Ensaios de triagem para avaliação dos efeitos de Ca2 +médio-produção-sinalização e reacção acrossómica no esperma humano

Summary

Aqui, dois ensaios de rendimento médio para avaliação dos efeitos de Ca^{2 +}-reação do acrossoma e sinalização no esperma humano são descritos. Estes ensaios podem ser usados para facilmente e rapidamente grandes quantidades de compostos para efeitos na Ca^{2 +}de tela-reação do acrossoma e sinalização no esperma humano.

Abstract

CA^{2 +}-sinalização é essencial para a função celular normal do esperma e a fertilidade masculina. Da mesma forma, a reação do acrossoma é vital para a capacidade de uma célula de esperma humana para penetrar a zona pelúcida e fecundar o óvulo. Portanto, é de grande interesse para testar compostos (por exemplo, produtos químicos ambientais ou candidatos a fármacos) para seu efeito no Ca^{2 +}-reação do acrossoma e sinalização no esperma humano ou para examinar os potenciais efeitos adversos sobre a função da célula de esperma humano ou para investigar um possível papel como um contraceptivo. Aqui, dois ensaios de rendimento médio são descritos: 1) um ensaio baseado em fluorescência para avaliação dos efeitos de Ca^{2 +}-sinalização no esperma humano e 2) um ensaio de cytometric de imagem para avaliação de Reacção acrossómica no esperma humano. Estes ensaios podem ser usados para um grande número de compostos para efeitos na Ca^{2 +}de tela-reação do acrossoma e sinalização no esperma humano. Além disso, os ensaios podem ser usados para gerar as curvas dose-resposta altamente específica de compostos individuais, determinar potencial aditividade/sinergismo para dois ou mais compostos e estudar o modo farmacológico de ação através da inibição competitiva experimentos com inibidores de CatSper.

Introduction

O objetivo dos dois ensaios aqui descritos é examinar efeitos na Ca^{2 +}-reação do acrossoma e sinalização no esperma humano, como foi demonstrado por vários compostos em diversas publicações, empregando estes ensaios^{1,2, 3,4,5,6,7}. CA^{2 +}-sinalização e a reacção acrossómica são função da célula de esperma humano vital ao normal e a fertilidade masculina.

O objectivo geral de uma célula de esperma humano é para fecundar o óvulo. Para ser capaz de com êxito e, naturalmente, fecundar o óvulo, as funções da célula de esperma devem ser reguladas firmemente durante a viagem da célula de esperma através do trato reprodutivo feminino^8,9. Muitas das funções de células de esperma são regulamentadas através do intracelular Ca^{2 +}-concentração [Ca^{2 +}]_eu (por exemplo, esperma motilidade, quimiotaxia e acrossoma reação)¹⁰. Também, um processo de maturação chamado capacitação, o que torna a célula de esperma capaz de fertilizar o óvulo, é parcialmente regulamentado pelo [Ca^{2 +}]_eu¹⁰. CA^{2 +}-extrusão de Ca^{2 +}-ATPase bombas¹¹ manter um Ca dobra aproximadamente 20.000^{2 +}-gradiente ao longo da membrana da célula de esperma humano, com um descanso [Ca^{2 +}]_eu de 50-100 nM. Se Ca^{2 +} é permitido atravessar a membrana celular (por exemplo, através da abertura de Ca^{2 +}-canais), ocorre um afluxo considerável de Ca^{2 +} , dando origem a uma altitude de [Ca^{2 +}]_eu. No entanto, o espermatozoide que carrega também intracelular Ca^{2 +}-lojas, que podem liberar Ca^{2 +} e, portanto, também dá-se uma elevação de [Ca^{2 +}]_i¹². Curiosamente, todos mediada por canal Ca^{2 +}-influxo em células de esperma humanas até agora foi encontrado para ocorrer através de CatSper (gatocanal iônico de Sperm), que só é expressa em células de esperma¹¹. Nas células de esperma humanas, CatSper é ativado pela progesterona ligantes endógenos e prostaglandinas através de distinta ligand binding sites^13,14,15, levando a uma rápida Ca^{2 +}-afluxo em a célula de esperma. Duas fontes principais perto do ovo fornecem altos níveis destes ligantes endógenos. Um é o fluido folicular que contém altos níveis de progesterona¹⁶. O fluido folicular é liberado do folículo maduro juntamente com o óvulo na ovulação e se mistura com o fluido dentro os ovidutos¹⁷. A outra fonte principal é as células do cumulus que cercam o ovo e liberar a altos níveis de progesterona e prostaglandinas. A progesterona induzida por Ca^{2 +}-influxo nas células de esperma tem sido mostrado para mediar a quimiotaxia para o ovo de^9,18, controlar esperma motilidade^19,20 e estimular a acrossoma reação de²¹. Acionamento destes individuais [Ca^{2 +}]_eu-funções de esperma regulamentado na ordem correta e no momento correto é crucial para a fertilização do ovo⁸. Dessa forma, uma qualidade inferior induzida pela progesterona Ca^{2 +}-influxo foi encontrado ser associado com reduzida fertilidade masculina^{22,23,24,25,26 ,},^27,28,29 e CatSper funcional é essencial para a fertilidade masculina^{26,30,31,32, 33,34,35,36}.

Como as células de esperma alcançar o ovo, uma sequência de eventos deve ocorrer para fertilização ocorra: 1) as células de esperma deve penetrar a camada de células cumulus circundante, 2) ligar a zona pelúcida, 3) exocytose o conteúdo acrossomal, a reação do acrossoma chamados ³⁷, 4) penetrar a zona pelúcida e 5) se fundem com a membrana do ovo para completar a fertilização³⁸. Para ser capaz de passar por estas etapas e fecundar o óvulo, o espermatozoide que primeiro devem ser submetidos a capacitação¹¹, que começa como as células de esperma sair o líquido seminal que contém “decapacitating” fatores³⁹ e nadam para os fluidos da fêmea trato reprodutivo com altos níveis de bicarbonato e albumina³⁷. Capacitação processa as células de esperma capazes de submeter-se hyperactivation, uma forma de mobilidade com uma surra vigorosa do flagelo e de reação do acrossoma³⁷. Hiperactivos motilidade é necessária para a penetração da zona pelúcida⁴⁰, e a acrossoma contém várias enzimas hidrolíticas que auxiliam neste processo de penetração⁴¹. Além disso, a reacção acrossómica processa os espermatozoides capazes de fundir-se com o ovo, expondo-as proteínas específicas da membrana na superfície de esperma necessária para a fusão de esperma-ovo⁴². Consequentemente, a capacidade de sofrer reação hyperactivation e acrossoma são ambos necessários para uma fecundação bem sucedida do ovo^40,42. Ao contrário do que tem sido visto por rato espermatozoides^43,44,45, apenas humanos espermatozoides que são acrossoma intacto pode ligar para a zona pelúcida⁴⁶. Quando as células de esperma humanas são vinculadas a zona pelúcida têm que submeter-se a reacção acrossómica tanto para penetrar a zona pelúcida⁴¹ e expor as proteínas de membrana específicos que são necessários para a fusão com o ovo,³⁸. O momento da reacção acrossómica no esperma humano, portanto, é fundamental para fertilização ocorra.

Conforme descrito acima, Ca^{2 +}-sinalização é vital para a célula de esperma normal função⁸, e é, portanto, de grande interesse para ser capaz de grandes números de tela de compostos para efeitos na Ca^{2 +}-sinalização em células de esperma humanas. Da mesma forma, como células de esperma humanas só que se submetem a reacção acrossómica no momento certo e no lugar pode penetrar a zona pelúcida e fertilizar o ovo^46,47, é também de grande interesse para poder testar compostos por sua capacidade de afecta a reacção acrossómica no esperma humano. Para este fim, são descritos dois ensaios de rastreio com throughput médio: 1) um ensaio para efeitos na Ca^{2 +}-sinalização em células de esperma humanas e 2) um ensaio para a capacidade de induzir a reacção acrossómica em células de esperma humanas.

Ensaio 1 é médio-taxa de transferência Ca^{2 +}-ensaio de sinalização. Esta técnica de baseado no leitor de placa de fluorescência monitora alterações em fluorescência em função do tempo simultaneamente em vários poços. O Ca^{2 +}-tintura fluorescente sensível, Fluo-4 tem um K_d de Ca^{2 +}≈ 335 nM e é célula-permeant sob a forma de éster de AM (acetoximetil). Usando Fluo-4, é possível medir mudanças na [Ca^{2 +}]_i , ao longo do tempo e após a adição de compostos de interesse para as células de esperma. O ensaio foi desenvolvido pelo laboratório de Timo Strünker em 2011¹³ e desde então tem sido utilizado em diversos estudos para compostos de tela para efeitos na Ca^{2 +}-sinalização no esperma humano^{1,2,3, 4,5}. Também utilizou-se um método semelhante para a tela de múltiplas drogas candidatos⁴⁸. Além disso, este ensaio também é útil para avaliar o modo farmacológico de ação^1,2,3,4,5, de curvas dose-resposta^{1, 2,3,4,5}, inibição competitiva^1,2, aditividade^1,2e sinergismo³ de compostos de interesse.

Ensaio 2 é um ensaio de reação do acrossoma médio-taxa de transferência. Esta técnica de imagem baseada em citômetro mede a quantidade de viável acrossoma reagiu espermatozoides em uma amostra, usando três corantes fluorescentes: iodeto de propidium (PI), FITC-acoplado lectina de Pisum sativum (FITC-PSA) e Hoechst 33342. O ensaio foi modificado de um método similar de baseados em citometria de fluxo por Zoppino et al.⁴⁹ e tem sido utilizado em diversos estudos^6,7. Quanto ao Ca^{2 +}-sinalização ensaio, este ensaio de reação do acrossoma também poderia ser utilizado para avaliar as curvas dose-resposta, inibição, aditividade e sinergismo de compostos de interesse.

Protocol

A recolha e análise de amostras de sêmen humano nos protocolos segue as diretrizes do Comitê de ética de pesquisa da região Capital da Dinamarca. Todas as amostras de sêmen foram obtidas após consentimento informado de doadores voluntários. Após o parto, as amostras foram totalmente anónimos. Por sua inconveniência cada doador recebeu uma taxa de 500 coroas dinamarquesas (cerca US $75 dólares americanos) por amostra. As amostras foram analisadas no dia da entrega e então destruídas imediatamente após os ex…

Representative Results

Representante resulta de uma experiência para testar o efeito de 4 compostos de (A, B, C e D) juntamente com um positivo (progesterona) e negativo (tampão) na [Ca2 +]i no esperma humano usando médio-taxa de transferência Ca2 +-sinalização ensaio pode ser visto na figura 4a. Na figura 4b, uma curva de resposta de dose de progesterona é mostrada, que foi derivado de pico ΔF/F0 (%)…

Discussion

A taxa de transferência média Ca^{2 +} sinalização ensaio baseia-se em medições da fluorescência do único micropoços cada contendo cerca de 250.000 células de esperma. O sinal capturado é em média de todas as células de esperma individuais no poço. O ensaio fornece, portanto, que nenhuma informação espacial sobre onde especificamente na célula de esperma [Ca^{2 +}] é alterada, como grandes numa proporção das células de esperma, uma mudança no [Ca^{2 +}]_i…

Materials

0.2 µm pore filter	Thermo Fisher Scientific, USA	296-4545
1 L measuring cylinder	Thermo Fisher Scientific, USA	3662-1000
1,4 and 2 mL plastic tubes	Eppendorf, Germany	30120086 and 0030120094
12-channel pipette	Eppendorf, Germany	4861000813
384 multi-well plates	Greiner Bio-One, Germany	781096
15 and 50 mL platic tubes	Eppendorf, Germany	0030122151 and 30122178
A2-slide	ChemoMetec, Denmark	942-0001
Automatic repeater pipette	Eppendorf, Germany	4987000010
CaCl2
Centrifuge
Clean wide-mouthed plastic container for semen sample
Dimethyl sulfoxide (DMSO)
FITC-coupled lectin of Pisum sativum (FITC-PSA)	Sigma-Aldrich, Germany	L0770
Fluo-4 AM	Thermo Fisher Scientific, USA	F14201
FLUOstar OMEGA fluorescence microplate reader	BMG Labtech, Germany
Glucose anhydrous
HEPES
Hoechst-33342	ChemoMetec, Denmark	910-3015
Human serum albumin (HSA)	Irvine Scientific	9988	For addition to HTF+
Immobilizing solution containing 0.6 M NaHCO3 and 0.37% (v/v) formaldehyde in distilled water
Incubator
KCl
KH2PO4
Magnetic stirrer
MgSO4
Na-Lactate
NaCl
NaHCO3
NC-3000 image cytometer	ChemoMetec, Denmark	970-3003
Pipettes and piptting tips
propidium iodide (PI)	ChemoMetec, Denmark	910-3002
Purified water
Rack for placing 50 mL plastic tubes in 45° angle
S100 buffer	ChemoMetec, Denmark	910-0101
SP1-cassette	ChemoMetec, Denmark	941-0006
Volumetric flasks of appropriate sizes
Vortexer