Summary

Medium gjennomstrømming Screening analyser for vurdering av virkningene på Ca2 +-signalisering og Acrosome reaksjon i menneskelig sæden

Published: March 01, 2019
doi:

Summary

Her, to medium gjennomstrømming analyser for vurdering av virkningene på Ca2 +-signalisering og acrosome reaksjon i menneskelig sperm er beskrevet. Disse analyser kan brukes til å raskt og enkelt skjermen store mengder forbindelser for effekter på Ca2 +-signalisering og acrosome reaksjon i menneskelig sperm.

Abstract

Ca2 +-signalisering er viktig for normal sperm celle funksjon og mannlig fertilitet. Tilsvarende er acrosome reaksjonen avgjørende for evnen til en menneskelig sperm celle å trenge zona pellucida og befrukte egget. Derfor er av stor interesse å teste forbindelser (f.eks miljømessige kjemikalier eller narkotika kandidater) for deres effekt på Ca2 +-signalisering og acrosome reaksjon i menneskelig sæden å undersøke mulige negative effekter på menneskelig sperm celle funksjon eller undersøke en mulig rolle som en pille. Her to middels gjennomstrømming analyser er beskrevet: 1) en fluorescens-baserte analysen for vurdering av virkningene på Ca2 +-signalering i menneskelig sperm, og 2) et bilde cytometric analysen for vurdering av acrosome reaksjonen i menneskelig sperm. Disse analyser kan brukes til skjermen et stort antall forbindelser for effekter på Ca2 +-signalisering og acrosome reaksjon i menneskelig sperm. Videre kan analyser brukes å generere svært spesifikke dose-respons kurver av personlige forbindelser, fastslår potensielle additivity/synergism for to eller flere forbindelser, og å studere farmakologiske virkemåte gjennom konkurrerende Eksperimenter med CatSper hemmere.

Introduction

Formålet med de to analyser beskrevet her er å undersøke virkningene på Ca2 +-signalisering og acrosome reaksjon i menneskelig sæd, som har vært vist flere forbindelser i flere publikasjoner bruke disse søk1,2, 3,4,5,6,7. Ca2 +-signalisering og acrosome reaksjonen er både viktig for normal menneskelig sperm celle funksjon og mannlig fertilitet.

Det overordnede målet med en menneskelig sperm celle er å befrukte egget. For å kunne lykkes og naturlig befrukte egget, må funksjonene i sperm cellen være regulert tett under reisen av sperm cellen til den kvinnelige skjede8,9. Mange av funksjonene sperm celle er regulert via en intracellulær Ca2 +-konsentrasjon [Ca2 +]jeg (f.eks sperm motilitet og chemotaxis acrosome reaksjon)10. En modning prosess som kalles capacitation, som gjengir sperm celle kan gjødslende egget, er også delvis regulert av [Ca2 +]jeg10. Ca2 +-ekstrudering Ca2 +-ATPase pumper11 opprettholde en ca 20.000 fold Ca2 +-gradient over menneskelige sperm celle membran, med en hvile [Ca2 +]jeg av 50-100 nM. Hvis Ca2 + tillates å krysse cellemembranen (for eksempel gjennom åpningen av Ca2 +-kanaler), en stor tilstrømning av Ca2 + oppstår, gir opphav til en høyde på [Ca2 +]jeg. Imidlertid sperm celle også bærer intracellulær Ca2 +-butikker, som kan frigi Ca2 + og, derfor også gi stige rettighetsutvidelse [Ca2 +]jeg12. Interessant, alle kanal-mediert Ca2 +-tilstrømning av menneskelig sædceller har så langt blitt funnet for å skje via CatSper (kattenioniske kanal SpeRM), som bare er uttrykt i sædceller11. I menneskelige sperm celler, CatSper utvikling av endogene ligander progesteron og prostaglandiner gjennom forskjellige ligand binding nettsteder13,14,15, fører til en rask Ca2 +-tilstrømningen til sperm cellen. To viktigste kildene i nærheten av egget gir høye nivåer av disse endogene ligander. En er follikulær væske som inneholder høye nivåer av progesteron16. Follicular væsken slippes fra modne follikler med egg på eggløsning og mikser med væsken innenfor de oviducts17. Andre hovedkilden er cumulus cellene som omgir egg og slipp høyt nivå av progesteron og prostaglandiner. Den progesteron-indusert Ca2 +-tilstrømning av sædceller har vist seg å megle chemotaxis mot egg9,18, kontrollere sperm motilitet19,20 og stimulere til acrosome reaksjon21. Følge av disse personlige [Ca2 +]jeg-regulert sperm funksjonene i riktig rekkefølge og på riktig tidspunkt er avgjørende for befruktning av egg8. I tråd med dette, en suboptimal progesteron-indusert Ca2 +-tilstrømningen er funnet å bli assosiert med redusert mannlig fertilitet22,23,24,25,26 ,27,28,29 og funksjonelle CatSper er avgjørende for mannlig fertilitet26,30,31,32, 33,34,35,36.

Som sædceller nå egget, en hendelsessekvens må skje for befruktning oppstår: 1) sædceller må trenge omkringliggende cumulus celle laget, 2) binde til zona pellucida, 3) exocytose acrosomal innhold, den såkalte acrosome-reaksjonen 37, 4) trenge zona pellucida og 5) sikring med egg membranen å fullføre befruktning38. For å kunne gå gjennom disse trinnene og befrukte egget, må sperm cellen først gjennomgå capacitation11, som begynner som sædceller forlate den seminal væsken som inneholder “decapacitating” faktorer39 og svømme i væsker av kvinnelige skjede med høye nivåer av bikarbonat og albumin37. Capacitation gjengir sædceller kunne gjennomgå hyperactivation, en form for motilitet med energisk juling av flagell og acrosome reaksjon37. Hyperactivated motilitet kreves for penetrasjon av zona pellucida40, og acrosome inneholder ulike hydrolytisk enzymer som hjelper denne penetrasjon prosessen41. I tillegg gjengir acrosome reaksjonen sædceller i stand til å smelte sammen med egg ved å utsette bestemt membran proteiner på sperm overflaten nødvendig for sperm-egg blanding42. Følgelig evnen til å gjennomgå hyperactivation og acrosome reaksjon er både nødvendig for vellykket befruktning av egg40,42. I motsetning til hva har blitt sett i musen sædceller43,44,45, kan bare menneskelig sædceller som er acrosome-intakt binde til zona pellucida46. Når den menneskelige sædceller er bundet til zona pellucida måtte de gjennomgå acrosome reaksjon både til å trenge den zona pellucida41 og å utsette bestemt membran proteiner som trengs for fusjon med egg38. Tidspunktet for acrosome reaksjonen i menneskelig sperm er derfor avgjørende for befruktning oppstår.

Som beskrevet ovenfor, Ca2 +-signalisering er viktig for normal sperm celle funksjon8, og det er derfor, av stor interesse å kunne skjermen stort antall forbindelser for effekter på Ca2 +-signalering i menneskelig sædceller. På samme måte som bare menneskelig sædceller som gjennomgå acrosome reaksjon på riktig tid og sted kan trenge zona pellucida og befrukte egget46,47, er det også av stor interesse å kunne teste forbindelser for deres evne til å påvirke acrosome reaksjonen i menneskelig sperm. Dette to medium gjennomstrømming screening analyser er beskrevet: 1) en analysen for effekter på Ca2 +-signalering i menneskelige sperm celler og 2) en analysen for evnen til å indusere acrosome reaksjon i menneskelig sædceller.

Analysen 1 er en medium gjennomstrømming Ca2 +-signalisering analysen. Denne fluorescens plate leser-basert teknikk overvåker endringer i fluorescens som en funksjon av tid samtidig i flere brønner. Ca2 +-sensitive fluorescerende farge, Fluo-4 har en Kd for Ca2 +≈ 335 nM og celle-permeant i skjemaet er (acetoxymethyl) ester. Bruker Fluo-4, er det mulig å måle endringer i [Ca2 +]jeg over tid og etter tilsetning av forbindelser av interesse for sædceller. Analysen ble utviklet ved laboratoriet av Timo Strünker i 201113 og har blitt brukt i flere studier til skjermen forbindelser for effekter på Ca2 +-signalisering i menneskelig sperm1,2,3, 4,5. En lignende metode er også brukt til skjermen flere narkotika kandidater48. I tillegg er denne analysen også nyttig for å vurdere farmakologiske modus handling1,2,3,4,5, dose-respons kurver1, 2,3,4,5, konkurrerende1,2, additivity1,2og synergism3 forbindelser av interesse.

Analysen 2 er en medium gjennomstrømming acrosome reaksjon analysen. Denne cytometer-basert teknikk måler mengden levedyktig acrosome reagerte sædceller i en prøve, bruker tre fluorescerende fargestoffer: propidium iodide (PI), FITC-kombinert Lektiner erter sativum (FITC-PSA) og Hoechst-33342. Analysen ble endret fra en lignende flyt cytometri-basert metode av Zoppino et al.49 og har blitt brukt i flere studier6,7. Som for Ca2 +-signalisering analysen, denne acrosome reaksjon analysen kan også brukes til å vurdere dose-respons kurver, hemming, additivity og synergism av forbindelser av interesse.

Protocol

Innsamling og analyse av menneskelig sæd prøver i protokoller følger retningslinjene for etikk for forskning hovedstaden regionen av Danmark. Alle sæd prøver har vært innhentet etter samtykke fra frivillige donorer. Etter levering, var prøvene fullt anonymiseres. Deres ulemper fått hver giver et gebyr på 500 DKK (ca $75 dollar) per prøve. Prøvene ble analysert ved levering og deretter ødelagt umiddelbart etter laboratorieforsøk. Merk: Middels gjennomstrømningen Ca2 +-s…

Representative Results

Representant resultater fra et eksperiment tester effekten av 4 forbindelser (A, B, C og D) sammen med en positiv (progesteron) og negative (buffer) kontroll på [Ca2 +]jeg i menneskelig sæden med medium gjennomstrømming Ca:2 +-signalisering analysen kan ses i figur 4a. Figur 4bvises en dose respons kurve av progesteron, som var avledet fra toppen ΔF/F0 (%) data av serielt utvannet k…

Discussion

Det medium gjennomstrømming Ca2 + signalering analysen er basert på målinger av fluorescens fra enkelt microwells som inneholder 250 000 sædceller. De fangede signalet er gjennomsnitt fra alle personlige sædceller i brønnen. Analysen dermed gir ingen romlig informasjon om hvor i den sperm celle [Ca2 +]jeg er endret, i hvor stor del av den sædceller trer en endring i [Ca2 +]i stedet, eller hvordan heterogene svaret er mellom de enkelte cellene. For å få infor…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Forfatterne ønsker å erkjenne laboratoriet av Timo Strünker tilsyn AR og DLE under sitt opphold på laboratoriet sitt. Videre ønsker vi å takke våre kolleger på avdelingen av vekst og reproduksjon, København universitetssykehus, Rigshospitalet for deres hjelp med å sette opp disse to analyser. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra Innovation fondet Danmark (grant tall 005-2010-3 og 14-2013-4).

Materials

0.2 µm pore filter Thermo Fisher Scientific, USA 296-4545
1 L measuring cylinder Thermo Fisher Scientific, USA 3662-1000
1,4 and 2 mL plastic tubes Eppendorf, Germany 30120086 and 0030120094
12-channel pipette Eppendorf, Germany 4861000813
384 multi-well plates Greiner Bio-One, Germany 781096
15 and 50 mL platic tubes Eppendorf, Germany 0030122151 and 30122178
A2-slide ChemoMetec, Denmark 942-0001
Automatic repeater pipette Eppendorf, Germany 4987000010
CaCl2
Centrifuge
Clean wide-mouthed plastic container for semen sample
Dimethyl sulfoxide (DMSO)
FITC-coupled lectin of Pisum sativum (FITC-PSA) Sigma-Aldrich, Germany L0770
Fluo-4 AM Thermo Fisher Scientific, USA F14201
FLUOstar OMEGA fluorescence microplate reader BMG Labtech, Germany
Glucose anhydrous
HEPES
Hoechst-33342 ChemoMetec, Denmark 910-3015
Human serum albumin (HSA) Irvine Scientific 9988 For addition to HTF+
Immobilizing solution containing 0.6 M NaHCO3 and 0.37% (v/v) formaldehyde in distilled water
Incubator
KCl
KH2PO4
Magnetic stirrer
MgSO4
Na-Lactate
NaCl
NaHCO3
NC-3000 image cytometer ChemoMetec, Denmark 970-3003
Pipettes and piptting tips
propidium iodide (PI) ChemoMetec, Denmark 910-3002
Purified water
Rack for placing 50 mL plastic tubes in 45° angle
S100 buffer ChemoMetec, Denmark 910-0101
SP1-cassette ChemoMetec, Denmark 941-0006
Volumetric flasks of appropriate sizes
Vortexer

References

  1. Schiffer, C., et al. Direct action of endocrine disrupting chemicals on human sperm. EMBO reports. , (2014).
  2. Rehfeld, A., Dissing, S., Skakkebæk, N. E. Chemical UV Filters Mimic the Effect of Progesterone on Ca(2+) Signaling in Human Sperm Cells. Endocrinology. 157 (11), 4297-4308 (2016).
  3. Brenker, C., et al. Synergistic activation of CatSper Ca2+ channels in human sperm by oviductal ligands and endocrine disrupting chemicals. Human Reproduction (Oxford, England). 33 (10), 1915-1923 (2018).
  4. Brenker, C., et al. The CatSper channel: a polymodal chemosensor in human sperm. The EMBO Journal. 31 (7), 1654-1665 (2012).
  5. Brenker, C., et al. Action of steroids and plant triterpenoids on CatSper Ca2+ channels in human sperm. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (3), E344-E346 (2018).
  6. Rehfeld, A., et al. Chemical UV filters can affect human sperm function in a progesterone-like manner. Endocrine Connections. , (2017).
  7. Egeberg Palme, D. L., et al. Viable acrosome-intact human spermatozoa in the ejaculate as a marker of semen quality and fertility status. Human Reproduction. , (2018).
  8. Publicover, S., Harper, C. V., Barratt, C. [Ca2+]i signalling in sperm–making the most of what you’ve got. Nature Cell Biology. 9 (3), 235-242 (2007).
  9. Publicover, S. J., et al. Ca2+ signalling in the control of motility and guidance in mammalian sperm. Frontiers in Bioscience. 13, 5623-5637 (2008).
  10. Publicover, S., Harper, C. V., Barratt, C. [Ca2+]i signalling in sperm–making the most of what you’ve got. Nature Cell Biology. 9 (3), 235-242 (2007).
  11. Lishko, P. V., et al. The control of male fertility by spermatozoan ion channels. Annual Review Of Physiology. 74, 453-475 (2012).
  12. Morris, J., et al. Cell-penetrating peptides, targeting the regulation of store-operated channels, slow decay of the progesterone-induced [Ca2+]i signal in human sperm. Molecular Human Reproduction. 21 (7), 563-570 (2015).
  13. Strünker, T., et al. The CatSper channel mediates progesterone-induced Ca2+ influx in human sperm. Nature. 471 (7338), 382-386 (2011).
  14. Lishko, P. V., Botchkina, I. L., Kirichok, Y. Progesterone activates the principal Ca2+ channel of human sperm. Nature. 471 (7338), 387-391 (2011).
  15. Miller, M. R., et al. Unconventional endocannabinoid signaling governs sperm activation via the sex hormone progesterone. Science (New York, N.Y.). 352 (6285), 555-559 (2016).
  16. Revelli, A., et al. Follicular fluid content and oocyte quality: from single biochemical markers to metabolomics. Reproductive Biology And Endocrinology RB&E. 7, 40 (2009).
  17. Lyons, R. A., Saridogan, E., Djahanbakhch, O. The effect of ovarian follicular fluid and peritoneal fluid on Fallopian tube ciliary beat frequency. Human Reproduction. 21 (1), 52-56 (2006).
  18. Eisenbach, M., Giojalas, L. C. Sperm guidance in mammals – an unpaved road to the egg. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 7 (4), 276-285 (2006).
  19. Alasmari, W., et al. The clinical significance of calcium-signalling pathways mediating human sperm hyperactivation. Human Reproduction. 28 (4), 866-876 (2013).
  20. Alasmari, W., et al. Ca2+ signals generated by CatSper and Ca2+ stores regulate different behaviors in human sperm. The Journal of Biological Chemistry. 288 (9), 6248-6258 (2013).
  21. Tamburrino, L., et al. The CatSper calcium channel in human sperm: relation with motility and involvement in progesterone-induced acrosome reaction. Human Reproduction. 29 (3), 418-428 (2014).
  22. Krausz, C., et al. Intracellular calcium increase and acrosome reaction in response to progesterone in human spermatozoa are correlated with in-vitro fertilization. Human Reproduction. 10 (1), 120-124 (1995).
  23. Oehninger, S., et al. Defective calcium influx and acrosome reaction (spontaneous and progesterone-induced) in spermatozoa of infertile men with severe teratozoospermia. Fertility and Sterility. 61 (2), 349-354 (1994).
  24. Shimizu, Y., Nord, E. P., Bronson, R. A. Progesterone-evoked increases in sperm [Ca2+]i correlate with the egg penetrating ability of sperm from fertile but not infertile men. Fertility and Sterility. 60 (3), 526-532 (1993).
  25. Falsetti, C., et al. Decreased responsiveness to progesterone of spermatozoa in oligozoospermic patients. Journal of Andrology. 14 (1), 17-22 (1993).
  26. Williams, H. L., et al. Specific loss of CatSper function is sufficient to compromise fertilizing capacity of human spermatozoa. Human Reproduction. 30 (12), 2737-2746 (2015).
  27. Forti, G., et al. Effects of progesterone on human spermatozoa: clinical implications. Annales d’Endocrinologie. 60 (2), 107-110 (1999).
  28. Krausz, C., et al. Two functional assays of sperm responsiveness to progesterone and their predictive values in in-vitro fertilization. Human Reproduction. 11 (8), 1661-1667 (1996).
  29. Kelly, M. C., et al. Single-cell analysis of [Ca2+]i signalling in sub-fertile men: characteristics and relation to fertilization outcome. Human Reproduction. 33 (6), 1023-1033 (2018).
  30. Brown, S. G., et al. Homozygous in-frame deletion in CATSPERE in a man producing spermatozoa with loss of CatSper function and compromised fertilizing capacity. Human Reproduction. 33 (10), 1812-1816 (2018).
  31. Avenarius, M. R., et al. Human male infertility caused by mutations in the CATSPER1 channel protein. American Journal of Human Genetics. 84 (4), 505-510 (2009).
  32. Smith, J. F., et al. Disruption of the principal, progesterone-activated sperm Ca2+ channel in a CatSper2-deficient infertile patient. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (17), 6823-6828 (2013).
  33. Hildebrand, M. S., et al. Genetic male infertility and mutation of CATSPER ion channels. European Journal of Human Genetics. 18 (11), 1178-1184 (2010).
  34. Avidan, N., et al. CATSPER2, a human autosomal nonsyndromic male infertility gene. European Journal of Human Genetic. 11 (7), 497-502 (2003).
  35. Zhang, Y., et al. Sensorineural deafness and male infertility: a contiguous gene deletion syndrome. BMJ Case Reports. 2009, (2009).
  36. Jaiswal, D., Singh, V., Dwivedi, U. S., Trivedi, S., Singh, K. Chromosome microarray analysis: a case report of infertile brothers with CATSPER gene deletion. Gene. 542 (2), 263-265 (2014).
  37. Visconti, P. E., Krapf, D., de la Vega-Beltrán, J. L., Acevedo, J. J., Darszon, A. Ion channels, phosphorylation and mammalian sperm capacitation. Asian Journal of Andrology. 13 (3), 395-405 (2011).
  38. Wassarman, P. M., Jovine, L., Litscher, E. S. A profile of fertilization in mammals. Nature Cell Biology. 3 (2), E59-E64 (2001).
  39. Leahy, T., Gadella, B. M. Sperm surface changes and physiological consequences induced by sperm handling and storage. Reproduction. 142 (6), 759-778 (2011).
  40. Suarez, S. S. Control of hyperactivation in sperm. Human Reproduction Update. 14 (6), 647-657 (2008).
  41. Liu, D. Y., Baker, H. W. Inhibition of acrosin activity with a trypsin inhibitor blocks human sperm penetration of the zona pellucida. Biology of Reproduction. 48 (2), 340-348 (1993).
  42. Okabe, M. The cell biology of mammalian fertilization. Development. 140 (22), 4471-4479 (2013).
  43. Inoue, N., Satouh, Y., Ikawa, M., Okabe, M., Yanagimachi, R. Acrosome-reacted mouse spermatozoa recovered from the perivitelline space can fertilize other eggs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (50), 20008-20011 (2011).
  44. Jin, M., et al. Most fertilizing mouse spermatozoa begin their acrosome reaction before contact with the zona pellucida during in vitro fertilization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (12), 4892-4896 (2011).
  45. Hirohashi, N., Yanagimachi, R. Sperm acrosome reaction: its site and role in fertilization. Biology of Reproduction. 99 (1), 127-133 (2018).
  46. Liu, D. Y., Garrett, C., Baker, H. W. G. Acrosome-reacted human sperm in insemination medium do not bind to the zona pellucida of human oocytes. International Journal of Andrology. 29 (4), 475-481 (2006).
  47. Overstreet, J. W., Hembree, W. C. Penetration of the zona pellucida of nonliving human oocytes by human spermatozoa in vitro. Fertility and Sterility. 27 (7), 815-831 (1976).
  48. Martins da Silva, S. J., et al. Drug discovery for male subfertility using high-throughput screening: a new approach to an unsolved problem. Human Reproduction. , 1-11 (2017).
  49. Zoppino, F. C. M., Halón, N. D., Bustos, M. A., Pavarotti, M. A., Mayorga, L. S. Recording and sorting live human sperm undergoing acrosome reaction. Fertility and Sterility. 97 (6), 1309-1315 (2012).
  50. Mata-Martínez, E., et al. Measuring intracellular Ca2+ changes in human sperm using four techniques: conventional fluorometry, stopped flow fluorometry, flow cytometry and single cell imaging. Journal of Visualized Experiments. (75), e50344 (2013).
  51. Egeberg, D. L., et al. Image cytometer method for automated assessment of human spermatozoa concentration. Andrology. 1 (4), 615-623 (2013).
  52. Nash, K., et al. Techniques for imaging Ca2+ signaling in human sperm. Journal of Visualized Experiments. (40), (2010).

Play Video

Cite This Article
Rehfeld, A., Egeberg Palme, D. L., Almstrup, K., Juul, A., Skakkebaek, N. E. Medium-throughput Screening Assays for Assessment of Effects on Ca2+-Signaling and Acrosome Reaction in Human Sperm. J. Vis. Exp. (145), e59212, doi:10.3791/59212 (2019).

View Video