Summary

Ensaios de triagem para avaliação dos efeitos de Ca2 +médio-produção-sinalização e reacção acrossómica no esperma humano

Published: March 01, 2019
doi:

Summary

Aqui, dois ensaios de rendimento médio para avaliação dos efeitos de Ca2 +-reação do acrossoma e sinalização no esperma humano são descritos. Estes ensaios podem ser usados para facilmente e rapidamente grandes quantidades de compostos para efeitos na Ca2 +de tela-reação do acrossoma e sinalização no esperma humano.

Abstract

CA2 +-sinalização é essencial para a função celular normal do esperma e a fertilidade masculina. Da mesma forma, a reação do acrossoma é vital para a capacidade de uma célula de esperma humana para penetrar a zona pelúcida e fecundar o óvulo. Portanto, é de grande interesse para testar compostos (por exemplo, produtos químicos ambientais ou candidatos a fármacos) para seu efeito no Ca2 +-reação do acrossoma e sinalização no esperma humano ou para examinar os potenciais efeitos adversos sobre a função da célula de esperma humano ou para investigar um possível papel como um contraceptivo. Aqui, dois ensaios de rendimento médio são descritos: 1) um ensaio baseado em fluorescência para avaliação dos efeitos de Ca2 +-sinalização no esperma humano e 2) um ensaio de cytometric de imagem para avaliação de Reacção acrossómica no esperma humano. Estes ensaios podem ser usados para um grande número de compostos para efeitos na Ca2 +de tela-reação do acrossoma e sinalização no esperma humano. Além disso, os ensaios podem ser usados para gerar as curvas dose-resposta altamente específica de compostos individuais, determinar potencial aditividade/sinergismo para dois ou mais compostos e estudar o modo farmacológico de ação através da inibição competitiva experimentos com inibidores de CatSper.

Introduction

O objetivo dos dois ensaios aqui descritos é examinar efeitos na Ca2 +-reação do acrossoma e sinalização no esperma humano, como foi demonstrado por vários compostos em diversas publicações, empregando estes ensaios1,2, 3,4,5,6,7. CA2 +-sinalização e a reacção acrossómica são função da célula de esperma humano vital ao normal e a fertilidade masculina.

O objectivo geral de uma célula de esperma humano é para fecundar o óvulo. Para ser capaz de com êxito e, naturalmente, fecundar o óvulo, as funções da célula de esperma devem ser reguladas firmemente durante a viagem da célula de esperma através do trato reprodutivo feminino8,9. Muitas das funções de células de esperma são regulamentadas através do intracelular Ca2 +-concentração [Ca2 +]eu (por exemplo, esperma motilidade, quimiotaxia e acrossoma reação)10. Também, um processo de maturação chamado capacitação, o que torna a célula de esperma capaz de fertilizar o óvulo, é parcialmente regulamentado pelo [Ca2 +]eu10. CA2 +-extrusão de Ca2 +-ATPase bombas11 manter um Ca dobra aproximadamente 20.0002 +-gradiente ao longo da membrana da célula de esperma humano, com um descanso [Ca2 +]eu de 50-100 nM. Se Ca2 + é permitido atravessar a membrana celular (por exemplo, através da abertura de Ca2 +-canais), ocorre um afluxo considerável de Ca2 + , dando origem a uma altitude de [Ca2 +]eu. No entanto, o espermatozoide que carrega também intracelular Ca2 +-lojas, que podem liberar Ca2 + e, portanto, também dá-se uma elevação de [Ca2 +]i12. Curiosamente, todos mediada por canal Ca2 +-influxo em células de esperma humanas até agora foi encontrado para ocorrer através de CatSper (gatocanal iônico de Sperm), que só é expressa em células de esperma11. Nas células de esperma humanas, CatSper é ativado pela progesterona ligantes endógenos e prostaglandinas através de distinta ligand binding sites13,14,15, levando a uma rápida Ca2 +-afluxo em a célula de esperma. Duas fontes principais perto do ovo fornecem altos níveis destes ligantes endógenos. Um é o fluido folicular que contém altos níveis de progesterona16. O fluido folicular é liberado do folículo maduro juntamente com o óvulo na ovulação e se mistura com o fluido dentro os ovidutos17. A outra fonte principal é as células do cumulus que cercam o ovo e liberar a altos níveis de progesterona e prostaglandinas. A progesterona induzida por Ca2 +-influxo nas células de esperma tem sido mostrado para mediar a quimiotaxia para o ovo de9,18, controlar esperma motilidade19,20 e estimular a acrossoma reação de21. Acionamento destes individuais [Ca2 +]eu-funções de esperma regulamentado na ordem correta e no momento correto é crucial para a fertilização do ovo8. Dessa forma, uma qualidade inferior induzida pela progesterona Ca2 +-influxo foi encontrado ser associado com reduzida fertilidade masculina22,23,24,25,26 ,,27,28,29 e CatSper funcional é essencial para a fertilidade masculina26,30,31,32, 33,34,35,36.

Como as células de esperma alcançar o ovo, uma sequência de eventos deve ocorrer para fertilização ocorra: 1) as células de esperma deve penetrar a camada de células cumulus circundante, 2) ligar a zona pelúcida, 3) exocytose o conteúdo acrossomal, a reação do acrossoma chamados 37, 4) penetrar a zona pelúcida e 5) se fundem com a membrana do ovo para completar a fertilização38. Para ser capaz de passar por estas etapas e fecundar o óvulo, o espermatozoide que primeiro devem ser submetidos a capacitação11, que começa como as células de esperma sair o líquido seminal que contém “decapacitating” fatores39 e nadam para os fluidos da fêmea trato reprodutivo com altos níveis de bicarbonato e albumina37. Capacitação processa as células de esperma capazes de submeter-se hyperactivation, uma forma de mobilidade com uma surra vigorosa do flagelo e de reação do acrossoma37. Hiperactivos motilidade é necessária para a penetração da zona pelúcida40, e a acrossoma contém várias enzimas hidrolíticas que auxiliam neste processo de penetração41. Além disso, a reacção acrossómica processa os espermatozoides capazes de fundir-se com o ovo, expondo-as proteínas específicas da membrana na superfície de esperma necessária para a fusão de esperma-ovo42. Consequentemente, a capacidade de sofrer reação hyperactivation e acrossoma são ambos necessários para uma fecundação bem sucedida do ovo40,42. Ao contrário do que tem sido visto por rato espermatozoides43,44,45, apenas humanos espermatozoides que são acrossoma intacto pode ligar para a zona pelúcida46. Quando as células de esperma humanas são vinculadas a zona pelúcida têm que submeter-se a reacção acrossómica tanto para penetrar a zona pelúcida41 e expor as proteínas de membrana específicos que são necessários para a fusão com o ovo,38. O momento da reacção acrossómica no esperma humano, portanto, é fundamental para fertilização ocorra.

Conforme descrito acima, Ca2 +-sinalização é vital para a célula de esperma normal função8, e é, portanto, de grande interesse para ser capaz de grandes números de tela de compostos para efeitos na Ca2 +-sinalização em células de esperma humanas. Da mesma forma, como células de esperma humanas só que se submetem a reacção acrossómica no momento certo e no lugar pode penetrar a zona pelúcida e fertilizar o ovo46,47, é também de grande interesse para poder testar compostos por sua capacidade de afecta a reacção acrossómica no esperma humano. Para este fim, são descritos dois ensaios de rastreio com throughput médio: 1) um ensaio para efeitos na Ca2 +-sinalização em células de esperma humanas e 2) um ensaio para a capacidade de induzir a reacção acrossómica em células de esperma humanas.

Ensaio 1 é médio-taxa de transferência Ca2 +-ensaio de sinalização. Esta técnica de baseado no leitor de placa de fluorescência monitora alterações em fluorescência em função do tempo simultaneamente em vários poços. O Ca2 +-tintura fluorescente sensível, Fluo-4 tem um Kd de Ca2 +≈ 335 nM e é célula-permeant sob a forma de éster de AM (acetoximetil). Usando Fluo-4, é possível medir mudanças na [Ca2 +]i , ao longo do tempo e após a adição de compostos de interesse para as células de esperma. O ensaio foi desenvolvido pelo laboratório de Timo Strünker em 201113 e desde então tem sido utilizado em diversos estudos para compostos de tela para efeitos na Ca2 +-sinalização no esperma humano1,2,3, 4,5. Também utilizou-se um método semelhante para a tela de múltiplas drogas candidatos48. Além disso, este ensaio também é útil para avaliar o modo farmacológico de ação1,2,3,4,5, de curvas dose-resposta1, 2,3,4,5, inibição competitiva1,2, aditividade1,2e sinergismo3 de compostos de interesse.

Ensaio 2 é um ensaio de reação do acrossoma médio-taxa de transferência. Esta técnica de imagem baseada em citômetro mede a quantidade de viável acrossoma reagiu espermatozoides em uma amostra, usando três corantes fluorescentes: iodeto de propidium (PI), FITC-acoplado lectina de Pisum sativum (FITC-PSA) e Hoechst 33342. O ensaio foi modificado de um método similar de baseados em citometria de fluxo por Zoppino et al.49 e tem sido utilizado em diversos estudos6,7. Quanto ao Ca2 +-sinalização ensaio, este ensaio de reação do acrossoma também poderia ser utilizado para avaliar as curvas dose-resposta, inibição, aditividade e sinergismo de compostos de interesse.

Protocol

A recolha e análise de amostras de sêmen humano nos protocolos segue as diretrizes do Comitê de ética de pesquisa da região Capital da Dinamarca. Todas as amostras de sêmen foram obtidas após consentimento informado de doadores voluntários. Após o parto, as amostras foram totalmente anónimos. Por sua inconveniência cada doador recebeu uma taxa de 500 coroas dinamarquesas (cerca US $75 dólares americanos) por amostra. As amostras foram analisadas no dia da entrega e então destruídas imediatamente após os ex…

Representative Results

Representante resulta de uma experiência para testar o efeito de 4 compostos de (A, B, C e D) juntamente com um positivo (progesterona) e negativo (tampão) na [Ca2 +]i no esperma humano usando médio-taxa de transferência Ca2 +-sinalização ensaio pode ser visto na figura 4a. Na figura 4b, uma curva de resposta de dose de progesterona é mostrada, que foi derivado de pico ΔF/F0 (%)…

Discussion

A taxa de transferência média Ca2 + sinalização ensaio baseia-se em medições da fluorescência do único micropoços cada contendo cerca de 250.000 células de esperma. O sinal capturado é em média de todas as células de esperma individuais no poço. O ensaio fornece, portanto, que nenhuma informação espacial sobre onde especificamente na célula de esperma [Ca2 +] é alterada, como grandes numa proporção das células de esperma, uma mudança no [Ca2 +]i

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores gostaria de reconhecer o laboratório de Timo Strünker para supervisão de AR e DLE durante suas estadias em seu laboratório. Além disso, gostaríamos de agradecer aos nossos colegas do departamento de crescimento e reprodução, Hospital Universitário de Copenhaga, Rigshospitalet por sua ajuda com a criação destes dois ensaios. Este trabalho foi financiado por doações da Dinamarca fundo de inovação (concessão números 005-2010-3 e 4-14-2013).

Materials

0.2 µm pore filter Thermo Fisher Scientific, USA 296-4545
1 L measuring cylinder Thermo Fisher Scientific, USA 3662-1000
1,4 and 2 mL plastic tubes Eppendorf, Germany 30120086 and 0030120094
12-channel pipette Eppendorf, Germany 4861000813
384 multi-well plates Greiner Bio-One, Germany 781096
15 and 50 mL platic tubes Eppendorf, Germany 0030122151 and 30122178
A2-slide ChemoMetec, Denmark 942-0001
Automatic repeater pipette Eppendorf, Germany 4987000010
CaCl2
Centrifuge
Clean wide-mouthed plastic container for semen sample
Dimethyl sulfoxide (DMSO)
FITC-coupled lectin of Pisum sativum (FITC-PSA) Sigma-Aldrich, Germany L0770
Fluo-4 AM Thermo Fisher Scientific, USA F14201
FLUOstar OMEGA fluorescence microplate reader BMG Labtech, Germany
Glucose anhydrous
HEPES
Hoechst-33342 ChemoMetec, Denmark 910-3015
Human serum albumin (HSA) Irvine Scientific 9988 For addition to HTF+
Immobilizing solution containing 0.6 M NaHCO3 and 0.37% (v/v) formaldehyde in distilled water
Incubator
KCl
KH2PO4
Magnetic stirrer
MgSO4
Na-Lactate
NaCl
NaHCO3
NC-3000 image cytometer ChemoMetec, Denmark 970-3003
Pipettes and piptting tips
propidium iodide (PI) ChemoMetec, Denmark 910-3002
Purified water
Rack for placing 50 mL plastic tubes in 45° angle
S100 buffer ChemoMetec, Denmark 910-0101
SP1-cassette ChemoMetec, Denmark 941-0006
Volumetric flasks of appropriate sizes
Vortexer

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Rehfeld, A., Egeberg Palme, D. L., Almstrup, K., Juul, A., Skakkebaek, N. E. Medium-throughput Screening Assays for Assessment of Effects on Ca2+-Signaling and Acrosome Reaction in Human Sperm. J. Vis. Exp. (145), e59212, doi:10.3791/59212 (2019).

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