Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biology

Medium-throughput Screening analyser för bedömning av effekter på Ca2 +-signalering och akrosomen reaktion i mänskliga spermier

doi: 10.3791/59212 Published: March 1, 2019

Summary

Här, två medium-genomströmning analyser för bedömning av effekter på Ca2 +-signalering och akrosomen reaktion i mänskliga spermier beskrivs. Dessa analyser kan användas för att snabbt och enkelt skärmen stora mängder föreningar för effekter på Ca2 +-signalering och akrosomen reaktion i mänskliga spermier.

Abstract

Ca2 +-signalering är nödvändig för normal spermie funktion och manlig fertilitet. Likaså är akrosomen reaktionen avgörande för möjligheten för en mänsklig spermie att penetrera zona pellucida och befrukta ägget. Det är därför av stort intresse att testa föreningar (t.ex. miljö kemikalier eller läkemedelskandidater) för sin effekt på Ca2 +-signalering och akrosomen reaktion i mänskliga spermier antingen att undersöka de potentiella negativa effekterna på människors spermie funktion eller att undersöka en möjlig roll som preventivmedel. Här beskrivs två medium-kapacitet idag: 1) en fluorescens-baserad analys för bedömning av effekter på Ca2 +-signalering i mänsklig sperma och 2) en bild flödescytometrisk analys för bedömning av akrosomen reaktion i mänskliga spermier. Dessa analyser kan användas för att screena ett stort antal föreningar för effekter på Ca2 +-signalering och akrosomen reaktion i mänskliga spermier. Dessutom kan analyserna användas för att generera mycket specifika dos-responskurvor för enskilda föreningar, bestämma potentiella additivitet/synergier för två eller flera föreningar, och att studera farmakologiska verkningsmekanism genom kompetitiv hämning experiment med CatSper-hämmare.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Syftet med de två analyser som beskrivs här är att undersöka påverkan på Ca2 +-signalering och akrosomen reaktion i mänsklig sperma, som har visats för flera föreningar i flera publikationer anställa dessa analyser1,2, 3,4,5,6,7. Ca2 +-signalering och akrosomen reaktionen är både viktigt att normala mänskliga spermie funktion och manlig fertilitet.

Det övergripande målet för en mänsklig spermie är att befrukta ägget. För att kunna framgångsrikt och naturligt befrukta ägget, måste funktioner i cellen spermier regleras ordentligt under resan av spermier cellen genom den kvinnliga genitalia8,9. Många av funktionerna spermie regleras via den intracellulära Ca2 +-koncentration [Ca2 +]jag (t.ex. spermier motilitet, Kemotaxis och akrosomen reaktion)10. En mognadsprocess som kallas capacitation, som återger spermie som gödning ägget, är också delvis reglerat av [Ca2 +]jag10. Ca2 +-strängpressning Ca2 +-ATPas pumpar11 upprätthålla ett ungefärligt 20.000 gånger Ca2 +-gradient över mänskliga spermier cellmembranet, med en vilande [Ca2 +]jag 50-100 Nm. Om Ca2 + tillåts korsa cellmembranet (t.ex. genom öppnandet av Ca2 +-kanaler), ett betydande inflöde av Ca2 + uppstår, ger upphov till en höjd av [Ca2 +]jag. Dock spermie också bär intracellulära Ca2 +-butiker, som kan frigöra Ca2 + och, därför, också ger upphov en höjd av [Ca2 +]i12. Intressant, alla kanal-medierad Ca2 +-inflöde i mänskliga spermaceller har hittills konstaterats för att ske via CatSper (CatJoniska kanal SpeRM), som uttrycks endast i spermierna11. I mänskliga spermaceller, CatSper aktiveras av endogena ligander progesteron och prostaglandiner genom distinkta ligand bindande platser13,14,15, leder till en snabb Ca2 +-inflöde till cellen spermier. Två huvudsakliga källor nära ägget ger höga nivåer av dessa endogena ligander. En är den follikulära vätska som innehåller höga halter av progesteron16. Den follikulära vätskan frigörs från mogna folliklar tillsammans med ägget vid ägglossningen och mixar med vätska inom den oviducts17. Andra huvudkällan är den cumulus celler som omger ägget och släppa höga nivåer av progesteron och prostaglandiner. Progesteron-inducerad Ca2 +-inflöde i spermacellerna har visat att medla chemotaxis mot ägg9,18, kontrollera spermier motilitet19,20 och stimulera akrosomen reaktion21. Utlösning av dessa enskilda [Ca2 +]jag-reglerade spermier funktioner i rätt ordning och vid rätt tidpunkt är avgörande för befruktning av ägg8. I linje med detta, en suboptimal progesteron-inducerad Ca2 +-inflöde har hittats ska associeras med minskad fertilitet22,23,24,25,26 ,27,28,29 och funktionella CatSper är avgörande för manlig fertilitet26,30,31,32, 33,34,35,36.

Som spermacellerna nå ägget, ett händelseförlopp måste äga rum för befruktning att inträffa: (1) spermacellerna måste penetrera det omgivande cumulus celllagrar, 2) binder till zona pellucida, 3) exocytose acrosomal innehåll, så kallade akrosomen reaktionen 37, 4) penetrera zona pellucida och 5) säkring med ägg membranet att slutföra befruktning38. För att kunna gå igenom dessa steg och befrukta ägget, måste spermie först genomgå capacitation11, som börjar som spermacellerna lämnar sädesvätskan som innehåller ”decapacitating” faktorer39 och simma in i vätskorna av kvinnliga fortplantningsorganen med höga nivåer av bikarbonat och albumin37. Capacitation återger spermacellerna kan genomgå en överaktivering, en form av motilitet med kraftig stryk av Flagellen och akrosomen reaktion37. Hyperactivated motilitet krävs för genomträngningen av zona pellucida40, och akrosomen innehåller olika Hydrolytiska enzymer som stöd denna penetration processen41. Dessutom återger akrosomen reaktionen spermacellerna kan fusing med ägg genom att exponera specifika membranproteiner på spermier ytan krävs för sperma-ägg fusion42. Möjligheten att genomgå överaktivering och akrosomen reaktion är följaktligen båda krävs för framgångsrik befruktning av ägg40,42. Tvärtemot vad har setts för mus sädesceller43,44,45, kan endast mänskliga spermaceller som är akrosomen-intakt binda till de zona pellucida46. När de mänskliga spermacellerna är bundna till zona pellucida måste de genomgå akrosomen reaktionen både penetrera zona pellucida41 och att exponera specifika membranproteiner som behövs för att fusionen med det ägg38. Tidpunkten för akrosomen reaktionen i mänskliga spermier är således avgörande för befruktning ska ske.

Som beskrivits ovan, Ca2 +-signalering är avgörande för normala spermier cell funktion8, och det är därför av stort intresse att kunna skärmen ett stort antal föreningar för effekter på Ca2 +-signalering i mänskliga spermaceller. På samma sätt som bara mänskliga spermaceller som genomgår akrosomen reaktion vid rätt tid och plats kan penetrera zona pellucida och gödsla den ägg46,47, är det också av stort intresse för att kunna testa föreningar för sin förmåga att påverka akrosomen reaktionen i mänskliga spermier. I detta syfte beskrivs två medium-throughput screening analyser: 1) test för effekter på Ca2 +-signalering i mänskliga spermaceller, och 2) test för förmågan att inducera akrosomen reaktion i mänskliga spermaceller.

Analys 1 är en medium-genomströmning Ca2 +-signalering assay. Denna fluorescens plate reader-baserad teknik övervakar ändringar i fluorescens som funktion av tiden samtidigt i flera brunnar. Den Ca2 +-känsliga fluorescerande färgämne, Fluo-4 har en K-d för Ca2 +≈ 335 nM och är cell-diffusionskoefficient i AM (acetoximetyl) ester form. Med Fluo-4, är det möjligt att mäta förändringar i [Ca2 +]i över tid och efter tillsats av föreningar av intresse för spermacellerna. Analysen har utvecklats av labbet av Timo Strünker 201113 och har sedan använts i flera studier att skärmen föreningar för effekter på Ca2 +-signalering i mänskliga spermier1,2,3, 4,5. En liknande metod har också använts till skärmen flera drog kandidater48. Dessutom är denna analys också användbart för att bedöma på farmakologiska verkningssätt åtgärd1,2,3,4,5, DOS-respons kurvor1, 2,3,4,5, kompetitiv hämning1,2, additivitet1,2och synergism3 av föreningar av intresse.

Analysen 2 är en medium-genomströmning akrosomen reaktion analysen. Denna bild cytometer-baserad teknik mäter mängden livskraftig akrosomen reagerade sädesceller i ett prov, med tre fluorescerande färger: propidium jodid (PI), FITC-kopplade lektin Pisum sativum (FITC-PSA) och Hoechst-33342. Analysens ändrades från ett liknande flöde flödescytometri-baserade metoden av Zoppino et al.49 och har använts i flera studier6,7. När det gäller de Ca2 +-signalering assay, denna akrosomen reaktion analys kunde också användas för att bedöma dos-responskurvor, hämning, additivitet och synergier av föreningar av intresse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Insamling och analys av human sädesvätska prover i protokollen följer riktlinjerna i den forskningsetisk kommitté av Danmarks huvudstad regionen. Alla sperma prov har erhållits efter informerat samtycke från frivilliga givare. Efter leverans, var proverna helt anonymiserade. Varje givare fått en avgift på 500 DKK (ca $75 US-dollar) per prov för sina besvär. Proverna analyseras samma dag som leverans och sedan förstöras omedelbart efter laboratorieförsök.

Obs: Medium genomströmning Ca2 +-signalering analys beskrivs i steg 4-5 och medelstora genomströmning akrosomen reaktion analysen i steg 6-7. Protokollet till förbereda mänskliga tubal vätska (HTF+) medium beskrivs i steg 1 och rening av sädesceller för analyserna beskrivs i steg 2-3.

1. beredning av mänskliga Tubal vätska (HTF+) Medium

Obs: Användning mätkolvar av lämpliga storlekar, en 1 L mäta cylinder, en magnetomrörare, salter som anges i tabell 1 och tabell 2, renat vatten, ett 0,2 µm porstorlek filter och 50 mL plaströr.

  1. Förbereda stamlösningar av salter i renat vatten (tabell 1).
    1. Lägg till mängden salt som anges i tabell 1 till en mätkolv av lämplig storlek, lägga till renat vatten till lite nedanför önskad volym och blanda väl med en magnetisk omrörare.
    2. När salt är helt upplöst, bort magneten och fyll med renat vatten till önskad slutlig volym.
  2. Överföra stamlösning till en flaska och förvara fram till användning.
    Obs: Stamlösningar kan hållas och återanvändas för längre tidsperioder: glukos och HEPES vid-20 ° C och de andra lager lösningarna vid rumstemperatur (RT).
  3. Laga 1 L av HTF+ medium från stamlösningar (tabell 2).
    1. Säkerställa att alla lager lösningar är helt upplöst och väl blandas före användning.
    2. Lägg mängden stamlösning och salt som anges i tabell 2 till en 1 L mäta cylinder och renat vatten till 900 mL.
    3. Blanda väl med en magnetisk omrörare och justera pH till 7,35 med NaOH-lösning.
    4. Ta bort magneten och tillsätt renat vatten till 1000 mL.
  4. Sterila filtratet HTF+ medium genom ett 0,2 µm porstorlek filter, alikvotens HTF+ medium till 50 mL plaströr och store vid 4 ° C fram till användning.
  5. Precis innan du kör ett experiment, tillsätt 165 µL av Na-Pyruvat till 50 mL alikvoten att få Na-Pyruvat koncentration på 0,33 mM.
    Obs: Mänskliga tubal flytande medium kan också erhållas från olika kommersiella leverantörer. När du använder 4 mM HCO3 medium, kan prover inkuberas med stängt lock i en inkubator utan extra CO2 i luften utan stora drivor i pH. Om en CO2 inkubator är tillgänglig, kan motsvarande mängd CO2 beräknas med hjälp av Henderson-Hasselbalch ekvation och används. Om du använder 25 mM HCO3 medium, bör prover inkuberas med öppet lock i en CO2 inkubator med luft som innehåller en motsvarande mängd CO2 (beror på lufttrycket vanligtvis mellan 5-10%) för att undvika en drift i pH. Den exakta mängden CO2 kan beräknas med hjälp av Henderson-Hasselbalch ekvation.

2. rening av rörliga spermier celler via Swim-up (figur 1)

Obs: Använd en ren wide-mouthed plastbehållare för sperma provet, en inkubator, 50 mL plaströr, ett rack för att placera 50 mL plaströr vid 45° vinkel, HTF+ medium (beredd i steg 1 eller erhållas från kommersiell leverantör), centrifug och humant serum albumin (HSA).

  1. Skaffa ett nymalet donerade mänskliga spermaprov produceras genom onani och utropade en wide-mouthed ren plast behållare. Använd endast sperma prov som uppfyller de parametrar som fastställts av WHO laboratory manualen för undersökning och behandling av human sädesvätska.
  2. Inkubera provet vid 37 ° C i 15-30 min så att det till vätskeform.
  3. Värma upp 50 mL av HTF+ medium med 4 mM HCO3 till 37 ° C.
  4. Plats ren 50 mL plaströr i ett rack i en 45° vinkel (för att öka yta mellan vätskor). Använd 1 tub per mL raw sperma.
  5. Tillsätt 4 mL av förvärmd HTF+ medium till vart och ett av rören.
  6. Noggrant Pipettera 1 mL av den flytande spermaprov till botten av varje tub innehållande 4 mL förvärmd HTF+. Undvik utsläpp av luftbubblor.
  7. Stäng locken och inkubera rören vid 37 ° C i 1 h.
  8. Försiktigt aspirera och överföra så mycket av den övre delen (HTF+ med motila spermier celler) som möjligt till en ny 15 mL plaströr, samtidigt uppmärksamma att ingenting den nedre delen (sperma med orörliga och döda celler) ingår. Generellt är det säkert att överföra 3,5 mL i det översta bråk, utan att störa den nedre del. För att undvika sug turbulens, skära av det yttersta 1-2 mm av pipettspetsen i en 45° vinkel för att få en större öppning.
  9. Fylla upp den 15 mL plaströr med HTF+ att tvätta cellerna och centrifugera röret vid 700 x g i 10 min vid RT.
  10. Försiktigt aspirera och avlägsna supernatanten och återsuspendera pelleten spermie i 2 mL av HTF+.
  11. Överför 20 µL av spermier suspensionen till två små plaströr för bedömning av spermiekoncentration (se steg 3).
  12. Fylla upp den 15 mL plaströr med HTF+ att tvätta cellerna och centrifugera röret vid 700 x g i 10 min vid RT.
  13. Försiktigt aspirera och avlägsna supernatanten och återsuspendera pelleten spermie till 10 x 106 celler/mL (baserat på cellkoncentrationen bedömas i steg 2.11).
    1. För experiment med un-capacitated spermaceller (rutinmässiga Ca2 +-signalering assay)
      1. Att resuspendera cellerna i HTF+ med 4 mM HCO3.
      2. Tillsätt 30 µL humant serumalbumin (HSA) (100 mg/mL) per mL HTF+ att få en slutlig koncentration på 3 mg/mL.
      3. Stäng locken och inkubera i ≥ 1 h vid 37 ° C.
    2. För experiment med capacitated spermaceller (akrosomen reaktion assay)
      1. Att resuspendera cellerna i HTF+ med 25 mM HCO3.
      2. Tillsätt 30 µL av HSA (100 mg/mL) per mL HTF+ att få en slutlig koncentration på 3 mg/mL.
      3. Fäst locken löst och inkubera vid 37 ° C med motsvarande mängd CO2 timmar på ≥3 (se steg 1, vanligtvis mellan 5-10% CO2).

3. räkna av spermier

Obs: Spermierna kan antingen räknas manuellt50 eller använda en bild cytometer51, som beskrivs här. Använda en bild cytometer, en vortexer, S100 buffert, en SP1-kassett, simma upp renas sädesceller (bereddes i steg 2).

  1. Späd en 20 µL delmängd till en faktor på 10, 20, 30, 50 eller 90 i S100 buffert med en rund botten 2 mL tub enligt den förvänta koncentrationen (utvärderas av manuell inspektion av pelleten i steg 2.10). Använd den utspädning som ligger närmast koncentrationen förväntas (dvs. om en koncentration av 15 x 106 spermier celler per mL efter simma upp väntas späd sedan 20 µL sperma provet med 380 µL av S100 buffert [utspädningsfaktorn 20]).
  2. Blanda väl för 10 s med en vortex mixer på maximal 700 rpm, fördjupa SP1-kassett i provet och tryck in den vita kolven helt ner till aspirera en alikvot av provet i kassetten.
  3. Öppna den bild cytometer, placera kassetten i facket och kör analysen Greve av PI färgas mänskliga spermaceller Assay enligt tillämpad utspädningsfaktorn (valt i steg 3.1).
  4. Upprepa steg 3.1-3.3 med en annan 20 µL prov, med hjälp av en närmast den uppmätta koncentrationen som erhållits från de första 20 µL provet utspädningsfaktor.
  5. Beräkna genomsnittlig spermie koncentration från de två mätningarna.
  6. Multiplicera menar spermier cellkoncentrationen med den ursprungliga volymen att erhålla antalet totala spermie (i steg 2, denna ursprungliga volym är 2 mL).

4. mätning av ändringar i gratis intracellulära Ca2 +-koncentration ([Ca2 +]jag) använder Ca2 +- fluorimetry (figur 2)

Obs: Använda en fluorescens Plattläsare, 384 plattor med flera, Fluo-4 AM, simma upp renat sädesceller (beredd i steg 2), föreningar av intresse som samt positiva och negativa kontroller, automatisk repeater pipett och 12-kanals pipett.

  1. Förbereda en 2 mM Fluo-4 AM lager genom att lägga till 22,7 µL av dimetyl sulfoxid (DMSO) till en injektionsflaska med 50 µg Fluo-4 AM och blanda röret väl.
  2. Tillsätt en alikvot av 700 µL simma upp återvunna spermier suspension (capacitated eller un-capacitated som beskrivs i steg 2) i ett nytt rör. 700 µL av sperma prov är det belopp som behövs för att analysera en rad 24 brunnar i 384-mikrobrunn plattan (används för att testa 3 kontroller och 9 föreningar i midjekort jacka).
  3. Tillsätt 3,5 µL av Fluo-4 AM stamlösningen till de 700 µL av spermier suspensionen att erhålla en slutlig koncentration på 10 µM Fluo-4 AM.
  4. Inkubera provet under 45 minuter vid 37 ° C, skyddas från ljus.
  5. Centrifugera provet vid 700 x g i 10 min, aspirera och kasta bort supernatanten för att ta bort överflödig Fluo-4.
  6. Återsuspendera färgade pellets i HTF+ till 5 x 106 celler/mL (dvs., Använd 2 x volymen av cellsuspensionen i steg 4,2)
  7. Preparera utspädningar av föreningar och kontroller (kan göras under inkubationstiden och centrifugering perioder steg 4.4 och 4.5, respektive).
    1. Späd föreningar, och en negativ kontroll (buffert med fordon) samt en positiv kontroll (progesteron) i HTF+. Späd föreningar och kontroller till 3 x önskad slutliga koncentration, som de är utspädd 1:3 när de läggs till spermacellerna i steg 4.16.
    2. Placera rören med utspädningar i ett rack med ett avstånd mellan rören som motsvarar avståndet mellan 12-kanals pipetten använde i steg 4.16 pipettspetsar.
  8. Använda en automatisk repeater pipett (24 steg på 50 µL).
    1. Blanda Fluo-4 färgade sperma prov försiktigt genom att hela beloppet uppåt och nedåt en gång med.
    2. Lägga till alikvoter av 50 µL 24 brunnarna en rad i 384-mikrobrunn plattan.
  9. Placera mikrobrunn plattan i en fluorescens-spektrofotometer vid 30 ° C och stäng lådan.
  10. Välj lämpligt protokoll för Fluo-4. Excitera fluorescens vid 480 nm och rekord utsläpp på 520 nm. Använda det snabbaste möjligt cykel tid med inställning.
    Obs: Använda minst 10 blixtar per brunn och botten optik, om möjligt.
  11. Välj en brunn i raden och justera förstärkning till ett målvärde på 20%.
  12. Starta mätningen.
  13. Kontrollera baslinjen under de första 5 cyklerna.
    1. Om den fluorescerande avläsningen ökar eller minskar över tiden, stoppa experimentet, justera känsligheten och starta experimentet igen.
    2. Om baslinjen skiljer sig mycket mellan enskilda brunnar i rad, antingen den pipettering i steg 4,8 har varit ospecifika eller provet blandades inte tillräckligt väl före pipettering. Kassera experimentet.
    3. Om den fluorescerande avläsningen är jämförbara mellan brunnarna i raden och stadig under de 5 första cyklerna, fortsätta till nästa steg.
  14. Efter 10 cykler (används för baslinjen), pausa experimentet.
  15. Mata ut lådan med mikrobrunn plattan.
  16. Med 12-kanals pipett (2 steg av 25 µL), snabbt tillsätt 25 µL av de beredda lösningarna av föreningar och kontroller (från steg 4.7) till 12 väl dubbletter (24 brunnar) av en rad. Lösningar blir utspädd 1:3, eftersom brunnarna redan innehåller 50 µL av färgade sperma provet.
  17. Fortsätta mätningen så snabbt som möjligt (låda stängs automatiskt) att undvika saknas några fluorescerande signaler som inducerats av de tillagda föreningarna och kontroller. Förändringar i fluorescens (ΔF) efter tillägg av föreningar och kontroller kommer nu att fångas.
  18. Köra experimentet tills fluorescerande signaler har registrerats från den positiva kontrollen och föreningar av intresse.
  19. Stoppa experimentet och exportera raw fluorescens data för att analysera det som i steg 5.
    Obs: Allmänhet Fluo-4 AM har använts som den Ca2 +-känsliga fluorophore i analysen, men andra Ca2 +-känsliga fluorophores kan också användas om excitation och utsläpp spectra passar med filter i fluorescens plattan läsaren. Beroende på valet av fluorophore, se till att vinna nivån är inställd på ”säker” nivå där de inducerade fluorescerande topparna är inom mätområde av instrumentet. Detta kan testas genom att lägga till ionomycin till en enda brunn på en specifik känslighetsinställningen. Om detta induceras en fluorescerande signal över tröskeln, minska känsligheten och försök igen. Vissa använder Pluronic F-127 för att underlätta lastning av Fluo-41,13, men det har visat att detta inte är nödvändigt2. Det maximala antalet rader mäts samtidigt beror på två faktorer. (1) cykeltiden för instrumentet: om cykeltiden är för lång, inducerad toppar i [Ca2 +]jag kan missas. Mäta högst två rader samtidigt att hålla cykeltiden låg; (2) hastighet pipettering i steg 4.16: med 12-kanals pipetten är det möjligt att snabbt lägga till 12 olika lösningar till de 12 dubbla brunnarna (24 brunnar) 1 eller 2 rader (t.ex. en rad före inkuberas med fordon och en rad före inkuberas med hämmare) , utan att missa de inducerade Ca2 + topparna. Det rekommenderas dock inte att försöka lägga till 24 olika lösningar i två rader för samtidig mätning, som pipettering tips kommer att behöva bytas mellan de två sekventiella pipettering stegen, whereby inducerad Ca2 + toppar kan missas.

5. analys av Data från Ca2 +- fluorimetry

  1. Öppna raw fluorescens data erhållits och exporterade i steg 4.
  2. Beräkna medelvärdet från dubbla brunnar. Om det finns stora skillnader mellan dubbletter, ignorera data från specifika brunnarna.
  3. Definiera baslinjen som de 10 första cyklerna.
  4. Beräkna ΔF/F0 (%) som procentuella förändring av fluorescens (ΔF) över tid efter tillägg av föreningar och kontroller med avseende på den genomsnittliga basala fluorescensen (F0) under de 10 första cyklerna (baslinje).
  5. Om du använder data för generering av DOS-responskurvor, subtrahera avläsningen av negativ kontroll från andra brunnar, ta bort pipettering artefakter.

6. mätning av akrosomen reaktion

Obs: Använda en bild cytometer, en inkubator, fluorescerande färgämnen: PI, FITC-PSA och Hoechst-33342, föreningar av intresse liksom positiva och negativa kontroller, en immobilisera lösning innehållande 0,6 M NaHCO3 och 0,37% (v/v) formaldehyd i destillerat vatten, en A2-bilden och capacitated simma upp renat sädesceller (bereddes i steg 2).

  1. Bered en färgning som innehåller PI (5 µg/mL), PSA-FITC (50 µg/mL) och Hoechst-33342 (100 µg/mL) i HTF+, blanda den väl med en vortex mixer och skydda den från ljus fram till användning.
  2. Bered lösningar av föreningar och kontroller 10 x önskad slutliga koncentration, eftersom de är utspätt 1:10 i steg 6,5. Inkluderar alltid en negativ (fordon) kontroll och två positiva kontroller: progesteron 10 µM slutlig koncentration och ionomycin 2 µM slutlig koncentration.
  3. Överför alikvoter av 240 µL av capacitated spermier (bereddes i steg 2) till plaströr.
  4. Tillsätt 30 µL av färgning lösning till varje rör. Slutlig koncentration på fläckar kommer att vara: 0,5 µg/mL PI, 5 µg/mL FITC-PSA och 10 µg/mL Hoechst-33342.
  5. Tillsätt 30 µL lösningar med kontroller eller föreningar i varje rör (1:10 utspädning).
  6. Blanda proverna försiktigt genom pipettering upp och ner några gånger eller mild vortexa. På grund av mekanisk stress, Undvik överdriven blandning.
  7. Inkubera vid 37 ° C i 30 min.
  8. Förbereda nya plaströr med 100 µL av en immobilisera lösning innehållande 0,6 M NaHCO3 och 0,37% (v/v) formaldehyd i destillerat vatten, en per provrör.
  9. Efter inkubation, Blanda proverna väl genom pipettering och tillsätt 50 µL av provet i en tub med 100 µL immobilisera lösning.
  10. Innan du fyller kamrarna i en A2 bild, blanda provet väl genom pipettering. Fylla kamrarna noggrant med cirka 30 µL utan skapar luftbubblor.
    Obs: Under inkubationstiden, motila spermier celler tenderar att aggregera. Cell klumpar kan störa mätningarna (även om de är undantagna). Därför är det mycket viktigt att en noggrann blandning av pipettering efter inkubation. Likaså kan luftbubblor i kamrarna stör mätningarna. Därför fylla kammaren långsamt och ändra vinkeln på pipetten om kanterna av vätskan ska träffa och skapa en luftbubbla.
  11. Placera den inlästa bilden på facket av den bilden cytometer och stäng facket.
  12. Välj FlexiCyte protokoll och tryck kör.
    1. Välj följande inställningar för protokollet FlexiCyte: antal analytiska kanaler: 2; Maskering kanal: UV (LED365), detta är den kanal som används för bild segmentering; Kanal 1: Blå (LED475), exponeringstid 3.000 ms, utsläpp filter 560/35; Kanal 2: Grön (LED530), exponeringstid 500 ms, utsläpp filter 675/75. Minsta antal analyserade celler: 5000; Utesluta aggregerade celler: Ja.
  13. Upprepa steg 6,9-6.12 tills alla prover har mätts.

7. analys av Data från bilden flödescytometri

  1. Öppen data som erhållits i steg 6.
  2. Skapa de två följande tomterna att utvärdera mätningarna.
    1. Skapa ett spridningsdiagram av Hoechst-33342 intensitet vs. Hoechst-33342 område på biexponentiell skalor. Denna tomt kan vara används till gate ut Hoechst-33342 positiva objekt som antingen för litet eller för stort för att vara mänskliga spermaceller.
    2. Skapa ett spridningsdiagram FITC-PSA intensitet och PI intensitet på biexponentiell skalor. Denna tomt kan användas att bedöma mängden akrosomen reagerade spermierna genom användning av en kvadrant grind som skiljer de fyra grupperna på tomten (figur 3): 1) en PI positiva och FITC-PSA positiva gruppen: akrosomen reagerade icke sädesceller; (2) en PI negativa och positiva FITC-PSA-gruppen: akrosomen reagerade livskraftiga spermierna; (3) en PI positiva och FITC-PSA negativa gruppen: akrosomen intakt icke sädesceller; och 4) en PI negativ och FITC-PSA negativa gruppen: akrosomen intakt livskraftiga spermierna.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Representativa resultat från experiment testa effekten av 4 föreningar (A, B, C och D) tillsammans med en positiv (progesteron) och negativa (buffert) kontroll på [Ca2 +]jag i mänskliga spermier med hjälp av medium-genomströmning Ca2 +-signalering analysen kan ses i figur 4a. I figur 4bvisas en dos-responskurva av progesteron, som härrörde från peak ΔF/F0 (%) data som induceras av seriellt utspädda koncentrationer av progesteron, testade i ett annat experiment med hjälp av medium-genomströmning Ca2 +-signalering assay. Analysen av data från de Ca2 +-signalering assay förklaras i steg 5. Representativa resultat från experiment testa induktion av akrosomen reaktion i capacitated mänskliga spermaceller med en negativ kontroll (DMSO) eller de två positiva kontrollerna (progesteron och ionomycin) på medium-genomströmning akrosomen reaktion analys kan ses i den övre panelen i Diagram 3. Kvadrant gated spridningsdiagram från de 3 förhållandena ses. Analysen av akrosomen reaktion data förklaras i steg 7.

Tabell 1: lagerför lösningar för beredning av HTF + . Stamlösningar kan hållas och återanvändas för längre tidsperioder, glukos och HEPES vid-20 ° C och de andra lager lösningarna vid rumstemperatur. Säkerställa att alla lösningar är helt upplöst och väl blandas före användning.

Tabell 2: beredning av HTF + med 4 eller 25 mM HCO 3 - från stamlösningar av salter (förberedd i tabell 1). Na-laktat kan läggas som sirap, 60% (w/w) eller pulver. NaHCO3 läggs som pulver.

Figure 1
Figur 1: simma upp rening av motila mänskliga spermaceller. Vänster: Tube med HTF+ medium och en alikvot av flytande spermaprov pipetteras nedanför HTF+ medium. Höger: Efter 1 h av simma upp vid 37 ° C, motila spermierna har simmat upp till HTF+ medium. Immotile och döda spermier celler liksom icke-spermier celler kvar i sperman nedanför HTF+ medium. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Diagram över de medium-genomströmning Ca2 +-signalering assay. (en) sädesceller är laddade med en Ca2 +-känsliga fluorophore, tvättas och alikvoter är pläterade till brunnarna av en plattan med 384 brunnar. (b) plattan med 384 brunnar är placerad i en fluorescens-spektrofotometer vid 30 ° C. (c), fluorescens registreras före och efter tillsats av föreningar, positiv kontroll (progesteron) och negativ kontroll (buffert med fordonet). Avläsning i ΔF/F0 (%) efter negativ och positiv kontroll (pilar) illustreras i botten av (c). Illustration som används med tillstånd från Christian Schiffer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: bedömning av akrosomen reaktion använda bilden flödescytometri. (Övre panelen) Kvadrant gated scatter tomter från en negativ fordonskontroll (DMSO), och den positiva kontroller progesteron (Prog, 10 µM) och ionomycin (Iono, 2 µM). En ökning i cellerna i den nedre högra kvadranten (akrosomen reagerade viabla celler) ses när man jämför de positiva kontrollerna till kontrollen DMSO. (Nedre panelen) Mikroskopiska bilder av fluorescently märkt sädesceller, inklusive celler från alla fyra grupper. BF = ljusa fält, Hoechst = Hoechst-33342, PSA = Pisum Sativum Agglutinin, PI = Propidium jodid. Skalstapeln = 10 µm. Denna siffra har ändrats från Egeberg Palme et al. 20187. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Exempel på data från Ca2 +- fluorimetry. (en) förändringar i [Ca2 +]jag induceras av negativ kontroll, progesteron och sammansatta A, B, C och D. (b), progesteron dos-respons kurva. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Den medelstora genomströmning Ca2 + signalering analysen baseras på mätningar av fluorescens från enda mikrobrunnar varje innehållande omkring 250.000 sädesceller. Fångade signalen är i genomsnitt från alla enskilda sädesceller i brunnen. Analysen ger således ingen rumslig information om var specifikt i den spermie [Ca2 +]jag har ändrats, i hur stor andel av de spermier som en förändring i [Ca2 +]jag äger rum, eller hur heterogena svar är mellan de enskilda cellerna. För att få sådan information, måste experiment med enstaka cell upplösning (t.ex. enligt beskrivningen i50,52) användas. En annan nackdel med tekniken är den temporal upplösning, som är storleksordningen sekunder. Även om de 50 µL spermier proverna är välblandade när 25 µL av lösningarna som läggs, mätningarna kan först initieras efter lådan med flera plattan är tillbaka inuti fluorescens plattan läsaren. För att erhålla högre temporal upplösning, andra tekniker måste användas (t.ex. en stoppad flöde fluorimetry13,50). Fördelen med den medium-genomströmning Ca2 +-signalering assay, jämfört med encelliga eller singel-bra metoder är att samtidig mätning av flera mikrobrunnar använder en microplate reader tillåter snabb och enkel provning av flera föreningar sida-vid-sida med positiva och negativa kontroller (figur 4)1,2, lätt generering av DOS-responskurvor för enskilda föreningar (figur 4)1,2,3 , 4 , 5, bedömning av additivitet1,2 och synergism3 för två eller flera föreningar, liksom studier av verkningsmekanismen för föreningar men kompetitiv hämning experiment och användning av specifika farmakologiska hämmare (t.ex. CatSper-hämmare1,2,3,4,5). Dessutom genom att ändra fluorophore, kan analysen användas för att undersöka andra intracellulära förändringar (t.ex. pHi1,2). Slutligen, mer än en fluorophore kan användas på en gång att samtidigt mäta flera intracellulära förändringar. I framtiden, den medium-genomströmning Ca2 +-signalering assay kunde användas till skärmen föreningar av intresse för effekter på Ca2 +-signalering i mänskliga spermier (t.ex. miljö kemikalier eller läkemedelskandidater) att undersöka potentiellt negativa effekter på människors spermie funktion eller för att utreda en möjlig roll som preventivmedel.

Medium-genomströmning akrosomen reaktion analysen baseras på bilden flödescytometri, som utgör ett tilltalande substitut för att bedöma människors akrosomen reaktion jämfört med manuell utvärdering med fluorescens Mikroskop. Färgning mönster av intakt eller reagerar/reagerade acrosomes är inte alltid tydlig och en stor inom individuell variation kan vara följden härav. Med bild flödescytometri, är bilderna förvärvat och analyseras automatiskt. Maskering kanalen, i detta fall Hoechst-33342, definierar celler och endast fluorescerande signaler från dessa specifika områden ingår i dataanalysen. Därav, färgning utan organ som innehåller kvarstående cytoplasman ingår inte i dataanalysen. Dessutom är räknar statistik överlägsen fluorescensmikroskopi. För att räkna 200 celler genom informationsprojicering av Mikroskop är en utmanande och tidskrävande uppgift men med bild flödescytometri analysen av minst 5.000 celler tar mindre än ett par minuter. Dock på grund av låg förstoring av den bild cytometer, förmågan att utvärdera mätningarna är förlorad och man måste föra färgas provet till mikroskopet fluorescens. Införlivandet av kontroller är därför av yttersta vikt att validera mätningarna. Om kontrollerna inte reagerar som förväntat, ska resultaten från ett experiment kasseras. Protokollet beskrivs här inspirerades av arbete som utförts av Zoppino et al.49, som utvärderas mänskliga akrosomen reaktion av flödescytometri. De beskrivs närmare av realtid fluorescensmikroskopi hur PSA kommer in i acrosomal facket när membran-fusion porer visas vid induktion av akrosomen reaktion. En gång inuti acrosomal facket, PSA träskor och bildar ett märke som är stabil för längre tidsperioder. Ingen fixering eller permeabilisering tillämpas i protokollet och därför tolkningen av resultatet är tydligt: PSA inuti acrosomal facket av en livskraftig spermie motsvarar akrosomen reaktion. När det gäller de Ca2 +-signalering assay, akrosomen reaktion analysen kunde också användas för att bedöma dos-responskurvor, hämning, additivitet och synergier av föreningar av intresse. I framtiden, kan medium-genomströmning akrosomen reaktion analysen också användas till skärmen föreningar av intresse för effekter på akrosomen reaktion mänskliga spermier (t.ex. miljö kemikalier eller läkemedelskandidater) för att undersöka de potentiella negativa effekterna på denna mänskliga spermie funktion eller för att utreda en möjlig roll som preventivmedel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Författarna vill erkänna labbet av Timo Strünker för övervakning av AR och DLE under sina vistelser på hans labb. Dessutom vill vi tacka våra kolleger på avdelningen för tillväxt och reproduktion, Köpenhamn universitetssjukhus, Rigshospitalet för deras hjälp med att sätta upp dessa två analyser. Detta arbete stöds av bidrag från Innovationsfonden Danmark (grant nummer 005-2010-3 och 14-2013-4).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 µm pore filter Thermo Fisher Scientific, USA 296-4545
1 L measuring cylinder Thermo Fisher Scientific, USA 3662-1000
1, 4, and 2 mL plastic tubes Eppendorf, Germany 30120086 and 0030120094
12-channel pipette Eppendorf, Germany 4861000813
384 multi-well plates Greiner Bio-One, Germany 781096
15 and 50 mL platic tubes Eppendorf, Germany 0030122151 and 30122178
A2-slide ChemoMetec, Denmark 942-0001
Automatic repeater pipette Eppendorf, Germany 4987000010
CaCl2
Centrifuge
Clean wide-mouthed plastic container for semen sample
Dimethyl sulfoxide (DMSO)
FITC-coupled lectin of Pisum sativum (FITC-PSA) Sigma-Aldrich, Germany L0770
Fluo-4 AM Thermo Fisher Scientific, USA F14201
FLUOstar OMEGA fluorescence microplate reader BMG Labtech, Germany
Glucose anhydrous
HEPES
Hoechst-33342 ChemoMetec, Denmark 910-3015
Human serum albumin (HSA) Irvine Scientific 9988 For addition to HTF+
Immobilizing solution containing 0.6 M NaHCO3 and 0.37% (v/v) formaldehyde in distilled water
Incubator
KCl
KH2PO4
Magnetic stirrer
MgSO4
Na-Lactate
NaCl
NaHCO3
NC-3000 image cytometer ChemoMetec, Denmark 970-3003
Pipettes and piptting tips
propidium iodide (PI) ChemoMetec, Denmark 910-3002
Purified water
Rack for placing 50 mL plastic tubes in 45° angle
S100 buffer ChemoMetec, Denmark 910-0101
SP1-cassette ChemoMetec, Denmark 941-0006
Volumetric flasks of appropriate sizes
Vortexer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schiffer, C., et al. Direct action of endocrine disrupting chemicals on human sperm. EMBO reports. (2014).
  2. Rehfeld, A., Dissing, S., Skakkebæk, N. E. Chemical UV Filters Mimic the Effect of Progesterone on Ca(2+) Signaling in Human Sperm Cells. Endocrinology. 157, (11), 4297-4308 (2016).
  3. Brenker, C., et al. Synergistic activation of CatSper Ca2+ channels in human sperm by oviductal ligands and endocrine disrupting chemicals. Human Reproduction (Oxford, England). 33, (10), 1915-1923 (2018).
  4. Brenker, C., et al. The CatSper channel: a polymodal chemosensor in human sperm. The EMBO Journal. 31, (7), 1654-1665 (2012).
  5. Brenker, C., et al. Action of steroids and plant triterpenoids on CatSper Ca2+ channels in human sperm. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, (3), E344-E346 (2018).
  6. Rehfeld, A., et al. Chemical UV filters can affect human sperm function in a progesterone-like manner. Endocrine Connections. (2017).
  7. Egeberg Palme, D. L., et al. Viable acrosome-intact human spermatozoa in the ejaculate as a marker of semen quality and fertility status. Human Reproduction. Oxford, England. (2018).
  8. Publicover, S., Harper, C. V., Barratt, C. [Ca2+]i signalling in sperm--making the most of what you've got. Nature Cell Biology. 9, (3), 235-242 (2007).
  9. Publicover, S. J., et al. Ca2+ signalling in the control of motility and guidance in mammalian sperm. Frontiers in Bioscience. 13, 5623-5637 (2008).
  10. Publicover, S., Harper, C. V., Barratt, C. [Ca2+]i signalling in sperm--making the most of what you've got. Nature Cell Biology. 9, (3), 235-242 (2007).
  11. Lishko, P. V., et al. The control of male fertility by spermatozoan ion channels. Annual Review Of Physiology. 74, 453-475 (2012).
  12. Morris, J., et al. Cell-penetrating peptides, targeting the regulation of store-operated channels, slow decay of the progesterone-induced [Ca2+]i signal in human sperm. Molecular Human Reproduction. 21, (7), 563-570 (2015).
  13. Strünker, T., et al. The CatSper channel mediates progesterone-induced Ca2+ influx in human sperm. Nature. 471, (7338), 382-386 (2011).
  14. Lishko, P. V., Botchkina, I. L., Kirichok, Y. Progesterone activates the principal Ca2+ channel of human sperm. Nature. 471, (7338), 387-391 (2011).
  15. Miller, M. R., et al. Unconventional endocannabinoid signaling governs sperm activation via the sex hormone progesterone. Science (New York, N.Y.). 352, (6285), 555-559 (2016).
  16. Revelli, A., et al. Follicular fluid content and oocyte quality: from single biochemical markers to metabolomics. Reproductive Biology And Endocrinology RB&E. 7, 40 (2009).
  17. Lyons, R. A., Saridogan, E., Djahanbakhch, O. The effect of ovarian follicular fluid and peritoneal fluid on Fallopian tube ciliary beat frequency. Human Reproduction. 21, (1), Oxford, England. 52-56 (2006).
  18. Eisenbach, M., Giojalas, L. C. Sperm guidance in mammals - an unpaved road to the egg. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 7, (4), 276-285 (2006).
  19. Alasmari, W., et al. The clinical significance of calcium-signalling pathways mediating human sperm hyperactivation. Human Reproduction. 28, (4), Oxford, England. 866-876 (2013).
  20. Alasmari, W., et al. Ca2+ signals generated by CatSper and Ca2+ stores regulate different behaviors in human sperm. The Journal of Biological Chemistry. 288, (9), 6248-6258 (2013).
  21. Tamburrino, L., et al. The CatSper calcium channel in human sperm: relation with motility and involvement in progesterone-induced acrosome reaction. Human Reproduction. 29, (3), Oxford, England. 418-428 (2014).
  22. Krausz, C., et al. Intracellular calcium increase and acrosome reaction in response to progesterone in human spermatozoa are correlated with in-vitro fertilization. Human Reproduction. 10, (1), Oxford, England. 120-124 (1995).
  23. Oehninger, S., et al. Defective calcium influx and acrosome reaction (spontaneous and progesterone-induced) in spermatozoa of infertile men with severe teratozoospermia. Fertility and Sterility. 61, (2), 349-354 (1994).
  24. Shimizu, Y., Nord, E. P., Bronson, R. A. Progesterone-evoked increases in sperm [Ca2+]i correlate with the egg penetrating ability of sperm from fertile but not infertile men. Fertility and Sterility. 60, (3), 526-532 (1993).
  25. Falsetti, C., et al. Decreased responsiveness to progesterone of spermatozoa in oligozoospermic patients. Journal of Andrology. 14, (1), 17-22 (1993).
  26. Williams, H. L., et al. Specific loss of CatSper function is sufficient to compromise fertilizing capacity of human spermatozoa. Human Reproduction. 30, (12), Oxford, England. 2737-2746 (2015).
  27. Forti, G., et al. Effects of progesterone on human spermatozoa: clinical implications. Annales d'Endocrinologie. 60, (2), 107-110 (1999).
  28. Krausz, C., et al. Two functional assays of sperm responsiveness to progesterone and their predictive values in in-vitro fertilization. Human Reproduction. 11, (8), Oxford, England. 1661-1667 (1996).
  29. Kelly, M. C., et al. Single-cell analysis of [Ca2+]i signalling in sub-fertile men: characteristics and relation to fertilization outcome. Human Reproduction. 33, (6), Oxford, England. 1023-1033 (2018).
  30. Brown, S. G., et al. Homozygous in-frame deletion in CATSPERE in a man producing spermatozoa with loss of CatSper function and compromised fertilizing capacity. Human Reproduction. 33, (10), Oxford, England. 1812-1816 (2018).
  31. Avenarius, M. R., et al. Human male infertility caused by mutations in the CATSPER1 channel protein. American Journal of Human Genetics. 84, (4), 505-510 (2009).
  32. Smith, J. F., et al. Disruption of the principal, progesterone-activated sperm Ca2+ channel in a CatSper2-deficient infertile patient. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, (17), 6823-6828 (2013).
  33. Hildebrand, M. S., et al. Genetic male infertility and mutation of CATSPER ion channels. European Journal of Human Genetics. 18, (11), 1178-1184 (2010).
  34. Avidan, N., et al. CATSPER2, a human autosomal nonsyndromic male infertility gene. European Journal of Human Genetic. 11, (7), 497-502 (2003).
  35. Zhang, Y., et al. Sensorineural deafness and male infertility: a contiguous gene deletion syndrome. BMJ Case Reports. 2009, (2009).
  36. Jaiswal, D., Singh, V., Dwivedi, U. S., Trivedi, S., Singh, K. Chromosome microarray analysis: a case report of infertile brothers with CATSPER gene deletion. Gene. 542, (2), 263-265 (2014).
  37. Visconti, P. E., Krapf, D., de la Vega-Beltrán, J. L., Acevedo, J. J., Darszon, A. Ion channels, phosphorylation and mammalian sperm capacitation. Asian Journal of Andrology. 13, (3), 395-405 (2011).
  38. Wassarman, P. M., Jovine, L., Litscher, E. S. A profile of fertilization in mammals. Nature Cell Biology. 3, (2), E59-E64 (2001).
  39. Leahy, T., Gadella, B. M. Sperm surface changes and physiological consequences induced by sperm handling and storage. Reproduction. 142, (6), Cambridge, England. 759-778 (2011).
  40. Suarez, S. S. Control of hyperactivation in sperm. Human Reproduction Update. 14, (6), 647-657 (2008).
  41. Liu, D. Y., Baker, H. W. Inhibition of acrosin activity with a trypsin inhibitor blocks human sperm penetration of the zona pellucida. Biology of Reproduction. 48, (2), 340-348 (1993).
  42. Okabe, M. The cell biology of mammalian fertilization. Development. 140, (22), Cambridge, England. 4471-4479 (2013).
  43. Inoue, N., Satouh, Y., Ikawa, M., Okabe, M., Yanagimachi, R. Acrosome-reacted mouse spermatozoa recovered from the perivitelline space can fertilize other eggs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, (50), 20008-20011 (2011).
  44. Jin, M., et al. Most fertilizing mouse spermatozoa begin their acrosome reaction before contact with the zona pellucida during in vitro fertilization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, (12), 4892-4896 (2011).
  45. Hirohashi, N., Yanagimachi, R. Sperm acrosome reaction: its site and role in fertilization. Biology of Reproduction. 99, (1), 127-133 (2018).
  46. Liu, D. Y., Garrett, C., Baker, H. W. G. Acrosome-reacted human sperm in insemination medium do not bind to the zona pellucida of human oocytes. International Journal of Andrology. 29, (4), 475-481 (2006).
  47. Overstreet, J. W., Hembree, W. C. Penetration of the zona pellucida of nonliving human oocytes by human spermatozoa in vitro. Fertility and Sterility. 27, (7), 815-831 (1976).
  48. Martins da Silva, S. J., et al. Drug discovery for male subfertility using high-throughput screening: a new approach to an unsolved problem. Human Reproduction. Oxford, England. 1-11 (2017).
  49. Zoppino, F. C. M., Halón, N. D., Bustos, M. A., Pavarotti, M. A., Mayorga, L. S. Recording and sorting live human sperm undergoing acrosome reaction. Fertility and Sterility. 97, (6), 1309-1315 (2012).
  50. Mata-Martínez, E., et al. Measuring intracellular Ca2+ changes in human sperm using four techniques: conventional fluorometry, stopped flow fluorometry, flow cytometry and single cell imaging. Journal of Visualized Experiments. (75), e50344 (2013).
  51. Egeberg, D. L., et al. Image cytometer method for automated assessment of human spermatozoa concentration. Andrology. 1, (4), 615-623 (2013).
  52. Nash, K., et al. Techniques for imaging Ca2+ signaling in human sperm. Journal of Visualized Experiments. (40), (2010).
Medium-throughput Screening analyser för bedömning av effekter på Ca<sup>2 +</sup>-signalering och akrosomen reaktion i mänskliga spermier
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rehfeld, A., Egeberg Palme, D. L., Almstrup, K., Juul, A., Skakkebaek, N. E. Medium-throughput Screening Assays for Assessment of Effects on Ca2+-Signaling and Acrosome Reaction in Human Sperm. J. Vis. Exp. (145), e59212, doi:10.3791/59212 (2019).More

Rehfeld, A., Egeberg Palme, D. L., Almstrup, K., Juul, A., Skakkebaek, N. E. Medium-throughput Screening Assays for Assessment of Effects on Ca2+-Signaling and Acrosome Reaction in Human Sperm. J. Vis. Exp. (145), e59212, doi:10.3791/59212 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter