Summary
Здесь мы представляем протокол для установления важных конечных точек и пролиферативных маркеров небольших кишечных повреждений и компенсационного гиперраспространения с использованием модели мукозита, вызванного химиотерапией. Мы демонстрируем обнаружение размножающихся клеток с помощью специфического маркера клеточного цикла и использования небольшого кишечного веса, глубины склепа и высоты вилюуса в качестве конечных точек.
Abstract
Кишечная адаптация является естественным компенсационным механизмом, который возникает, когда кишечник теряется из-за травмы. Адаптивные реакции, такие как пролиферация клеток криптов и увеличение поглощения питательных веществ, имеют решающее значение для восстановления, но плохо понимаются. Понимание молекулярного механизма, лежащего в основе адаптивных реакций, имеет решающее значение для облегчения идентификации питательных веществ или лекарств для повышения адаптации. Различные подходы и модели были описаны во всей литературе, но для получения воспроизводимых данных необходим подробный описательный способ существенного выполнения процедур. Здесь мы описываем метод оценки важных конечных точек и пролиферативных маркеров небольших кишечных повреждений и компенсационного гиперраспространения с помощью модели мукозита, вызванного химиотерапией у мышей. Мы демонстрируем обнаружение размножающихся клеток с помощью специфического маркера клеточного цикла, а также использование небольшого кишечного веса, глубины склепа и высоты villus в качестве конечных точек. Некоторые из критических шагов в рамках описанного метода удаления и взвешивания тонкой кишки и довольно сложной программной системы, предложенной для измерения этого метода. Эти методы имеют преимущества, которые они не отнимают много времени, и что они являются экономически эффективными и легко выполнять и измерять.
Introduction
Кишечная адаптация является естественным компенсационным механизмом, который возникает, когда кишечник теряется из-за болезни или операции1,2. После травмы, кишечник проходит морфометрический и функциональный адаптивный ответ, характеризуется пролиферацией клеток склепа и увеличение поглощения питательных веществ3. Этот шаг имеет решающее значение для восстановления, но плохо понимается. Экспериментальные исследования адаптивной реакции кишечника были сосредоточены на изменениях, происходящих после небольшой резекции кишечника у мышей, крыс и свиней, но понимание молекулярного механизма, лежащего в основе адаптивной реакции в других видах травм (например, химических или бактериальных) имеет решающее значение для облегчения идентификации питательных веществ или препаратов для повышения адаптации. Экспериментально для описания сложного молекулярно-клеточного индекса малой кишечной патологии, включая гистопатологический скоринг и измерения исхода травмы, использовались различные подходы. Несмотря на это, в литературе отсутствует подробное описание того, как выполнять процедуры, необходимые для получения воспроизводимых данных. При выявлении факторов, участвующих в адаптации, таких как гормоны кишечника, легко, низкая стоимость, и воспроизводимые модели животных является оправданным, и здесь мы предлагаем использовать модель химиотерапии индуцированного мукозита кишечника (CIM).
Одной из простейших и очень информативных конечных точек как травмы, так и адаптации является измерение массы тонкой кишки (СИ). Мы знаем, что отличительной чертой мукозита является апоптоз энтероцитов, зависимый от времени атрофия вилюуса и снижение митоза. Поэтому изучение морфологии кишечника очень актуально вдоклинических моделях 4,5. У людей, снижение плазмы цитруллин, маркер функционирования энтероцитов, коррелирует с токсичностью оценки и воспалительные маркеры6 в дополнение к абсорфтивной емкости7, предполагая, что эта аминокислота является отличным биомаркером Мукозит. Цитруллин может быть измерен атакжем как у мышей, так иу крыс, и показал отличную корреляцию с длиной 8, выживанием склепа9и радиационным мукозитом10.
Основным преимуществом измерения плазменного цитруллина является способность собирать повторные измерения от одного животного. Тем не менее, несколько проб крови у мышей ограничивается общим объемом крови в размере 6 л/г/неделю и требует общей анестезии. Это, к сожалению, также ограничивает использование цитруллин измерений у мышей. Кроме того, измерение цитруллина требует высокопроизводительной жидкой хроматографии11,12,что является дорогостоящим и трудоемким. Недавно мы показали, что уровни цитруллина у мышей значительно коррелируют с весом SI (p qlt; 0.001) (неопубликованные данные), что делает цитруллин прямым измерением, отражающим массу энтероцита. Ограничение милиенции веса SI является необходимостью для мышей, которые будут принесены в жертву и, таким образом, не повторяющиеся измерения в пределах одной мыши возможны. Тем не менее метод дает возможность провести целый ряд других анализов тканей, направленных на исследовательский вопрос, и эти факты могут предположительно компенсировать дополнительное использование животных. Поэтому мы предлагаем использовать вес СИ как простой, недорогой и быстрый биомаркер травми и адаптации у мышей. Для обеспечения воспроизводимости и приемлемого аналитического изменения кишечник следует тщательно удалить из животного, покраснеть сольнием, опорожнить и высушить перед взвешиванием. В этой статье мы показываем, как именно выполняется эта процедура.
Еще одной отличительной чертой мукозита является потеря размножающихся клеток в склепе и компенсационная гиперпролиферация во время регенеративного периода3. Клеточный маркер Ki67 часто используется для определения быстрых пролиферативных клеток с помощью иммуногистохимии13. Хотя Ki67 является простым маркером распространения, он имеет тенденцию к неточности, как Ki67 присутствует во всех активных фазах клеточного цикла (G1, S, G2, и M)14. Специфическая маркировка имеет важное значение для обнаружения репликации клеток, поэтому мы предлагаем на месте включение 5-бромо-2'-deoxyuridine (BrdU), синтетический аналог тимидина, так как это в значительной степени ограничивается репликации клеток в S-фазе15. BrdU вводят в животных 150 минут до жертвовать и клетки могут затем быть обнаружены с иммуногистохимией используя антитела BrdU специфические. В этой статье метода мы покажем, как именно измерить площадь иммунопозитивных клеток BrdU в склепе с помощью свободного программного обеспечения изображения.
Морфологические и функциональные изменения часто изучаются в моделях 5-FU индуцированного мукозита, где адаптация кишечника оценивается по высоте и глубине склепа. В ходе этого исследования мы обнаружили, что во время острой фазы мукозита, который равен фазе травмы, пролиферация, измеренная включением BrdU, не коррелирует с глубиной крипты. В отличие от этого, глубина склепа значительно коррелирует с распространением, наблюдаемым в фазе ремонта мукозита, через 3-5 дней после индукции. Это говорит о том, что острая фаза мукозита не поддается измерению только глубиной склепа. Мы предлагаем, что при использовании распространения в качестве конечной точки в острой фазе мукозита мышей, BrdU включения предпочтительно использовать, но при количественной гиперраспространения на более поздней стадии во время регенеративной фазы, крипта глубина является разумным альтернативой регистрации BrdU. Цель этого исследования состояла в том, чтобы описать эту модель таким образом, что она может быть использована всеми исследователями, как в области онкологии, но особенно исследователи не знакомы с моделями травм кишечника.
Описанная модель может быть использована для фенотипа трансгенных моделей в соответствии с адаптивной реакцией, используя массу тела, вес SI и глубину склепа в качестве конечных точек. В качестве примера, мы показываем здесь, как мы использовали модель 5-фторурацил (5-FU) индуцированный мукозит в клеточной выбить модели с недостаточной L-клеточной секреции16. Глюкагон-как пептид-1 (GLP-1) и глюкагоноподобный пептид-2 (GLP-2) являются кишечными гормонами, со-секретированными из энтероэндокринных L-клеток в ответ на потребление пищи17,18. GLP-2 признан важным фактором заживления кишечника, регуляции слизистой апоптоза и улучшения барьерной функции СИ19,20,21,22. Основываясь на литературе, мы предположили, что эндогенные гормоны необходимы для компенсационного гиперраспространения, происходящих в адаптивной реакции после травмы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все описанные методы были проведены в соответствии с руководящими принципами датского законодательства, регулирующего эксперименты с животными (1987 год). Исследования проводились с разрешения Датской инспекции по экспериментам на животных (2013-15-2934-00833) и местного комитета по этике.
ПРИМЕЧАНИЕ: У женщин C57BL/6J мышей (No 20-25 г) были получены и размещены восемь на клетку в стандартном 12 ч свет, 12 ч темный цикл с свободным доступом к воде и стандартный чау. До начала экспериментов животных оставляли акклиматизироваться в течение недели.
1. Индукция мукозита с использованием 5-фторурацила
- Получить 5-фторурацил (5-FU) в 50 мг /мл раствора.
- Взвешивание и запись массы тела мышей. Из массы тела вычислите количество 5-FU для инъекций (например, 400 мг/кг).
- Подготовьте 1 мл шприца, подключенного к игле 27 G x 30 мм, и заполните шприц расчетным количеством 5-FU для инъекций.
- Сдержать мышь методом scruff. Для этого схватите основание хвоста одной рукой и поместите его на поверхность, захватив нос, например, крышку проволочного проволочного прокладки. Расположите хвост одной рукой, держите потертость шеи другой рукой.
- Твердо расположить тело мыши через одну руку, продлив указательный палец и большой палец назад, насколько это возможно. Поместите хвост между пальцами этой же руки, чтобы обеспечить мышь.
- Поддерживая мышь в твердом, но нежном сцеплении, разоблачите брюшную сторону мыши и вставьте иглу в интраперитонеальную полость в правом нижнем или левом квадранте живота. Аспир для обеспечения надлежащего размещения и вводить 400 мг/кг 5-ФУ.
2. Коллекция тканей
- Анестезируйте мышь интраперитонеальной инъекцией кетамина/ксилазина (100/10 мг/кг), разбавленного сольником (0,9% NaCl). Мониторинг глубины анестезии, наблюдая щепотку рефлекс вывода.
ПРИМЕЧАНИЕ: Анестезия является невосстановительной анестезией. - Запись веса анестезируется мыши.
- Поместите мышь в положение на спине и выполнить лапаротомию, чтобы разоблачить брюшную полость, а затем разрез грудной полости, чтобы ввести пневмоторакс.
- Используя ножницы, жертвуйте животным, разрезая диафрагму.
- Удалите тонкой кишки. Вырезать выше pylorus, тщательно убрать тонкой кишки от туши, пока cecum достигается и сделать разрез непосредственно перед cecum.
- Используя щипцы, аккуратно зажимая проксимальный просвет. Использование 1 мл шприц с 25 G иглы прилагается, промыть тонкой кишки с сольным раствором, чтобы удалить фекалии.
- Аккуратно удалите солен из просвета кишечника хирургическими инструментами.
- Поместите тонкий кишечник на чистую бумагу для промывки, чтобы тщательно удалить избыток солья.
- Запись веса промытой ткани.
- Рассчитайте покраснение небольшой кишечный вес в процентах от массы тела.
3. Гистология тонкого кишечника
-
Ткань подготовки
- В дым капюшон, использовать ножницы, чтобы сократить 3 см разделы покраснел кишечной ткани от каждой мыши из двенадцатиперстной кишки, jejunum и ileum и фиксации разделов в 10% формалин для 24 ч при комнатной температуре.
ПРИМЕЧАНИЕ: Фиксативный объем должен быть в 5–10 раз больше объема ткани. - Перенесите фиксированную ткань на разделочную доску.
- С помощью скальпеля, обрезать ткани примерно до 1 см и передать в встраивающую кассету.
ПРИМЕЧАНИЕ: Кассета должна быть помечена идентификацией образца (ID) карандашом. - Погрузите кассету в 70% этанола и храните при 4 градусах Цельсия до дальнейшей обработки.
- В дым капюшон, использовать ножницы, чтобы сократить 3 см разделы покраснел кишечной ткани от каждой мыши из двенадцатиперстной кишки, jejunum и ileum и фиксации разделов в 10% формалин для 24 ч при комнатной температуре.
-
Ткань встраивания в парафин
- Обезвоживать ткани, поместив в восходящие растворы алкоголя. Поместите кассету в 70% этанола на 1 ч, затем 80% этанола на 1 ч, 95% этанола на 1 ч и 100% этанола на 1,5 ч. Перенесите кассету со 100% этанола на ксилен за 1,5 ч.
- Погрузите кассету с парафиновой воском, нагретой между 58-60 градусов по Цельсию. Используйте щипцвы для размещения ткани в поперечной ориентации и оставить блоки для охлаждения более 24 ч до твердых.
-
Резка ткани с помощью микротома
- Поместите блок, ткань лицом вниз на льду в течение 5 мин. Используя микротом, обрезать парафин блоки толщиной 10-30 мкм, чтобы разоблачить поверхность ткани.
- Вырежьте поперечные сечения тканевого блока между 3х5 мкм, делая поперечные секции из двенадцатиперстной кишки, джеджуна и илеума.
- Поместите парафина лента в водяную ванну, расположенную между 40-45 градусов по Цельсию. Используйте щипки для разделения секций.
- Используйте слайды микроскопа, чтобы забрать разделы из воды.
- Воздух высушить горки в течение 30 минут перед окрашиванием.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для хранения в течение более длительного периода времени, хранить слайды в холодильнике.
-
Гематоксилин-эозин окрашивание тканей
- Поместите слайды микроскопа в гистологической колыбели. Депарафинизировать горки в отопительном шкафу, установленном при 60 градусах по Цельсию в течение 60 минут.
ПРИМЕЧАНИЕ: Слайды прямо из холодильника должны быть оставлены для достижения комнатной температуры, прежде чем поместить их в отопительный шкаф. - В дым капюшон, регидратировать ткани в 3 изменения клирингового агента(Таблица материалов), сделать 20 провалов в первой банке клирингового агента, а затем дать им стоять в течение 7'8 минут в каждом из двух дополнительных клиринговых агентов банки. Передача слайдов на нисходящие спиртовые растворы, начните с 3 изменений 99% этанола, а затем 2 изменения 96% этанола и 70% этанола. Сделайте минимум 20 провалов в каждой банке. Перенесите на протоканную воду и дайте горки стоять 5 мин.
- Погрузите слайды в отфильтрованный гематоксилин Мейера в течение 1 мин.
- Вымойте образцы в проточной водопроводной воде в течение 5 мин.
- Погрузите секции в эозиновые пятна в течение 1 х 2 мин, затем промыть в водопроводной воде.
- Обезвоживать ткани, поместив в восходящие растворы алкоголя. Начните с 70% этанола, затем 96% этанола, 96% этанола, и 4 раза 99% этанола. Сделайте минимум 20 провалов в каждой банке, и пусть колыбель стоять в 99% этанола, пока они не установлены.
- Гора покрываетлип, применяя небольшое количество монтажной среды к поверхности слайдов. Положите coverslip на верхней части монтажа среды, не создавая пузырьки под крышкой. Дайте ему высохнуть в течение 24 ч.
- Изучите ткани с помощью светового микроскопа, подключенного к камере, для получения гистологических фотографий. Используйте 10x цель, чтобы сделать снимки до полного покрытия ткани слайд достигается.
- Поместите слайды микроскопа в гистологической колыбели. Депарафинизировать горки в отопительном шкафу, установленном при 60 градусах по Цельсию в течение 60 минут.
4. Измерение глубины склепа и/или высоты вилюса
- Скачать и установить программное обеспечение для анализа (т.е., Дзен Lite, Таблица материалов).
- Откройте изображение в программном обеспечении и подключитесь к камере. Сделать снимки в режиме камеры с целью 20x.
- В режиме обработки откройте снимок.
- Для измерения глубины склепа: в 2D-представлениивыберите линейный инструмент из графической вкладки. Выберите хорошо ориентированный склеп и начните линию внизу вилюуса и закончите в нижней части склепа. Повторите это действие для 20 хорошо ориентированных склепов(Дополнительная диаграмма 1).
- Для измерения высоты villus: в 2D-представлениивыберите линейный инструмент из графической вкладки. Выберите хорошо ориентированный villus и начните линию в конце световой проекции и закончите в начале склепа. Повторите это действие для 20 хорошо ориентированных вилли(Дополнительная диаграмма 1).
- Переключиться с 2D-представления на представление измерения для отображения измерений.
- Экспорт измерений и вычислить среднее значение глубины склепа и высоты villus.
5. Количественная оценка BrdU (распространение) иммуногистохимией
- Инъекция раствора BrdU
- Взвешивание и запись массы тела мышей.
- В дым капюшон, подготовить репрезентативное количество 0,5% ж / V bromodeoxyuridine (BrdU) раствор в фосфат буферных солей (PBS).
- В дымовой капот вводят 50 мг/кг BrdU путем интраперитонеальной инъекции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы убедиться, что каждая мышь усыплена ровно через 150 минут после инъекции BrdU, введите каждую индивидуальную мышь подряд с интервалом 10–20 минут между ними, чтобы правильно выполнить сбор тканей. - Запишите время инъекции.
- Подождите 150 минут, затем обезопасить мышей и собрать ткани, как описано в шагах 2.1'2.7. Выполните иммуногистохимию BrdU, описанную в разделе 5.2.
- BrdU иммуногистохимия
- Подготовьте ткань, описанную в шагах 3.1.1.3.3.4.
- Для поиска антигена поместите колыбель слайда с секциями в стеклянную гистологическую банку и заполните ее буфером EDTA (pH 9) в микроволновой печи в течение 1 мин при 750 Вт, а затем 9 мин при 350 Вт Повторный цикл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что ткань не высыхает, что может потребовать добавления большего буфера в банки между нагреванием. - Вымойте разделы 2-3 раза в трис-буферированных сольники и полисорбат 20 (TBS-T) буфер для 3 мин каждый.
- Нанесите 5 капель блока перекиси(Таблицаматериалов) на 10–15 мин при комнатной температуре, чтобы блокировать эндогенную активность пероксидаза. Вымойте разделы 2–3 раза в буфере TBS-T по 3 мин каждый.
- Нанесите 5 капель буфера блока грызунов(Таблицаматериалов) на 30 мин при комнатной температуре, чтобы заблокировать неспецифические связывания. Вымойте разделы 2–3 раза в буфере TBS-T по 3 мин каждый.
- Инкубировать секции моноклональной мышью анти-BrdU антитела разбавленной 1:500 на 1 ч при комнатной температуре. Вымойте разделы 2–3 раза в буфере TBS-T по 3 мин каждый.
- Визуализируйте иммунопозитивность с помощью 3,3'-диаминобензидина (DAB), применяя 5 капель пероксидазы хрена на каждый слайд и инкубировать в течение 15 минут при комнатной температуре. Перенесите секции на капот дыма, добавьте 150 кЛ DAB и инкубировать в течение 5 минут.
ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда носите перчатки при обращении с DAB и утилизировать отходы надлежащим образом. - Промыть секции в деионизированной воде.
- Обезвоживать ткани и смонтировать покрытие, как описано в шагах 3.4.6 и 3.4.7.
- Визуализация иммунореакций
- Визуализируйте образец ткани с помощью светового микроскопа, подключенного к камере.
- Используйте программное обеспечение для анализа для получения изображений микроскопа с помощью 20-x цели всех разделов и сохранения файлов в . формат JPG.
- Сфотографать микрометр сцены с помощью 20-кратной цели, которая будет использоваться в качестве инструмента калибровки в программном обеспечении ImageJ.
- Измерение площади иммунореактивных клеток BrdU
- Установка программного обеспечения ImageJ(Таблица материалов).
- Назначение масштаба изображения в ImageJ: Откройте изображение микрометра сцены с помощью файла ImageJ (ru) Открытая команда меню. Выберите инструмент выбора прямой линии.
- Выберите прямой инструмент и нарисуйте прямую линию на изображении микрометра, чтобы определить известное расстояние.
- Выберите шкалу набора в меню «Анализ».
- Введите значение в поле Known Distance и определите единицу длины в коробке Unit of Length. Выберите Глобальный, чтобы эта калибровка применима ко всем изображениям, которые открываются в этой сессии ImageJ.
- Откройте изображение интереса с помощью файла ImageJ (ru) Открытая команда меню для измерения площади иммунореактивных клеток BrdU в склепе.
- Установите цветную графику на 8-битную под меню Image/Type.
- Увеличьте контрастность изображения под контрастом Process/Enhance и установите насыщенные пиксели до 0,4%.
- Примените порог к изображению, чтобы сегментировать иммунопозитивность. Выберите изображение/Нарежье под меню, затем порог и выберите красный цвет (темная область, показанная красным цветом). Выберите порог около 10–20%, переместив пороговую планку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите порог, который включает в себя все положительные клетки BrdU с как можно меньше фона, как это возможно. Выбранный процент должен применяться ко всем разделам. - Выберите хорошо ориентированный склеп, т.е. полный склеп из нетронутой ткани, и выберите бесплатный инструмент выбора рук, чтобы отметить область вокруг него.
- Для измерения пороговой области выберите вкладку «Анализ», за которой следуют частицыанализа. В окне частиц анализа установите размер до 20-бесконечности,щелкните единицы пикселей,установите Круговость до 0,00-1.00и установите Show to Outlines. Нажмите коробки Отображение результатов, Суммировать, и включить отверстия.
ПРИМЕЧАНИЕ: Значения для положительных ячеек BrdU автоматически генерируются в окне результата, показывая индивидуальные измерения для каждой положительной ячейки BrdU. Кроме того, автоматически генерируется сводном окне, показывающее количество отсчетов, общую площадь, средний размер и процент площади с положительными ячейками BrdU. - Повторите шаги 5.4.10 и 5.4.11 для измерения нового склепа. Результаты всех измеренных склепов будут отображаться в окне Резюме.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В первом эксперименте, мы индуцированных мукозита у мышей в день 0 и пожертвовал группу мышей каждый день в течение 5 дней подряд. При измерении веса СИ, мы обнаружили, что этот параметр снизился с 2-го дня до 4 дня, предполагая потерю в массе энтероцита. Мы также обнаружили, что на 5-й день вес СИ существенно не отличался от дня 0 (необработанные мыши) (Рисунок1). Распространение измеряется включение BrdU был почти отменен в день 1 и день 2, но в день 4 и день 5 было примерно в четыре раза и в пять раз увеличивается распространение, соответственно(рисунок 2). Это гиперраспространение было также проиллюстрировано при измерении глубины склепа(рисунок 3). Что не иллюстрируется путем измерения глубины склепа является потеря в пролиферации клеток в день 1 и день 2, где глубина склепа была сокращена примерно на 13%, но не сильно отличается от здоровых мышей. Мы могли бы показать, что в регенеративной фазе мукозита существует сильная корреляция между регистрацией BrdU и глубиной склепа, но это не считается острой фазой, указывающей на то, что глубина крипты в качестве конечной точки может не подходить в острую фазу мукозит(рисунок 4).
Во втором исследовании мы изучили мукости в нашей трансгенной модели мыши с недостаточной секрецией L-клеток. Мыши с дефицитом GLP-1 и GLP-2 показали серьезную потерю массы тела (BW) и снижение веса СИ в фазе восстановления, что было весьма значительным по сравнению с диким типом (WT) 5-FU мышей (p qlt; 0.01) (Рисунок 5A,B). Кроме того, трансгенные мыши не смогли продемонстрировать компенсационную гиперраспространение; крипты были значительно короче, чем у мышей WT и здорового контроля. Вопреки этому WT мышей показали увеличение глубины крипты в знак гиперраспространения(Рисунок 5C).
Рисунок 1: Небольшой кишечный вес. Мыши были принесены в жертву от 1 до 5 дней после 5-FU инъекции в день 0 и кишечного веса был измерен, как описано. Результаты отображаются как средняя - стандартная ошибка среднего значения (SEM). n No 13. Эта цифра была изменена с Hytting-Andreasen и др.16. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Иммунопозитивные клетки BrdU в склепе для двенадцатиперстной кишки, jejunum и ileum SI. Мыши были принесены в жертву от 1 до 5 дней после 5-FU инъекции в день 0 и BrdU включения была количественно иммуногистохимии, как описано. Результаты отображаются как средние - SEM. n no 13. ПЧ/т; 0,05, «p» (0.001 по сравнению с днем 0) (анализ дисперсии (ANOVA) с последующим тестом даннетта). р Злт; 0,001 по сравнению с днем 0 (ANOVA следуют Даннетт несколько тест сравнения). Эта цифра была изменена с Hytting-Andreasen и др.16. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Измерение глубины склепа. Мыши были принесены в жертву от 1 до 5 дней после 5-FU инъекции в день 0 и крипта глубина была измерена, как описано. Результаты отображаются как средние - SEM. n no 13. Злт; 0,05, qp йlt; 0,001 по сравнению с днем 0 (ANOVA следуют Даннетт несколько сравнительный тест). Эта цифра была изменена с Hytting-Andreasen и др.16. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Корреляция глубины склепа и BrdU. Глубина склепа (в двенадцатиперстной килице, jejunum, и ileum) коррелирует с включением BrdU в каждый день жертвоприношения с помощью двуххвостого теста корреляции Пирсона. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: GLP-1 и GLP-2 недостаточно мышей не в состоянии регенерировать после острого мукозита. (A) Изменение BW (%) (B) Вес SI (g), и (C)глубина crypt в ileum (мкм). Результаты показаны в виде среднего - SEM. Tg и трансгенных мышей; WT - мыши дикого типа; 5-ФУ 5-фторурацил. n No 4 х 8. Злт; 0,05, Злт; 0,01, зlt; 0,001 по сравнению со здоровым контролем (WT сольный), а р-р юрт; 0,05, аа р.л.; 0,01, ааа пл/с; 0,001 по сравнению с WT 5-FU (двухсторонний ANOVA, за которым следует Бонферрон на тест). Эта цифра была изменена с Hytting-Andreasen и др.16. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Дополнительная рисунок 1: Малые ткани кишечника до индукции мукозита, во время острой фазы и фазы восстановления мукозита. (A) Гемотоксилин и эозин (H и E) окрашивания и (D) BrdU окрашивания в необработанных мышей. Черная пунктирная линия в панели А иллюстрирует хорошо ориентированный склеп, в то время как пунктирная зеленая линия демонстрирует хорошо ориентированный виллюс. (B) Н И E окрашивания и (E) BrdU окрашивания во время острой фазы мукозита. (C) Н И Е окрашивания и (F) BrdU окрашивания во время фазы восстановления после индукции мукозита. Шкала бар 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы демонстрируем широко доступный метод изучения травмы ИИ и регенерации в мышиной модели. Существует широкий спектр доклинических моделей кишечных травм, но очень важно понимать, что каждая модель уникальна и что конечные точки должны быть подходящими для ответа на исследовательский вопрос. Эта модель отлично подходит для изучения адаптивной реакции на травму, но конечные точки должны быть изменены при использовании модели в качестве доклинической модели мукозита. Тем не менее, перевод с животных моделей для пациентов является сложнойзадачей 23. Предлагаемые нами конечные точки веса и распространения СИ должны ограничиваться только изучением адаптивного реагирования. Изучение эндогенных факторов часто требует использования трансгенных мышей, и даже если небольшая резекция кишечника возможна у мышей1, эта модель может быть альтернативой, чтобы избежать послеоперационной смертности. При применении этой модели для трансгенных мышей, важно внимательно следить за мышами и контролировать их вес каждый день. В ходе этого исследования, некоторые из мышей испытали потерю веса до 30%, что является весьма существенным. Чтобы избежать высокой смертности у чувствительных фенотипов, мы предлагаем проводить экспериментальные исследования на трансгенных мышах, так как корректировка дозы может быть необходимо.
Важным шагом в описанном методе является удаление и взвешивание СИ. Важно, чтобы удаление и обработка выполнялись одинаково и один и тот же исследователь каждый раз, чтобы избежать больших вариаций межассоции.
Последовательность крипты и виллис выбор имеет важное значение, чтобы избежать дисперсии и предвзятости при измерении глубины склепа и высота виллиуса. При встраивании ткани в парафин, кишечник расположен в вертикальном положении, чтобы сделать поперечные порезы, тем самым увеличивая возможность для нетронутых вилли и склепы. После резки ткани выбирается хорошо ориентированный склеп и/или виллус. Выбор основан на полной визуализации всего склепа и виллуса в одной плоскости и наличии четких границ клеток внутри склепа и villus. Ограничением для этого метода является несколько субъективный подход при выборе хорошо ориентированного склепа, так как выбор хорошо ориентированного склепа и/или вилли производится после разрезания ткани. Предыдущее исследование24 представил альтернативный метод преодоления этого ограничения, где они используют микрорассечение. В этом методе, вилли и склепы выбираются при наблюдении под микроскопом, до разреза ткани, что позволяет обеспечить, чтобы неповрежденные склепа и вилли в настоящее время вскрыты из ткани.
В отличие от предыдущих методов, используемых для количества положительных ячеек BrdU25,26, этот протокол описывает область положительных ячеек BrdU в склепе, которая обеспечивает быстрый способ количественной оценки пролиферативных клеток в каждом склепе. Этот метод, однако, может быть несколько ограничительным, поскольку он требует более глубокого знания программного обеспечения, предложенного для измерения этого метода. В будущем применение этого протокола может заключаться в создании более автоматического метода количественной оценки и измерения положительных ячеек BrdU.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана неограниченным грантом от Ново Нордиск Центр фундаментальных метаболических исследований и Лундбек Фонда.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-Fluorouracil | Hospira Nordic AB, Sweden | 137853 | |
| Ketaminol®Vet | Merck, New Jersey, USA | 511485 | |
| Rompun®Vet Xylazine | Rompunvet, Bayer, Leverkusen, Germany. | 148999 | |
| 10% nautral formalin buffer | Cell Path Ltd, Powys, United Kingdom | BAF-5000-08A | |
| HistoClear | National Diagnostics, United Kingdom | HS-200 | |
| Pertex | HistoLab®, Sweden | 840 | |
| BrdU | Sigma-Aldrich, Germany. | B5002 | |
| Tris/EDTA pH 9 buffer | Thermofisher scientific, Denmark | TA-125-PM4X | |
| Peroxide Block | Ultravision Quanto Mouse on Mouse kit, Thermofisher Scientific, Denmark | TL-060-QHDM | |
| Rodent Block buffer | Ultravision Quanto Mouse on Mouse kit, Thermofisher Scientific, Denmark | TL-060-QHDM | |
| Monoclonal mouse anti-BrdU antibody | Thermofisher Scientific, Denmark. | MA1-81890 | |
| Lab Vision Antibody Diluent OP Quanto | Thermofisher Scientific, Denmark. | TA-125-ADQ | |
| Horseradish peroxidase | Ultravision Quanto Mouse on Mouse kit, Thermofisher Scientific, Denmark | TL-060-QHDM | |
| DAB Quanto Substrate | DAB Substrate Kit, Thermofisher Scientific, Denmark | TA-125-QHDX | |
| DAB Quanto Chromogen | DAB Substrate Kit, Thermofisher Scientific, Denmark | TA-125-QHDX | |
| Zen Lite Software (Blue edition) | Carl Zeiss A/S | https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/microscope-software/zen-lite.html | |
| ImageJ Software | LOCI, University of Wisconsin | https://imagej.nih.gov/ij/ |
References
- Weinstein, L. D., Shoemaker, C. P., Hersh, T., Wright, H. K. Enhanced intestinal absorption after small bowel resection in man. The Archives of Surgery. 99 (5), 560-562 (1969).
- Helmrath, M. A., VanderKolk, W. E., Can, G., Erwin, C. R., Warner, B. W. Intestinal adaptation following massive small bowel resection in the mouse. Journal of the American College of Surgeons. 183 (5), 441-449 (1996).
- Kissow, H., et al. Exogenous glucagon-like peptide-2 (GLP-2) prevents chemotherapy-induced mucositis in rat small intestine. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 70 (1), 39-48 (2012).
- Kaczmarek, A., Brinkman, B. M., Heyndrickx, L., Vandenabeele, P., Krysko, D. V. Severity of doxorubicin-induced small intestinal mucositis is regulated by the TLR-2 and TLR-9 pathways. The Journal of Pathology. 226 (4), 598-608 (2012).
- Pontoppidan, P. L., et al. Intestinal response to myeloablative chemotherapy in piglets. Experimental Biology and Medicine. 239 (1), 94-104 (2014).
- Pontoppidan, P. L., et al. Associations between gastrointestinal toxicity, micro RNA and cytokine production in patients undergoing myeloablative allogeneic stem cell transplantation. International Immunopharmacology. 25 (1), 180-188 (2015).
- Crenn, P., Messing, B., Cynober, L. Citrulline as a biomarker of intestinal failure due to enterocyte mass reduction. Clinical Nutrition. 27 (3), 328-339 (2008).
- Fijlstra, M., et al. Lactose maldigestion during methotrexate-induced gastrointestinal mucositis in a rat model. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 300 (2), G283-G291 (2011).
- Jones, J. W., et al. Citrulline as a Biomarker in the Murine Total-Body Irradiation Model: Correlation of Circulating and Tissue Citrulline to Small Intestine Epithelial Histopathology. Health Physics. 109 (5), 452-465 (2015).
- Lutgens, L. C., et al. Citrulline: a physiologic marker enabling quantitation and monitoring of epithelial radiation-induced small bowel damage. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 57 (4), 1067-1074 (2003).
- Demacker, P. N., et al. Plasma citrulline measurement using UPLC tandem mass-spectrometry to determine small intestinal enterocyte pathology. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 877 (4), 387-392 (2009).
- van Eijk, H. M., Rooyakkers, D. R., Deutz, N. E. Rapid routine determination of amino acids in plasma by high-performance liquid chromatography with a 2-3 microns Spherisorb ODS II column. Journal of Chromatography. 620 (1), 143-148 (1993).
- Scholzen, T., Gerdes, J. The Ki-67 protein: from the known and the unknown. Journal of Cellular Physiology. 182 (3), 311-322 (2000).
- Khoshyomn, S., Lew, S., DeMattia, J., Singer, E. B., Penar, P. L. Brain tumor invasion rate measured in vitro does not correlate with Ki-67 expression. Journal of Neuro-Oncology. 45 (2), 111-116 (1999).
- Matatall, K. A., Kadmon, C. S., King, K. Y. Detecting Hematopoietic Stem Cell Proliferation Using BrdU Incorporation. Methods in Molecular Biology. , 91-103 (2018).
- Hytting-Andreasen, R., et al. Endogenous glucagon-like peptide- 1 and 2 are essential for regeneration after acute intestinal injury in mice. PLoS One. 13 (6), e0198046 (2018).
- Elliott, R. M., et al. Glucagon-like peptide-1 (7-36)amide and glucose-dependent insulinotropic polypeptide secretion in response to nutrient ingestion in man: acute post-prandial and 24-h secretion patterns. Journal of Endocrinology. 138 (7-36), 159-166 (1993).
- Orskov, C., Wettergren, A., Holst, J. J. Secretion of the incretin hormones glucagon-like peptide-1 and gastric inhibitory polypeptide correlates with insulin secretion in normal man throughout the day. Scandinavian Journal of Gastroenterology. 31 (7), 665-670 (1996).
- Drucker, D. J., Erlich, P., Asa, S. L., Brubaker, P. L. Induction of intestinal epithelial proliferation by glucagon-like peptide 2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (15), 7911-7916 (1996).
- Lee, S. J., et al. Disruption of the murine Glp2r impairs Paneth cell function and increases susceptibility to small bowel enteritis. Endocrinology. 153 (3), 1141-1151 (2012).
- Shin, E. D., Estall, J. L., Izzo, A., Drucker, D. J., Brubaker, P. L. Mucosal Adaptation to Enteral Nutrients is Dependent on the Physiologic Actions of Glucagon-Like Peptide-2 in Mice. Gastroenterology. 128 (5), 1340-1353 (2005).
- Tsai, C. H., et al. Intestinal growth-promoting properties of glucagon-like peptide-2 in mice. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 273 (1), E77-E84 (1997).
- Sangild, P. T., Shen, R. L., Pontoppidan, P., Rathe, M. Animal models of chemotherapy-induced mucositis: translational relevance and challenges. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 314 (2), G231-G246 (2017).
- Gibson, R. J., et al. Irinotecan causes severe small intestinal damage, as well as colonic damage, in the rat with implanted breast cancer. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 18 (9), 1095-1100 (2003).
- Zhang, C., et al. Bone marrow stromal cells upregulate expression of bone morphogenetic proteins 2 and 4, gap junction protein connexin-43 and synaptophysin after stroke in rats. Neuroscience. 141 (2), 687-695 (2006).
- Biebl, M., Cooper, C. M., Winkler, J., Nl Kuhn, H. G. J. Analysis of neurogenesis and programmed cell death reveals a self-renewing capacity in the adult rat brain. Neuroscience Letters. 291 (1), 17-20 (2000).
