Här, två medium-genomströmning analyser för bedömning av effekter på Ca2 +-signalering och akrosomen reaktion i mänskliga spermier beskrivs. Dessa analyser kan användas för att snabbt och enkelt skärmen stora mängder föreningar för effekter på Ca2 +-signalering och akrosomen reaktion i mänskliga spermier.
Ca2 +-signalering är nödvändig för normal spermie funktion och manlig fertilitet. Likaså är akrosomen reaktionen avgörande för möjligheten för en mänsklig spermie att penetrera zona pellucida och befrukta ägget. Det är därför av stort intresse att testa föreningar (t.ex. miljö kemikalier eller läkemedelskandidater) för sin effekt på Ca2 +-signalering och akrosomen reaktion i mänskliga spermier antingen att undersöka de potentiella negativa effekterna på människors spermie funktion eller att undersöka en möjlig roll som preventivmedel. Här beskrivs två medium-kapacitet idag: 1) en fluorescens-baserad analys för bedömning av effekter på Ca2 +-signalering i mänsklig sperma och 2) en bild flödescytometrisk analys för bedömning av akrosomen reaktion i mänskliga spermier. Dessa analyser kan användas för att screena ett stort antal föreningar för effekter på Ca2 +-signalering och akrosomen reaktion i mänskliga spermier. Dessutom kan analyserna användas för att generera mycket specifika dos-responskurvor för enskilda föreningar, bestämma potentiella additivitet/synergier för två eller flera föreningar, och att studera farmakologiska verkningsmekanism genom kompetitiv hämning experiment med CatSper-hämmare.
Syftet med de två analyser som beskrivs här är att undersöka påverkan på Ca2 +-signalering och akrosomen reaktion i mänsklig sperma, som har visats för flera föreningar i flera publikationer anställa dessa analyser1,2, 3,4,5,6,7. Ca2 +-signalering och akrosomen reaktionen är både viktigt att normala mänskliga spermie funktion och manlig fertilitet.
Det övergripande målet för en mänsklig spermie är att befrukta ägget. För att kunna framgångsrikt och naturligt befrukta ägget, måste funktioner i cellen spermier regleras ordentligt under resan av spermier cellen genom den kvinnliga genitalia8,9. Många av funktionerna spermie regleras via den intracellulära Ca2 +-koncentration [Ca2 +]jag (t.ex. spermier motilitet, Kemotaxis och akrosomen reaktion)10. En mognadsprocess som kallas capacitation, som återger spermie som gödning ägget, är också delvis reglerat av [Ca2 +]jag10. Ca2 +-strängpressning Ca2 +-ATPas pumpar11 upprätthålla ett ungefärligt 20.000 gånger Ca2 +-gradient över mänskliga spermier cellmembranet, med en vilande [Ca2 +]jag 50-100 Nm. Om Ca2 + tillåts korsa cellmembranet (t.ex. genom öppnandet av Ca2 +-kanaler), ett betydande inflöde av Ca2 + uppstår, ger upphov till en höjd av [Ca2 +]jag. Dock spermie också bär intracellulära Ca2 +-butiker, som kan frigöra Ca2 + och, därför, också ger upphov en höjd av [Ca2 +]i12. Intressant, alla kanal-medierad Ca2 +-inflöde i mänskliga spermaceller har hittills konstaterats för att ske via CatSper (CatJoniska kanal SpeRM), som uttrycks endast i spermierna11. I mänskliga spermaceller, CatSper aktiveras av endogena ligander progesteron och prostaglandiner genom distinkta ligand bindande platser13,14,15, leder till en snabb Ca2 +-inflöde till cellen spermier. Två huvudsakliga källor nära ägget ger höga nivåer av dessa endogena ligander. En är den follikulära vätska som innehåller höga halter av progesteron16. Den follikulära vätskan frigörs från mogna folliklar tillsammans med ägget vid ägglossningen och mixar med vätska inom den oviducts17. Andra huvudkällan är den cumulus celler som omger ägget och släppa höga nivåer av progesteron och prostaglandiner. Progesteron-inducerad Ca2 +-inflöde i spermacellerna har visat att medla chemotaxis mot ägg9,18, kontrollera spermier motilitet19,20 och stimulera akrosomen reaktion21. Utlösning av dessa enskilda [Ca2 +]jag-reglerade spermier funktioner i rätt ordning och vid rätt tidpunkt är avgörande för befruktning av ägg8. I linje med detta, en suboptimal progesteron-inducerad Ca2 +-inflöde har hittats ska associeras med minskad fertilitet22,23,24,25,26 ,27,28,29 och funktionella CatSper är avgörande för manlig fertilitet26,30,31,32, 33,34,35,36.
Som spermacellerna nå ägget, ett händelseförlopp måste äga rum för befruktning att inträffa: (1) spermacellerna måste penetrera det omgivande cumulus celllagrar, 2) binder till zona pellucida, 3) exocytose acrosomal innehåll, så kallade akrosomen reaktionen 37, 4) penetrera zona pellucida och 5) säkring med ägg membranet att slutföra befruktning38. För att kunna gå igenom dessa steg och befrukta ägget, måste spermie först genomgå capacitation11, som börjar som spermacellerna lämnar sädesvätskan som innehåller ”decapacitating” faktorer39 och simma in i vätskorna av kvinnliga fortplantningsorganen med höga nivåer av bikarbonat och albumin37. Capacitation återger spermacellerna kan genomgå en överaktivering, en form av motilitet med kraftig stryk av Flagellen och akrosomen reaktion37. Hyperactivated motilitet krävs för genomträngningen av zona pellucida40, och akrosomen innehåller olika Hydrolytiska enzymer som stöd denna penetration processen41. Dessutom återger akrosomen reaktionen spermacellerna kan fusing med ägg genom att exponera specifika membranproteiner på spermier ytan krävs för sperma-ägg fusion42. Möjligheten att genomgå överaktivering och akrosomen reaktion är följaktligen båda krävs för framgångsrik befruktning av ägg40,42. Tvärtemot vad har setts för mus sädesceller43,44,45, kan endast mänskliga spermaceller som är akrosomen-intakt binda till de zona pellucida46. När de mänskliga spermacellerna är bundna till zona pellucida måste de genomgå akrosomen reaktionen både penetrera zona pellucida41 och att exponera specifika membranproteiner som behövs för att fusionen med det ägg38. Tidpunkten för akrosomen reaktionen i mänskliga spermier är således avgörande för befruktning ska ske.
Som beskrivits ovan, Ca2 +-signalering är avgörande för normala spermier cell funktion8, och det är därför av stort intresse att kunna skärmen ett stort antal föreningar för effekter på Ca2 +-signalering i mänskliga spermaceller. På samma sätt som bara mänskliga spermaceller som genomgår akrosomen reaktion vid rätt tid och plats kan penetrera zona pellucida och gödsla den ägg46,47, är det också av stort intresse för att kunna testa föreningar för sin förmåga att påverka akrosomen reaktionen i mänskliga spermier. I detta syfte beskrivs två medium-throughput screening analyser: 1) test för effekter på Ca2 +-signalering i mänskliga spermaceller, och 2) test för förmågan att inducera akrosomen reaktion i mänskliga spermaceller.
Analys 1 är en medium-genomströmning Ca2 +-signalering assay. Denna fluorescens plate reader-baserad teknik övervakar ändringar i fluorescens som funktion av tiden samtidigt i flera brunnar. Den Ca2 +-känsliga fluorescerande färgämne, Fluo-4 har en K-d för Ca2 +≈ 335 nM och är cell-diffusionskoefficient i AM (acetoximetyl) ester form. Med Fluo-4, är det möjligt att mäta förändringar i [Ca2 +]i över tid och efter tillsats av föreningar av intresse för spermacellerna. Analysen har utvecklats av labbet av Timo Strünker 201113 och har sedan använts i flera studier att skärmen föreningar för effekter på Ca2 +-signalering i mänskliga spermier1,2,3, 4,5. En liknande metod har också använts till skärmen flera drog kandidater48. Dessutom är denna analys också användbart för att bedöma på farmakologiska verkningssätt åtgärd1,2,3,4,5, DOS-respons kurvor1, 2,3,4,5, kompetitiv hämning1,2, additivitet1,2och synergism3 av föreningar av intresse.
Analysen 2 är en medium-genomströmning akrosomen reaktion analysen. Denna bild cytometer-baserad teknik mäter mängden livskraftig akrosomen reagerade sädesceller i ett prov, med tre fluorescerande färger: propidium jodid (PI), FITC-kopplade lektin Pisum sativum (FITC-PSA) och Hoechst-33342. Analysens ändrades från ett liknande flöde flödescytometri-baserade metoden av Zoppino et al.49 och har använts i flera studier6,7. När det gäller de Ca2 +-signalering assay, denna akrosomen reaktion analys kunde också användas för att bedöma dos-responskurvor, hämning, additivitet och synergier av föreningar av intresse.
Den medelstora genomströmning Ca2 + signalering analysen baseras på mätningar av fluorescens från enda mikrobrunnar varje innehållande omkring 250.000 sädesceller. Fångade signalen är i genomsnitt från alla enskilda sädesceller i brunnen. Analysen ger således ingen rumslig information om var specifikt i den spermie [Ca2 +]jag har ändrats, i hur stor andel av de spermier som en förändring i [Ca2 +]jag äger rum, eller hur heterogena svar är mellan de en…
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill erkänna labbet av Timo Strünker för övervakning av AR och DLE under sina vistelser på hans labb. Dessutom vill vi tacka våra kolleger på avdelningen för tillväxt och reproduktion, Köpenhamn universitetssjukhus, Rigshospitalet för deras hjälp med att sätta upp dessa två analyser. Detta arbete stöds av bidrag från Innovationsfonden Danmark (grant nummer 005-2010-3 och 14-2013-4).
0.2 µm pore filter | Thermo Fisher Scientific, USA | 296-4545 | |
1 L measuring cylinder | Thermo Fisher Scientific, USA | 3662-1000 | |
1,4 and 2 mL plastic tubes | Eppendorf, Germany | 30120086 and 0030120094 | |
12-channel pipette | Eppendorf, Germany | 4861000813 | |
384 multi-well plates | Greiner Bio-One, Germany | 781096 | |
15 and 50 mL platic tubes | Eppendorf, Germany | 0030122151 and 30122178 | |
A2-slide | ChemoMetec, Denmark | 942-0001 | |
Automatic repeater pipette | Eppendorf, Germany | 4987000010 | |
CaCl2 | |||
Centrifuge | |||
Clean wide-mouthed plastic container for semen sample | |||
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | |||
FITC-coupled lectin of Pisum sativum (FITC-PSA) | Sigma-Aldrich, Germany | L0770 | |
Fluo-4 AM | Thermo Fisher Scientific, USA | F14201 | |
FLUOstar OMEGA fluorescence microplate reader | BMG Labtech, Germany | ||
Glucose anhydrous | |||
HEPES | |||
Hoechst-33342 | ChemoMetec, Denmark | 910-3015 | |
Human serum albumin (HSA) | Irvine Scientific | 9988 | For addition to HTF+ |
Immobilizing solution containing 0.6 M NaHCO3 and 0.37% (v/v) formaldehyde in distilled water | |||
Incubator | |||
KCl | |||
KH2PO4 | |||
Magnetic stirrer | |||
MgSO4 | |||
Na-Lactate | |||
NaCl | |||
NaHCO3 | |||
NC-3000 image cytometer | ChemoMetec, Denmark | 970-3003 | |
Pipettes and piptting tips | |||
propidium iodide (PI) | ChemoMetec, Denmark | 910-3002 | |
Purified water | |||
Rack for placing 50 mL plastic tubes in 45° angle | |||
S100 buffer | ChemoMetec, Denmark | 910-0101 | |
SP1-cassette | ChemoMetec, Denmark | 941-0006 | |
Volumetric flasks of appropriate sizes | |||
Vortexer |