Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biology

Medium gjennomstrømming Screening analyser for vurdering av virkningene på Ca2 +-signalisering og Acrosome reaksjon i menneskelig sæden

doi: 10.3791/59212 Published: March 1, 2019

Summary

Her, to medium gjennomstrømming analyser for vurdering av virkningene på Ca2 +-signalisering og acrosome reaksjon i menneskelig sperm er beskrevet. Disse analyser kan brukes til å raskt og enkelt skjermen store mengder forbindelser for effekter på Ca2 +-signalisering og acrosome reaksjon i menneskelig sperm.

Abstract

Ca2 +-signalisering er viktig for normal sperm celle funksjon og mannlig fertilitet. Tilsvarende er acrosome reaksjonen avgjørende for evnen til en menneskelig sperm celle å trenge zona pellucida og befrukte egget. Derfor er av stor interesse å teste forbindelser (f.eks miljømessige kjemikalier eller narkotika kandidater) for deres effekt på Ca2 +-signalisering og acrosome reaksjon i menneskelig sæden å undersøke mulige negative effekter på menneskelig sperm celle funksjon eller undersøke en mulig rolle som en pille. Her to middels gjennomstrømming analyser er beskrevet: 1) en fluorescens-baserte analysen for vurdering av virkningene på Ca2 +-signalering i menneskelig sperm, og 2) et bilde cytometric analysen for vurdering av acrosome reaksjonen i menneskelig sperm. Disse analyser kan brukes til skjermen et stort antall forbindelser for effekter på Ca2 +-signalisering og acrosome reaksjon i menneskelig sperm. Videre kan analyser brukes å generere svært spesifikke dose-respons kurver av personlige forbindelser, fastslår potensielle additivity/synergism for to eller flere forbindelser, og å studere farmakologiske virkemåte gjennom konkurrerende Eksperimenter med CatSper hemmere.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Formålet med de to analyser beskrevet her er å undersøke virkningene på Ca2 +-signalisering og acrosome reaksjon i menneskelig sæd, som har vært vist flere forbindelser i flere publikasjoner bruke disse søk1,2, 3,4,5,6,7. Ca2 +-signalisering og acrosome reaksjonen er både viktig for normal menneskelig sperm celle funksjon og mannlig fertilitet.

Det overordnede målet med en menneskelig sperm celle er å befrukte egget. For å kunne lykkes og naturlig befrukte egget, må funksjonene i sperm cellen være regulert tett under reisen av sperm cellen til den kvinnelige skjede8,9. Mange av funksjonene sperm celle er regulert via en intracellulær Ca2 +-konsentrasjon [Ca2 +]jeg (f.eks sperm motilitet og chemotaxis acrosome reaksjon)10. En modning prosess som kalles capacitation, som gjengir sperm celle kan gjødslende egget, er også delvis regulert av [Ca2 +]jeg10. Ca2 +-ekstrudering Ca2 +-ATPase pumper11 opprettholde en ca 20.000 fold Ca2 +-gradient over menneskelige sperm celle membran, med en hvile [Ca2 +]jeg av 50-100 nM. Hvis Ca2 + tillates å krysse cellemembranen (for eksempel gjennom åpningen av Ca2 +-kanaler), en stor tilstrømning av Ca2 + oppstår, gir opphav til en høyde på [Ca2 +]jeg. Imidlertid sperm celle også bærer intracellulær Ca2 +-butikker, som kan frigi Ca2 + og, derfor også gi stige rettighetsutvidelse [Ca2 +]jeg12. Interessant, alle kanal-mediert Ca2 +-tilstrømning av menneskelig sædceller har så langt blitt funnet for å skje via CatSper (kattenioniske kanal SpeRM), som bare er uttrykt i sædceller11. I menneskelige sperm celler, CatSper utvikling av endogene ligander progesteron og prostaglandiner gjennom forskjellige ligand binding nettsteder13,14,15, fører til en rask Ca2 +-tilstrømningen til sperm cellen. To viktigste kildene i nærheten av egget gir høye nivåer av disse endogene ligander. En er follikulær væske som inneholder høye nivåer av progesteron16. Follicular væsken slippes fra modne follikler med egg på eggløsning og mikser med væsken innenfor de oviducts17. Andre hovedkilden er cumulus cellene som omgir egg og slipp høyt nivå av progesteron og prostaglandiner. Den progesteron-indusert Ca2 +-tilstrømning av sædceller har vist seg å megle chemotaxis mot egg9,18, kontrollere sperm motilitet19,20 og stimulere til acrosome reaksjon21. Følge av disse personlige [Ca2 +]jeg-regulert sperm funksjonene i riktig rekkefølge og på riktig tidspunkt er avgjørende for befruktning av egg8. I tråd med dette, en suboptimal progesteron-indusert Ca2 +-tilstrømningen er funnet å bli assosiert med redusert mannlig fertilitet22,23,24,25,26 ,27,28,29 og funksjonelle CatSper er avgjørende for mannlig fertilitet26,30,31,32, 33,34,35,36.

Som sædceller nå egget, en hendelsessekvens må skje for befruktning oppstår: 1) sædceller må trenge omkringliggende cumulus celle laget, 2) binde til zona pellucida, 3) exocytose acrosomal innhold, den såkalte acrosome-reaksjonen 37, 4) trenge zona pellucida og 5) sikring med egg membranen å fullføre befruktning38. For å kunne gå gjennom disse trinnene og befrukte egget, må sperm cellen først gjennomgå capacitation11, som begynner som sædceller forlate den seminal væsken som inneholder "decapacitating" faktorer39 og svømme i væsker av kvinnelige skjede med høye nivåer av bikarbonat og albumin37. Capacitation gjengir sædceller kunne gjennomgå hyperactivation, en form for motilitet med energisk juling av flagell og acrosome reaksjon37. Hyperactivated motilitet kreves for penetrasjon av zona pellucida40, og acrosome inneholder ulike hydrolytisk enzymer som hjelper denne penetrasjon prosessen41. I tillegg gjengir acrosome reaksjonen sædceller i stand til å smelte sammen med egg ved å utsette bestemt membran proteiner på sperm overflaten nødvendig for sperm-egg blanding42. Følgelig evnen til å gjennomgå hyperactivation og acrosome reaksjon er både nødvendig for vellykket befruktning av egg40,42. I motsetning til hva har blitt sett i musen sædceller43,44,45, kan bare menneskelig sædceller som er acrosome-intakt binde til zona pellucida46. Når den menneskelige sædceller er bundet til zona pellucida måtte de gjennomgå acrosome reaksjon både til å trenge den zona pellucida41 og å utsette bestemt membran proteiner som trengs for fusjon med egg38. Tidspunktet for acrosome reaksjonen i menneskelig sperm er derfor avgjørende for befruktning oppstår.

Som beskrevet ovenfor, Ca2 +-signalisering er viktig for normal sperm celle funksjon8, og det er derfor, av stor interesse å kunne skjermen stort antall forbindelser for effekter på Ca2 +-signalering i menneskelig sædceller. På samme måte som bare menneskelig sædceller som gjennomgå acrosome reaksjon på riktig tid og sted kan trenge zona pellucida og befrukte egget46,47, er det også av stor interesse å kunne teste forbindelser for deres evne til å påvirke acrosome reaksjonen i menneskelig sperm. Dette to medium gjennomstrømming screening analyser er beskrevet: 1) en analysen for effekter på Ca2 +-signalering i menneskelige sperm celler og 2) en analysen for evnen til å indusere acrosome reaksjon i menneskelig sædceller.

Analysen 1 er en medium gjennomstrømming Ca2 +-signalisering analysen. Denne fluorescens plate leser-basert teknikk overvåker endringer i fluorescens som en funksjon av tid samtidig i flere brønner. Ca2 +-sensitive fluorescerende farge, Fluo-4 har en Kd for Ca2 +≈ 335 nM og celle-permeant i skjemaet er (acetoxymethyl) ester. Bruker Fluo-4, er det mulig å måle endringer i [Ca2 +]jeg over tid og etter tilsetning av forbindelser av interesse for sædceller. Analysen ble utviklet ved laboratoriet av Timo Strünker i 201113 og har blitt brukt i flere studier til skjermen forbindelser for effekter på Ca2 +-signalisering i menneskelig sperm1,2,3, 4,5. En lignende metode er også brukt til skjermen flere narkotika kandidater48. I tillegg er denne analysen også nyttig for å vurdere farmakologiske modus handling1,2,3,4,5, dose-respons kurver1, 2,3,4,5, konkurrerende1,2, additivity1,2og synergism3 forbindelser av interesse.

Analysen 2 er en medium gjennomstrømming acrosome reaksjon analysen. Denne cytometer-basert teknikk måler mengden levedyktig acrosome reagerte sædceller i en prøve, bruker tre fluorescerende fargestoffer: propidium iodide (PI), FITC-kombinert Lektiner erter sativum (FITC-PSA) og Hoechst-33342. Analysen ble endret fra en lignende flyt cytometri-basert metode av Zoppino et al.49 og har blitt brukt i flere studier6,7. Som for Ca2 +-signalisering analysen, denne acrosome reaksjon analysen kan også brukes til å vurdere dose-respons kurver, hemming, additivity og synergism av forbindelser av interesse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Innsamling og analyse av menneskelig sæd prøver i protokoller følger retningslinjene for etikk for forskning hovedstaden regionen av Danmark. Alle sæd prøver har vært innhentet etter samtykke fra frivillige donorer. Etter levering, var prøvene fullt anonymiseres. Deres ulemper fått hver giver et gebyr på 500 DKK (ca $75 dollar) per prøve. Prøvene ble analysert ved levering og deretter ødelagt umiddelbart etter laboratorieforsøk.

Merk: Middels gjennomstrømningen Ca2 +-signalisering analysen er beskrevet i trinn 4-5 og medium gjennomstrømming acrosome reaksjon analysen i trinn 6-7. Protokollen for å forberede menneskelige tubal væske (HTF+) medium er beskrevet i trinn 1 og rensing av sædceller for analyser er beskrevet i trinn 2-3.

1. forberedelse av menneskelig Tubal væske (HTF+) Medium

Merk: Bruk volumetriske flasker av passende størrelse, en 1 L måle sylinder, et magnetisk rørestang, salter som er oppført i tabell 1 og tabell 2, renset vann, en 0,2 µm pore filter og 50 mL plast rør.

  1. Klargjør lager løsninger av salter i renset vann (tabell 1).
    1. Legger til mengden av salt oppført i tabell 1 til en volumetriske bolle med riktig størrelse, Legg renset vann til litt under ønsket volum og bland godt med en magnetisk rørestang.
    2. Når salt er fullstendig oppløst, fjerne magnet og fyll med renset vann til ønsket endelige volumet.
  2. Overføre lager løsning til en flaske og lagre før bruk.
    Merk: Lager løsninger kan holdt og gjenbrukes for lengre perioder: glukose og HEPES ved 20 ° C og andre lager løsninger ved romtemperatur (RT).
  3. Forberede 1 L HTF+ medium fra lager løsninger (tabell 2).
    1. Kontroller at alle lager løsninger er fullstendig oppløst og godt blandet før bruk.
    2. Legg lagerløsning og salt oppført i tabell 2 en 1 L måle sylinder og Legg renset vann til 900 mL.
    3. Bland godt med en magnetisk rørestang og justere pH til 7.35 med NaOH løsning.
    4. Fjern magneten og legge renset vann til 1000 mL.
  4. Sterilt filtratet HTF+ medium gjennom en 0,2 µm pore filter, aliquot HTF+ medium 50 mL plast rør, og butikken på 4 ° C før bruk.
  5. Bare før du kjører et eksperiment, legge til 165 µL av Na-pyruvate 50 mL aliquot å få en endelig Na-pyruvate konsentrasjon av 0,33 mM.
    Merk: Menneskelige tubal flytende medium kan også fås fra ulike kommersielle leverandører. Når du bruker 4 mM HCO3- medium, kan prøver bli inkubert med lukket lokk i en inkubator uten ekstra CO2 i luften uten store driver i pH. Hvis det finnes en CO2 inkubator, kan tilsvarende mengden CO2 beregnes ved hjelp av Henderson-Hasselbalch formelen og brukt. Hvis bruker 25 mM HCO3- medium, bør prøver være inkubert med åpne lokk i en CO2 inkubator med luft som inneholder en tilsvarende mengde CO2 (avhenger lufttrykk, vanligvis mellom 5-10%) for å unngå en drift i pH. Den nøyaktige mengden CO2 kan beregnes ved hjelp av Henderson-Hasselbalch-formelen.

2. rensing av Motile sædceller via bade-up (figur 1)

Merk: Bruk en ren vid hals plastbeholder for sæden, en inkubator, 50 mL plast rør, en rack for å plassere 50 mL plastikk rør på en vinkel på 45 grader, HTF+ medium (forberedt i trinn 1 eller hentes fra kommersiell leverandør), en sentrifuge og humant serum albumin (HSA).

  1. Få en fersk donert menneskelige sædprøve produsert masturbasjon og utbrøt i en vid hals ren plastbeholder. Bare bruke sæd prøver som oppfyller parametere av WHO laboratory manualen for undersøkelse og behandling av menneskelig sæd.
  2. Inkuber prøven ved 37 ° C i 15-30 min å tillate den å flytende.
  3. Varme opp 50 mL av HTF+ medium med 4 mM HCO3- til 37 ° C.
  4. Sted feilfri 50 mL plast rør i en rack på en vinkel på 45 grader (å forhøye arealet mellom væsker). Bruk 1 t per mL av rå sæd.
  5. Legge til 4 mL forvarmet HTF+ mediet til hver av rør.
  6. Nøye Pipetter 1 mL av flytende sæden nederst på hver rør som inneholder 4 mL forvarmet HTF+. Unngå utgivelsen av luftbobler.
  7. Lukk lokkene og ruge rør ved 37 ° C i 1 time.
  8. Forsiktig Sug opp og overføre så mye av den øvre fraksjon (HTF+ med motile sædceller) som mulig til en ny 15 mL plastrør, mens betalende oppmerksomhet som ingenting fra bunnen brøkdel (sæd med immotile og døde celler) er inkludert. Vanligvis er det trygt å overføre 3,5 mL av den øverste fraksjon, uten å forstyrre bunnen brøken. For å unngå sugekraft turbulens, kuttet av den ytterste 1-2 mm pipette tips i 45° vinkel å få en større åpning.
  9. Fylle opp 15 mL plast røret med HTF+ å vaske celler og sentrifuge røret på 700 x g i 10 min på RT.
  10. Forsiktig Sug opp og fjerne nedbryting og resuspend sperm celle pellet i 2 mL HTF+.
  11. Overføre 20 µL av sæd suspensjon til to små plastikk rør for vurdering av sæd konsentrasjon (se trinn 3).
  12. Fylle opp 15 mL plast røret med HTF+ å vaske celler og sentrifuge røret på 700 x g i 10 min på RT.
  13. Forsiktig Sug opp og fjerne nedbryting og resuspend sperm celle pellets til 10 x 106 celler/mL (basert på celle konsentrasjonen vurdert i trinn 2.11).
    1. For eksperimenter med un capacitated sædceller (rutinemessig Ca2 +-signalisering analysen)
      1. Resuspend celler i HTF+ med 4 mM HCO3-.
      2. Legg til 30 µL av menneskelig serum albumin (HSA) (100 mg/mL) per mL HTF+ å få en endelig konsentrasjon av 3 mg/mL.
      3. Lukk lokkene og ruge for ≥1 h på 37 ° C.
    2. For eksperimenter med capacitated sædceller (acrosome reaksjon analysen)
      1. Resuspend celler i HTF+ med 25 mM HCO3-.
      2. Legg til 30 µL av HSA (100 mg/mL) per mL HTF+ å få en endelig konsentrasjon av 3 mg/mL.
      3. Legge lokk løst og Inkuber ≥3 timer på 37 ° C med tilsvarende mengden CO2 (se trinn 1, vanligvis mellom 5-10% CO2).

3. telling av sædceller

Merk: Sædceller kan enten telles manuelt50 eller bruke et bilde cytometer51, som beskrevet her. Bruk et bilde cytometer, en vortexer, S100 buffer, en SP1-kassett, bade-up renset sædceller (forberedt i trinn 2).

  1. Fortynne en 20 µL aliquot til en faktor på 10, 20, 30, 50 eller 90 S100 buffer med en rund bunn 2 mL tube etter forventet konsentrasjonen (evaluert av manuell inspeksjon av pellets i trinn 2.10). Bruk fortynning som er nærmest konsentrasjonen forventet (dvs. Hvis en konsentrasjon av 15 x 106 sperm celler per mL etter svømme forventes fortynne deretter 20 µL sperm prøven med 380 µL S100 bufferen [fortynningsfaktoren 20]).
  2. Bland godt for 10 s med en vortex mikser på maksimal 700 rpm, dyppe SP1-kassetten i utvalget og trykk hvit stempelet helt ned til leveringstanken en aliquot på utvalget i kassetten.
  3. Åpne bildet cytometer, sett kassetten i skuffen og Kjør analysen Greven av PI farget menneskelige sædceller analysen i henhold til den brukte fortynningsfaktoren (valgt i trinn 3.1).
  4. Gjenta trinn 3.1 3,3 med en annen 20 µL utvalget, med en fortynningsfaktoren nærmest målt konsentrasjonen fra første 20 µL prøven.
  5. Beregne mener sperm celle konsentrasjonen fra to målinger.
  6. Multipliser mener sperm celle konsentrasjon med originale volumet å få den totale sperm celletall (i trinn 2, dette originale volumet er 2 mL).

4. måling av endringer i den gratis intracellulær Ca2 +-konsentrasjon ([Ca2 +]jeg) bruker Ca2 +- fluorimetry (figur 2)

Merk: Bruke en fluorescens plate leser, 384 multi bra plater, Fluo-4 AM, svømme renset sædceller (forberedt i trinn 2), forbindelser rundt som vel som positive og negative kontroller, en automatisk repeater pipette og en 12-kanals pipette.

  1. Forberede en 2 mM Fluo-4 AM lager ved å legge til 22,7 µL av dimethyl sulfoxide (DMSO) ampuller med 50 µg Fluo-4 AM blandingen røret.
  2. Legge til en aliquot av 700 µL svømme gjenopprettede sperm suspensjon (capacitated eller un capacitated som beskrevet i trinn 2) en ny test-rør. 700 µL av sæd prøve er nødvendig for å analysere én rad 24 brønner i 384-microwell plate (brukes til å teste 3 Kontroller og 9 forbindelser i doublets).
  3. Legge til 3,5 µL av Fluo-4 AM lager løsning på 700 µL av sæd suspensjon å få en endelig konsentrasjon av 10 µM Fluo-4 AM.
  4. Inkuber utvalg for 45 min ved 37 ° C, beskyttet mot lyset.
  5. Sentrifuge eksempel på 700 x g i 10 min, Sug opp og kast nedbryting for å fjerne overflødig Fluo-4.
  6. Resuspend farget pellets i HTF+ til 5 x 106 celler/mL (dvs., bruk 2 x volumet av cellen suspensjon tatt i trinn 4.2)
  7. Forberede fortynninger av stoffer og kontroller (kan gjøres i inkubasjonstiden og sentrifugering perioder i trinn 4.4 og 4.5, henholdsvis).
    1. Fortynne forbindelser, samt en negativ kontroll (buffer med kjøretøy) og en positiv kontroll (progesteron) i HTF+. Fortynne forbindelser og kontroller 3 x ønsket endelige konsentrasjonen, som de er fortynnes 1:3 når de legges til sædceller i trinn 4,16.
    2. Plass rør med fortynninger i et stativ med en avstand mellom rør tilsvarer avstanden mellom pipette tips av 12-kanals pipette brukte i trinn 4,16.
  8. Bruke en automatisk repeater Pipetter (24 meter av 50 µL).
    1. Blanding Fluo-4 farget sperm eksempel forsiktig av pipettering hele beløpet opp og ned én gang.
    2. Legge til dele 50 µL 24 brønnene en rad i 384-microwell platen.
  9. Plasser microwell platen i en fluorescens plate leser på 30 ° C og Lukk skuffen.
  10. Velg den riktige protokollen for Fluo-4. Opphisse fluorescens på 480 nm og posten utslipp på 520 nm. Bruk raskest mulig syklus tid med innstillingen.
    Merk: Bruk minst 10 blink per godt og bunnen optikk, hvis mulig.
  11. Velg en brønn i raden og Juster gevinst til et målverdi på 20%.
  12. Starte målingen.
  13. Kontroller grunnlinjen under de første 5 syklusene.
    1. Hvis er fluorescerende avlesning økes eller reduseres over tid, stoppe eksperimentet, justere forsterkningen og starte eksperimentet igjen.
    2. Hvis opprinnelige varierer mye mellom individuelle brønner på rad, enten pipettering i trinn 4.8 er unøyaktig eller utvalget var ikke blandet godt nok før pipettering. Kast eksperimentet.
    3. Hvis det fluorescerende readout er sammenlignbare mellom brønnene i raden og stødig under 5 første sykluser, Fortsett til neste trinn.
  14. Etter 10 sykluser (brukes for grunnlinje), pause eksperimentet.
  15. Løse ut skuffen med microwell platen.
  16. Bruke en 12-kanals pipette (2 meter av 25 µL), raskt legge til 25 µL av forberedt løsninger av forbindelser og kontroller (fra trinn 4.7) 12 godt duplikater (24 wells) en rad. Løsninger vil være fortynnes 1:3, som brønnene inneholder 50 µL av farget sperm prøve.
  17. Fortsette målingen så raskt som mulig (skuff vil automatisk lukke) å huske noen fluorescerende signaler av de ekstra forbindelsene og kontroller. Endringer i fluorescens (ΔF) etter tillegg av forbindelser og kontroller vil nå bli tatt.
  18. Løpe eksperimentet til fluorescerende signaler er spilt inn fra kontrollen positiv og forbindelsene rundt.
  19. Stoppe eksperimentet og eksportere rå fluorescens analysere data i trinn 5.
    Merk: Generelt Fluo-4 AM har blitt brukt som Ca2 +-sensitive fluorophore i analysen, men andre Ca2 +-sensitive fluorophores kan også brukes hvis eksitasjon og utslipp spectra passer med filtre i fluorescens plate leseren. Avhengig av valget av fluorophore, sørg for at gevinsten nivå er satt i en "safe" nivå hvor indusert fluorescerende toppene er innen måling instrumentet. Dette kan testes ved å legge ionomycin til en enkelt brønn på en bestemt gevinst innstilling. Hvis dette indusert et fluorescerende signal over sperregrensen, lavere gevinst og prøv på nytt. Noen bruk Pluronic F-127 for å hjelpe lasting av Fluo-41,13, men det har blitt funnet at dette ikke er nødvendig2. Maksimalt antall rader målt samtidig avhengig av to faktorer. 1) syklustiden av instrumentet: Hvis syklustiden er for lang, indusert toppene i [Ca2 +]jeg kunne være savnet. Måle maksimalt to rader samtidig for å holde syklustiden lav; 2) hastigheten på pipettering i trinn 4,16: bruker 12-kanals pipette, er det mulig å raskt legge til 12 ulike løsninger i 12 like brønnene (24 wells) 1 eller 2 rader (f.eks én rad pre inkubert med kjøretøy og en rad før inkubert med en inhibitor) , uten indusert Ca2 + toppene. Men anbefales det ikke å prøve å legge til 24 ulike løsninger i to rader for samtidig måling, som pipettering tips må skiftes mellom de to sekvensielle pipettering trinnene, der indusert Ca2 + toppene kan bli savnet.

5. analyse av Data fra Ca2 +- fluorimetry

  1. Åpne rå fluorescens dataene innhentet og eksporterte i trinn 4.
  2. Beregne gjennomsnittet fra like brønner. Hvis store forskjeller mellom duplikater, forkaste data fra bestemte brønnene.
  3. Definere planlagte som de 10 første syklusene.
  4. Beregne ΔF/F0 (%) endre fluorescens (ΔF) over tid etter forbindelser kontroller med hensyn til den bety basale fluorescensen (F0) i løpet av de 10 første syklusene (grunnlinje) som prosent.
  5. Hvis bruker dataene for generering av dose-respons kurver, trekk avlesning av negativ kontroll fra andre brønnene, fjerne pipettering gjenstander.

6. måling av Acrosome reaksjon

Merk: Bruke et bilde cytometer, en inkubator, fluorescerende fargestoffer: PI FITC-PSA og Hoechst-33342, forbindelser interesse i tillegg til positive og negative kontroller, en immobilizing løsning som inneholder 0.6 M NaHCO3 og 0,37% (v/v) formaldehyd i destillert vann, en A2 lysbildet og capacitated svømme renset sperm celler (forberedt i trinn 2).

  1. Forberede en flekker løsning inneholder PI (5 µg/mL), FITC-PSA (50 µg/mL) og Hoechst-33342 (100 µg/mL) i HTF+, bland det godt med en vortex mikser og beskytte den fra lys til bruk.
  2. Utarbeide løsninger av forbindelser og kontroller på 10 x ønsket endelige konsentrasjonen, som de er fortynnes 1:10 i trinn 6.5. Alltid inkludere en negativ (vehicle) kontroll og to positiv kontroller: progesteron 10 µM siste konsentrasjon og ionomycin 2 µM siste konsentrasjon.
  3. Overføre dele 240 µL capacitated sperm celler (forberedt i trinn 2) til plast rør.
  4. Legge til 30 µL av flekker løsning til hver tube. Siste konsentrasjon av flekker blir: 0,5 µg/mL PI, 5 µg/mL FITC-PSA og 10 µg/mL Hoechst-33342.
  5. Legge til 30 µL av løsninger kontroller eller forbindelser til hver tube (1:10 fortynning).
  6. Bland prøvene forsiktig ved pipettering opp og ned et par ganger eller mild vortexing. På grunn av mekanisk stress, unngå overdreven miksing.
  7. Ruge på 37 ° C i 30 min.
  8. Klargjør nye plast rør med 100 µL av en immobilizing løsning som inneholder 0.6 M NaHCO3 og 0,37% (v/v) formaldehyd i destillert vann, ett per reagensglasset.
  9. Etter inkubasjon bland prøvene godt pipettering og legge 50 µL av prøven til en rør med 100 µL av immobilizing løsning.
  10. Før du legger kamrene en A2 lysbilde, bland prøven godt pipettering. Fyll kamrene nøye med ca 30 µL uten luftbobler.
    Merk: Under incubation, den motile sædceller pleier å samle. Cellen klumper kan forstyrre målinger (selv om de er ekskludert). Derfor er en grundig blande av pipettering etter inkubasjon svært viktig. Likeledes kan luftbobler i kamrene forstyrre målinger. Derfor fylle kammeret sakte og endre pipette hvis kantene av væsken skal møte og opprette en luftboble.
  11. Plasser lastet lysbildet på skuffen for bildet cytometer og Lukk skuffen.
  12. Velg FlexiCyte-protokollen og trykk på Kjør.
    1. Velg følgende innstillinger for FlexiCyte-protokollen: antall analytisk kanaler: 2; Maskering kanal: UV (LED365), dette er kanalen brukes for bildesegmentering; Kanal 1: Blå (LED475), eksponeringstid 3000 ms, utslipp filter 560/35; Kanal 2: Green (LED530), eksponering tid 500 ms, utslipp filter 675/75; Minimum antall analysert celler: 5000; Utelate aggregert celler: Ja.
  13. Gjenta trinn 6,9-6.12 til alle prøvene blitt målt.

7. analyse av Data fra bildet cytometri

  1. Åpne data innhentet i trinn 6.
  2. Opprett to følgende tomter å vurdere målene.
    1. Opprette et spredningsdiagram Hoechst-33342 intensitet vs Hoechst-33342 området på biexponential skalaer. Denne handlingen kan brukes til gate ut Hoechst-33342 positive objekter som enten for lite eller for stort til å være menneskelig sædceller.
    2. Opprette et spredningsdiagram FITC-PSA intensitet og PI intensitet på biexponential skalaer. Denne handlingen kan brukes til esler mengden acrosome reagerte sædceller ved bruk av en kvadrant gate som skiller de fire gruppene på tomten (Figur 3): 1) en PI positive og FITC-PSA positiv gruppe: Acrosome reagerte uholdbare sperm celler. 2) en PI negative og positive FITC-PSA-gruppen: Acrosome reagerte levedyktig sperm celler. 3) en PI positiv og FITC-PSA negative gruppe: Acrosome intakt uholdbare sperm celler. og 4) en PI negative og FITC-PSA negative gruppe: Acrosome intakt levedyktig sædceller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Representant resultater fra et eksperiment tester effekten av 4 forbindelser (A, B, C og D) sammen med en positiv (progesteron) og negative (buffer) kontroll på [Ca2 +]jeg i menneskelig sæden med medium gjennomstrømming Ca:2 +-signalisering analysen kan ses i figur 4a. Figur 4bvises en dose respons kurve av progesteron, som var avledet fra toppen ΔF/F0 (%) data av serielt utvannet konsentrasjoner av progesteron, testet i et annet eksperiment med medium gjennomstrømming Ca:2 +-signalisering analysen. Analyse av data fra Ca2 +-signalisering analysen er forklart i trinn 5. Representant resultater fra et eksperiment tester induksjon av acrosome reaksjon i capacitated menneskelige sperm celler ved hjelp av en negativ kontroll (DMSO) eller to positiv kontrollene (progesteron og ionomycin) på medium gjennomstrømming acrosome reaksjon analysen kan sees i øvre panel i Figur 3. Kvadrant gated scatter tomter fra 3 teste forholdene er sett. Analyse av acrosome reaksjonen dataene er forklart i trinn 7.

Tabell 1: lager løsninger for utarbeidelse av HTF + . Lager løsninger kan holdt og gjenbrukes for lengre perioder, glukose og HEPES ved 20 ° C og andre lager løsninger ved romtemperatur. Sikre at alle løsninger er fullstendig oppløst og godt blandet før bruk.

Tabell 2: utarbeidelse av HTF + med 4 eller 25 mM HCO 3 - fra lager løsninger av salter (forberedt i tabell 1). Na-laktat legges til som sirup, 60% (w/w), eller pulver. NaHCO3 legges som pulver.

Figure 1
Figur 1: svømme rensing av motile menneskelige sædceller. Venstre: Tube med HTF+ medium og en aliquot av flytende sædprøve pipetted under HTF+ medium. Høyre: Etter 1 h av svømme opp på 37 ° C, motile sædceller har svømt opp til HTF+ medium. Immotile og døde sædceller samt sperm celler forblir i sæd under HTF+ medium. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Diagram av medium gjennomstrømming Ca:2 +-signalisering analysen. (en) sædceller er lastet med en Ca2 +-sensitive fluorophore, vasket og dele er belagt fordelt av en 384-vel plate. (b) 384-vel platen plasseres i en fluorescens plate leser på 30 ° C. (c) fluorescens registreres før og etter forbindelser, positiv kontroll (progesteron) og negative kontroll (buffer med kjøretøy). Readouts i ΔF/F0 (%) etter tillegg (piler) av negative og positive er illustrert i bunnen av (c). Illustrasjon brukt med tillatelse fra Christian Schiffer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: vurdering av acrosome reaksjon med bilde cytometri. (Topp panel) Kvadrant gated scatter tomter fra en negativ kjøretøy kontroll (DMSO) og positiv kontroller progesteron (Prog, 10 µM) og ionomycin (Iono, 2 µM). En økning i celler i den nederste høyre kvadranten (acrosome reagerte levedyktige cellers) vises når sammenligne positiv kontrollene DMSO kontrollen. (Bunnpanel) Mikroskopiske bilder av fluorescently merket sædceller, inkludert celler fra alle fire grupper. BF = lyse feltet Hoechst = Hoechst-33342, PSA = erter Sativum Agglutinin, PI = Propidium Iodide. Skala bar = 10 µm. Dette tallet er endret fra Egeberg Palme et al. 20187. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: Eksempel på data fra Ca2 +- fluorimetry. (en) endringer i [Ca2 +]jeg indusert av negativ kontroll, progesteron og sammensatte A, B, C og D. (b) progesteron dose-respons kurve. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Det medium gjennomstrømming Ca2 + signalering analysen er basert på målinger av fluorescens fra enkelt microwells som inneholder 250 000 sædceller. De fangede signalet er gjennomsnitt fra alle personlige sædceller i brønnen. Analysen dermed gir ingen romlig informasjon om hvor i den sperm celle [Ca2 +]jeg er endret, i hvor stor del av den sædceller trer en endring i [Ca2 +]i stedet, eller hvordan heterogene svaret er mellom de enkelte cellene. For å få informasjon, må eksperimenter med enkeltcelle oppløsning (f.eks, som beskrevet i50,52) brukes. En annen ulempe av teknikken er timelige oppløsning, som er på sekunder. Selv om 50 µL sperm prøvene er godt blandet når 25 legges µL av løsninger, målene kan først startes etter skuffen med flere godt platen er tilbake i fluorescens plate leseren. Andre teknikker må brukes for å få høyere midlertidig løsning, (f.eks en stoppet flyt fluorimetry13,50). Fordelen med medium gjennomstrømming Ca:2 +-signalisering analysen, sammenlignet med én celle eller én-brønnen er at samtidig måling av flere microwells med en microplate leseren tillater for rask og enkel testing av flere forbindelser side ved side med positive og negative kontroller (figur 4)1,2, lett generasjon av dose-respons kurver personlige forbindelser (Figur 4)1,2,3 , 4 , 5, vurdering av additivity1,2 og synergism3 for to eller flere forbindelser og studier av modusen for handling av forbindelser skjønt konkurrerende eksperimenter og bruk av bestemte farmakologiske hemmere (f.eks CatSper hemmere1,2,3,4,5). Videre, ved å endre fluorophore, analysen kan brukes til å undersøke andre intracellulær endringer (f.eks pHi1,2). Endelig, mer enn én fluorophore kan brukes samtidig samtidig måle flere intracellulær endringer. I fremtiden, det medium gjennomstrømming Ca2 +-signalisering analysen kan brukes til skjermen forbindelser av interesse for effekter på Ca2 +-signalering i menneskelig sperm (f.eks miljømessige kjemikalier eller narkotika kandidater) å undersøke ugunstig effekter på menneskelig sperm celle funksjon eller for å undersøke en mulig rolle som en pille.

Medium gjennomstrømming acrosome reaksjon analysen er basert på bildet cytometri, som utgjør en tiltalende erstatning for å vurdere menneskelige acrosome reaksjon i forhold til manuell vurdering bruker fluorescens mikroskop. Farging bruksmønstre intakt eller reagerer/reagert acrosomes er ikke alltid klart, og en stor intra individuell variasjon kan være konsekvensen bestemmelsene. Med bildet cytometri, er bildene kjøpt og analysert automatisk. Maskering kanalen, i dette tilfellet Hoechst-33342, definerer celler og bare fluorescerende signaler fra disse bestemte områder er inkludert i dataanalyse. Derfor er farging av enucleated organer som inneholder gjenværende cytoplasma ikke inkludert i dataanalyse. Videre er opptellingsstatistikk overordnet fluorescens mikroskopi. Du teller 200 celler gjennom okulars av mikroskopet er en tidkrevende og utfordrende oppgave, men med bilde cytometri analyse av minst 5 000 celler tar mindre enn et par minutter. Men på grunn av lav forstørrelsen av bildet cytometer, muligheten til å vurdere målene er tapt og en må bringe farget prøven til fluorescens mikroskopet. Derfor er inkludering av kontrollene av ytterste betydning å validere målinger. Hvis kontrollene ikke reagerer som forventet, bør resultatene fra et eksperiment forkastes. Protokollen beskrevet her var inspirert av arbeidet gjort av Zoppino et al.49, som evalueres menneskelige acrosome reaksjon av flowcytometri. De videre beskrevet av sanntid fluorescens mikroskopi hvordan PSA angir acrosomal rommet når membran-fusion porene vises på induksjon av acrosome reaksjon. En gang inne det acrosomal rommet, PSA tresko og danner et merke stabile i lengre perioder. Ingen fiksering eller permeabilization brukes i protokollen, og derfor tolkningen av resultatet er klart: PSA i acrosomal rommet for en levedyktig sperm celle er lik acrosome reaksjon. Som for Ca2 +-signalisering analysen, acrosome reaksjon analysen kan også brukes til å vurdere dose-respons kurver, hemming, additivity og synergism av forbindelser av interesse. I fremtiden, kan medium gjennomstrømming acrosome reaksjon analysen også brukes til skjermen forbindelser av interesse for effekter på acrosome reaksjon menneskelige sperm (f.eks miljømessige kjemikalier eller narkotika kandidater) for å undersøke de potensielle negative påvirkninger på denne sperm celle funksjon eller for å undersøke en mulig rolle som en pille.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne ønsker å erkjenne laboratoriet av Timo Strünker tilsyn AR og DLE under sitt opphold på laboratoriet sitt. Videre ønsker vi å takke våre kolleger på avdelingen av vekst og reproduksjon, København universitetssykehus, Rigshospitalet for deres hjelp med å sette opp disse to analyser. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra Innovation fondet Danmark (grant tall 005-2010-3 og 14-2013-4).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 µm pore filter Thermo Fisher Scientific, USA 296-4545
1 L measuring cylinder Thermo Fisher Scientific, USA 3662-1000
1, 4, and 2 mL plastic tubes Eppendorf, Germany 30120086 and 0030120094
12-channel pipette Eppendorf, Germany 4861000813
384 multi-well plates Greiner Bio-One, Germany 781096
15 and 50 mL platic tubes Eppendorf, Germany 0030122151 and 30122178
A2-slide ChemoMetec, Denmark 942-0001
Automatic repeater pipette Eppendorf, Germany 4987000010
CaCl2
Centrifuge
Clean wide-mouthed plastic container for semen sample
Dimethyl sulfoxide (DMSO)
FITC-coupled lectin of Pisum sativum (FITC-PSA) Sigma-Aldrich, Germany L0770
Fluo-4 AM Thermo Fisher Scientific, USA F14201
FLUOstar OMEGA fluorescence microplate reader BMG Labtech, Germany
Glucose anhydrous
HEPES
Hoechst-33342 ChemoMetec, Denmark 910-3015
Human serum albumin (HSA) Irvine Scientific 9988 For addition to HTF+
Immobilizing solution containing 0.6 M NaHCO3 and 0.37% (v/v) formaldehyde in distilled water
Incubator
KCl
KH2PO4
Magnetic stirrer
MgSO4
Na-Lactate
NaCl
NaHCO3
NC-3000 image cytometer ChemoMetec, Denmark 970-3003
Pipettes and piptting tips
propidium iodide (PI) ChemoMetec, Denmark 910-3002
Purified water
Rack for placing 50 mL plastic tubes in 45° angle
S100 buffer ChemoMetec, Denmark 910-0101
SP1-cassette ChemoMetec, Denmark 941-0006
Volumetric flasks of appropriate sizes
Vortexer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schiffer, C., et al. Direct action of endocrine disrupting chemicals on human sperm. EMBO reports. (2014).
  2. Rehfeld, A., Dissing, S., Skakkebæk, N. E. Chemical UV Filters Mimic the Effect of Progesterone on Ca(2+) Signaling in Human Sperm Cells. Endocrinology. 157, (11), 4297-4308 (2016).
  3. Brenker, C., et al. Synergistic activation of CatSper Ca2+ channels in human sperm by oviductal ligands and endocrine disrupting chemicals. Human Reproduction (Oxford, England). 33, (10), 1915-1923 (2018).
  4. Brenker, C., et al. The CatSper channel: a polymodal chemosensor in human sperm. The EMBO Journal. 31, (7), 1654-1665 (2012).
  5. Brenker, C., et al. Action of steroids and plant triterpenoids on CatSper Ca2+ channels in human sperm. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, (3), E344-E346 (2018).
  6. Rehfeld, A., et al. Chemical UV filters can affect human sperm function in a progesterone-like manner. Endocrine Connections. (2017).
  7. Egeberg Palme, D. L., et al. Viable acrosome-intact human spermatozoa in the ejaculate as a marker of semen quality and fertility status. Human Reproduction. Oxford, England. (2018).
  8. Publicover, S., Harper, C. V., Barratt, C. [Ca2+]i signalling in sperm--making the most of what you've got. Nature Cell Biology. 9, (3), 235-242 (2007).
  9. Publicover, S. J., et al. Ca2+ signalling in the control of motility and guidance in mammalian sperm. Frontiers in Bioscience. 13, 5623-5637 (2008).
  10. Publicover, S., Harper, C. V., Barratt, C. [Ca2+]i signalling in sperm--making the most of what you've got. Nature Cell Biology. 9, (3), 235-242 (2007).
  11. Lishko, P. V., et al. The control of male fertility by spermatozoan ion channels. Annual Review Of Physiology. 74, 453-475 (2012).
  12. Morris, J., et al. Cell-penetrating peptides, targeting the regulation of store-operated channels, slow decay of the progesterone-induced [Ca2+]i signal in human sperm. Molecular Human Reproduction. 21, (7), 563-570 (2015).
  13. Strünker, T., et al. The CatSper channel mediates progesterone-induced Ca2+ influx in human sperm. Nature. 471, (7338), 382-386 (2011).
  14. Lishko, P. V., Botchkina, I. L., Kirichok, Y. Progesterone activates the principal Ca2+ channel of human sperm. Nature. 471, (7338), 387-391 (2011).
  15. Miller, M. R., et al. Unconventional endocannabinoid signaling governs sperm activation via the sex hormone progesterone. Science (New York, N.Y.). 352, (6285), 555-559 (2016).
  16. Revelli, A., et al. Follicular fluid content and oocyte quality: from single biochemical markers to metabolomics. Reproductive Biology And Endocrinology RB&E. 7, 40 (2009).
  17. Lyons, R. A., Saridogan, E., Djahanbakhch, O. The effect of ovarian follicular fluid and peritoneal fluid on Fallopian tube ciliary beat frequency. Human Reproduction. 21, (1), Oxford, England. 52-56 (2006).
  18. Eisenbach, M., Giojalas, L. C. Sperm guidance in mammals - an unpaved road to the egg. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 7, (4), 276-285 (2006).
  19. Alasmari, W., et al. The clinical significance of calcium-signalling pathways mediating human sperm hyperactivation. Human Reproduction. 28, (4), Oxford, England. 866-876 (2013).
  20. Alasmari, W., et al. Ca2+ signals generated by CatSper and Ca2+ stores regulate different behaviors in human sperm. The Journal of Biological Chemistry. 288, (9), 6248-6258 (2013).
  21. Tamburrino, L., et al. The CatSper calcium channel in human sperm: relation with motility and involvement in progesterone-induced acrosome reaction. Human Reproduction. 29, (3), Oxford, England. 418-428 (2014).
  22. Krausz, C., et al. Intracellular calcium increase and acrosome reaction in response to progesterone in human spermatozoa are correlated with in-vitro fertilization. Human Reproduction. 10, (1), Oxford, England. 120-124 (1995).
  23. Oehninger, S., et al. Defective calcium influx and acrosome reaction (spontaneous and progesterone-induced) in spermatozoa of infertile men with severe teratozoospermia. Fertility and Sterility. 61, (2), 349-354 (1994).
  24. Shimizu, Y., Nord, E. P., Bronson, R. A. Progesterone-evoked increases in sperm [Ca2+]i correlate with the egg penetrating ability of sperm from fertile but not infertile men. Fertility and Sterility. 60, (3), 526-532 (1993).
  25. Falsetti, C., et al. Decreased responsiveness to progesterone of spermatozoa in oligozoospermic patients. Journal of Andrology. 14, (1), 17-22 (1993).
  26. Williams, H. L., et al. Specific loss of CatSper function is sufficient to compromise fertilizing capacity of human spermatozoa. Human Reproduction. 30, (12), Oxford, England. 2737-2746 (2015).
  27. Forti, G., et al. Effects of progesterone on human spermatozoa: clinical implications. Annales d'Endocrinologie. 60, (2), 107-110 (1999).
  28. Krausz, C., et al. Two functional assays of sperm responsiveness to progesterone and their predictive values in in-vitro fertilization. Human Reproduction. 11, (8), Oxford, England. 1661-1667 (1996).
  29. Kelly, M. C., et al. Single-cell analysis of [Ca2+]i signalling in sub-fertile men: characteristics and relation to fertilization outcome. Human Reproduction. 33, (6), Oxford, England. 1023-1033 (2018).
  30. Brown, S. G., et al. Homozygous in-frame deletion in CATSPERE in a man producing spermatozoa with loss of CatSper function and compromised fertilizing capacity. Human Reproduction. 33, (10), Oxford, England. 1812-1816 (2018).
  31. Avenarius, M. R., et al. Human male infertility caused by mutations in the CATSPER1 channel protein. American Journal of Human Genetics. 84, (4), 505-510 (2009).
  32. Smith, J. F., et al. Disruption of the principal, progesterone-activated sperm Ca2+ channel in a CatSper2-deficient infertile patient. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, (17), 6823-6828 (2013).
  33. Hildebrand, M. S., et al. Genetic male infertility and mutation of CATSPER ion channels. European Journal of Human Genetics. 18, (11), 1178-1184 (2010).
  34. Avidan, N., et al. CATSPER2, a human autosomal nonsyndromic male infertility gene. European Journal of Human Genetic. 11, (7), 497-502 (2003).
  35. Zhang, Y., et al. Sensorineural deafness and male infertility: a contiguous gene deletion syndrome. BMJ Case Reports. 2009, (2009).
  36. Jaiswal, D., Singh, V., Dwivedi, U. S., Trivedi, S., Singh, K. Chromosome microarray analysis: a case report of infertile brothers with CATSPER gene deletion. Gene. 542, (2), 263-265 (2014).
  37. Visconti, P. E., Krapf, D., de la Vega-Beltrán, J. L., Acevedo, J. J., Darszon, A. Ion channels, phosphorylation and mammalian sperm capacitation. Asian Journal of Andrology. 13, (3), 395-405 (2011).
  38. Wassarman, P. M., Jovine, L., Litscher, E. S. A profile of fertilization in mammals. Nature Cell Biology. 3, (2), E59-E64 (2001).
  39. Leahy, T., Gadella, B. M. Sperm surface changes and physiological consequences induced by sperm handling and storage. Reproduction. 142, (6), Cambridge, England. 759-778 (2011).
  40. Suarez, S. S. Control of hyperactivation in sperm. Human Reproduction Update. 14, (6), 647-657 (2008).
  41. Liu, D. Y., Baker, H. W. Inhibition of acrosin activity with a trypsin inhibitor blocks human sperm penetration of the zona pellucida. Biology of Reproduction. 48, (2), 340-348 (1993).
  42. Okabe, M. The cell biology of mammalian fertilization. Development. 140, (22), Cambridge, England. 4471-4479 (2013).
  43. Inoue, N., Satouh, Y., Ikawa, M., Okabe, M., Yanagimachi, R. Acrosome-reacted mouse spermatozoa recovered from the perivitelline space can fertilize other eggs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, (50), 20008-20011 (2011).
  44. Jin, M., et al. Most fertilizing mouse spermatozoa begin their acrosome reaction before contact with the zona pellucida during in vitro fertilization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, (12), 4892-4896 (2011).
  45. Hirohashi, N., Yanagimachi, R. Sperm acrosome reaction: its site and role in fertilization. Biology of Reproduction. 99, (1), 127-133 (2018).
  46. Liu, D. Y., Garrett, C., Baker, H. W. G. Acrosome-reacted human sperm in insemination medium do not bind to the zona pellucida of human oocytes. International Journal of Andrology. 29, (4), 475-481 (2006).
  47. Overstreet, J. W., Hembree, W. C. Penetration of the zona pellucida of nonliving human oocytes by human spermatozoa in vitro. Fertility and Sterility. 27, (7), 815-831 (1976).
  48. Martins da Silva, S. J., et al. Drug discovery for male subfertility using high-throughput screening: a new approach to an unsolved problem. Human Reproduction. Oxford, England. 1-11 (2017).
  49. Zoppino, F. C. M., Halón, N. D., Bustos, M. A., Pavarotti, M. A., Mayorga, L. S. Recording and sorting live human sperm undergoing acrosome reaction. Fertility and Sterility. 97, (6), 1309-1315 (2012).
  50. Mata-Martínez, E., et al. Measuring intracellular Ca2+ changes in human sperm using four techniques: conventional fluorometry, stopped flow fluorometry, flow cytometry and single cell imaging. Journal of Visualized Experiments. (75), e50344 (2013).
  51. Egeberg, D. L., et al. Image cytometer method for automated assessment of human spermatozoa concentration. Andrology. 1, (4), 615-623 (2013).
  52. Nash, K., et al. Techniques for imaging Ca2+ signaling in human sperm. Journal of Visualized Experiments. (40), (2010).
Medium gjennomstrømming Screening analyser for vurdering av virkningene på Ca<sup>2 +</sup>-signalisering og Acrosome reaksjon i menneskelig sæden
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rehfeld, A., Egeberg Palme, D. L., Almstrup, K., Juul, A., Skakkebaek, N. E. Medium-throughput Screening Assays for Assessment of Effects on Ca2+-Signaling and Acrosome Reaction in Human Sperm. J. Vis. Exp. (145), e59212, doi:10.3791/59212 (2019).More

Rehfeld, A., Egeberg Palme, D. L., Almstrup, K., Juul, A., Skakkebaek, N. E. Medium-throughput Screening Assays for Assessment of Effects on Ca2+-Signaling and Acrosome Reaction in Human Sperm. J. Vis. Exp. (145), e59212, doi:10.3791/59212 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter