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Cancer Research

रसायन चिकित्सा-प्रेरित म्यूकोसाइटिस के माउस मॉडल का उपयोग करके छोटे आंत्र चोट और अनुकूलन का आकलन करने के लिए महत्वपूर्ण एंडपॉइंट और प्रोliferative मार्कर

Published: May 12, 2019 doi: 10.3791/59236
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Biomedical Sciences, Faculty of Health and Medical Sciences, University of Copenhagen, 2Novo Nordisk Foundation Center of Basic Metabolic Research, Faculty of Health and Medical Sciences, University of Copenhagen

Summary

यहाँ, हम रसायन चिकित्सा प्रेरित mucositis के एक मॉडल का उपयोग कर छोटे आंतों की चोट और प्रतिपूरक अतिप्रसार के महत्वपूर्ण समापन बिंदु और proliferative मार्करों स्थापित करने के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं। हम एक सेल चक्र विशिष्ट मार्कर का उपयोग कर और समापन बिंदु के रूप में छोटे आंतों के वजन, crypt गहराई, और गांव ऊंचाई का उपयोग कर proliferating कोशिकाओं का पता लगाने का प्रदर्शन.

Abstract

आंत्र अनुकूलन प्राकृतिक प्रतिपूरक तंत्र है जो तब होता है जब आंत्र आघात के कारण खो जाती है। अनुकूली प्रतिक्रियाओं, इस तरह के crypt सेल प्रसार और वृद्धि हुई पोषक तत्व अवशोषण के रूप में, वसूली में महत्वपूर्ण हैं, अभी तक खराब समझ. अनुकूली प्रतिक्रियाओं के पीछे आणविक तंत्र को समझना अनुकूलन बढ़ाने के लिए पोषक तत्वों या दवाओं की पहचान को सुविधाजनक बनाने के लिए महत्वपूर्ण है। विभिन्न दृष्टिकोण और मॉडल साहित्य भर में वर्णित किया गया है, लेकिन अनिवार्य रूप से प्रक्रियाओं प्रदर्शन करने के लिए एक विस्तृत वर्णनात्मक तरीका reproduible डेटा प्राप्त करने की जरूरत है. यहाँ, हम चूहों में कीमोथेरेपी प्रेरित mucositis के एक मॉडल का उपयोग कर छोटे आंतों की चोट और प्रतिपूरक अतिप्रसार के महत्वपूर्ण समापन बिंदु और proliferative मार्करों का अनुमान लगाने के लिए एक विधि का वर्णन. हम एक सेल चक्र विशिष्ट मार्कर का उपयोग कर proliferating कोशिकाओं का पता लगाने का प्रदर्शन, साथ ही साथ समापन बिंदु के रूप में छोटे आंतों के वजन, crypt गहराई, और villus ऊंचाई का उपयोग कर. वर्णित विधि के भीतर महत्वपूर्ण कदम के कुछ हटाने और छोटी आंत के वजन और बल्कि जटिल सॉफ्टवेयर प्रणाली इस तकनीक की माप के लिए सुझाव दिया है. इन तरीकों लाभ है कि वे समय लेने वाली नहीं हैं, और है कि वे लागत प्रभावी और बाहर ले जाने और उपाय करने के लिए आसान कर रहे हैं.

Introduction

आंत्र अनुकूलन एक प्राकृतिक प्रतिपूरक तंत्र है जो रोग या शल्य चिकित्सा1,2के कारण आंत्र के खो जाने पर होता है . आघात के बाद, आंत एक morphometric और कार्यात्मक अनुकूली प्रतिक्रिया से होकर गुजरती है, जो क्रिप्ट सेल प्रसार और बढ़ी हुई पोषक तत्व अवशोषण3की विशेषता है। यह कदम वसूली में महत्वपूर्ण है, अभी तक खराब समझ. आंतों अनुकूली प्रतिक्रिया के प्रायोगिक अध्ययन चूहों, चूहों, और सूअरों में छोटे आंत्र लकीर के बाद होने वाले परिवर्तनों पर ध्यान केंद्रित किया है, लेकिन चोटों के अन्य प्रकार में अनुकूली प्रतिक्रिया के पीछे आणविक तंत्र को समझने (जैसे, रासायनिक या जीवाणु) अनुकूलन बढ़ाने के लिए पोषक तत्वों या दवाओं की पहचान की सुविधा के लिए महत्वपूर्ण है. प्रायोगिक रूप से, विभिन्न दृष्टिकोणों का उपयोग छोटे आंतों की पैथोलॉजी के जटिल आणविक और सेलुलर सूचकांक का वर्णन करने के लिए किया गया है, जिसमें हिस्टोपैथोलॉजिकल स्कोरिंग और चोट के परिणाम को मापने शामिल है। इस के बावजूद, क्या साहित्य से अनुपस्थित है कैसे प्रक्रियाओं है कि reproduible डेटा प्राप्त करने के लिए आवश्यक हैं प्रदर्शन करने के लिए एक विस्तृत विवरण है. जब अनुकूलन में शामिल कारकों की पहचान, इस तरह के आंत हार्मोन के रूप में, एक आसान, कम लागत, और reproduible पशु मॉडल warranted है और यहाँ हम रसायन चिकित्सा प्रेरित आंत्र mucositis (CIM) के एक मॉडल का उपयोग करने का सुझाव.

दोनों चोट और अनुकूलन के सरलतम और बहुत जानकारीपूर्ण समापन बिंदु में से एक छोटी आंत (एसआई) के द्रव्यमान को मापने के लिए है। हम जानते हैं कि म्यूकोसाइटिस की एक पहचान आंत्रकोशिकाओं, समय पर निर्भर ग्राम शोष और कम मिटोसिस का एपोप्टोसिस है। अतः आंत्र आकृति विज्ञान की जांच पूर्व नैदानिक मॉडलों 4,5में अत्यधिक प्रासंगिक है। मनुष्यों में, प्लाज्मा citrulline में गिरावट, कार्य entercytes के एक मार्कर, विषाक्तता स्कोर और भड़काऊ मार्करों के साथ सहसंबंध6 अवशोषण क्षमता के अलावा7, इस एमिनो एसिड का सुझाव एक उत्कृष्ट biomarker है म्यूकोशोटिस। Citrulline दोनों चूहों और चूहों में मापा जा सकताहै, और गांव लंबाई 8, crypt अस्तित्व9,और विकिरण प्रेरित mucositis10के साथ उत्कृष्ट सहसंबंध दिखाया गया है.

प्लाज्मा citrulline को मापने का एक प्रमुख लाभ के लिए एक जानवर से दोहराया माप इकट्ठा करने की क्षमता है. हालांकि, चूहों में कई रक्त नमूने की कुल रक्त की मात्रा के लिए प्रतिबंधित है 6 $L/g/सप्ताह और सामान्य संज्ञाहरण की आवश्यकता है. यह दुर्भाग्य से भी चूहों में citrulline माप के उपयोग को सीमित करता है. इसके अलावा, सिट्रुलाइन की माप के लिए उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी11,12,की आवश्यकता होती है जो महंगा और समय लेने वाली है। हाल ही में, हमने दिखाया कि चूहों में citrulline स्तर एसआई वजन के साथ काफी सहसंबंधित (पी एंड एलटी; 0.001) (अप्रकाशित डेटा), citrulline एक प्रत्यक्ष माप entercyte द्रव्यमान को दर्शाती बनाने. एसआई वजन की माप के लिए एक सीमा चूहों के लिए आवश्यकता के लिए बलिदान किया जा रहा है और इस तरह एक ही माउस के भीतर कोई दोहराया माप संभव हो रहे हैं. फिर भी विधि अन्य ऊतक अनुसंधान प्रश्न के लिए निर्देशित विश्लेषण की एक किस्म प्रदर्शन करने की संभावना प्रदान करता है, और इन तथ्यों को conceivably जानवरों के अतिरिक्त उपयोग के लिए कर सकते हैं. इसलिए, हम चूहों में चोट और अनुकूलन के एक आसान, कम लागत, और तेजी से biomarker के रूप में एसआई वजन का उपयोग करने का सुझाव देते हैं। पुन: उत्पादनीयता और स्वीकार्य विश्लेषणात्मक भिन्नता सुनिश्चित करने के लिए, आंतों को ध्यान से जानवर से हटाया जाना चाहिए, वजन से पहले नमकीन, खाली और सूखे के साथ फ्लश किया जाना चाहिए। इस आलेख में, हम दिखाएँ कि यह कार्यविधि कैसे की जाती है.

श्लेष्मशोद की एक अन्य विशेषता यह है कि प्रयोक्ता काल3के दौरान क्रिप्ट्स में उत्तेजित कोशिकाओं का नुकसान और प्रतिपूरक अतिअप्रसार . सेल्यूलर मार्कर Ki67 का प्रयोग इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री13के माध्यम से तेजी से प्रजननात्मक कोशिकाओं को निर्धारित करने के लिए अक्सर किया जाता रहा है . हालांकि Ki67 प्रसार का एक सरल मार्कर है, यह imprecision के लिए एक प्रवृत्ति है के रूप में Ki67 सेल चक्र के सभी सक्रिय चरणों के दौरान मौजूद है (G1, एस, G2, और एम)14. विशिष्ट लेबलिंग प्रतिकृति कोशिकाओं का पता लगाने के लिए आवश्यक है, यही वजह है कि हम 5-ब्रोमो-2'-deoxyuridine (BrdU), थाइमिडीन का एक सिंथेटिक एनालॉग, के रूप में यह काफी हद तक एस चरण15में कोशिकाओं की नकल करने के लिए प्रतिबंधित है की सीटू शामिल करने में सुझाव है। BdU जानवरों में इंजेक्शन है 150 मिनट त्याग से पहले और कोशिकाओं को बाद में BrdU विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग कर इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के साथ पता लगाया जा सकता है. इस विधि लेख में, हम वास्तव में कैसे एक मुक्त छवि सॉफ्टवेयर का उपयोग कर एक crypt के भीतर BrdU इम्यूनोपॉजिटिव कोशिकाओं के क्षेत्र को मापने के लिए दिखा.

Morphologic और कार्यात्मक परिवर्तन अक्सर 5-FU प्रेरित mucositis मॉडल में अध्ययन कर रहे हैं, जहां आंतों अनुकूलन villus ऊंचाई और crypt गहराई द्वारा मूल्यांकन किया जाता है. इस अध्ययन के दौरान, हमने पाया कि mucositis के तीव्र चरण के दौरान, जो चोट चरण के बराबर है, BrdU निगमन द्वारा मापा प्रसार crypt गहराई के साथ सहसंबद्ध नहीं है. इस के विपरीत, crypt गहराई काफी mucositis की मरम्मत चरण में देखा प्रसार के साथ सहसंबद्ध है, 3 से 5 दिनों के प्रेरण के बाद. यह पता चलता है कि mucositis के तीव्र चरण अकेले crypt गहराई से औसत दर्जे का नहीं है. हमारा सुझाव है कि mucositis चूहों के तीव्र चरण में एक समापन बिंदु के रूप में प्रसार का उपयोग करते समय, BrdU निगमन अधिमानतः इस्तेमाल किया जाना चाहिए, लेकिन जब पुनर्योजी चरण के दौरान बाद के चरण में अतिप्रसार परिमाणित, crypt गहराई एक उचित है BrdU निगमन के लिए विकल्प. इस अध्ययन का लक्ष्य इस मॉडल का इस तरीके से वर्णन करना था कि इसका उपयोग सभी शोधकर्ताओं द्वारा ऑन्कोलॉजी के क्षेत्र में किया जा सकता है, लेकिन विशेष रूप से शोधकर्ताओं को आंतों की चोट के मॉडल से परिचित नहीं है।

वर्णित मॉडल शरीर के वजन का उपयोग कर अनुकूली प्रतिक्रिया के अनुसार ट्रांसजेनिक मॉडल phenotype करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, एसआई वजन और अंतिमबिंदु के रूप में crypt गहराई. एक उदाहरण के रूप में, हम यहाँ दिखाने के लिए कैसे हम एक सेलुलर दस्तक मॉडल में 5-fluorouracil (5-FU) प्रेरित mucositis के मॉडल का इस्तेमाल किया अपर्याप्त एल सेल स्राव16के साथ बाहर मॉडल दस्तक . ग्लूकागन की तरह पेप्टाइड-1 (जीएलपी-1) और ग्लूकागन जैसे पेप्टाइड-2 (जीएलपी-2) आंतों के हार्मोन हैं जो भोजन सेवन के जवाब में आंत्र अंत: स्रावी एल-कोशिकाओं से सह-स्रावित होते हैं17,18। जीएलपी-2 को आंतों के उपचार के लिए एक महत्वपूर्ण कारक के रूप में मान्यता प्राप्त है , म्यूकोसल एपोप्टोसिस का विनियमन और एसआई19,20,21,22के अवरोध समारोह में सुधार . साहित्य के आधार पर, हम hypothesized है कि अंतर्जात हार्मोन चोट के बाद अनुकूली प्रतिक्रिया में होने वाली प्रतिपूरक अतिप्रसार के लिए आवश्यक हैं.

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Protocol

वर्णित सभी तरीकों डेनिश कानून पशु प्रयोग (1987) को नियंत्रित करने के दिशा निर्देशों के अनुसार आयोजित किए गए. अध्ययन डेनिश पशु प्रयोग निरीक्षकालय (2013-15-2934-00833) और स्थानीय नैतिक समिति से अनुमति के साथ प्रदर्शन किया गया.

नोट: महिला C57BL/6J चूहों ($20 डिग्री 25 जी) प्राप्त किया गया और मानक 12 एच प्रकाश में पिंजरे प्रति आठ रखे, पानी और मानक चाउ के लिए नि: शुल्क उपयोग के साथ 12 एच अंधेरे चक्र. प्रयोगों के शुरू होने से पहले जानवरों को एक सप्ताह के लिए अनुकूल करने के लिए छोड़ दिया गया था।

1. 5-फ्लोरोरासिल का उपयोग करके म्यूकोसाइटिस का प्रेरण

  1. 50 मिलीग्राम/एमएल घोल में 5-फ्लोरोरासिल (5-FU) प्राप्त करें।
  2. चूहों के शरीर के वजन का वजन और रिकॉर्ड करें। शरीर के वजन से, इंजेक्शन के लिए 5-FU की मात्रा की गणना (उदाहरण के लिए, 400 मिलीग्राम/
  3. एक 1 एमएल सिरिंज एक 27 जी x 30 मिमी सुई से जुड़ा तैयार है और इंजेक्शन के लिए 5-FU की गणना राशि के साथ सिरिंज को भरने।
  4. स्क्रफ विधि द्वारा माउस को रोकें। ऐसा करने के लिए, एक हाथ से पूंछ के आधार को पकड़ो और इसे एक खिलौना-ग्रिपिंग सतह पर रखें, जैसे कि एक तार बार ढक्कन। एक हाथ से पूंछ स्थिति, दूसरे हाथ से गर्दन की घसीट पकड़.
  5. जहां तक संभव हो तर्जनी और अंगूठे को वापस बढ़ाकर माउस के शरीर को एक हाथ में मजबूती से रखें। माउस को सुरक्षित करने के लिए इस एक ही हाथ की उंगलियों के बीच पूंछ रखें।
  6. एक फर्म लेकिन कोमल पकड़ में माउस को बनाए रखने के दौरान, माउस के अधर पक्ष को बेनकाब और पेट के निचले दाएँ या बाएं वृत्त का चतुर्थ भाग पर इंट्रापर्टोनल गुहा में सुई डालें। उचित स्थान सुनिश्चित करने और 400 मिलीग्राम/किग्रा 5-FU इंजेक्ट करने के लिए प्रेरित करें।

2. ऊतक संग्रह

  1. केटामाइन/xylazine (100/10 mg/kg) के एक इंट्रापेरिटोनल इंजेक्शन के साथ माउस को नमकीन समाधान (0.9% NaCl) में पतला एनेस्थेटाइज करें। चुटकी वापसी पलटा देख कर संज्ञाहरण की गहराई की निगरानी करें.
    नोट: संज्ञाहरण एक गैर वसूली संज्ञाहरण है.
  2. एनेस्थेटाइज्ड माउस का भार रिकॉर्ड करें.
  3. माउस को एक सुपाच्य स्थिति में रखें और पेट की गुहा को उजागर करने के लिए एक लैपरोटोमी करें, इसके बाद छाती गुहा के चीरा के बाद न्यूमोथोरैक्स पेश करें।
  4. कैंची का उपयोग करके, डायाफ्राम को काटने से जानवर का बलिदान करें।
  5. छोटी आंत निकालें. pylorus से बेहतर कट, ध्यान से छोटी आंत शव से दूर वापस लेने जब तक cecum तक पहुँच गया है और एक कट बस सीकम से पहले.
  6. संदंश का उपयोग करना, धीरे निकटस्थ लुमेन बंद दबाना. एक 25 जी सुई संलग्न के साथ एक 1 एमएल सिरिंज का उपयोग करना, मल को हटाने के लिए नमकीन के साथ छोटी आंत फ्लश।
  7. धीरे शल्य चिकित्सा उपकरणों के साथ आंतों लुमेन से नमकीन हटा दें।
  8. अतिरिक्त नमकीन को सावधानी से हटाने के लिए साफ सोख्ता कागज पर छोटी आंत रखें।
  9. फ्लश किए गए ऊतक के वजन को रिकॉर्ड करें।
  10. शरीर के वजन के प्रतिशत के रूप में फ्लश किए गए छोटे आंतों के वजन की गणना करें।

3. छोटी आंत ऊतकविज्ञान

  1. ऊतक की तैयारी
    1. एक धूआं हुड में, सिसौदिया का उपयोग करने के लिए डुओडेनम, जेजुनम और ileum से प्रत्येक माउस से flushed आंतों के ऊतकों के 3 सेमी वर्गों में कटौती और कमरे के तापमान पर 24 एच के लिए 10% formalin में वर्गों fixate.
      नोट: स्थिर मात्रा ऊतक मात्रा के 5 डिग्री 10 बार होना चाहिए।
    2. निश्चित ऊतक को काटने के बोर्ड पर स्थानांतरित करें।
    3. एक स्केलपेल का उपयोग करना, लगभग 1 सेमी करने के लिए ऊतक ट्रिम और एक embedding कैसेट में स्थानांतरण.
      नोट: कैसेट पेंसिल में नमूना पहचान (आईडी) के साथ लेबल किया जाना चाहिए.
    4. 70% इथेनॉल में कैसेट डूब और आगे प्रसंस्करण तक 4 डिग्री सेल्सियस पर दुकान.
  2. पैराफिन में टिश्यू एम्बेडिंग
    1. आरोही शराब समाधान में रखकर ऊतक निर्जलित. 1 एच के लिए 70% इथेनॉल में कैसेट रखें, 1 एच के लिए 80% इथेनॉल के बाद, 1 एच के लिए 95% इथेनॉल और 1.5 ज के लिए 100% इथेनॉल. 1.5 h के लिए 100% इथेनॉल से कैसेट स्थानांतरित करें।
    2. पैराफिन मोम के साथ कैसेट विसर्जित 58 डिग्री सेल्सियस के बीच गर्म. एक अनुप्रस्थ अभिविन्यास में ऊतक की स्थिति और ठोस जब तक अधिक से अधिक 24 एच शांत करने के लिए ब्लॉक छोड़ने के लिए forceps का प्रयोग करें।
  3. माइक्रोटोम का उपयोग करके ऊतक काटना
    1. ब्लॉक रखें, ऊतक 5 मिनट के लिए बर्फ पर नीचे चेहरा. एक microtome का उपयोग करके, ऊतक की सतह का पर्दाफाश करने के लिए 10 डिग्री 30 डिग्री मीटर की मोटाई पर पैराफिन ब्लॉक ट्रिम।
    2. 3 डिग्री 5 डिग्री के बीच ऊतक ब्लॉक के पार वर्गों में कटौती, ग्रहणी से अनुप्रस्थ वर्गों बनाने, जेजुनम और ileum.
    3. 40 डिग्री 45 डिग्री सेल्सियस के बीच सेट एक पानी के स्नान में पैराफिन रिबन रखें। वर्गों को अलग करने के लिए बल का प्रयोग करें।
    4. पानी से वर्गों को लेने के लिए माइक्रोस्कोप स्लाइड का प्रयोग करें।
    5. दाग से पहले 30 मिनट के लिए स्लाइड सूखी एयर.
      नोट: समय की एक लंबी अवधि में भंडारण के लिए, एक फ्रिज में स्लाइड की दुकान.
  4. ऊतक का हेमाटॉक्सिलिन-ईओसिन धुंधला
    1. सूक्ष्मदर्शी स्लाइड को ऊतक विज्ञान पालने में रखें। 60 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर सेट एक हीटिंग कैबिनेट में स्लाइड deparaffinize।
      नोट: फ्रिज से सीधे स्लाइड उन्हें एक हीटिंग कैबिनेट में रखने से पहले कमरे के तापमान तक पहुँचने के लिए छोड़ दिया जाना चाहिए।
    2. धूआं हुड में, एक समाशोधन एजेंट (सामग्री कीतालिका)के 3 परिवर्तनों में ऊतक को फिर से हाइड्रेट करें, पहले समाशोधन एजेंट जार में 20 डुबकी बनाएं और फिर उन्हें दो अतिरिक्त समाशोधन एजेंट जार में से प्रत्येक में 7 डिग्री 8 मिनट के लिए खड़े हो जाओ। शराब समाधान उतरते करने के लिए स्लाइड स्थानांतरण, 99% इथेनॉल के 3 परिवर्तन के साथ शुरू, 96% इथेनॉल और 70% इथेनॉल के 2 परिवर्तन के बाद. प्रत्येक जार में 20 डुबकी की एक न्यूनतम बनाओ. पानी चलाने के लिए स्थानांतरण और स्लाइड 5 मिनट के लिए खड़े हो जाओ।
    3. 1 मिनट के लिए फ़िल्टर्ड मेयर के हेमेटॉक्सीलिन में स्लाइड विसर्जित।
    4. 5 मिनट के लिए चल नल के पानी में नमूने धो लें.
    5. 1 "2 मिनट के लिए eosin दाग में वर्गों विसर्जित कर दिया, तो नल के पानी में कुल्ला.
    6. आरोही शराब समाधान में रखकर ऊतक निर्जलित. 70% इथेनॉल, 96% इथेनॉल, 96% इथेनॉल, और 4 बार 99% इथेनॉल के बाद के साथ शुरू करो। प्रत्येक जार में 20 डुबकी की एक न्यूनतम बनाओ, और पालना 99% इथेनॉल में खड़े जब तक वे घुड़सवार हैं.
    7. स्लाइड की सतह के लिए बढ़ते माध्यम की एक छोटी राशि को लागू करने से माउंट coverss. कवरस्लिप के नीचे बुलबुले बनाने के बिना बढ़ते माध्यम के शीर्ष पर कवरस्लिप रखो। इसे 24 ज के लिए सूखने दें।
    8. हिस्टोलॉजिकल तस्वीरें प्राप्त करने के लिए कैमरे से जुड़े हल्के माइक्रोस्कोप का उपयोग करके ऊतक की जांच करें। ऊतक स्लाइड की एक पूर्ण कवरेज तक पहुँच गया है जब तक स्नैपशॉट लेने के लिए एक 10x उद्देश्य का उपयोग करें.

4. crypt गहराई और /या villus ऊंचाई का मापन

  1. डाउनलोड करें और विश्लेषण सॉफ्टवेयर स्थापित (यानी, ज़ेन लाइट, सामग्री कीतालिका).
  2. सॉफ्टवेयर में छवि खोलें और कैमरे से कनेक्ट करें। 20x उद्देश्य के साथ कैमरा मोड में स्नैपशॉट ले लो.
  3. संसाधन मोड में, स्नैपशॉट खोलें।
  4. क्रिप्ट गहराई को मापने के लिए: 2D दृश्यमें, ग्राफ़िक्स टैब से रेखा उपकरण का चयन करें. एक अच्छी तरह से उन्मुख क्रिप्ट चुनें और एक गांव के निचले भाग पर रेखा को प्रारंभ करें और क्रिप्ट के तल पर समाप्त करें. 20 अच्छी तरह से उन्मुख crypts के लिए इस क्रिया को दोहराएँ (पूरकचित्र1).
  5. ग्रामीण ऊंचाई को मापने के लिए: 2D दृश्यमें, ग्राफिक्स टैब से लाइन उपकरण का चयन करें. एक अच्छी तरह से उन्मुख गांव चुनें और luminal प्रक्षेपण के अंत में लाइन शुरू करें और crypt के शुरू में खत्म करें. 20 अच्छी तरह से उन्मुख villi के लिए इस कार्रवाई को दोहराएँ (पूरकचित्र1).
  6. माप प्रदर्शित करने के लिए उपाय दृश्य के लिए 2D दृश्य से स्विच करें.
  7. माप निर्यात और crypt गहराई और villus ऊंचाई के औसत की गणना.

5. इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री द्वारा BrdU परिमाणीकरण (प्रसार)

  1. BrdU समाधान का इंजेक्शन
    1. चूहों के शरीर के वजन का वजन और रिकॉर्ड करें।
    2. एक धूआं हुड में, फॉस्फेट बफर नमकीन (पीबीएस) में 0.5% w/v bromodeoxyuridine (BrdU) समाधान का एक प्रतिनिधि राशि तैयार करते हैं।
    3. धूआं हुड में, इंट्रापर्टोनल इंजेक्शन द्वारा 50 मिलीग्राम/किलोग्राम BrdU इंजेक्ट करें।
      नोट: प्रत्येक माउस ठीक से 150 मिनट पोस्ट BrdU इंजेक्शन पर euthanized है कि यह सुनिश्चित करने के लिए, के बीच में 10 डिग्री 20 मिनट अंतराल के साथ उत्तराधिकार में प्रत्येक व्यक्ति माउस सुई ठीक से ऊतक संग्रह प्रदर्शन करने के लिए.
    4. इंजेक्शन के समय रिकॉर्ड.
    5. 150 मिनट रुको, तो चूहों anesthetize और ऊतक इकट्ठा के रूप में कदम 2.1 में वर्णित 2.1 "2.7. अनुभाग 5.2 में वर्णित के रूप में BrdU इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री प्रदर्शन करें।
  2. बी.आर.डी.यू. इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री
    1. 3-1-1-3-4 के चरण में वर्णित ऊतक को तैयार की ंणापकी अहम्।
    2. प्रतिजन पुनर्प्राप्ति के लिए, एक गिलास ऊतक विज्ञान जार में वर्गों के साथ एक स्लाइड पालना जगह है और यह EDTA बफर (पीएच 9) के साथ एक माइक्रोवेव ओवन में 1 मिनट के लिए 750 डब्ल्यू पर 9 मिनट के बाद 350 डब्ल्यू दोहराएँ चक्र में भरें.
      नोट: सुनिश्चित करें कि ऊतक बाहर सूखी नहीं है, जो हीटिंग के बीच जार करने के लिए और अधिक बफर जोड़ने की आवश्यकता हो सकती है.
    3. धोने वर्गों 2 -3 बार tris-buffered नमकीन और polysorbate 20 (टीबीएस-टी) बफर में 3 मिनट प्रत्येक के लिए.
    4. अंतर्जात peroxidase गतिविधि को ब्लॉक करने के लिए कमरे के तापमान पर 10 डिग्री 15 मिनट के लिए पेरोक्साइड ब्लॉक (सामग्री की तालिका) की 5 बूँदें लागू करें। 3 मिनट प्रत्येक के लिए टीबीएस-टी बफर में 2 डिग्री 3 बार अनुभागों को धोएं।
    5. गैर-विशिष्ट बंधन को अवरोधित करने के लिए कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए कृंतक ब्लॉक बफर (सामग्री तालिका) की 5 बूँदें लागू करें। 3 मिनट प्रत्येक के लिए टीबीएस-टी बफर में 2 डिग्री 3 बार अनुभागों को धोएं।
    6. कमरे के तापमान पर 1 एच के लिए पतला एक monoclonal माउस विरोधी BrdU एंटीबॉडी के साथ वर्गों इनक्यूबेट। 3 मिनट प्रत्येक के लिए टीबीएस-टी बफर में 2 डिग्री 3 बार अनुभागों को धोएं।
    7. प्रत्येक स्लाइड के लिए घोड़े की 5 बूँदें peroxidase लागू करने और कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट द्वारा 3,3'-diaminobenzidine (DAB) का उपयोग कर प्रतिरक्षा की कल्पना। एक धूआं हुड करने के लिए वर्गों स्थानांतरण, DAB के 150 $L और 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट जोड़ें।
      नोट: हमेशा दस्ताने पहनते हैं जब DAB से निपटने और उचित रूप से कचरे के निपटान.
    8. deionized पानी में वर्गों कुल्ला.
    9. ऊतक को निर्जलित करें और एक कवरस्लिप माउंट करें जैसा कि चरण 3.4.6 और 3.4.7 में वर्णित है।
  3. इम्यूनोरिएंशन का दृश्य
    1. एक प्रकाश माइक्रोस्कोप एक कैमरे से जुड़े के साथ ऊतक के नमूने कल्पना.
    2. विश्लेषण सॉफ्टवेयर का प्रयोग सभी वर्गों के एक 20x उद्देश्य का उपयोग कर माइक्रोस्कोप छवियों को प्राप्त करने और में फ़ाइलों को बचाने के लिए. JPG स्वरूप.
    3. एक 20x उद्देश्य है, जो ImageJ सॉफ्टवेयर में एक अंशांकन उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा का उपयोग कर एक मंच micrometer का एक स्नैपशॉट ले लो.
  4. BrdU इम्यूनोरेएक्टिव कोशिकाओं के क्षेत्र को मापने
    1. ImageJ सॉफ्टवेयर स्थापित करें (सामग्री की तालिका).
    2. ImageJ में किसी छवि को स्केल असाइन करना: ImageJ फ़ाइल का उपयोग करके चरण माइक्रोमीटर छवि खोलें | मेनू आदेश खोलें. सीधे-पंक्ति चयन उपकरण का चयन करें.
    3. सीधे उपकरण का चयन करें और एक ज्ञात दूरी को परिभाषित करने के लिए micrometer छवि पर एक सीधी रेखा खींचना.
    4. विश्लेषण मेनू के अंतर्गत स्केल सेट करें का चयन करें.
    5. ज्ञात दूरी बॉक्स में कोई मान दर्ज करें और लंबाई बॉक्स की इकाई में लंबाई की इकाई निर्धारित करें. वैश्विक का चयन करें ताकि यह अंशांकन इस ImageJ सत्र में खोले गए सभी छवियों पर लागू होता है.
    6. ImageJ फ़ाइल का उपयोग करके रुचि की छवि खोलें | crypt प्रति BrdU इम्यूनोरेएक्टिव कोशिकाओं के क्षेत्र को मापने के लिए मेनू आदेश खोलें।
    7. छवि/प्रकार मेनू के अंतर्गत 8-बिट करने के लिए रंग ग्राफ़िक्स सेट करें।
    8. प्रक्रिया के तहत छवि के विपरीत बढ़ाएँ / वृद्धि इसके विपरीत और 0.4% करने के लिए संतृप्त पिक्सल सेट.
    9. प्रतिरक्षा को विभाजित करने के लिए छवि के लिए एक सीमा लागू करें। मेनू के अंतर्गत छवि/समायोजित का चयन करें, फिर थ्रेशोल्ड और लाल रंग (लाल रंग में दिखाया गया काला क्षेत्र) का चयन करें। थ्रेशोल्ड बार ले जाकर लगभग 10 डिग्री 20% की सीमा चुनें.
      नोट: संभव के रूप में कम पृष्ठभूमि के साथ सभी BrdU सकारात्मक कोशिकाओं को शामिल एक थ्रेशोल्ड चुनें। चुना प्रतिशत सभी वर्गों पर लागू होना चाहिए.
    10. एक अच्छी तरह से उन्मुख क्रिप्ट चुनें, यानी, बरकरार ऊतक से एक पूर्ण क्रिप्ट, और इसके आसपास के क्षेत्र को चिह्नित करने के लिए मुक्त हाथ चयन उपकरण का चयन करें।
    11. थ्रेशोल्ड क्षेत्र को मापने के लिए, विश्लेषण टैब का चयन करें, उसके बाद विश्लेषण कणों। विश्लेषण कण विंडो में, आकार को 20-इनफिनिटीपर सेट करें, बॉक्स पिक्सेल इकाइयोंको क्लिक करें, परिपत्र को 0.00$1.00पर सेट करें, और बाह्यरेखाओंके लिए दिखाएँ सेट करें. बॉक्स प्रदर्शित करें , सारांशकरें , और छेद शामिल करें.
      नोट: BrdU सकारात्मक कोशिकाओं के लिए मान स्वचालित रूप से एक परिणाम विंडो में उत्पन्न होते हैं, प्रत्येक BrdU सकारात्मक सेल के लिए अलग-अलग माप दिखा. इसके अलावा, एक सारांश विंडो स्वचालित रूप से उत्पन्न होता है, गिनती की संख्या दिखा, कुल क्षेत्र, औसत आकार और BrdU सकारात्मक कोशिकाओं के साथ क्षेत्र का प्रतिशत.
    12. एक नया crypt को मापने के लिए चरण 5.4.10 और 5.4.11 दोहराएँ। सभी मापा crypts के परिणाम सारांश विंडो में प्रदर्शित किया जाएगा।

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Representative Results

पहले प्रयोग में, हम 0 दिन में चूहों में mucositis प्रेरित और चूहों के एक समूह का बलिदान प्रत्येक दिन लगातार 5 दिनों के लिए. जब एसआई वजन को मापने, हमने पाया कि इस पैरामीटर दिन से कमी आई 2 दिन तक 4 entercyte द्रव्यमान में एक नुकसान का सुझाव. हमने यह भी पाया कि दिन 5 में एसआई का वजन दिन 0 (अशोधित चूहों) से काफी अलग नहीं था (चित्र1)। ब्रुदयू के समावेश द्वारा मापा गया प्रसार लगभग पहले दिन और दिन 2 में समाप्त हो गया था, लेकिन दिन4 और दिन 5 में प्रसार में लगभग चार गुना और पांच गुना वृद्धि हुई थी, क्रमशः (चित्र 2)। इस अतिप्रसार को भी क्रिप्ट गहराई को मापने के दौरान सचित्र किया गया था (चित्र 3) । क्या crypt गहराई को मापने के द्वारा सचित्र नहीं है दिन में कोशिकाओं proliferating में नुकसान है 1 और दिन 2, जहां crypt गहराई लगभग द्वारा कम किया गया था 13% लेकिन स्वस्थ चूहों से काफी अलग नहीं था. हम दिखा सकते हैं कि, mucositis के पुनर्योजी चरण में BrdU निगमन और crypt गहराई के बीच एक मजबूत संबंध था, लेकिन यह तीव्र चरण के लिए गिनती नहीं है कि एक समापन बिंदु के रूप में crypt गहराई का संकेत है कि तीव्र चरण में उपयुक्त नहीं हो सकता है श्लेष्मशोश्व (चित्र 4)

दूसरे अध्ययन में, हम अपर्याप्त एल सेल स्राव के साथ हमारे ट्रांसजेनिक माउस मॉडल में mucostis की जांच की. कमी GLP-1 और GLP-2 के साथ चूहे शरीर के वजन का एक गंभीर नुकसान दिखाया (BW) और वसूली चरण में एसआई वजन में कमी है, जो जंगली प्रकार की तुलना में अत्यधिक महत्वपूर्ण था (WT) 5-FU चूहों (पी एंड एलटी; 0.01) (चित्रा 5A,B). इसके अलावा, ट्रांसजेनिक चूहों प्रतिपूरक अतिप्रसार दिखाने में विफल रहा; crypts दोनों WT चूहों और स्वस्थ नियंत्रण में की तुलना में काफी कम थे. इसके विपरीत WT चूहों ने अतिअप्रसार के संकेत के रूप में क्रिप्ट गहराई में वृद्धि दिखाई (चित्र 5C) .

Figure 1
चित्रा 1: छोटे आंतों के वजन. चूहे दिन 0 में 5-FU इंजेक्शन के बाद 1 से 5 दिनों के बलिदान किए गए थे और आंतों के वजन को वर्णित के रूप में मापा गया था। परिणाम मतलब के रूप में दिखाए जाते हैं - मतलब (SEM) के मानक त्रुटि. द ] 13. यह आंकड़ा Hyting-Andreasen एट अल से संशोधित किया गया है16. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: BrdU इम्यूनोपॉजिटिव कोशिकाओं को ग्रहणी, जेजुनम, और एसआई के ileum के लिए प्रति crypt. चूहे दिन 0 में 5-FU इंजेक्शन के बाद 1 से 5 दिनों के लिए बलिदान कर दिया गया था और BrdU निगमन इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री द्वारा निर्धारित किया गया था के रूप में वर्णित. परिणाम माध्य के रूप में दर्शाए गए हैं - SEM. n ] 13. *p और 0.05, * * *p और lt; 0.001 दिन 0 की तुलना में (विचरण का विश्लेषण [ANOVA] Dunnett एकाधिक तुलना परीक्षण के बाद). p और 0.001 दिन 0 की तुलना में (ANOVA Dunnett एकाधिक तुलना परीक्षण के बाद). यह आंकड़ा Hyting-Andreasen एट अल से संशोधित किया गया है16. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: crypt गहराई का मापन. चूहे दिन 0 में 5-FU इंजेक्शन के बाद 1 से 5 दिनों के लिए बलिदान कर दिया गया और crypt गहराई वर्णित के रूप में मापा गया था। परिणाम माध्य के रूप में दर्शाए गए हैं - SEM. n ] 13. * पी और 0.05, * * पी और lt; 0.001 दिन 0 की तुलना में (ANOVA Dunnett एकाधिक तुलना परीक्षण के बाद) यह आंकड़ा Hyting-Andreasen एट अल से संशोधित किया गया है16. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: क्रिप्ट गहराई और BrdU का सहसंबंध. Crypt गहराई (ग्रहणी में, जेजुनम, और ileum) दो पूंछ Pearson सहसंबंध परीक्षण का उपयोग कर बलिदान के प्रत्येक दिन में BrdU निगमन से संबंधित है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5: GLP-1 और GLP-2 कमी चूहों तीव्र mucositisके बाद पुनर्जीवित करने में विफल | (ए) बW (%), (ठ) एसआई भार (छ ) और (ब्) में इलेयम (ज) में क्रिप्ट गहराई में परिवर्तन। परिणाम मतलब के रूप में दिखाए जाते हैं - SEM. Tg ] ट्रांसजेनिक चूहों; WT - जंगली प्रकार चूहों; 5-FU ] 5-fluorouracil. द [ 4]8. * पी एंड एलटी; 0.05, *च और 0.01, ***p और 0.001 स्वस्थ नियंत्रण की तुलना में (WT saline), एक $ p और lt; 0.05, aa [ p और lt; 0.01, aa ] p और lt; 0.01 WT 5-FU की तुलना में (दो-वे ANOVA कई तुलना द्वारा पीछा किया ] परीक्षण पर). यह आंकड़ा Hyting-Andreasen एट अल से संशोधित किया गया है16. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्र 1: तीव्र चरण के दौरान म्यूकोसिटिस के प्रेरण से पहले छोटे आंतों के ऊतक और म्यूकोसिटिस की वसूली चरणके दौरान। (ए) हेमोटॉक्सिलिन और ईओसिन (एच एंड ई ) धुंधला और (डी) ब्रडयू अनुपचारित चूहों में धुंधला। पैनल में काले डॉटेड लाइन एक अच्छी तरह से उन्मुख क्रिप्ट का उदाहरण है, जबकि डॉटेड हरी रेखा एक अच्छी तरह से उन्मुख गांव को दर्शाता है। (बी) एच एंड ई धुंधला और (ई) ब्रुदु म्यूकोसिटिस के तीव्र चरण के दौरान धुंधला। (ग) एच एंड ई धुंधला और (एफ ) ब्रुदु म्यूकोसिटिस के प्रेरण के बाद वसूली चरण के दौरान धुंधला। स्केल बार ] 100 डिग्री मी. इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

यहाँ, हम एक माउस मॉडल में एसआई चोट और पुनर्जनन का अध्ययन करने के लिए एक व्यापक रूप से सुलभ विधि का प्रदर्शन. आंतों की चोट के पूर्व नैदानिक पशु मॉडल की एक विस्तृत विविधता मौजूद है, लेकिन यह महत्वपूर्ण है कि हम समझते हैं कि प्रत्येक मॉडल अद्वितीय है और समापन बिंदु अनुसंधान सवाल का जवाब देने के लिए उपयुक्त होना चाहिए. यह मॉडल चोट के लिए अनुकूली प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए उत्कृष्ट है, लेकिन म्यूकोसाइटिस के पूर्व-नैदानिक मॉडल के रूप में मॉडल का उपयोग करते समय अंतिमबिंदु को संशोधित किया जाना चाहिए। हालांकि, पशु मॉडल से रोगियों के लिए अनुवाद23को चुनौती दे रहा है. एसआई वजन और प्रसार के हमारे सुझाए गए अंतिम बिंदु केवल अनुकूली प्रतिक्रिया के अध्ययन तक सीमित होने चाहिए। अंतर्जात कारकों के अध्ययन अक्सर ट्रांसजेनिक चूहों के उपयोग की आवश्यकता है, और यहां तक कि अगर छोटे आंत्र लकीर चूहों में संभव है1, इस मॉडल के बाद ऑपरेटिव मृत्यु दर से बचने के लिए एक विकल्प हो सकता है. ट्रांसजेनिक चूहों के लिए इस मॉडल को लागू करते समय, चूहों को ध्यान से देखना और हर दिन उनके वजन की निगरानी करना महत्वपूर्ण है। इस अध्ययन के दौरान, चूहों में से कुछ अप करने के लिए एक वजन घटाने का अनुभव 30%, जो काफी पर्याप्त है. संवेदनशील phenotypes में उच्च मृत्यु दर से बचने के लिए, हम ट्रांसजेनिक चूहों में पायलट अध्ययन प्रदर्शन का सुझाव है, के बाद से खुराक समायोजन आवश्यक हो सकता है.

वर्णित विधि के भीतर एक महत्वपूर्ण कदम को हटाने और एसआई के वजन है. यह महत्वपूर्ण है कि हटाने और हैंडलिंग एक ही तरीके से और एक ही शोधकर्ता द्वारा हर बार बड़े अंतर-आस्पर विविधताओं से बचने के लिए प्रदर्शन किया जाना है।

crypt और villus चयन की स्थिरता के लिए विचरण और पूर्वाग्रह से बचने के लिए जब crypt गहराई और villus ऊंचाई को मापने के लिए महत्वपूर्ण है. जब पैराफिन में ऊतक embedding, आंतों एक ईमानदार स्थिति में तैनात करने के लिए अनुप्रस्थ कटौती कर रहे हैं, इस प्रकार बरकरार villi और crypts के लिए संभावना बढ़ रही है. ऊतक के काटने के बाद, एक अच्छी तरह से उन्मुख क्रिप्ट और / चयन एक ही विमान में पूरे crypt और villus के पूर्ण दृश्य और crypt और villus के भीतर कोशिकाओं की स्पष्ट सीमाओं की उपस्थिति पर आधारित है. इस विधि के लिए एक सीमा कुछ व्यक्तिपरक दृष्टिकोण है जब एक अच्छी तरह से उन्मुख crypt का चयन के बाद से एक अच्छी तरह से उन्मुख crypt और / एक पिछले अध्ययन24 इस सीमा को दूर करने के लिए एक वैकल्पिक विधि प्रस्तुत किया है, जहां वे microdissection का उपयोग करें. इस विधि में, villi और crypts एक माइक्रोस्कोप के नीचे देखते समय चयन कर रहे हैं, ऊतक कटौती से पहले, इस प्रकार यह सुनिश्चित करने के लिए कि एक बरकरार crypt और villi ऊतक से विच्छेदन किया जा रहा है संभव बना.

BrdU धनात्मक कोशिकाओं की मात्रा के लिए इस्तेमाल किया पिछले तरीकों के विपरीत25,26, इस प्रोटोकॉल crypt प्रति BrdU सकारात्मक कोशिकाओं के क्षेत्र का वर्णन है, जो प्रत्येक crypt के भीतर proliferative कोशिकाओं को परिमाणित करने के लिए एक तेजी से तरीका प्रदान करता है. इस तकनीक, तथापि, कुछ हद तक प्रतिबंधात्मक हो सकता है क्योंकि यह इस तकनीक की माप के लिए सुझाव दिया सॉफ्टवेयर का एक और अधिक गहरा ज्ञान की आवश्यकता है. इस प्रोटोकॉल का एक भविष्य आवेदन मात्रा निर्धारित करने और BrdU सकारात्मक कोशिकाओं को मापने के लिए एक और अधिक स्वत: उत्पन्न विधि बनाने के लिए किया जा सकता है.

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

यह काम बुनियादी मेटाबोलिक अनुसंधान और Lundbeck फाउंडेशन के लिए नोवो Nordisk केंद्र से एक अप्रतिबंधित अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5-Fluorouracil Hospira Nordic AB, Sweden 137853
Ketaminol®Vet Merck, New Jersey, USA 511485
Rompun®Vet Xylazine Rompunvet, Bayer, Leverkusen, Germany. 148999
10% nautral formalin buffer Cell Path Ltd, Powys, United Kingdom BAF-5000-08A
HistoClear National Diagnostics, United Kingdom HS-200
Pertex HistoLab®, Sweden 840
BrdU Sigma-Aldrich, Germany. B5002
Tris/EDTA pH 9 buffer Thermofisher scientific, Denmark TA-125-PM4X
Peroxide Block Ultravision Quanto Mouse on Mouse kit, Thermofisher Scientific, Denmark TL-060-QHDM
Rodent Block buffer Ultravision Quanto Mouse on Mouse kit, Thermofisher Scientific, Denmark TL-060-QHDM
Monoclonal mouse anti-BrdU antibody Thermofisher Scientific, Denmark. MA1-81890
Lab Vision Antibody Diluent OP Quanto Thermofisher Scientific, Denmark. TA-125-ADQ
Horseradish peroxidase Ultravision Quanto Mouse on Mouse kit, Thermofisher Scientific, Denmark TL-060-QHDM
DAB Quanto Substrate DAB Substrate Kit, Thermofisher Scientific, Denmark TA-125-QHDX
DAB Quanto Chromogen DAB Substrate Kit, Thermofisher Scientific, Denmark TA-125-QHDX
Zen Lite Software (Blue edition) Carl Zeiss A/S https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/microscope-software/zen-lite.html
ImageJ Software LOCI, University of Wisconsin https://imagej.nih.gov/ij/

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References

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Billeschou, A., Hunt, J., Kissow, H. Important Endpoints and Proliferative Markers to Assess Small Intestinal Injury and Adaptation using a Mouse Model of Chemotherapy-Induced Mucositis. J. Vis. Exp. (147), e59236, doi:10.3791/59236 (2019).

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