Medium-throughput Screening Assays til vurdering af virkninger på Ca2 +-signalering og Acrosome reaktion i menneskelige sædceller

Summary

Her, to medium-overførselshastighed assays til vurdering af virkninger på Ca^{2 +}-signalering og acrosome reaktion i menneskelige sædceller er beskrevet. Disse assays kan bruges til hurtigt og nemt skærmen store mængder af stoffer for effekter på Ca^{2 +}-signalering og acrosome reaktion i menneskelige sædceller.

Abstract

Ca^{2 +}-signalering er afgørende for normal sæd cellefunktion og mandlige fertilitet. Ligeledes, acrosome reaktionen er afgørende for evne til menneskelige sædcellen trænger zona pellucida og befrugte ægget. Det er derfor af stor interesse at teste forbindelser (f.eks. Miljøkontaminanter eller lægemiddelkandidater) for deres effekt på Ca^{2 +}-signalering og acrosome reaktion i menneskelige sædceller enten at undersøge de potentielle negative virkninger på menneskers sædcelle funktion eller at undersøge en mulig rolle som et præventionsmiddel. Her, to medium-overførselshastighed assays er beskrevet: 1) et fluorescens-baseret analyse til vurdering af virkninger på Ca^{2 +}-signalering i menneskelige sædceller og 2) et billede cytometric analyse til vurdering af acrosome reaktion i menneskelige sædceller. Disse assays kan bruges til at screene et stort antal stoffer for effekter på Ca^{2 +}-signalering og acrosome reaktion i menneskelige sædceller. Desuden, assays kan bruges til at generere meget specifikke dosis-respons kurver af enkelte forbindelser, bestemme potentielle additivity/synergi for to eller flere forbindelser og studere den farmakologiske virkningsmekanisme gennem konkurrencedygtige hæmning eksperimenter med CatSper hæmmere.

Introduction

Formålet med de to assays beskrevet her er at undersøge virkningerne på Ca^{2 +}-signalering og acrosome reaktion i menneskelige sædceller, som har været vist flere forbindelser i flere publikationer beskæftiger disse undersøgelser^{1,2, 3,4,5,6,7}. Ca^{2 +}-signalering og acrosome reaktion er afgørende for normale menneskelige sædceller cellefunktion og mandlige fertilitet.

Det overordnede mål med en menneskelig sædcelle er at befrugte ægget. For at være i stand til med succes og naturligvis befrugte ægget, skal funktioner af sædcellen være reguleret stramt under rejsen af sædcellen gennem den kvindelige forplantningsorganerne^8,9. Mange af funktionerne sædcelle er reguleret via den intracellulære Ca^{2 +}-koncentration [Ca^{2 +}]_jeg (fx, sperm motilitet, chemotaxis og acrosome reaktion)¹⁰. Også, en modningsproces, kaldet retsevne, som gengiver sædcellen i stand til at befrugte ægget, er delvis reguleret af [Ca^{2 +}]_jeg¹⁰. Ca^{2 +}-ekstrudering af Ca^{2 +}-ATPase pumper¹¹ opretholde en cirka 20.000 fold Ca^{2 +}-gradienten over menneskelige sædceller cellemembranen, med en hvilende [Ca^{2 +}]_jeg af 50-100 nM. Hvis Ca^{2 +} er tilladt at krydse cellemembranen (f.eks. gennem åbningen af Ca^{2 +}-kanaler), en betydelig tilstrømning af Ca^{2 +} opstår, giver anledning til en højde af [Ca^{2 +}],_jeg. Dog sædcellen også bærer intracellulære Ca^{2 +}-butikker, som kan frigive Ca^{2 +} og derfor også giver anledning en udvidelse af [Ca^{2 +}]_i¹². Interessant, alle kanal-medieret Ca^{2 +}-tilstrømning i menneskelige sædceller er hidtil blevet fundet for at forekomme via CatSper (kationisk kanal SpeRM), som er kun udtrykt i sædceller¹¹. I menneskelige sædceller, CatSper er aktiveret af endogene ligander progesteron og prostaglandiner gennem særskilte ligand bindende websteder^13,14,15, fører til en hurtig Ca^{2 +}-tilstrømning til sædcelle. To hovedkilder nær ægget giver høje niveauer af disse endogene ligander. En er den follikulære væske, der indeholder høje niveauer af progesteron¹⁶. Follikulært væsken er frigivet fra modne follikler sammen med æg på ægløsning og blander sig med væsken i æggelederne¹⁷. Den andre vigtigste kilde er de cumulus celler, der omgiver ægget og slip høje niveauer af progesteron og prostaglandiner. De progesteron-induceret Ca^{2 +}-tilstrømning i sædceller har vist sig at mægle chemotaxis mod æg^9,18, styre sperm motilitet^19,20 og stimulere acrosome reaktion²¹. Udløsning af disse individuelle [Ca^{2 +}]_jeg-regulerede sperm funktioner i den rigtige rækkefølge og på det rigtige tidspunkt er afgørende for befrugtning af ægget⁸. I denne, en suboptimal progesteron-induceret Ca^{2 +}-tilstrømning er blevet fundet at være associeret med reduceret mandlige fertilitet^{22,23,24,25,26} er vigtigt for mandlige fertilitet^{26,30,31,32, ,27,28,29 og funktionelle CatSper 33,34,35,36}.

Da sædceller nå ægget, en sekvens af begivenheder skal finde sted for befrugtning forekommer: 1) sædcellerne skal trænge igennem de omkringliggende cumulus cellelag, 2) binder sig til zona pellucida, 3) exocytose acrosomal indhold, den såkaldte acrosome reaktion ³⁷, 4) trænge igennem zona pellucida og 5) fuse med æg membranen at fuldføre befrugtning³⁸. Hvis du vil være i stand til at gå gennem disse trin og befrugte ægget, skal sædcellen først gennemgå retsevne¹¹, der begynder som sædcellerne forlade den sædvæske, der indeholder “decapacitating” faktorer³⁹ og svømme ind i væsker for kvindelige forplantningsorganerne med høje niveauer af bikarbonat og albumin³⁷. Retsevne gengiver i stand til at gennemgå hyperactivation, en form for motilitet med en kraftig slå fimrehår, og acrosome reaktion³⁷sædceller. Hyperactivated motilitet kræves til penetration af zona pellucida⁴⁰, og acrosome indeholder forskellige hydrolytiske enzymer, at støtte denne penetration proces⁴¹. Derudover gengiver acrosome reaktion sædceller i stand til at fusionere med ægget ved at udsætte specifikke Membranproteiner på sæd overfladen nødvendige for sperm-æg fusion⁴². Evnen til at gennemgå hyperactivation og acrosome reaktion er derfor både nødvendige for vellykket befrugtning af æg^40,42. I modsætning til hvad er blevet set for musen sædceller^43,44,45, kan kun menneskelige sædceller, der er acrosome-intakt binde til zona pellucida⁴⁶. De skal gennemgå acrosome reaktion at trænge igennem zona pellucida⁴¹ og afdække specifikke Membranproteiner, der er nødvendige for fusion med æg³⁸, når de menneskelige sædceller er bundet til zona pellucida. Timingen af acrosome reaktionen i menneskelige sædceller er således afgørende for befrugtning at forekomme.

Som beskrevet ovenfor, Ca^{2 +}-signalering er af afgørende betydning for normale sæd celle funktion⁸, og det er derfor af stor interesse at skærmen stort antal forbindelser for effekter på Ca^{2 +}-signalering i menneskelige sædceller. På samme måde, som kun menneskelige sædceller, der undergår acrosome reaktion på rette tid og sted kan trænge igennem zona pellucida og befrugte ægget^46,47, det er også af stor interesse at kunne teste forbindelser for deres evne til at påvirke acrosome reaktionen i menneskelige sædceller. Til dette formål to medium-throughput screening-assays er beskrevet: 1) en analyse af virkninger på Ca^{2 +}-signalering i menneskelige sædceller og 2) en analyse for evnen til at fremkalde acrosome reaktion i menneskelige sædceller.

Analyse 1 er en medium-overførselshastighed Ca^{2 +}-signalering assay. Denne fluorescens plade reader-baseret teknik overvåger ændringer i fluorescens som funktion af tiden samtidig i flere brønde. Ca^{2 +}-følsomme fluorescerende farvestof, Fluo-4 har en K_d for Ca^{2 +}≈ 335 nM og er celle-permeant i AM (acetoxymethyl) ester form. Med Fluo-4, er det muligt at måle ændringer i [Ca^{2 +}]_jeg over tid og efter tilsætning af forbindelser af interesse for sædceller. Analysen blev udviklet af laboratoriet af Timo Strünker i 2011¹³ og er siden blevet brugt i flere undersøgelser at skærmen stoffer for effekter på Ca^{2 +}-signalering i menneskelige sædceller^{1,2,3, 4,5}. Også har en lignende metode været anvendt til at screene flere drug kandidater⁴⁸. Desuden, er denne analyse også nyttige til at vurdere den farmakologiske tilstand af aktion^1,2,3,4,5, dosis-respons kurver^{1, 2,3,4,5}, konkurrencedygtige hæmning^1,2, additivity^1,2og synergi³ af forbindelser af interesse.

Analysen 2 er en medium-overførselshastighed acrosome reaktion assay. Dette billede Flowcytometret-baseret teknik måler mængden af levedygtige acrosome reagerede sædceller i en prøve, ved hjælp af tre fluorescerende farvestoffer: propidium Iodid (PI), FITC-kombineret lektin Pisum sativum (FITC-PSA), og Hoechst-33342. Analysen blev ændret fra en lignende flow flowcytometri-baserede metode af Zoppino et al.⁴⁹ og har været anvendt i flere undersøgelser^6,7. For Ca^{2 +}-signalering assay, denne acrosome reaktion assay kan også bruges til at vurdere dosis-respons-kurver, hæmning, additivity og synergi af forbindelser af interesse.

Protocol

Indsamling og analyse af menneskelige sæd prøver i protokollerne følger retningslinjerne i den videnskabsetisk Komité for Region Hovedstaden. Alle sæd prøver har opnået efter informeret samtykke fra frivillige donorer. Efter levering, var prøverne fuldt anonymiseret. For deres ulejlighed modtaget hver donor et gebyr på 500 kr. (omkring $75 amerikanske. dollars) pr. prøve. Prøverne blev analyseret på dagen for levering og derefter destrueres straks efter laboratorieforsøg. Bemærk:…

Representative Results

Repræsentant resultater fra et eksperiment teste effekten af 4 forbindelser (A, B, C og D) sammen med en positiv (progesteron) og negative (buffer) kontrol på [Ca2 +]jeg i menneskelige sædceller ved hjælp af medium-overførselshastighed Ca2 +-signalering analysen kan ses i figur 4a. I figur 4b, er en dosis responskurve af progesteron vist, som var afledt af peak ΔF/F0 (%) data indu…

Discussion

Den medium gennemløb Ca^{2 +} signalering assay er baseret på målinger af fluorescens fra enkelt microwells indeholder omkring 250.000 sædceller. De tilfangetagne signal er i gennemsnit fra alle individuelle sædceller i brønden. Analysen giver således ingen geografisk information om, hvor specielt i den sædcelle [Ca^{2 +}]_jeg er ændret, i hvor stor en del af sædcellerne en ændring i [Ca^{2 +}]_jeg finder sted, eller hvor heterogene svaret er mellem de enkelte celler…

Materials

0.2 µm pore filter	Thermo Fisher Scientific, USA	296-4545
1 L measuring cylinder	Thermo Fisher Scientific, USA	3662-1000
1,4 and 2 mL plastic tubes	Eppendorf, Germany	30120086 and 0030120094
12-channel pipette	Eppendorf, Germany	4861000813
384 multi-well plates	Greiner Bio-One, Germany	781096
15 and 50 mL platic tubes	Eppendorf, Germany	0030122151 and 30122178
A2-slide	ChemoMetec, Denmark	942-0001
Automatic repeater pipette	Eppendorf, Germany	4987000010
CaCl2
Centrifuge
Clean wide-mouthed plastic container for semen sample
Dimethyl sulfoxide (DMSO)
FITC-coupled lectin of Pisum sativum (FITC-PSA)	Sigma-Aldrich, Germany	L0770
Fluo-4 AM	Thermo Fisher Scientific, USA	F14201
FLUOstar OMEGA fluorescence microplate reader	BMG Labtech, Germany
Glucose anhydrous
HEPES
Hoechst-33342	ChemoMetec, Denmark	910-3015
Human serum albumin (HSA)	Irvine Scientific	9988	For addition to HTF+
Immobilizing solution containing 0.6 M NaHCO3 and 0.37% (v/v) formaldehyde in distilled water
Incubator
KCl
KH2PO4
Magnetic stirrer
MgSO4
Na-Lactate
NaCl
NaHCO3
NC-3000 image cytometer	ChemoMetec, Denmark	970-3003
Pipettes and piptting tips
propidium iodide (PI)	ChemoMetec, Denmark	910-3002
Purified water
Rack for placing 50 mL plastic tubes in 45° angle
S100 buffer	ChemoMetec, Denmark	910-0101
SP1-cassette	ChemoMetec, Denmark	941-0006
Volumetric flasks of appropriate sizes
Vortexer