Medium gjennomstrømming Screening analyser for vurdering av virkningene på Ca2 +-signalisering og Acrosome reaksjon i menneskelig sæden

Summary

Her, to medium gjennomstrømming analyser for vurdering av virkningene på Ca^{2 +}-signalisering og acrosome reaksjon i menneskelig sperm er beskrevet. Disse analyser kan brukes til å raskt og enkelt skjermen store mengder forbindelser for effekter på Ca^{2 +}-signalisering og acrosome reaksjon i menneskelig sperm.

Abstract

Ca^{2 +}-signalisering er viktig for normal sperm celle funksjon og mannlig fertilitet. Tilsvarende er acrosome reaksjonen avgjørende for evnen til en menneskelig sperm celle å trenge zona pellucida og befrukte egget. Derfor er av stor interesse å teste forbindelser (f.eks miljømessige kjemikalier eller narkotika kandidater) for deres effekt på Ca^{2 +}-signalisering og acrosome reaksjon i menneskelig sæden å undersøke mulige negative effekter på menneskelig sperm celle funksjon eller undersøke en mulig rolle som en pille. Her to middels gjennomstrømming analyser er beskrevet: 1) en fluorescens-baserte analysen for vurdering av virkningene på Ca^{2 +}-signalering i menneskelig sperm, og 2) et bilde cytometric analysen for vurdering av acrosome reaksjonen i menneskelig sperm. Disse analyser kan brukes til skjermen et stort antall forbindelser for effekter på Ca^{2 +}-signalisering og acrosome reaksjon i menneskelig sperm. Videre kan analyser brukes å generere svært spesifikke dose-respons kurver av personlige forbindelser, fastslår potensielle additivity/synergism for to eller flere forbindelser, og å studere farmakologiske virkemåte gjennom konkurrerende Eksperimenter med CatSper hemmere.

Introduction

Formålet med de to analyser beskrevet her er å undersøke virkningene på Ca^{2 +}-signalisering og acrosome reaksjon i menneskelig sæd, som har vært vist flere forbindelser i flere publikasjoner bruke disse søk^{1,2, 3,4,5,6,7}. Ca^{2 +}-signalisering og acrosome reaksjonen er både viktig for normal menneskelig sperm celle funksjon og mannlig fertilitet.

Det overordnede målet med en menneskelig sperm celle er å befrukte egget. For å kunne lykkes og naturlig befrukte egget, må funksjonene i sperm cellen være regulert tett under reisen av sperm cellen til den kvinnelige skjede^8,9. Mange av funksjonene sperm celle er regulert via en intracellulær Ca^{2 +}-konsentrasjon [Ca^{2 +}]_jeg (f.eks sperm motilitet og chemotaxis acrosome reaksjon)¹⁰. En modning prosess som kalles capacitation, som gjengir sperm celle kan gjødslende egget, er også delvis regulert av [Ca^{2 +}]_jeg¹⁰. Ca^{2 +}-ekstrudering Ca^{2 +}-ATPase pumper¹¹ opprettholde en ca 20.000 fold Ca^{2 +}-gradient over menneskelige sperm celle membran, med en hvile [Ca^{2 +}]_jeg av 50-100 nM. Hvis Ca^{2 +} tillates å krysse cellemembranen (for eksempel gjennom åpningen av Ca^{2 +}-kanaler), en stor tilstrømning av Ca^{2 +} oppstår, gir opphav til en høyde på [Ca^{2 +}]_jeg. Imidlertid sperm celle også bærer intracellulær Ca^{2 +}-butikker, som kan frigi Ca^{2 +} og, derfor også gi stige rettighetsutvidelse [Ca^{2 +}]_jeg¹². Interessant, alle kanal-mediert Ca^{2 +}-tilstrømning av menneskelig sædceller har så langt blitt funnet for å skje via CatSper (kattenioniske kanal SpeRM), som bare er uttrykt i sædceller¹¹. I menneskelige sperm celler, CatSper utvikling av endogene ligander progesteron og prostaglandiner gjennom forskjellige ligand binding nettsteder^13,14,15, fører til en rask Ca^{2 +}-tilstrømningen til sperm cellen. To viktigste kildene i nærheten av egget gir høye nivåer av disse endogene ligander. En er follikulær væske som inneholder høye nivåer av progesteron¹⁶. Follicular væsken slippes fra modne follikler med egg på eggløsning og mikser med væsken innenfor de oviducts¹⁷. Andre hovedkilden er cumulus cellene som omgir egg og slipp høyt nivå av progesteron og prostaglandiner. Den progesteron-indusert Ca^{2 +}-tilstrømning av sædceller har vist seg å megle chemotaxis mot egg^9,18, kontrollere sperm motilitet^19,20 og stimulere til acrosome reaksjon²¹. Følge av disse personlige [Ca^{2 +}]_jeg-regulert sperm funksjonene i riktig rekkefølge og på riktig tidspunkt er avgjørende for befruktning av egg⁸. I tråd med dette, en suboptimal progesteron-indusert Ca^{2 +}-tilstrømningen er funnet å bli assosiert med redusert mannlig fertilitet^{22,23,24,25,26 ,27,28,29} og funksjonelle CatSper er avgjørende for mannlig fertilitet^{26,30,31,32, 33,34,35,36}.

Som sædceller nå egget, en hendelsessekvens må skje for befruktning oppstår: 1) sædceller må trenge omkringliggende cumulus celle laget, 2) binde til zona pellucida, 3) exocytose acrosomal innhold, den såkalte acrosome-reaksjonen ³⁷, 4) trenge zona pellucida og 5) sikring med egg membranen å fullføre befruktning³⁸. For å kunne gå gjennom disse trinnene og befrukte egget, må sperm cellen først gjennomgå capacitation¹¹, som begynner som sædceller forlate den seminal væsken som inneholder “decapacitating” faktorer³⁹ og svømme i væsker av kvinnelige skjede med høye nivåer av bikarbonat og albumin³⁷. Capacitation gjengir sædceller kunne gjennomgå hyperactivation, en form for motilitet med energisk juling av flagell og acrosome reaksjon³⁷. Hyperactivated motilitet kreves for penetrasjon av zona pellucida⁴⁰, og acrosome inneholder ulike hydrolytisk enzymer som hjelper denne penetrasjon prosessen⁴¹. I tillegg gjengir acrosome reaksjonen sædceller i stand til å smelte sammen med egg ved å utsette bestemt membran proteiner på sperm overflaten nødvendig for sperm-egg blanding⁴². Følgelig evnen til å gjennomgå hyperactivation og acrosome reaksjon er både nødvendig for vellykket befruktning av egg^40,42. I motsetning til hva har blitt sett i musen sædceller^43,44,45, kan bare menneskelig sædceller som er acrosome-intakt binde til zona pellucida⁴⁶. Når den menneskelige sædceller er bundet til zona pellucida måtte de gjennomgå acrosome reaksjon både til å trenge den zona pellucida⁴¹ og å utsette bestemt membran proteiner som trengs for fusjon med egg³⁸. Tidspunktet for acrosome reaksjonen i menneskelig sperm er derfor avgjørende for befruktning oppstår.

Som beskrevet ovenfor, Ca^{2 +}-signalisering er viktig for normal sperm celle funksjon⁸, og det er derfor, av stor interesse å kunne skjermen stort antall forbindelser for effekter på Ca^{2 +}-signalering i menneskelig sædceller. På samme måte som bare menneskelig sædceller som gjennomgå acrosome reaksjon på riktig tid og sted kan trenge zona pellucida og befrukte egget^46,47, er det også av stor interesse å kunne teste forbindelser for deres evne til å påvirke acrosome reaksjonen i menneskelig sperm. Dette to medium gjennomstrømming screening analyser er beskrevet: 1) en analysen for effekter på Ca^{2 +}-signalering i menneskelige sperm celler og 2) en analysen for evnen til å indusere acrosome reaksjon i menneskelig sædceller.

Analysen 1 er en medium gjennomstrømming Ca^{2 +}-signalisering analysen. Denne fluorescens plate leser-basert teknikk overvåker endringer i fluorescens som en funksjon av tid samtidig i flere brønner. Ca^{2 +}-sensitive fluorescerende farge, Fluo-4 har en K_d for Ca^{2 +}≈ 335 nM og celle-permeant i skjemaet er (acetoxymethyl) ester. Bruker Fluo-4, er det mulig å måle endringer i [Ca^{2 +}]_jeg over tid og etter tilsetning av forbindelser av interesse for sædceller. Analysen ble utviklet ved laboratoriet av Timo Strünker i 2011¹³ og har blitt brukt i flere studier til skjermen forbindelser for effekter på Ca^{2 +}-signalisering i menneskelig sperm^{1,2,3, 4,5}. En lignende metode er også brukt til skjermen flere narkotika kandidater⁴⁸. I tillegg er denne analysen også nyttig for å vurdere farmakologiske modus handling^1,2,3,4,5, dose-respons kurver^{1, 2,3,4,5}, konkurrerende^1,2, additivity^1,2og synergism³ forbindelser av interesse.

Analysen 2 er en medium gjennomstrømming acrosome reaksjon analysen. Denne cytometer-basert teknikk måler mengden levedyktig acrosome reagerte sædceller i en prøve, bruker tre fluorescerende fargestoffer: propidium iodide (PI), FITC-kombinert Lektiner erter sativum (FITC-PSA) og Hoechst-33342. Analysen ble endret fra en lignende flyt cytometri-basert metode av Zoppino et al.⁴⁹ og har blitt brukt i flere studier^6,7. Som for Ca^{2 +}-signalisering analysen, denne acrosome reaksjon analysen kan også brukes til å vurdere dose-respons kurver, hemming, additivity og synergism av forbindelser av interesse.

Protocol

Innsamling og analyse av menneskelig sæd prøver i protokoller følger retningslinjene for etikk for forskning hovedstaden regionen av Danmark. Alle sæd prøver har vært innhentet etter samtykke fra frivillige donorer. Etter levering, var prøvene fullt anonymiseres. Deres ulemper fått hver giver et gebyr på 500 DKK (ca $75 dollar) per prøve. Prøvene ble analysert ved levering og deretter ødelagt umiddelbart etter laboratorieforsøk. Merk: Middels gjennomstrømningen Ca2 +-s…

Representative Results

Representant resultater fra et eksperiment tester effekten av 4 forbindelser (A, B, C og D) sammen med en positiv (progesteron) og negative (buffer) kontroll på [Ca2 +]jeg i menneskelig sæden med medium gjennomstrømming Ca:2 +-signalisering analysen kan ses i figur 4a. Figur 4bvises en dose respons kurve av progesteron, som var avledet fra toppen ΔF/F0 (%) data av serielt utvannet k…

Discussion

Det medium gjennomstrømming Ca^{2 +} signalering analysen er basert på målinger av fluorescens fra enkelt microwells som inneholder 250 000 sædceller. De fangede signalet er gjennomsnitt fra alle personlige sædceller i brønnen. Analysen dermed gir ingen romlig informasjon om hvor i den sperm celle [Ca^{2 +}]_jeg er endret, i hvor stor del av den sædceller trer en endring i [Ca^{2 +}]_i stedet, eller hvordan heterogene svaret er mellom de enkelte cellene. For å få infor…

Materials

0.2 µm pore filter	Thermo Fisher Scientific, USA	296-4545
1 L measuring cylinder	Thermo Fisher Scientific, USA	3662-1000
1,4 and 2 mL plastic tubes	Eppendorf, Germany	30120086 and 0030120094
12-channel pipette	Eppendorf, Germany	4861000813
384 multi-well plates	Greiner Bio-One, Germany	781096
15 and 50 mL platic tubes	Eppendorf, Germany	0030122151 and 30122178
A2-slide	ChemoMetec, Denmark	942-0001
Automatic repeater pipette	Eppendorf, Germany	4987000010
CaCl2
Centrifuge
Clean wide-mouthed plastic container for semen sample
Dimethyl sulfoxide (DMSO)
FITC-coupled lectin of Pisum sativum (FITC-PSA)	Sigma-Aldrich, Germany	L0770
Fluo-4 AM	Thermo Fisher Scientific, USA	F14201
FLUOstar OMEGA fluorescence microplate reader	BMG Labtech, Germany
Glucose anhydrous
HEPES
Hoechst-33342	ChemoMetec, Denmark	910-3015
Human serum albumin (HSA)	Irvine Scientific	9988	For addition to HTF+
Immobilizing solution containing 0.6 M NaHCO3 and 0.37% (v/v) formaldehyde in distilled water
Incubator
KCl
KH2PO4
Magnetic stirrer
MgSO4
Na-Lactate
NaCl
NaHCO3
NC-3000 image cytometer	ChemoMetec, Denmark	970-3003
Pipettes and piptting tips
propidium iodide (PI)	ChemoMetec, Denmark	910-3002
Purified water
Rack for placing 50 mL plastic tubes in 45° angle
S100 buffer	ChemoMetec, Denmark	910-0101
SP1-cassette	ChemoMetec, Denmark	941-0006
Volumetric flasks of appropriate sizes
Vortexer