Generazione, amplificazione e titolazione del virus sinciziale respiratorio ricombinante

Summary

Descriviamo un metodo per la generazione e amplificando geneticamente modificate virus sinciziale respiratorio (ad) e un saggio della placca ottimizzato per ad. Illustriamo questo protocollo creando due virus ricombinanti che rispettivamente permettono di quantificazione della replica di RSV e live analisi dei corpi di inclusione di RSV e dinamiche di granuli di corpi di inclusione-collegata.

Abstract

L’uso di virus ricombinanti è diventato cruciale in virologia di base o applicata. Genetica inversa ha dimostrata di essere una tecnologia estremamente potente, sia per decifrare i meccanismi di replicazione virale e per studiare farmaci antivirali o fornire la piattaforma di sviluppo per i vaccini. La costruzione e la manipolazione di un sistema di genetico inverso per un negativo-strand RNA virus come un virus respiratorio sinciziale (RSV), tuttavia, rimane delicate e richiede particolare know-how. Il genoma di RSV è un RNA single-strand, senso negativo di circa 15 kb che serve come modello per sia virale RNA replicazione e trascrizione. Il nostro sistema di genetica inversa utilizza una copia del cDNA del genoma di ceppo lunga RSV (HRSV). Questo cDNA, come pure di cDNA codificanti proteine virali della polimerasi complessa (L, P, N e M2-1), vengono inseriti in vettori di espressione individuale sotto sequenze di controllo della polimerasi di T7. La transfezione di questi elementi in cellule di BSR-T7/5, che esprimono stabilmente della polimerasi T7, consente la replica citoplasmatica e trascrizione di RSV ricombinante, dando origine a virioni geneticamente. Una nuova RSV, che è presente alla superficie delle cellule e nel surnatante cultura di BSRT7/5, si è riunita per infettare cellule HEp-2 per l’amplificazione virale. Due o tre cicli di amplificazione sono necessari per ottenere stock virali contenenti 1 x 10⁶ a 1 x 10⁷ unità formanti placca (PFU) / mL. Metodi per l’ottimale raccolta, congelamento e la titolazione degli stock virali sono descritti qui in dettaglio. Illustriamo il protocollo presentato qui creando due virus ricombinante rispettivamente esprimendo gratis proteina fluorescente verde (GFP) (RSV-GFP) o virale M2-1 fuso a GFP (RSV-M2-1-GFP). Vi mostriamo come utilizzare RSV-GFP per quantificare RSV replica e la RSV-M2-1-GFP per visualizzare strutture virali, come pure le dinamiche di proteina virale in cellule vive, utilizzando tecniche di microscopia dei video.

Introduction

RSV umana è la principale causa di ricovero in ospedale per infezione acuta delle vie respiratorie nei neonati nel mondo¹. Inoltre, RSV è associato a un onere notevole malattia negli adulti paragonabili all’influenza, con la maggior parte dell’ospedalizzazione e l’onere di mortalità in anziani². Non esistono vaccini o farmaci antivirali specifici disponibili ancora contro RSV, ma promettendo nuovi farmaci sono in sviluppo^3,4. La complessità e la pesantezza delle tecniche di quantificazione di moltiplicazione RSV ostacolare la ricerca di antivirali o vaccini nonostante i notevoli sforzi attuali. La quantificazione della moltiplicazione di RSV in vitro è generalmente basata su metodi laboriosi, lunghi e costosi, che consistono principalmente nell’analisi dell’effetto citopatico da microscopia, immunostaining, riduzione della placca saggi, quantitative trascrittasi inversa (qRT)-reazione a catena della polimerasi (PCR) ed enzima-collegata dell’immunosorbente test di analisi. Virus con genomi modificati e che esprimono i geni reporter, come quelli codificanti per la GFP, sono più adatti per tali proiezioni. Accoppiato all’uso di lettori di micropiastre automatizzati, virus ricombinante di reporter gene-trasportare può rendere queste analisi più adatta per scopi di alto-rendimento e standardizzazione.

RSV è un involucro,-senso virus a RNA che appartiene al genere di Orthopneumovirus di Pneumoviridae famiglia, ordine Mononegavirales⁵. Il genoma di RSV è un RNA single-strand, senso negativo di circa 15 kb, che contiene una regione non codificante alle estremità 3′ e 5′ chiamato Leader e Trailer e 10 unità trascrizionale codifica 11 proteine. I geni vengono ordinati come segue: 3′-NS1, NS2, N, P, M, SH, G, F, M2 (codifica per le proteine M2-1 e M2-2) e L-5′. il RNA genomico è strettamente confezionato dalla nucleoproteina N. Using il RNA genomico incapsidato come un modello, in modo virale RNA polimerasi RNA-dipendente (RdRp) trascrizione e replicazione del RNA virale. RdRp virale è composta da grande proteina L, che trasporta l’attività della polimerasi del nucleotide per sé, suo cofattore obbligatorio la fosfoproteina P e la proteina M2-1 che funziona come una trascrizione virale fattore⁶. Nelle cellule infette, RSV induce la formazione di inclusioni citoplasmiche chiamati corpi di inclusione (IBs). Le inclusioni citoplasmiche morfologicamente simili sono state osservate per diversi Mononegavirales^7,8,9,10. Recenti studi sul virus della rabbia, virus della stomatite vescicolare (VSV), il virus di Ebola e RSV ha mostrato che la sintesi di RNA virale si presenta in IBs, che può dunque essere considerata come fabbriche virali^{8,9,11, 12}. le fabbriche di virus concentrare il RNA e proteine virali, necessarie per la sintesi del RNA virale e contengono anche proteine cellulari^{13,14,15,16, 17}. IBs esibiscono un subcompartment funzionale chiamato granuli IB-collegato (IBAGs), che si concentrano il recentemente sintetizzato mRNA virale nascente insieme con la proteina M2-1. il RNA genomico e la L, P e N non vengono rilevati in IBAGs. IBAGs sono piccole strutture sferiche dinamici all’interno di IBs che presentano le proprietà di organelli liquido¹². Nonostante il ruolo centrale di IBs in moltiplicazione virale, pochissimo è conosciuto circa la natura, struttura interna, formazione e funzionamento di queste fabbriche virali.

L’espressione del genoma di un poliovirus da un cDNA ha permesso la produzione del primo clone virale infettiva nel 1981¹⁸. Per singolo filamento negativo virus del RNA, non era fino al 1994 che la produzione di un primo virus di rabbia dopo trasfezione di plasmidi in cellule¹⁹ ha avuto luogo. Il sistema genetico inverso basato su plasmide primo per RSV è stato pubblicato nel 1995²⁰. Genetica inversa hanno portato a grandi progressi nel campo della virologia. La possibilità di introdurre modifiche specifiche nel genoma virale ha fornito le comprensioni critiche nella replica e nella patogenesi del virus del RNA. Questa tecnologia inoltre notevolmente ha facilitato lo sviluppo di vaccini permettendo attenuazione specifici attraverso una serie mirata di modifiche. Modifiche di genoma permettendo una rapida quantificazione della moltiplicazione virale notevolmente migliorato lo screening antivirale e studio della loro modalità di azione.

Anche se descritto in precedenza, ottenendo geneticamente ad rimane delicato. Qui, dettagliamo un protocollo per creare due tipi di HRSV ricombinante, che esprimono rispettivamente RSV-GFP o RSV-M2-1-GFP. In questo protocollo, descriviamo le condizioni di transfezione necessarie per salvare i nuovi virus ricombinanti, come pure la loro amplificazione per ottenere stock virali con alto titolo, adatto per sperimentazioni riproducibile. La costruzione di vettori di genetica inversa di per sé non è descritto qui. Descriviamo i metodi per la raccolta ottimale e il blocco di stock virali. Il metodo più preciso per quantificare le particelle virali infettive rimane saggio della placca. Le cellule sono infettate con diluizioni seriali della sospensione analizzata e incubate con un overlay che vieta la diffusione di particelle virali libere nel surnatante. In tali condizioni, il virus infetterà solo celle contigue, formando una “targa” per ogni particella infettiva. Nell’analisi della titolazione RSV convenzionale, le piastre sono rivelate immunostaining e conteggiate sotto osservazione microscopica. Questo metodo è costoso e richiede tempo. Qui abbiamo descritto un protocollo molto semplice per un saggio della placca di RSV mediante sovrapposizione di cellulosa microcristallina che consente la formazione di placche visibili ad occhio nudo. Vi mostriamo come RSV-GFP può essere utilizzato per misura RSV replica e, quindi, di quantificare l’impatto di antivirali. Combinazione di genetica inversa e diretta tecnologia di imaging, dimostriamo come RSV-M2-1-GFP permette agli scienziati di visualizzare M2-1 in cellule vive e di seguire la dinamica di strutture virali intracellulari, come IBs.

Protocol

1. materiale preparazione Acquisto di media delle cellule (siero ridotto mezzi di comunicazione, minimo essenziale [MEM], 10 x MEM e Dulbecco s modified esente Eagle [DMEM]), reagente di transfezione e cellulosa microcristallina (Vedi Tabella materiali). Ottenere i seguenti vettori per genetica inversa: la genomica tutt’e i vettori di espressione che codifica la proteina di N e le proteine del complesso della polimerasi. I vettori genomici contengono il genoma completo del cDNA della …

Representative Results

In questo lavoro, abbiamo descritto un protocollo dettagliato per produrre ricombinanti virus RSV che esprime una proteina fluorescente (Figura 2). OSPRO-GFP, il gene GFP è stato introdotto tra i geni P e M, come descritto per il gene della ciliegio in lavoro precedentemente pubblicato21. In OSPRO-M2-1-GFP, il gene di M2 è stato lasciato intatto e un ulteriore gene che codifica per M2-1-GFP è stata inserita tra i geni<sup class="xre…

Discussion

Qui presentiamo un metodo di salvataggio del ricombinante ad da cinque plasmidi e la loro amplificazione. La capacità di manipolare il genoma del virus ha rivoluzionato la ricerca virologia per testare le mutazioni ed esprimere un ulteriore gene o una proteina virale taggata. La RSV abbiamo descritto e utilizzato come esempio in questo articolo è un virus che esprime un gene reporter, RSV-GFP (non pubblicati) ed esprime una proteina M2-1 fuso a un tag GFP¹². Salvataggio di RSV è impegnativo e r…

Materials

35mm µ dish for live cell imaging	Ibidi	81156
A549	ATCC	ATCC CCL-185
Avicel RC-591	FMC BioPolymer	Avicel RC-591	Technical and other information on Avicels is available at http://www.fmcbiopolymer.com. Store at room temperature. Protocol in step 4 is optimized for this reagent.
BSRT7/5		not commercially available	See ref 22. Buchholz et al, 1999
Crystal violet solution	Sigma	HT90132
Fluorescence microscope for observations	Olympus	IX73 Olympus microscope
Fluorescence microscope for videomicroscopy	Olympus	ScanR Olympus microscope
HEp-2	ATCC	ATCC CCL-23
HEPES ≥99.5%	Sigma	H3375
L-Glutamine (200 mM)	ThermoFisher Scientific	25030024
LIPOFECTAMINE 2000 REAGENT	ThermoFisher Scientific	11668019	Protocol in step 2.3. is optimized for this reagent.
MEM (10X), no glutamine	ThermoFisher Scientific	11430030
MEM, GlutaMAX Supplement	ThermoFisher Scientific	41090-028
MgSO4 ReagentPlus, ≥99.5%	Sigma	M7506
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	ThermoFisher Scientific	51985-026
Paraformaldehyde Aqueous Solution, 32%, EM Grade	Electron Microscopy Sciences	15714
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	ThermoFisher Scientific	15140122
Plasmids		not commercially available	see ref 21. Rameix-Welti et al, 2014
See Saw Rocker	VWR	444-0341
Si RNA GAPDH	Dharmacon	ON-TARGETplus siRNA D-001810-10-05	SMARTpool and 3 of 4 individual siRNAs designed by Dharmacon.
Si RNA IMPDH2	Dharmacon	ON-TARGETplus siRNA IMPDH2 Pool- Human L-004330-00-0005	SMARTpool of 4 individual siRNAs designed by Dharmacon. Individual references and sequences J-004330-06: GGAAAGUUGCCCAUUGUAA; J-004330-07: GCACGGCGCUUUGGUGUUC; J-004330-08: AAGGGUCAAUCCACAAAUU; J-004330-09: GGUAUGGGUUCUCUCGAUG;
Si RNA RSV N	Dharmacon	ON-TARGETplus custom siRNA	UUCAGAAGAACUAGAGGCUAU and UUUCAUAAAUUCACUGGGUUA
SiRNA NT	Dharmacon	ON-TARGETplus Non-targeting Pool
SiRNA transfection reagent	Dharmacon	DharmaFECT 1 Ref: T-2001-03	Protocol in steps 5.1.and 5.1.2 are optimized for this reagent.
Sodium Bicarbonate 7.5% solution	ThermoFisher Scientific	25080094
Spectrofluorometer	Tecan	Tecan infinite M200PRO