), centrifuge og humant serum albumin (HSA).

  1. Få en frisk donerede menneskelige sædprøve produceret gennem onani og udbrød i en bred åbning ren plast beholder. Brug kun sæd prøver, som opfylder de parametre, der er etableret af WHO laboratorium manual for undersøgelse og behandling af menneskelige sæd.
  2. Inkuber prøve ved 37 ° C i 15-30 min at gøre det muligt at liquefy.
  3. Varme op 50 mL af HTF+ medium med 4 mM HCO3- til 37 ° C.
  4. Sted clean 50 mL plastik rør i et rack med en 45° vinkel (at øge overfladearealet mellem væsker). Bruge 1 rør pr. mL af rå sæd.
  5. Tilsættes 4 mL af forvarmet HTF+ medium til hver af rør.
  6. Omhyggeligt afpipetteres 1 mL flydende sædprøven til bunden af hver tube indeholder 4 mL af forvarmet HTF+. Undgå overgang af luftbobler.
  7. Slutning låg og inkuberes rør ved 37 ° C i 1 time.
  8. Forsigtigt Aspirér og overføre så meget af den øvre del (HTF+ med motile sædceller) som muligt til en ny 15 mL plastik rør, mens opmærksomhed at intet af den nederste del (sæd med immotile og døde celler) er inkluderet. Generelt er det sikkert at overføre 3,5 mL af den øverste del, uden at forstyrre den nederste del. For at undgå at suge turbulens, afbrød de yderste 1-2 mm pipette tip i en 45° vinkel til at opnå en større åbning.
  9. Fylde 15 mL plastik rør med HTF+ at vaske cellerne og centrifugeres rør ved 700 x g i 10 min. ved RT.
  10. Forsigtigt Aspirér og Fjern supernatanten og resuspenderes sædcelle i 2 mL af HTF+.
  11. Overføre 20 µL af sperm suspension til to små plastik rør til vurdering af koncentrationen af sædceller (Se trin 3).
  12. Fylde 15 mL plastik rør med HTF+ at vaske cellerne og centrifugeres rør ved 700 x g i 10 min. ved RT.
  13. Forsigtigt Aspirér og Fjern supernatanten og resuspenderes sædcelle til 10 x 106 celler/mL (baseret på celle koncentration vurderes i trin 2.11).
    1. For eksperimenter ved hjælp af un-capacitated sædceller (rutinemæssig Ca2 +-signalering assay)
      1. Resuspend celler i HTF+ med 4 mM HCO3-.
      2. Tilføj 30 µL af human serum albumin (HSA) (100 mg/mL) pr. mL HTF+ at få en endelig koncentration på 3 mg/mL.
      3. Tæt låg og Inkuber i ≥ 1 h ved 37 ° C.
    2. For eksperimenter ved hjælp af capacitated sædceller (acrosome reaktion assay)
      1. Resuspend celler i HTF+ med 25 mM HCO3-.
      2. Tilføj 30 µL af HSA (100 mg/mL) pr. mL HTF+ at få en endelig koncentration på 3 mg/mL.
      3. Lægger låg løst og der inkuberes i ≥3 timer ved 37 ° C med det tilsvarende beløb af CO2 (Se trin 1, sædvanligvis mellem 5-10% CO2).

3. optælling af sædceller

Bemærk: Sædceller kan enten tælles manuelt50 eller ved hjælp af et billede Flowcytometret51, som beskrevet her. Bruge et billede Flowcytometret, en vortexer, S100 buffer, en SP1-kassette, swim-up renset sædceller (udarbejdet i trin 2).

  1. Fortynde en 20 µL alikvot til en faktor på 10, 20, 30, 50 og 90 i S100 buffer ved hjælp af en rund bund 2 mL tube efter den forventede koncentration (vurderes med en manuel kontrol af toerstoffet i trin 2.10). Brug den fortynding, der er tættest på koncentrationen forventes (dvs., hvis en koncentration på 15 x 106 sædceller pr. mL efter swim-up forventes derefter fortyndes den 20 µL sædprøve med 380 µL af S100 buffer [fortyndingsfaktoren 20]).
  2. Bland godt for 10 s ved hjælp af en vortex-mixer på maksimal 700 rpm, fordybe SP1-kassette i prøven og tryk på den hvide stemplet fuldt ned til aspirat en alikvot af prøven i kassetten.
  3. Åbn billedet Flowcytometret, Placer kassetten i bakken og køre assay Optælling af PI farves menneskelige sædceller Assay ifølge de anvendte fortyndingsfaktoren (valgt i trin 3.1).
  4. Gentag trin 3.1-3.3 med en anden 20 µL prøve, ved hjælp af en tættest på den målte koncentration fra første 20 µL prøven fortyndingsfaktoren.
  5. Beregne gennemsnitlige sædcelle koncentration fra de to målinger.
  6. Multiplicer betyder sæd celle koncentration med den oprindelige volumen at få den samlede sperm celletal (i trin 2, denne oprindelige volumen er 2 mL).

4. måling af ændringer i gratis intracellulære Ca2 +-koncentration ([Ca2 +]jeg) ved hjælp af Ca2 +- fluorimetry (figur 2)

Bemærk: Bruge et fluorescens Pladelæser, 384 multi godt plader, Fluo-4 AM, swim-up oprensede sædceller (forberedt i trin 2), forbindelser af interesse som positive og negative kontroller, automatiske repeater pipette, og en 12-kanals pipette.

  1. Forbered en 2 mM Fluo-4 AM lager ved at tilføje 22,7 µL af dimethylsulfoxid (DMSO) til et hætteglas med 50 µg Fluo-4 AM og bland rør godt.
  2. Tilføje en alikvot af 700 µL swim-up gendannede sperm suspension (capacitated eller un-capacitated som beskrevet i trin 2) til et nyt reagensglas. 700 µL af sædprøve er det beløb, der er nødvendige for at analysere en række 24 brønde i 384-microwell plade (bruges til at teste 3 controls og 9 forbindelser i dubletter).
  3. Tilføje 3,5 µL af Fluo-4 AM stamopløsning til de 700 µL af sperm suspension til at opnå en endelig koncentration på 10 µM Fluo-4 AM.
  4. Inkuber prøve for 45 min ved 37 ° C, beskyttet mod lys.
  5. Centrifugeres prøve på 700 x g i 10 min., Aspirér og supernatanten for at fjerne overskydende Fluo-4.
  6. Resuspend farves pellet i HTF+ til 5 x 106 celler/mL (dvs., brug 2 x mængden af cellesuspension taget i trin 4.2)
  7. Tilberedes fortyndinger af forbindelser og kontrol (kan gøres i rugemaskinen og centrifugering perioder i trin 4.4 og 4.5, henholdsvis).
    1. Fortyndes forbindelser, såvel som en negativ kontrol (buffer med køretøjet) og en positiv kontrol (progesteron) i HTF+. Fortynd forbindelser og kontrolelementer til 3 x den ønskede slutkoncentration, som de er fortyndet 1:3, når de føjes til sædceller i trin 4.16.
    2. Sted rør med fortyndinger i et rack med en afstand mellem rør svarende til afstanden mellem pipette tips af 12-kanals pipette bruges i trin 4.16.
  8. Bruge en automatisk repeater pipette (24 trin af 50 µL).
    1. Mix Fluo-4 farvede sædprøve forsigtigt af pipettering hele beløbet op og ned en gang.
    2. Tilføje delprøver af 50 µL 24 brønde på en række i 384-microwell pladen.
  9. Microwell pladen anbringes i et fluorescens-Pladelæser ved 30 ° C og luk skuffen.
  10. Vælg den relevante protokol til Fluo-4. Excite fluorescens på 480 nm, og Optag emission ved 520 nm. Bruge den hurtigste cyklus tid muligt med indstillingen.
    Bemærk: Bruge mindst 10 blinker pr. brønd og nederste optik, hvis det er muligt.
  11. Vælg en brønd i rækken og justere gevinst til en målværdi på 20%.
  12. Start måling.
  13. Kontrol med grundlinjen i løbet af de første 5 cykler.
    1. Hvis den fluorescerende udlæsning stiger eller falder over tid, standse eksperimentet, justere forstærkningen og starte forsøget igen.
    2. Hvis baseline varierer meget mellem individuelle brønde på en række, enten pipettering taktfast 4.8 har været upræcis eller prøven var ikke blandet godt nok før pipettering. Kassér eksperimentet.
    3. Hvis den fluorescerende udlæsning er sammenlignelige mellem brønde i rækken og støt i løbet af de 5 første cykler, fortsætte til næste trin.
  14. Efter 10 cyklusser (anvendes til baseline), pause eksperimentet.
  15. Skub skuffen med microwell plade.
  16. Brug en 12-kanals pipette (2 trin på 25 µL), hurtigt tilføje 25 µL af de forberedte løsninger af forbindelser og kontrol (fra trin 4.7) til de 12 godt dubletter (24 brønde) i en række. Løsninger bliver fortyndet 1:3, da brøndene allerede indeholder 50 µL af bejdset sædprøve.
  17. Fortsætte målingen så hurtigt som muligt (skuffe vil automatisk lukke) at undgå mangler nogen fluorescerende signaler induceret af de tilsatte stoffer og kontrol. Ændringer i fluorescens (ΔF) efter tilsætning af forbindelser og kontrol vil nu blive taget til fange.
  18. Eksperiment indtil fluorescerende signaler er registreret fra den positive kontrol og forbindelser af interesse.
  19. Standse eksperimentet og eksportere rå fluorescens data til at analysere det som i trin 5.
    Bemærk: Generelt Fluo-4 AM har været brugt som Ca2 +-følsomme fluorophore i analysen, men andre Ca2 +-følsomme fluorophores også kunne bruges hvis excitation og emission spectra passer med filtre i pladelæseren fluorescens. Afhængigt af valget af fluorophore, Sørg for, at den gevinst er indstillet på en "sikker" niveau hvor de inducerede fluorescerende toppe er inden for det pågældende måleområde af instrumentet. Det kan testes ved at føje ionomycin til en enkelt brønd på en bestemt gevinst indstilling. Hvis dette induceret en fluorescerende signal over tærsklen, sænke gevinsten, og prøv igen. Nogle bruger Pluronic F-127 til at støtte lastning af Fluo-41,13, men det er blevet konstateret, at dette ikke er nødvendigt2. Det maksimale antal rækker målt samtidig afhænger af to faktorer. 1) procestid for instrumentet: Hvis procestid er for lang, induceret toppe [Ca2 +],jeg kunne blive savnet. Måle et maksimum på to rækker samtidigt at holde procestid lav; 2) hastighed pipettering taktfast 4.16: med 12-kanals pipette, er det muligt hurtigt at føje 12 forskellige løsninger til 12 dublerede brøndene (24 wells) af 1 eller 2 rækker (f.eks., en række forud inkuberet med køretøjet og en række forud inkuberet med en inhibitor) , uden at miste de inducerede Ca2 + toppe. Det anbefales dog ikke at forsøge at tilføje 24 forskellige løsninger til to rækker til samtidige måling, som pipettering tips vil skulle udskiftes i mellem de to sekventielle pipettering trin, hvorved induceret Ca2 + toppe kunne blive savnet.

5. analyse af Data fra Ca2 +- fluorimetry

  1. Åbne raw fluorescens data fremstillet og eksporteret i trin 4.
  2. Beregne gennemsnittet fra dublerede brønde. Hvis store forskelle mellem dubletter, kassere data fra de særlige brønde.
  3. Definere baseline som de 10 første cyklusser.
  4. Beregn ΔF/F0 (%) som procentvise ændring i fluorescens (ΔF) over tid efter tilsætning af forbindelser og kontrol med hensyn til den gennemsnitlige basal fluorescens (F0) i løbet af de 10 første cykler (baseline).
  5. Hvis bruger dataene for generation af dosis-respons-kurver, subtrahere udlæsning af negativ kontrol fra de andre brønde, fjerne pipettering artefakter.

6. maaling af Acrosome reaktion

Bemærk: Bruge et billede Flowcytometret, en inkubator, fluorescerende farvestoffer: PI, FITC-PSA og Hoechst-33342, forbindelser af interesse samt positive og negative kontroller, en blokeret løsning indeholdende 0,6 M NaHCO3 og 0,37% (v/v) formaldehyd i destilleret vand, en A2 dias, og capacitated swim-up oprensede sædceller (udarbejdet i trin 2).

  1. Forberede en Farvningsopløsningen indeholdende PI (5 µg/mL), FITC-PSA (50 µg/mL) og Hoechst-33342 (100 µg/mL) i HTF+, bland det godt brug en vortex-mixer og beskytte det fra light indtil brug.
  2. Forberede løsninger af forbindelser og kontrol på 10 x den ønskede slutkoncentration, som de er fortyndet 1:10 i skridt 6,5. Altid omfatte en negativ (køretøj) kontrol og to positive kontroller: progesteron 10 µM endelige koncentration og ionomycin 2 µM endelige koncentration.
  3. Overføre delprøver af 240 µL af capacitated sædceller (udarbejdet i trin 2) til plasticrør.
  4. Tilføj 30 µL af farvning løsning til hvert rør. Endelig koncentration af pletter vil være: 0,5 µg/mL PI, 5 µg/mL FITC-PSA og 10 µg/mL Hoechst-33342.
  5. Tilføje 30 µL af løsninger med kontrolelementer eller forbindelser til hver tube (1:10 fortynding).
  6. Bland prøverne forsigtigt af pipettering op og ned et par gange eller mild vortexing. På grund af mekanisk stress, undgå overdreven blanding.
  7. Der inkuberes ved 37 ° C i 30 min.
  8. Udarbejde nye plast rør med 100 µL af en blokeret løsning indeholdende 0,6 M NaHCO3 og 0,37% (v/v) formaldehyd i destilleret vand, én pr reagensglas.
  9. Efter inkubationen blandes prøverne godt af pipettering og tilføje 50 µL af prøven til et rør med 100 µL af blokeret løsning.
  10. Før pålæsning af afdelingerne med en A2 dias, proeven blandes godt af pipettering. Fyld afdelingerne omhyggeligt med ca. 30 µL uden at skabe luftbobler.
    Bemærk: Under inkubation, motile sædceller har tendens til at samle. Celle klumper kan forstyrre målingen (selvom de er udelukket). Derfor, en grundig blanding af pipettering efter inkubation er meget vigtigt. Ligeledes, luftbobler i afdelingerne kan forstyrre målingen. Derfor, fylde salen langsomt og ændre vinklen på pipetten, hvis kanterne af væsken er ved at møde og skabe en luftboble.
  11. Placere den indlæste dias på bakken af billede forskellige og luk skuffen.
  12. Vælg FlexiCyte protokol og tryk køre.
    1. Vælg følgende indstillinger for FlexiCyte protokol: antallet af analytiske kanaler: 2; Maskering kanal: UV (LED365), dette er den kanal, der anvendes til billedsegmentering; Kanal 1: Blå (LED475), eksponeringstid 3,000 ms, emission filter 560/35; Kanal 2: Grøn (LED530), eksponering tid 500 ms, emission filter 675/75; Mindste antal analyserede celler: 5000; Udelukke aggregerede celler: Ja.
  13. Gentag trin 6,9-6.12 indtil alle prøver er blevet målt.

7. analyse af Data fra billede flowcytometri

  1. Åbne data indhentet i trin 6.
  2. Opret de to følgende grunde til at evaluere målingerne.
    1. Oprette en scatter plot af Hoechst-33342 intensitet vs. Hoechst-33342 område på biexponential skalaer. Dette plot kan være brugt til porten ud Hoechst-33342 positive objekter, der er enten for lille eller for stor til at blive menneskelige sædceller.
    2. Oprette en scatter plot af FITC-PSA intensitet og PI intensitet på biexponential skalaer. Dette plot kan bruges til æsler mængden af acrosome reagerede sædceller ved brug af en kvadrant gate, der adskiller de fire grupper på plot (figur 3): 1) en PI positive og FITC-PSA positive gruppe: Acrosome reagerede sædceller; 2) en PI negative og FITC-PSA positive gruppe: Acrosome reagerede levedygtige sædceller; 3) en PI positive og FITC-PSA negative gruppe: Acrosome intakt sædceller; og 4) en PI negative og FITC-PSA negative gruppe: Acrosome intakt levedygtige sædceller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Repræsentant resultater fra et eksperiment teste effekten af 4 forbindelser (A, B, C og D) sammen med en positiv (progesteron) og negative (buffer) kontrol på [Ca2 +]jeg i menneskelige sædceller ved hjælp af medium-overførselshastighed Ca2 +-signalering analysen kan ses i figur 4a. I figur 4b, er en dosis responskurve af progesteron vist, som var afledt af peak ΔF/F0 (%) data induceret af seriefremstillede fortyndet koncentrationen af progesteron, testet i et andet eksperiment ved hjælp af medium-overførselshastighed Ca2 +-signalering assay. Analyse af data fra Ca2 +-signalering assay er forklaret i trin 5. Repræsentative resultater fra et eksperiment test induktion af acrosome reaktion i capacitated menneskelige sædceller ved hjælp af en negativ kontrol (DMSO) eller de to positive kontroller (progesteron og ionomycin) på medium-overførselshastighed acrosome reaktion assay kan ses i det øverste panel af figur 3. Quadrant gated scatter parceller fra 3 afprøvningsbetingelserne er set. Analysen af acrosome reaktion data er forklaret i trin 7.

Tabel 1: lager løsninger til forberedelse af HTF + . Stamopløsninger kan holdes og genbruges i længere perioder, Glucose og HEPES ved-20 ° C og de andre stamopløsninger ved stuetemperatur. Sikre, at alle løsninger er helt opløst og godt blandet før brug.

Tabel 2: forberedelse af HTF + med 4 eller 25 mM HCO 3 - fra stamopløsninger af salte (udarbejdet i tabel 1). Na-laktat kan tilføjes som sirup, 60% (w/w) eller pulver. NaHCO3 tilføjes som pulver.

Figure 1
Figur 1: Swim-up rensning af bevægelige menneskelige sædceller. Venstre: Rør med HTF+ medium og en alikvot af flydende sædprøve pipetted nedenfor HTF+ medium. Højre: 1 h swim-up ved 37 ° C, motile sædceller har svømmet op i HTF+ medium. Immotile og døde sædceller samt sæd celler forbliver i sæd under HTF+ medium. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Diagram over medium-overførselshastighed Ca2 +-signalering assay. (en) sædceller er indlæst med en Ca2 +-følsomme fluorophore, vasket og delprøver er belagte brønde i en 384-godt plade. (b) 384-godt plade er placeret i et fluorescens-Pladelæser ved 30 ° C. (c) Fluorescens er registreret før og efter tilsætning af forbindelser, positiv kontrol (progesteron) og negativ kontrol (buffer med køretøj). Udlæsninger i ΔF/F0 (%) efter tilsætning (pile) af negative og positive kontrol er illustreret i bunden af (c). Illustration anvendes med tilladelse fra Christian Schiffer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: vurdering af acrosome reaktion ved hjælp af billede flowcytometri. (Øverste panel) Quadrant gated scatter parceller fra en negativ køretøj kontrol (DMSO), og den positive kontroller progesteron (Prog, 10 µM) og ionomycin (Iono, 2 µM). En tilvækst i celler i den nederste højre kvadrant (acrosome reagerede levedygtige celler) ses, når man sammenligner de positive kontroller til kontrolelementet DMSO. (Nederste panel) Mikroskopiske billeder af fluorescently mærket sædceller, herunder celler fra alle fire grupper. BF = lysfelt, Hoechst = Hoechst-33342, PSA = Pisum Sativum Agglutinin, PI = Propidium Iodid. Skalalinjen = 10 µm. Dette tal er blevet ændret fra Egeberg Palme et al. 20187. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Eksempel på data fra Ca2 +- fluorimetry. (en) ændringer i [Ca2 +],jeg induceret af negativ kontrol, progesteron og sammensatte A, B, C og D. (b) progesteron dosis-respons kurve. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Den medium gennemløb Ca2 + signalering assay er baseret på målinger af fluorescens fra enkelt microwells indeholder omkring 250.000 sædceller. De tilfangetagne signal er i gennemsnit fra alle individuelle sædceller i brønden. Analysen giver således ingen geografisk information om, hvor specielt i den sædcelle [Ca2 +]jeg er ændret, i hvor stor en del af sædcellerne en ændring i [Ca2 +]jeg finder sted, eller hvor heterogene svaret er mellem de enkelte celler. For at opnå sådanne oplysninger, skal eksperimenter med enkelt celle opløsning (f.eks. som beskrevet i50,52) være ansat. En anden ulempe ved teknikken er den tidsmæssige opløsning, som er på rækkefølgen af sekunder. Selvom 50 µL sperm prøverne er godt blandet, når 25 µL af løsningerne, der er tilføjet, målingerne kan først påbegyndes, når skuffen med multi godt pladen er tilbage inde i fluorescens pladelæseren. For at opnå højere tidsmæssige opløsning, der skal anvendes andre teknikker (f.eks. en stoppet flow fluorimetry13,50). Fordelen ved medium-overførselshastighed Ca2 +-signalering assay, sammenlignet med enkelt-celle eller single-godt metoder er at samtidig måling af flere microwells ved hjælp af en mikrotiterplade læser giver mulighed for hurtig og nem afprøvning af flere forbindelser side om side med positive og negative kontroller (figur 4)1,2, let generation af dosis-respons kurver enkelte forbindelser (figur 4)1,2,3 , 4 , 5, vurdering af additivity1,2 og synergi3 for to eller flere stoffer, samt undersøgelser af virkningsmekanisme af forbindelser selv konkurrencedygtig hæmning eksperimenter og brugen af specifikke farmakologiske hæmmere (f.eks. CatSper hæmmere1,2,3,4,5). Ved at ændre fluorophore, kan analysen være ansat til at undersøge andre intracellulære ændringer (f.eks., pHi1,2). Endelig, mere end én fluorophore kan bruges på én gang samtidig måle flere intracellulære ændringer. I fremtiden, den medie-overførselshastighed Ca2 +-signalering assay kan bruges til skærm forbindelser af interesse for effekter på Ca2 +-signalering i menneskelige sædceller (fx Miljøkontaminanter eller lægemiddelkandidater) til at undersøge de potentielle negative effekter på menneskers sædcelle funktion eller til at undersøge en mulig rolle som et præventionsmiddel.

Medium-overførselshastighed acrosome reaktion assay er baseret på image flowcytometri, der udgør en tiltalende erstatning for at vurdere menneskelige acrosome reaktion i forhold til manuel evaluering ved hjælp af et fluorescens mikroskop. Farvning mønstre af intakt eller reagerer/reagerede acrosomes er ikke altid klart, og en stor intra individuel variation kan være konsekvensen heraf. Med image flowcytometri, er billeder erhvervet og analyseres automatisk. Maskering kanal, i dette tilfælde Hoechst-33342, definerer celler og kun fluorescerende signaler fra disse specifikke områder er inkluderet i analysen af data. Dermed, farvning af kerneløse organer indeholdende resterende cytoplasma er ikke inkluderet i dataanalyse. Desuden er regner statistikker overlegen i forhold til fluorescens mikroskopi. Hvis du vil tælle 200 celler gennem okularer af mikroskopet er en udfordrende og tidskrævende opgave, men med billede flowcytometri analysen af mindst 5.000 celler tager mindre end et par minutter. Men på grund af lav forstørrelse af billedet Flowcytometret, evnen til at vurdere målingerne er tabt og sig vil være nødt til at bringe den farvede prøve til fluorescens mikroskop. Optagelse af kontrolelementer er derfor af yderste vigtighed at validere målingerne. Hvis kontrollen ikke reagerer som forventet, skal resultaterne fra et eksperiment kasseres. Protokollen beskrevet her var inspireret af arbejde udført af Zoppino et al.49, der evalueres menneskelige acrosome reaktion ved flowcytometri. De er yderligere beskrevet af realtid Fluorescens mikroskopi hvordan PSA træder i acrosomal rum når membran-fusion porer vises ved induktion af acrosome reaktion. Én gang inde i acrosomal rum, PSA træsko og danner en mark stabile i længere perioder. Ingen fiksation eller permeabilization anvendes i protokollen og fortolkning af resultatet er derfor klart: PSA inde i acrosomal rum af en levedygtig sæd celle er lig med acrosome reaktion. For Ca2 +-signalering assay, acrosome reaktion assay kan også bruges til at vurdere dosis-respons-kurver, hæmning, additivity og synergi af forbindelser af interesse. I fremtiden, kan medium-overførselshastighed acrosome reaktion assay også bruges til skærmen forbindelser af interesse for effekter på acrosome reaktion menneskelige sædceller (fx Miljøkontaminanter eller lægemiddelkandidater) til at undersøge de potentielle negative virkninger på denne menneskelige sæd cellefunktion eller til at undersøge en mulig rolle som et præventionsmiddel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne anerkende lab af Timo Strünker for kontrol med AR og DLE under deres ophold på hans lab. Desuden vil vi gerne takke vores kolleger på afdelingen for vækst og reproduktion, Rigshospitalet, Rigshospitalet for deres hjælp med opsætning af disse to assays. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Danmarks innovationsfond (grant numre 005-2010-3 og 14-2013-4).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 µm pore filter Thermo Fisher Scientific, USA 296-4545
1 L measuring cylinder Thermo Fisher Scientific, USA 3662-1000
1, 4, and 2 mL plastic tubes Eppendorf, Germany 30120086 and 0030120094
12-channel pipette Eppendorf, Germany 4861000813
384 multi-well plates Greiner Bio-One, Germany 781096
15 and 50 mL platic tubes Eppendorf, Germany 0030122151 and 30122178
A2-slide ChemoMetec, Denmark 942-0001
Automatic repeater pipette Eppendorf, Germany 4987000010
CaCl2
Centrifuge
Clean wide-mouthed plastic container for semen sample
Dimethyl sulfoxide (DMSO)
FITC-coupled lectin of Pisum sativum (FITC-PSA) Sigma-Aldrich, Germany L0770
Fluo-4 AM Thermo Fisher Scientific, USA F14201
FLUOstar OMEGA fluorescence microplate reader BMG Labtech, Germany
Glucose anhydrous
HEPES
Hoechst-33342 ChemoMetec, Denmark 910-3015
Human serum albumin (HSA) Irvine Scientific 9988 For addition to HTF+
Immobilizing solution containing 0.6 M NaHCO3 and 0.37% (v/v) formaldehyde in distilled water
Incubator
KCl
KH2PO4
Magnetic stirrer
MgSO4
Na-Lactate
NaCl
NaHCO3
NC-3000 image cytometer ChemoMetec, Denmark 970-3003
Pipettes and piptting tips
propidium iodide (PI) ChemoMetec, Denmark 910-3002
Purified water
Rack for placing 50 mL plastic tubes in 45° angle
S100 buffer ChemoMetec, Denmark 910-0101
SP1-cassette ChemoMetec, Denmark 941-0006
Volumetric flasks of appropriate sizes
Vortexer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schiffer, C., et al. Direct action of endocrine disrupting chemicals on human sperm. EMBO reports. (2014).
  2. Rehfeld, A., Dissing, S., Skakkebæk, N. E. Chemical UV Filters Mimic the Effect of Progesterone on Ca(2+) Signaling in Human Sperm Cells. Endocrinology. 157, (11), 4297-4308 (2016).
  3. Brenker, C., et al. Synergistic activation of CatSper Ca2+ channels in human sperm by oviductal ligands and endocrine disrupting chemicals. Human Reproduction (Oxford, England). 33, (10), 1915-1923 (2018).
  4. Brenker, C., et al. The CatSper channel: a polymodal chemosensor in human sperm. The EMBO Journal. 31, (7), 1654-1665 (2012).
  5. Brenker, C., et al. Action of steroids and plant triterpenoids on CatSper Ca2+ channels in human sperm. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, (3), E344-E346 (2018).
  6. Rehfeld, A., et al. Chemical UV filters can affect human sperm function in a progesterone-like manner. Endocrine Connections. (2017).
  7. Egeberg Palme, D. L., et al. Viable acrosome-intact human spermatozoa in the ejaculate as a marker of semen quality and fertility status. Human Reproduction. Oxford, England. (2018).
  8. Publicover, S., Harper, C. V., Barratt, C. [Ca2+]i signalling in sperm--making the most of what you've got. Nature Cell Biology. 9, (3), 235-242 (2007).
  9. Publicover, S. J., et al. Ca2+ signalling in the control of motility and guidance in mammalian sperm. Frontiers in Bioscience. 13, 5623-5637 (2008).
  10. Publicover, S., Harper, C. V., Barratt, C. [Ca2+]i signalling in sperm--making the most of what you've got. Nature Cell Biology. 9, (3), 235-242 (2007).
  11. Lishko, P. V., et al. The control of male fertility by spermatozoan ion channels. Annual Review Of Physiology. 74, 453-475 (2012).
  12. Morris, J., et al. Cell-penetrating peptides, targeting the regulation of store-operated channels, slow decay of the progesterone-induced [Ca2+]i signal in human sperm. Molecular Human Reproduction. 21, (7), 563-570 (2015).
  13. Strünker, T., et al. The CatSper channel mediates progesterone-induced Ca2+ influx in human sperm. Nature. 471, (7338), 382-386 (2011).
  14. Lishko, P. V., Botchkina, I. L., Kirichok, Y. Progesterone activates the principal Ca2+ channel of human sperm. Nature. 471, (7338), 387-391 (2011).
  15. Miller, M. R., et al. Unconventional endocannabinoid signaling governs sperm activation via the sex hormone progesterone. Science (New York, N.Y.). 352, (6285), 555-559 (2016).
  16. Revelli, A., et al. Follicular fluid content and oocyte quality: from single biochemical markers to metabolomics. Reproductive Biology And Endocrinology RB&E. 7, 40 (2009).
  17. Lyons, R. A., Saridogan, E., Djahanbakhch, O. The effect of ovarian follicular fluid and peritoneal fluid on Fallopian tube ciliary beat frequency. Human Reproduction. 21, (1), Oxford, England. 52-56 (2006).
  18. Eisenbach, M., Giojalas, L. C. Sperm guidance in mammals - an unpaved road to the egg. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 7, (4), 276-285 (2006).
  19. Alasmari, W., et al. The clinical significance of calcium-signalling pathways mediating human sperm hyperactivation. Human Reproduction. 28, (4), Oxford, England. 866-876 (2013).
  20. Alasmari, W., et al. Ca2+ signals generated by CatSper and Ca2+ stores regulate different behaviors in human sperm. The Journal of Biological Chemistry. 288, (9), 6248-6258 (2013).
  21. Tamburrino, L., et al. The CatSper calcium channel in human sperm: relation with motility and involvement in progesterone-induced acrosome reaction. Human Reproduction. 29, (3), Oxford, England. 418-428 (2014).
  22. Krausz, C., et al. Intracellular calcium increase and acrosome reaction in response to progesterone in human spermatozoa are correlated with in-vitro fertilization. Human Reproduction. 10, (1), Oxford, England. 120-124 (1995).
  23. Oehninger, S., et al. Defective calcium influx and acrosome reaction (spontaneous and progesterone-induced) in spermatozoa of infertile men with severe teratozoospermia. Fertility and Sterility. 61, (2), 349-354 (1994).
  24. Shimizu, Y., Nord, E. P., Bronson, R. A. Progesterone-evoked increases in sperm [Ca2+]i correlate with the egg penetrating ability of sperm from fertile but not infertile men. Fertility and Sterility. 60, (3), 526-532 (1993).
  25. Falsetti, C., et al. Decreased responsiveness to progesterone of spermatozoa in oligozoospermic patients. Journal of Andrology. 14, (1), 17-22 (1993).
  26. Williams, H. L., et al. Specific loss of CatSper function is sufficient to compromise fertilizing capacity of human spermatozoa. Human Reproduction. 30, (12), Oxford, England. 2737-2746 (2015).
  27. Forti, G., et al. Effects of progesterone on human spermatozoa: clinical implications. Annales d'Endocrinologie. 60, (2), 107-110 (1999).
  28. Krausz, C., et al. Two functional assays of sperm responsiveness to progesterone and their predictive values in in-vitro fertilization. Human Reproduction. 11, (8), Oxford, England. 1661-1667 (1996).
  29. Kelly, M. C., et al. Single-cell analysis of [Ca2+]i signalling in sub-fertile men: characteristics and relation to fertilization outcome. Human Reproduction. 33, (6), Oxford, England. 1023-1033 (2018).
  30. Brown, S. G., et al. Homozygous in-frame deletion in CATSPERE in a man producing spermatozoa with loss of CatSper function and compromised fertilizing capacity. Human Reproduction. 33, (10), Oxford, England. 1812-1816 (2018).
  31. Avenarius, M. R., et al. Human male infertility caused by mutations in the CATSPER1 channel protein. American Journal of Human Genetics. 84, (4), 505-510 (2009).
  32. Smith, J. F., et al. Disruption of the principal, progesterone-activated sperm Ca2+ channel in a CatSper2-deficient infertile patient. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, (17), 6823-6828 (2013).
  33. Hildebrand, M. S., et al. Genetic male infertility and mutation of CATSPER ion channels. European Journal of Human Genetics. 18, (11), 1178-1184 (2010).
  34. Avidan, N., et al. CATSPER2, a human autosomal nonsyndromic male infertility gene. European Journal of Human Genetic. 11, (7), 497-502 (2003).
  35. Zhang, Y., et al. Sensorineural deafness and male infertility: a contiguous gene deletion syndrome. BMJ Case Reports. 2009, (2009).
  36. Jaiswal, D., Singh, V., Dwivedi, U. S., Trivedi, S., Singh, K. Chromosome microarray analysis: a case report of infertile brothers with CATSPER gene deletion. Gene. 542, (2), 263-265 (2014).
  37. Visconti, P. E., Krapf, D., de la Vega-Beltrán, J. L., Acevedo, J. J., Darszon, A. Ion channels, phosphorylation and mammalian sperm capacitation. Asian Journal of Andrology. 13, (3), 395-405 (2011).
  38. Wassarman, P. M., Jovine, L., Litscher, E. S. A profile of fertilization in mammals. Nature Cell Biology. 3, (2), E59-E64 (2001).
  39. Leahy, T., Gadella, B. M. Sperm surface changes and physiological consequences induced by sperm handling and storage. Reproduction. 142, (6), Cambridge, England. 759-778 (2011).
  40. Suarez, S. S. Control of hyperactivation in sperm. Human Reproduction Update. 14, (6), 647-657 (2008).
  41. Liu, D. Y., Baker, H. W. Inhibition of acrosin activity with a trypsin inhibitor blocks human sperm penetration of the zona pellucida. Biology of Reproduction. 48, (2), 340-348 (1993).
  42. Okabe, M. The cell biology of mammalian fertilization. Development. 140, (22), Cambridge, England. 4471-4479 (2013).
  43. Inoue, N., Satouh, Y., Ikawa, M., Okabe, M., Yanagimachi, R. Acrosome-reacted mouse spermatozoa recovered from the perivitelline space can fertilize other eggs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, (50), 20008-20011 (2011).
  44. Jin, M., et al. Most fertilizing mouse spermatozoa begin their acrosome reaction before contact with the zona pellucida during in vitro fertilization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, (12), 4892-4896 (2011).
  45. Hirohashi, N., Yanagimachi, R. Sperm acrosome reaction: its site and role in fertilization. Biology of Reproduction. 99, (1), 127-133 (2018).
  46. Liu, D. Y., Garrett, C., Baker, H. W. G. Acrosome-reacted human sperm in insemination medium do not bind to the zona pellucida of human oocytes. International Journal of Andrology. 29, (4), 475-481 (2006).
  47. Overstreet, J. W., Hembree, W. C. Penetration of the zona pellucida of nonliving human oocytes by human spermatozoa in vitro. Fertility and Sterility. 27, (7), 815-831 (1976).
  48. Martins da Silva, S. J., et al. Drug discovery for male subfertility using high-throughput screening: a new approach to an unsolved problem. Human Reproduction. Oxford, England. 1-11 (2017).
  49. Zoppino, F. C. M., Halón, N. D., Bustos, M. A., Pavarotti, M. A., Mayorga, L. S. Recording and sorting live human sperm undergoing acrosome reaction. Fertility and Sterility. 97, (6), 1309-1315 (2012).
  50. Mata-Martínez, E., et al. Measuring intracellular Ca2+ changes in human sperm using four techniques: conventional fluorometry, stopped flow fluorometry, flow cytometry and single cell imaging. Journal of Visualized Experiments. (75), e50344 (2013).
  51. Egeberg, D. L., et al. Image cytometer method for automated assessment of human spermatozoa concentration. Andrology. 1, (4), 615-623 (2013).
  52. Nash, K., et al. Techniques for imaging Ca2+ signaling in human sperm. Journal of Visualized Experiments. (40), (2010).
Medium-throughput Screening Assays til vurdering af virkninger på Ca<sup>2 +</sup>-signalering og Acrosome reaktion i menneskelige sædceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rehfeld, A., Egeberg Palme, D. L., Almstrup, K., Juul, A., Skakkebaek, N. E. Medium-throughput Screening Assays for Assessment of Effects on Ca2+-Signaling and Acrosome Reaction in Human Sperm. J. Vis. Exp. (145), e59212, doi:10.3791/59212 (2019).More

Rehfeld, A., Egeberg Palme, D. L., Almstrup, K., Juul, A., Skakkebaek, N. E. Medium-throughput Screening Assays for Assessment of Effects on Ca2+-Signaling and Acrosome Reaction in Human Sperm. J. Vis. Exp. (145), e59212, doi:10.3791/59212 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter